KR101855849B1 - 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 ds842 - Google Patents

피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 ds842 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (Paenibacillus polymyxa) (수탁번호: KCTC18528P) 균주 및 이를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주는 피부상재균에 대한 항균 효능이 요구되는 제약 및 화장품 분야에서 피부상재균의 생장을 억제함으로써 약품·화장품의 오염 방지 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842{Paenibacillus polymyxa DS842 having antimicrobial activity against human skin pathogens}
본 발명은 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (Paenibacillus polymyxa) 균주에 관한 것이다.
현재 다양한 식품, 화장품 산업에서 미생물 오염으로 인해 제품이 리콜되는 사례가 빈번하게 발생하고 있고, 이를 방지하기 위해 방부제를 사용하는 방법으로 문제를 해결해왔다. 하지만 이 또한 제품을 이용하는 사람에게 문제점을 일으키고 또한 언론매체의 보도 등으로 인하여 대부분의 소비자들은 화학적 방부제나 첨가물에 대한 거부감이 증가하였다. 따라서 자연히 동식물 유래 항균물질, 미생물이나 그 대사산물로서 변패 미생물의 생육을 저해할 수 있는 천연 보존제 또는 방부제에 대한 관심이 급증하였다.
미생물이 생산하는 많은 생리활성 물질들은 효소, 화장품, 식품 및 발효 산업 그리고 의약품 산업 등 다양한 분야에서 상업적으로 이용되고 있으며, 현재도 여러 분야에서 미생물은 새로운 천연물질의 개발을 위한 잠재적인 소재로서, 이들의 탐색과 응용을 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
다양한 미생물 중에서도 항균물질을 생산한다고 알려져 있는 페니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa)는 그람 양성 세균으로 토양, 근권, 다양한 해양퇴적물 등에서 찾을 수 있다.
페니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa)의 어떠한 균주는 폴리믹신 (polymyxin)이라는 항생물질을 생산하며, 또한 계면활성제 복합체를 생성하여 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), 마이크로코커스 류터스 (Micrococcus luteus), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa ), 스테필로코커스 오리어스 (Staphylococcus aureus )와 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis )와 같은 미생물이 생물막을 형성하는 것을 방해하는 효과를 낼 수 있다.
대한민국 특허공개 제10-2008-0014242호 (2008.02.14) 대한민국 특허공개 제10-2009-0123158호 (2009.12.02) 대한민국 특허등록 제10-0976037호 (2010.08.09) 대한민국 특허공개 제10-2012-0043584호 (2012.05.04)
Ansari, A., Aman, A., Siddiqui, N.N., Iqbal, S., Qader, S.A. 2012. Bacteriocin (BAC-IB17): Screening, isolation and production from Bacillus subtilis KIBGE IB-17. Pakistan Journal Pharmaceutical Science 25: 195-201. Beric, T., Stankovic, S., Draganic, V., Kojic, M., Lozo, J., Fira, D. 2013. Novel antilisterial bacteriocin licheniocin 50.2 from Bacillus licheniformis VPS50.2 isolated from soil sample. Journal of Applied Microbiology 116: 502-510. Chaimanee, V., Sakulsingharoj, C., Deejing, S., Seetakoses, P., Niamsup, P. 2009. Screening and characterisation of bacteriocin-producing bacteria capable of inhibiting the growth of bovine mastitis. Maejo International Journal of Science and Technology 3: 43-52. Herna´ndez, D., Cardell, E., Za´rate, V. 2005. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711. Journal of Applied Microbiology 99: 77-74. Jiang, J., Shi, B., Zhu, D., Cai, Q., Chen, Y., Li, J., Qi, K., Zhang., M. 2012. Characterization of a novel bacteriocin produced by Lactobacillus sakei LSJ618 isolated from traditional Chinese fermented radish. Food Control 23: 338-344. Nagarajkumar, M., Bhaskaran, R., Velazhahan, R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiological Research 159: 73-81. Youssef, N.H., Duncan, K.E., Nagle, D.P., Savage, K.N., Knapp, R.M., Mcinerney, M.J. 2004). Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms. Journal of Microbiological Methods 56: 339-347.
