KR101849704B1 - A method of pretreatment of transparency of a living tissue and a method of transparency of a living tissue comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 생체 조직의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법에 관한 것이다.BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0002] The present invention relates to a method for pretreatment of transparency of a living tissue and a method for transparency of a living tissue including the same.
조직 투명화 기술은 생체 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있고 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다. The organization transparency technology can confirm the internal structure and protein distribution of biological tissues and observe the structure structure deeper than the observation limit of the existing technology and make it possible to access the integrated structure and molecular information from various systems Recently, technology has been developed to make the organization transparent in various ways.
종래의 조직 투명화 기술로는 유기 용매를 이용한 조직투명화 과정인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO 법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우, 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성이 있으며, 이는 CLARITY와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하며, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.Conventional tissue transparency techniques have reported antigen preservation of tissues treated by Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO and ACT (active CLARITY technology), which is a tissue inversion process using an organic solvent. Other methods except ACT have the problem that the conservation of fluorescence and antigen is reduced. ACT has more than 90% antigen retention, which is more conservative than a method that requires binding of a hydrogel polymer to a fixed protein such as CLARITY. However, a strong tissue fixation process causes loss of antigenicity, and it is necessary to take into consideration the problems such as the decrease in available antibodies. Therefore, various techniques need to be improved.
또한, 최근에 개발된 조직 투명화 방법인 'CLARITY' 기반 기술은 조직 내 Hydrogel을 추가하여 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 중요 물질들을 붙잡아주는 일종의 조직 내 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. (특허문헌 1, 비특허문헌 1, 2 참조)In addition, recently developed 'CLARITY' based technology, which is a system based on 'CLARITY', is a method of adding a hydrogel to the tissues to create a kind of tissue net support which captures important substances important for diagnosis such as DNA and protein, . (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2)
그러나, 상기 'CLARITY' 기반 기술은 하이드로젤 지지체를 조직에 침투시키게 되는데, 하이드로젤의 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아지며 보다 촘촘한 그물형 구조가 만들어지기 때문에 조직이 더 단단해진다. 반면 조직이 단단해지면 계면활성제에 의해서 지질이 빠져나가기 어려워지기 때문에 투명화에 걸리는 시간이 길어진다. 또한, 상기 방법은 조직 표면에 공기 및 검은 입자 침착을 야기하거나, 조직을 노랗게 변색시키는 문제점이 있다.However, the 'CLARITY' -based technology infiltrates the tissue into the tissue. As the concentration of the hydrogel increases, the tissue becomes more rigid because of its higher degree of protein binding and a more dense network structure. On the other hand, if the tissue is hardened, it becomes difficult for the lipid to escape by the surfactant, so that the time required for transparency becomes long. In addition, the method has the problem of causing air and black particle deposition on the tissue surface or discoloring the tissue to yellow.
또한, 상기 'CLARITY' 기반 기술은 과정이 너무나 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 예를 들면 뇌 하나를 투명화하기 위해서는 적어도 30,000,000 만원 이상이 필요하다. 뿐만 아니라, 한 번에 하나의 뇌만 투명화하는 것이 가능하므로 경제적, 시간적으로 많은 손실이 유발된다. 보다 큰 문제는 항체을 이용한 염색이 그물망 구조를 이루는 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)의 사이를 투과하기에 어려움이 있다.Also, the 'CLARITY' -based technology is too complicated and requires a lot of additional equipment. For example, at least 30 million won is needed to make a brain transparent. In addition, since only one brain can be made transparent at a time, a lot of economic and time loss is caused. A greater problem is that dyeing with antibodies is difficult to penetrate between polyacrylamides that form the network structure.
따라서 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)의 사용 없이 조직의 투명화 과정을 유도하고, 조직의 구조와 단백질의 손상 없이 생체 조직을 투명화 할 수 있는 기술이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for a technique that can induce a process of transparency of a tissue without using polyacrylamide, and can make a living tissue transparent without damaging the structure and protein of the tissue.
상기 기술의 필요성에 따라, 본 발명은 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)을 이용한 단백질 보존 방식이 아닌 수크로오스(Sucrose)를 전 처리하여 조직에서 탈수를 유발하여 조직의 구조와 단백질의 손상 없이 생체 조직을 투명화할수 있는 방법을 제공한다.According to the need of the present invention, the present invention relates to a method for preparing a protein, which is not a protein preserving method using polyacrylamide, but which is pretreated with sucrose to induce dehydration in the tissue to transparentize the biotissue without damaging the structure and protein of the tissue. Provide a method.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법은 고가의 전기영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 형광 시그널의 유지를 통하여 생체 조직의 구조적 이미지화 및 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.More specifically, the method for pretreatment of transparency of a living tissue according to the present invention and the method of transparency of a living tissue including the same, which do not require an expensive electrophoresis apparatus and an expensive solution, can be applied to a brain, liver, , Muscles, blood vessels, and the like, as well as bubble formation, discoloration and black deposits are not displayed, the transparency of the living tissue is improved, the antibody can be stained in the transparent tissue, It can be used to identify the structural imaging of living tissue and the causes of various diseases and to find a treatment method.