본 발명자들은 다양한 분야에서 문제를 일으키는 미생물의 생장을 억제하기 위한 화학적인 처리의 문제점을 해결하고자 현재 천연 항균물질을 이용한 방부제 개발에 대하여 연구하던 중, 화장품 오염을 유발할 수 있는 피부 상재균 6종을 포함한 다양한 미생물을 억제하는 세균 균주를 다양한 환경으로부터 분리하고, 균주가 생산하는 항균물질의 종류와 특성을 조사함으로써, 피부상재균을 포함한 다양한 미생물을 효과적으로 방제할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 신규한 페니바실러스 폴리믹사 균주 및 이를 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (Paenibacillus polymyxa) (수탁번호: KCTC18528P) 균주가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 피부상재균은 캔디다 알비칸스 (Candida albicans ), 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 스테필로코커스 오리어스 (Staphylococcus aureus), 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 이스처리치아 콜라이 (Escherichia coli), 마이크로코커스 류투스 (Micrococcus lutues), 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pnemoniae), 및 스테필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 균주는 생물계면활성제 생산 활성을 갖거나, 사이드로포어 생산 활성을 갖거나, β-1,3-글루카네이즈 생산 활성을 갖거나, 세포벽 용해 활성을 갖는 균주일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따라, 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 항균물질이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따라, 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 생물계면활성제가 제공된다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따라, 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 유효성분으로 포함하는 피부상재균에 대한 항균용 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따라, 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 유효성분으로 포함하는 피부상재균에 대한 항균용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명에 의해, 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 신규한 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (수탁번호: KCTC18528P) 균주가 생물계면활성제 생산 활성, 사이드로포어 생산 활성, β-1,3-글루카네이즈 생산 활성, 및 세포벽 용해 활성을 나타내어 피부상재균에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 온도 (-22~80℃), pH (5~10), 계면활성제 (urea, tween 20, tween 80)에서 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (수탁번호: KCTC18528P) 균주는 피부상재균에 대한 항균 효능이 요구되는 제약 및 화장품 분야에서 피부상재균의 생장을 억제함으로써 약품·화장품의 오염 방지 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 삼척의 대금동굴 토양으로부터 분리한 균주인 P. 폴리믹사 DS842 균주의 배양 사진이다.
도 2는 P. 폴리믹사 DS842 균주의 다양한 미생물에 대한 억제 직경 사진이다.
도 3은 P. 폴리믹사 DS842 균주의 배양 시간에 따른 항균력을 나타낸 그래프이다 [▲: optical density at 600 nm, □: antimicrobial activity (AU/ml), 지시자 균주로 S. aureus를 이용함].
도 4는 P. 폴리믹사 DS842 균주의 배양 상층액의 오일 스프레딩 검사 (oil spreading test)를 이용한 생물 계면활성제 생산 여부를 조사한 결과이다.
도 5는 P. 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 생물 계면활성제의 구조적 특성을 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 6은 P. 폴리믹사 DS842 균주에 의해서 생산된 사이드로포어의 정성 조사 결과이다.
도 7은 P. 폴리믹사 DS842 균주에 의해서 생산된 사이드로포어의 배양 시간에 따fms 정량 조사 결과이다.
도 8은 P. 폴리믹사 DS842 균주에 의해 생산된 β-1,3-글루카네이즈의 정성 조사 결과이다.
도 9는 P. 폴리믹사 DS842 균주에 생산된 β-1,3-글루카네이즈의 배양 시간에 따른 정량 조사 결과이다.
도 10은 P. 폴리믹사 DS842 균주에 의한 세균세포벽 용해 효소 생산 결과이다 [B. subtilis (a), P. aeruginosa (b), E. coli (c)].
도 11은 P. 폴리믹사 DS842 균주의 탄소원과 질소원에 따른 항균활성 결과이다 (지시자 균주로 S. aureus를 이용함).
본 발명은 피부상재균에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (Paenibacillus polymyxa) (수탁번호: KCTC18528P) 균주를 제공한다.
상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (수탁번호: KCTC18528P) 균주는 동굴 토양 등으로부터 분리될 수 있다. 분리된 균주에 대하여 16s rDNA 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 서열을 얻었으며, 생리생화학적 동정과 종합한 결과 페니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa)와 99% 상동성을 나타내어, 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (수탁번호: KCTC18528P)로 동정하였다.
본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주는 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 스테필로코커스 오리어스 (Staphylococcus aureus), 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 이스처리치아 콜라이 (Escherichia coli), 마이크로코커스 류투스 (Micrococcus lutues), 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pnemoniae), 및 스테필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis) 등의 피부상재균에 대하여 우수한 항균활성을 나타내었다.
또한, 상기 균주는 오일 스프레딩 검사에서 생물계면활성제를 생산하고, 정성실험 결과 사이드로포어를 생산하였으며, 효모의 세포벽성분 포함 한천 배지에 대한 클리어 존 형성으로 β-1,3-글루카네이즈를 생산하였고, 열-사멸 처리된 피부 상재균의 성분 포함 한천 배지에 대한 클리어 존 형성으로 피부 상재균의 세포벽 용해 활성을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 항균물질 및 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 생물계면활성제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 유효성분으로 포함하는 피부상재균에 대한 항균용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 시료채취
항균활성 세균을 분리하기 위해 식물 근권 토양을 주로 하여 다양한 환경에서 시료를 채취하였다.
2. 항균활성 균주의 분리
토양 시료 10 g을 50 ml 코니칼 튜브(conical tube)에 넣고 총 부피가 30 ml가 되도록 NaCl 8.5%를 넣은 후 30 분 동안 진탕하고 시료를 PBS를 이용하여 연속 희석하였다. 한천배지(Nutrient agar, NA), LB배지(Luria Bertani agar, LA)에 PBS로 1/103, 1/104 만큼 연속 희석한 토양 시료 100 ㎕를 도말하여 30℃에서 7일간 배양하며 세균 집락을 분리하고 새로운 배지에 계대배양 하였다. 순수 분리한 균주 콜로니를 피부 상재균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans ), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스테필로코커스 오리어스 (Staphylococcus aureus), 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 이스처리치아 콜라이 (Escherichia coli), 마이크로코커스 류투스 (Micrococcus lutues), 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pnemoniae), 스테필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)를 도말한 배지에 획선으로 그어 배양 (30℃, 24 h)한 후 콜로니 주변에 생긴 클리어 존(clear zone)을 토대로 1차 선별하였다.
3. 균주 동정
균주는 ㈜마크로젠에 의뢰하여 16S rDNA 염기서열분석을 통하여 동정하였으며, 추가적으로 API 키트 (API kit, 50CH, 20E)를 이용한 생리생화학적 테스트를 통해 종 수준까지 동정을 확정하였다.
4. 항균활성 조사
(1) 피부 상재균에 대한 억제 직경 조사
분리 균주를 50 ml LB배지에서 선 배양 (30℃, 160 rpm)한 후 새로운 배지 45 ml에 2 x 108 CFU/ml로 개체수를 보정하여 10% 접종하였다. 분리 균주를 48시간 배양한 후 배양액 1 ml를 원심 분리하였다 (12,000x g, 20 분, 4℃). 피부 상재균 6종의 경우 다음 조건의 배지 50 ml에 24시간 배양하였다 〔C. albicans-YM(yeast malt) 배지, B. subtilis , P. aeruginosa-NB배지, S. aureus , E. coli , M. lutues , S. epidermidis, K. pnemoniae -TSB (trypticase soy broth)배지, A. niger-SDB(Sobouraud dextrose broth)배지〕. 배양 후 개체수를 2 x 108 CFU/ml로 보정하여 NA, PDA+NA(A. niger)배지에 100 ㎕ 도말한 후 10 mm 웰(well)을 뚫어 이용하였다 (A. niger의 경우 평판배지에서 48시간 배양한 후 직경 10 mm의 웰을 뚫어 새로운 배지에 뒤집어 놓은 것을 이용하였다). 피부 상재균이 도말된 배지의 웰에 분리 균주 배양 상층액을 100 ㎕ 첨가한 후 30℃에서 24~48 시간 배양 후 억제 직경을 측정하였다.
(2) 항균물질 생산 조사
분리 균주를 50 ml LB배지에서 선 배양한 (30℃, 160 rpm) 후 새로운 배지 45 ml에 2 x 108 CFU/ml로 개체수를 보정하여 10% 접종하였다. 균주는 48 시간 배양한 후 배양액을 원심 분리하였다 (12,000x g, 20 분, 4℃). 지시자 균주인 스테필로코커스 오리어스 (Staphylococcus aureus)를 2 x 108 CFU/ml로 보정하여 NA배지에 도말한 뒤 배지에 6 mm 직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 PBS를 이용하여 2배씩 연속 희석하여 웰에 20 ㎕로 처리하였다. 배양 24 시간 후 억제 직경이 나타난 희석배수를 통해 활성을 평가하였으며 활성 단위 AU/ml는 희석배수 x 50으로 표현하였다.
5. 항균물질 조사
(1) 생물계면활성제
(ㄱ) 생물 계면활성제 생산
분리 균주를 50 ml LB배지에서 배양하고 원심 분리(4,500x g, 40 분, 4℃)하여 상층액을 회수하였다. 유리 페트리 디쉬(petri dish)에 증류수 50 ml를 담고 원유 (crude oil) 20 ㎕를 떨어뜨린 후 배양 상층액 10 ㎕ 가한 뒤 생긴 클리어 존을 측정하여 생물 계면활성제 생산 여부를 판단하였다.
(ㄴ) 생물 계면활성제 추출
분리 균주를 250 ml LB배지에서 배양하고 원심분리(4,500x g, 40 분, 4℃) 하여 상층액을 회수하였다. 상층액을 2 M HCl을 이용하여 pH 2로 적정하고 상층액과 동량의 에틸 아세테이트를 첨가 후 추출 교반기 (extraction shaker, Recipro shaker RS-1, Jeio Tech)로 진탕하였다(300 rpm, 30 분). 그 후 튜브를 원심 분리(4,500x g, 15 분, 4℃) 후 플라스크에 에틸 아세테이트 층만 취하여 감압증발기로 증발시키고 시료를 1 ml의 에틸 아세테이트로 용해시킨 후 이용하였다. 또한 대조군 (control)은 LB배지를 에틸 아세테이트로 추출한 것을 이용하였다.
(ㄷ) TLC(Thin Layer Chromatography)
에틸 아세테이트로 추출한 계면활성제 시료를 TLC 플레이트 (TLC plate, silicagel 60)에 점적하였다. TLC 플레이트를 이동상 (chloroform / methanol/ glacial acetic acid = 65 :15 :2)에 위치시키고 전개시킨 후 UV하에서 밴드를 관찰하였다. 또한 다양한 염색시료를 이용하여 잔기를 조사하였다. 당 잔기는 오르시놀 (orcinol), 단백질과 아미노산 잔기는 1% 닌히드린 (ninhydrin), 지방산 잔기는 브로모티몰 블루 (bromothymol blue)와 같은 염색시료를 이용하여 조사하였으며 나타난 밴드 부분을 긁어 소량의 증류수에 녹인 후 오일 스프레딩 검사 (oil spreading test)를 통하여 다시 생물 계면활성제 존재 유무를 조사하였다.
(ㄹ) 배양 시간에 따른 배양 상층액 표면장력 측정
분리 균주를 50 ml LB배지에서 선 배양 (30℃, 160 rpm)한 후 새로운 배지 45 ml에 2 x 108 CFU/ml로 개체수를 보정하여 10% 접종하였다. 24시간 주기로 배양액을 원심분리 (4,500x g, 40 분, 4℃)하여 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 배양 상층액을 링 방법 (Ring method)을 이용하여 배양 상층액의 표면장력을 측정하였고 대조군으로는 증류수와 LB배지를 이용하였다.
(2) 사이드로포어 ( siderophore )
(ㄱ) 정성실험
CAS 한천 (agar) 배지를 제작하였다 (조성 : 60 mg CAS(Chrome Azurol S), 1 mM FeCl3 (10 mM HCl) 10 ml, 72.9 mg HDTAB, 16 g agar, 30.2 g pipes, pH 6.8). CAS 배지에 6 mm의 웰을 뚫고 균주 배양액을 70 ㎕를 넣은 후 30℃ 암 조건에서 48 시간 동안 배양하여 노란색 환의 형성 유무로 사이드로포어 생산을 정성적으로 조사하였다.
(ㄴ) 정량실험
분리 균주를 50 ml LB배지에서 선 배양 (30℃, 160 rpm)한 후 새로운 배지 45 ml에 2 x 108 CFU/ml로 개체수를 보정하여 10% 접종하였다. 24시간 주기로 15 ml의 배양액을 원심 분리 (4,500x g, 40 분, 4℃)하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액의 pH를 1 M의 HCl을 이용하여 2.9로 보정하였다. 상층액에 동량의 에틸 아세테이트를 첨가하여 300 rpm에서 30분간 추출 교반기로 1회 추출하고 추출한 용액을 원심분리 하여(4,500x g, 15 분, 4℃) 상층의 에틸 아세테이트 5 ml과 헤쓰웨이 (Hathway) 반응 용액 (0.1 M FeCl3 1ml, 0.1 M potassium ferricyanide 1ml, 98 ml 증류수) 5 ml을 30분간 반응시켰다. 반응 후 분광광도계를 이용해 OD700에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선은 디히드록시 벤조산 (dihydroxy benzoic acid)을 이용하여 정량하였고 대조군으로는 LB배지를 이용하였다.
(3) 베타-1,3- 글루카네이즈 (β-1,3- glucanase )
(ㄱ) 정성실험
펩톤-부이용-효모 한천 (Peptone-bouillon-yeast agar, 1% peptone, 1% beef extract, 2% baker’s yeast, 2% agar, pH 7)에 분리 균주를 스트리킹 (streaking)하고 콜로니 주변에 생긴 클리어 존으로 효소 생성 여부를 판단하였고 이를 토대로 정량실험을 실시하였다.
(ㄴ) 정량실험
분리 균주를 LB배지 45 ml에 2 x 108 CFU/ml로 개체수를 보정하여 10% 접종하였다. 24시간 주기로 배양액 1 ml를 원심분리 (12,000x g, 20 분, 4℃)하였다. 균주 배양액 1 ml을 원심분리 하고(12,000×g, 20분, 4℃) 상층액 250 ㎕, 0.1 M 인산 완충액 (phosphate buffer, pH 5.5) 500 ㎕, 0.2% 라미나린 (laminarin) 500 ㎕을 각각 혼합하고 2시간 동안 40℃ 항온수조에서 반응시켰다. 반응시킨 용액 100 ㎕ 를 DNS 용액 200 ㎕와 90℃에서 10분간 반응시키고 5분간 냉각하여 반응을 종료시켰다. 시료의 흡광도를 575 nm에서 측정하고 대조군으로 LB배지를 이용하여 흡광도 차이를 조사하고, 글루코오스(glucose)로 표준곡선을 작성하여 정량하였다. 1 유닛 (unit)은 1분간 1 mol의 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)을 생성하는 효소량으로 하였고, 브래드포드 (Bradford) 방법으로 시료의 단백질을 정량하였다. 표준곡선은 소혈청알부민 (bovin serum albumin)을 이용하였다.
(4) 세균세포벽 용해효소
4종의 피부 상재균 B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli의 배양액을 원심 분리(4,500x g, 15 분, 4℃)하여 세균 성분을 수집하였다. 그 뒤 121℃에서 15분간 멸균하여 균을 사멸시킨 후 건조하여 준비하고 피부 상재균의 성분을 NA배지에 0.2%로 첨가하여 배지를 제작하였다. 배지에 분리 균주를 스트리킹하여 배양 (30℃, 24시간)한 후 콜로니 주변에 생긴 클리어 존을 토대로 세균 세포벽 용해효소 생산을 정성적으로 판단하였다.
6. 탄소원 및 질소원 조사
(1) 최적 탄소원 조사
효모 추출물 (Yeast extract, 10 g/L)과 탄소원 5가지 (20 g/L) 솔비톨 (sorbitol), D-만니톨 (D-mannitol), 글리세롤 (glycerol), 수크로오즈 (sucrose), 글루코오스 (glucose)가 첨가된 각각의 배지 20 ml에 분리 균주를 선 배양하였다 (30℃, 48 시간). 새로운 배지에 선 배양액의 개체수를 2 x 108 CFU/ml로 보정하여 10% 접종하고 48시간 뒤에 배양액을 원심 분리 (12,000x g, 15분, 4℃) 하였다. 지시자 (indicator) 균주인 S. aureus가 2 x 108 CFU/ml로 도말된 NA배지에 10 mm직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 첨가하여 배양 (30℃, 24 시간)하고 나타난 억제 직경으로 활성을 평가하였다.
(2) 최적 질소원 조사
글루코오스 (20 g/L)와 질소원 7가지 인산암모늄 (ammonium phosphate), 트립톤 (tryptone), 유레아 (urea), 펩톤 (peptone), 효모 추출물 (yeast extract), 맥아 추출물 (malt extract), 황산암모늄 (ammonium sulfate) (10 g/L)이 첨가된 배지에 분리 균주를 선 배양하였다. 새로운 배지에 선 배양액의 개체수를 2 x 108 CFU/ml로 보정하여 10% 접종하고 48시간 뒤에 배양액을 원심 분리 (12,000xg, 15분, 4℃) 하였다. 지시자 균주인 S. aureus가 2 x 108 CFU/ml로 도말된 NA배지에 10 mm 직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 첨가하여 배양 (30℃, 24 시간)하고 나타난 억제 직경으로 활성을 평가하였다.
7. 안정성 조사
(1) 온도에 대한 안정성 조사
분리 균주를 LB배지 50 ml에서 48시간 배양한 후 원심 분리 (4,500 g, 40분, 4℃)하여 상층액을 회수하였다. 배양 상층액을 2 ml씩 취하여 다양한 온도(-22, 4, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분)에서 반응시켰다. 지시자 균주인 S. aureus가 2 x 108 CFU/ml로 도말된 NA배지에 10 mm 직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 첨가하여 배양 (30℃, 24 시간)하고 나타난 억제 직경으로 활성을 평가하였다. 이에 대한 대조군은 25℃ 처리구로 설정하였다.
(2) pH에 대한 안정성 조사
분리 균주를 LB배지 50 ml에서 48시간 배양한 후 원심 분리 (4,500 g, 40분, 4℃)하여 상층액을 회수하였다. 배양 상층액을 2 ml씩 취하여 2 M의 HCl과 NaOH를 이용하여 pH를 3~12 범위로 적정한 뒤 30분간 방치하였다. 그 뒤 다시 pH를 기존의 배양 상층액의 pH 값으로 재 적정하여 지시자 균주인 S. aureus가 2 x 108 CFU/ml로 도말된 NA배지에 10 mm 직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 첨가하여 배양 (30℃, 24 시간)하고 나타난 억제 직경으로 활성을 평가하였다. 이에 대한 대조군으로 pH 변화를 주지 않은 시료를 이용하였다.
(3) 계면활성제에 대한 안정성 조사
분리 균주를 LB배지 50 ml에서 48시간 배양한 후 원심 분리 (4,500 g, 40분, 4℃)하여 상층액을 회수하였다. 배양 상층액을 2 ml씩 취하여 1% 농도로 다양한 계면활성제 (urea, tween 20, tween 80, triton-100)를 처리하였다. 반응 후 지시자 균주인 S. aureus가 2 x 108 CFU/ml로 도말된 NA배지에 10 mm 직경의 웰을 뚫고 분리 균주 배양 상층액을 첨가하여 배양 (30℃, 24 시간)하고 나타난 억제 직경으로 활성을 평가하였다. 이에 대한 대조군으로 계면활성제를 처리하지 않은 시료를 이용하였다.
Ⅱ. 실험결과
1. 미생물 분리 및 동정
삼척의 대금 동굴 분리 균주 P. 폴리믹사 DS842 의 콜로니 사진은 도 1에 나타내었다.
하기 표 1은 삼척의 대금 동굴 분리 균주 P. 폴리믹사 DS842 의 16s rDNA 염기서열 분석과 API test 결과를 나타낸 것이다.
strain Scientific name Pairwise Similarity(%)
DS842 페니바실러스 폴리믹사 99.0
분리 균주 DS842를 마크로젠에 분석을 의뢰하여 16s rDNA 염기서열 분석결과를 얻었으며(서열번호 1), API 키트 (API kit, API 50CH, 20E)를 통한 생리생화학적 동정과 종합한 결과 페니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa)와 99% 상동성을 나타내었다. 최종 동정된 내용으로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다 (기탁 번호: KCTC18528P).
2. 항균 활성 조사
하기 표 2는 6종을 포함하는 피부 상재균에 대한 P. 폴리믹사 DS842 균주의 억제 직경을 나타낸 것이다.
Target organism DS842
IZD (mm) 활성 (activity)
Candida albicans 20±0 ++
Bacillus subtilis 18.6±0.5 ++
Staphylococcus aureus 27.5±1.2 ++++
Aspergillus niger 27.3±3 ++++
Pseudomonas aeruginosa 12.6±1.5 +
Escherichia coli 17.6±0.5 ++
Micrococcus luteus 25±1 +++
Klebsiella pnemoniae 14±0.5 +
Staphylococcus epidermidis 24±0.8 +++
*IZD: inhibition zone diameter
* No inhibition zone: -, 11~15 mm: +, 16~20 mm: ++, 21~25 mm:+++ , 26 mm~:++++
페니바실러스 폴리믹사 DS842는 6종의 그람 양성, 그람 음성, 곰팡이, 효모에 항균활성을 나타내었으며, 그 중에서도 S. aureus , A. niger, M. luteus 그리고S. epidermidis 에 억제 직경이 27.5±1.2, 27.3±3, 25±1와 24±0.8 mm로 넓게 나타났다. 또한 C . albicans, B. subtilis , P. aeruginos , E. coli와 K. pnemoniae 에 20±0, 18.6±0.5, 12.6±1.5, 17.6±0.5와 14±0.5 mm의 항균활성을 나타내었다. 이는 T. Beric et al., 2013년의 연구에서의 바실러스 리치니포미스 (Bacillus licheniformis) VPS50 균주가 생산하는 항균물질보다 폭 넓게 다양한 그람 양성, 그람 음성 세균, 곰팡이, 효모를 억제하며, Asma Ansari et al., 2012년 연구에서의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KIBGE IB-17 균주의 항균활성과 비교하였을 때 S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa Drinking Water, E. coli Drinking Water에 대한 억제 직경이 0, 0, 18 mm인데 비해 항균 활성이 더 우수하였으며 S. aureus Clinical Isolate 균주에 대한 억제직경이 28 mm인 것과 유사한 활성을 나타내었다. 또한 특허문헌 (출원번호 제10-2007-0139155호)에서의 B. Subtilis 균주와 비교하였을 때 그람 양성세균인 Microccus lutues와 그람 음성세균인 P. aeruginosa와 , E. coli 를 억제한다는 점에서 우수하다.
페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주의 배양 시간에 따른 항균력은 도 3에 나타내었다. 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주의 항균력은 배양 시간이 늘어남에 따라 증가하였으며 배양 1일차에 최대 활성인 166±28 AU/ml을 나타내었다. 이는 Veeranan Chaimanee et al.(2009)의 연구에서의 Latobacillus fermentum RMM701 균주의 최대 활성인 40 AU/ml보다 약 4배 높은 값으로서 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
3. 항균 물질 조사
(1) 생물 계면활성제
원유를 이용한 오일 스프레딩 검사에서 분리 균주 DS842의 배양 상층액이 오일을 퍼트리는 효과는 도 4에 나타내었으며 이를 통해 계면활성제를 생산한다는 것을 알 수 있었다.
하기 표 3은 P. 폴리믹사 DS842 균주 배양 상층액의 오일 스프레딩 검사 결과 나타난 클리어 존의 직경조사와 표면장력을 나타낸 것이다.
Strain Oil spreading (cm) Surface tension (mN/m)
DS842 6.6±0.3 30.3±0.8
* DW와 luria bertani (LB)배지의 표면장력은 각각 75와 60 mN/m
P. 폴리믹사 DS842 균주 배양 상층액은 6.6 cm의 직경으로 원유를 퍼트렸으며, 이를 토대로 표면장력을 측정한 결과 LB배지의 표면장력인 60을 30.3 mN/m로 현저하게 낮추는 효과를 나타내었다. 이는 Noha H et al., 2004년 연구에서 클리어 존의 최대값인 3 cm보다 넓은 범위로 원유를 퍼트리는 우수한 효과를 나타내었으며, 표면장력 측정 결과에서 최소값이었던 35 mN/m 수치보다 현저하게 표면장력을 낮추는 우수한 효과를 나타내었다.
또한, P. 폴리믹사 DS842 균주 배양 상층액 에틸 아세테이트 추출물을 TLC하여 분획한 후 오르시놀을 처리하여 밴드가 형성된 것을 관찰할 수 있었다 (도 5). 따라서 균주가 생산하는 생물 계면활성제는 글리코리피드 (glycolipid) 구조를 가진 것으로 판단되었다.
(2) 사이드로포어
사이드로포어 정성실험 결과를 도 6에 나타내었다. P. 폴리믹사 DS842 균주의 배양 상층액을 CAS 플레이트 웰에 주입하고 48시간 배양한 후 노란환이 형성된 것으로 사이드로포어 생산을 정성적으로 판단하였다.
Arnow와 Hathway의 방법을 이용하여 다이벤조산 (dibenzoic acid)으로 표준곡선을 작성하여 이를 토대로 사이드로포어의 정량 실험을 수행한 결과, P. 폴리믹 사 DS842 균주는 배양 2일차에 170±15 μmol/ml의 사이드로포어 생산량을 나타내었고, 이러한 결과를 도 7에 나타내었다. 이는 M. Nagarajkumar (2004)의 연구에서의 Pseudomonas fluorenscens 균주가 생산하는 사이드로포어 최대 생산량인 13 ㎛ol/ml 보다 13배 정도 우수한 수치였다.
(3) β-1,3- 글루카네이즈
효모의 세포벽성분을 포함하고 있는 한천 배지에 분리 균주를 획선배양한 후 콜로니 주변에 생긴 클리어 존 형성을 토대로 β-1,3-글루카네이즈 생산을 판단하였고 P. 폴리믹사 DS842 균주가 양성반응을 나타내었다 (도 8).
환원당 측정법 (DNS method)과 단백질 정량을 이용하여 P. 폴리믹사 DS842 균주에 의한 β-1,3-글루카네이즈 생산 변화를 조사하였을 때 P. 폴리믹사 DS842 균주는 배양 1일차에 357.2±13.7 nmol/min/mg 단백질의 효소를 생산하는 것으로 나타났으며 도 9에 나타내었다. 이는 Nagarajkumar (2004)의 연구에서의 Pseudomonas fluorenscens 균주가 생산하는 β-1,3-글루카네이즈의 최대수치인 200 nmol/min/mg 단백질보다 1.7배 우수한 활성을 나타내었다.
(4) 세균세포벽 용해효소
열-사멸 처리된 피부 상재균의 성분을 0.2%로 포함하고 있는 한천 배지에 P. 폴리믹사 DS842 균주를 획선배양한 후 콜로니 주변에 생긴 클리어 존을 토대로 세균세포벽 용해능을 조사하였다. 그 결과 균주는 B. subtilis, P. aeruginosa와 E. coli의 세포벽을 용해하는 것으로 나타났다 (도 10).
4. 최적 탄소원과 질소원 조사
탄소원 5가지 질소원 7가지로 나누어 배지 조성을 달리하여 배지를 제작하고 균주를 배양한 후 한천 웰 확산법 (agar well diffusion)을 이용하여 항균활성을 조사한 결과 P. 폴리믹사 DS842 균주의 경우 탄소원으로 글리세롤에서 억제직경 25 mm로, 질소원으로는 유레아, 펩톤에서 27 mm로 가장 높은 활성이 나타났다(도 11).
5. 안정성 조사
하기 표 4에 P. 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 항균물질의 안정성을, 온도 (a), pH (b), 계면활성제 (c)로 분류하여 나타냈으며, 지시자 균주로 S. aureus를 이용하였다.
(a) 온도(℃) 잔여 활성(±SD)%
-22 92.47±0.01
4 96.77±0.3
50 90.32±0.03
60 94.62±0.01
70 93.55±0.02
80 93.55±0.02
90 0
100 0
121 96.77±0.02
(b) pH 잔여 활성(±SD)%
3 0
4 0
5 97.97±0.06
6 93.94±0.02
7 100
8 100
9 73.73
10 72.73±0.09
11 0
12 0
(c) 계면활성제 잔여 활성(±SD)%
유레아 100±0.28
Tween 20 100±0.28
Tween 80 97.61±0.28
TritonX-100 0
P. 폴리믹사 DS842 균주가 생산하는 항균물질의 안정성을 한천 웰 확산법을 이용하여 다양한 영향 하에서 조사하였을 때 온도에서는 -22~80℃ 범위에서 안정하였으며, pH에서는 5~10 범위에서 대체로 안정한 활성을 나타내었다. 또한 계면활성제의 영향에서 대체로 안정한 활성을 나타내었다. 이는 D. Herna´ndez et al.(2005)의 연구에서 Lactobacillus plantarum TF711 균주의 항균물질이 80℃에서 80% 잔여활성이었던 것에 비하여 우수하며, Jie Jiang et al.(2012) 연구에서 Lactobacillus sakei LSJ618 균주의 항균물질이 pH 10~12 범위에서 활성이 0이 된 것보다 우수하다. 또한 D. Herna´ndez et al.(2005)의 연구에서 Lactobacillus plantarum TF711 균주보다 다양한 계면활성제의 영향에서 안정한 활성을 나타내었으며, 비교 균주는 프로테이나아제 K (Proteinase K), a-키모트립신 (a-Chymotrypsin), a-아밀라제 (a-Amylase)의 영향에서 잔여활성이 0이 된 반면 본 발명 분리 균주의 항균활성은 안정함을 나타내었다. 이로써 특허문헌 (출원번호 제10-2007-0139155호)에서의 Bacillus subtilis 균주의 항균물질보다 다양한 온도와 pH 범위에서 안정하다는 점에서, 본 발명의 분리 균주가 우수하다는 것을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18528P 20161212
<110> Kangwon National University <120> Paenibacillus polymyxa DS842 having antimicrobial activity against human skin pathogens <130> P161208 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1752 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 1 ggggaccttt tagatttttg tttctggctc aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca 60 tgcaagtcga gcggggttaa ttagaagctt gcttctaatc aacctagcgg cggacgggtg 120 agtaacacgt aggcaacctg cccacaagac agggataact accggaaacg gtagctaata 180 cccgatacat ccttttcctg catgggagaa ggaggaaaga cggagcaatc tgtcacttgt 240 ggatgggcct gcggcgcatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatgc 300 gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 360 gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat gggcgaaagc ctgacggagc aacgccgcgt 420 gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgccag ggaagaacgt cttgtagagt 480 aactgctaca agagtgacgg tacctgagaa gaaagccccg gctaactacg tgccagcagc 540 cgcggtaata cgtagggggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg 600 cggctcttta agtctggtgt ttaatcccga ggctcaactt cgggtcgcac tggaaactgg 660 ggagcttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagata 720 tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctgggctg taactgacgc tgaggcgcga 780 aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc 840 taggtgttag taagcattcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900 tgacggggac ccgcacaagc agtggagtat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960 ttaccaggtc ttgacatccc tctgaccggt ctagagatag atctttcctt cgggacagag 1020 gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080 aacgagcgca acccttatgc ttagttgcca gcaggtcaag ctgggcactc taagcagact 1140 gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtactacaa tggccggtac aacgggaagc gaaatcgcga ggtggagcca 1260 atcctagaaa agccggtctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg 1320 aattgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca 1380 ccgcccgtca caccacgaga gtttacaaca cccgaagtcg gtggggtaac ccgcaaggga 1440 gccagccgcc gaaggtgggg tagatgattg ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtatc 1500 ggaaggtgcg gctggatacc ttccttttca aaaggggggg gaggagcaag cgtgaagaga 1560 tgcgagggga agtttaatcc actatttgtg ttaaactcgg gtgtttcgct ctctaaattc 1620 gttgttgtga tcatgtcggt atgatttcct attctcttct ctaatctaaa caacatttat 1680 cttcaataag acatcgttca gggtaggtac gccgtgagga gaaacaaata aatcaatatt 1740 aaaagccgcc cc 1752

Claims (10)

  1. 캔디다 알비칸스, 클레브시엘라 뉴모니에 및 스테필로코커스 에피더미디스로 구성된 균 중 1 이상에 대하여 항균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 DS842 (Paenibacillus polymyxa) (수탁번호: KCTC18528P) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주가 생물계면활성제 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주가 사이드로포어 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주가 β-1,3-글루카네이즈 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  6. 삭제
  7. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 포함하는 항균제.
  8. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 포함하는 계면활성제.
  9. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 유효성분으로 포함하는, 캔디다 알비칸스, 클레브시엘라 뉴모니에 및 스테필로코커스 에피더미디스로 구성된 균 중 1 이상에 대한 항균용 약학 조성물.
  10. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 페니바실러스 폴리믹사 DS842 균주를 유효성분으로 포함하는, 캔디다 알비칸스, 클레브시엘라 뉴모니에 및 스테필로코커스 에피더미디스로 구성된 균 중 1 이상에 대한 항균용 화장료 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160295901A1 (en) 2013-12-18 2016-10-13 Dupont Nutrition Biosciences Aps Paenibacillus strains and compositions thereof that inhibit microorganisms

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US20160295901A1 (en) 2013-12-18 2016-10-13 Dupont Nutrition Biosciences Aps Paenibacillus strains and compositions thereof that inhibit microorganisms

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