본 발명의 목적은 생체 조직 투명화제를 생체조직에 접촉시켜 투명화시키기 이전에 당류를 함유하는 용액을 처리하여 추후 생체 조직의 투명화가 용이하게 진행될 수 있게 하는 전처리 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pretreatment method that allows a biocortical clarifying agent to be contacted with a living body tissue to make the living body tissue transparent before processing the solution containing the saccharide to facilitate transparency of the living tissue.
본 발명의 다른 목적은 상기 전처리를 수행한 후 생체 조직 투명화제를 생체조직에 접촉시켜 생체 조직을 투명화하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for making a living tissue transparent by bringing a living body tissue clarifying agent into contact with a living tissue after performing the pretreatment.
본 발명의 또 다른 목적은 당류 용액을 포함하는 생체 조직 투명화 전처리용 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a composition for pretreatment of biopsy transparency comprising a saccharide solution.
본 발명의 다른 목적은 당류 용액을 포함하는 생체 조직 투명화 전처리용 조성물 및 생체 조직 투명화제를 포함하는 생체 조직 투명화용 키트를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a biotissue transparency kit comprising a saccharide solution-containing composition for pretreatment of biopsy transparency and a biotissue-clarifying agent.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명은 고정화된 생체 조직에 당류를 함유하는 용액을 처리하는 단계를 포함하는, 생체 조직의 투명화 전처리 방법을 제공한다.The present invention provides a method for pretreatment of transparency of a living tissue, comprising the step of treating a solution containing a saccharide in an immobilized biological tissue.
또한, 본 발명은 고정화된 생체 조직에, 당류를 포함하는 용액을 처리하는 전처리 단계(단계 1); 및Further, the present invention provides a method for treating a liquid containing a saccharide, comprising the steps of: a pretreatment step (step 1) of treating a solution containing a saccharide to immobilized biotissue; And
상기 단계 1에서 전처리된 생체 조직을 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화제와 접촉시켜 투명화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법을 제공한다.And a step of making the biotissue pretreated in step 1 contact with a biotissue-clarifying agent comprising a compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof to make the biotissue transparent (step 2).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
나아가, 본 발명은 당류 용액을 포함하는 생체 조직 투명화 전처리용 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a composition for pretreatment of biopsy transparency comprising a saccharide solution.
또한, 본 발명은 당류 용액을 포함하는 생체 조직 투명화 전처리용 조성물; 및The present invention also provides a composition for pretreatment of biopsy transparency comprising a saccharide solution; And
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화제;를 포함하는, 생체 조직 투명화용 키트를 제공한다.And a biotissue-clarifying agent comprising the compound of Formula 1 or a hydrate thereof.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법은 투명화제를 생체 조직에 처리하기 이전에 생체 조직에 당류 용액을 처리하는 전처리 단계를 포함함에 따라,The pretreatment method of transparency of a living tissue according to the present invention and the method of transparency of a living tissue including the method of the present invention include a pretreatment step of treating a saccharide solution in a living body tissue before the vitreous tissue is treated with the clarifying agent,
빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분이 생체 조직으로부터 미리 제거되고, 탈수가 유도되어 결과적으로 조직을 고정화하는 시약과 생체조직 단백질과의 구조적 결합력이 증가하여 변성을 일으키지 않고, 조직을 더 단단하게 할 수 있으며, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어오름을 방지하고, 항체 처리과정, 세척 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있는 현저한 효과가 있다.The lipid component blocking the transmission of light and other molecules is removed from the living tissue in advance and the dehydration is induced, resulting in an increase in the structural bonding force between the reagent for immobilizing the tissue and the biotissue protein, resulting in no denaturation, And it has a remarkable effect of preventing the swelling of the tissue appearing in the process of tissue transparency and preventing the tissue from being broken in the course of antibody treatment and washing.
도 1은 고정화한 뇌에 수크로오스로 전처리한 마우스의 뇌와, 수크로오스로 전처리하지 않고 고정화만 수행한 마우스의 뇌를 비교한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 1의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.
도 2는 고정화한 뇌에 수크로오스로 전처리하고 투명화제로 5시간 동안 투명화를 수행한 마우스의 뇌와, 고정화만 수행한 마우스의 뇌에 투명화제로 5시간 동안 투명화를 수행한 마우스의 뇌를 비교한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 2의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.
도 3은 고정화한 뇌에 수크로오스로 전처리하고 투명화제로 48시간 동안 투명화를 수행한 마우스의 뇌와, 고정화만 수행한 마우스의 뇌에 투명화제로 48시간 동안 투명화를 수행한 마우스의 뇌를 비교한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 3의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.
도 4는 투명화가 진행된 마우스 뇌를 멸균 증류수에 인큐베이션 한 후 관찰한 이미지이다. 도 4의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.
도 5는 멸균 증류수로 세척한 후 마우스 뇌를 투명화제로 투명화시킨 결과를 나타내는 이미지이다. 도 5의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.1 is an image showing the result of comparing brain of mouse pretreated with sucrose to immobilized brain and brain of mouse only immobilized without pretreatment with sucrose. 1 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
Fig. 2 shows the results of comparing the brain of a mouse in which the immobilized brain was pretreated with sucrose and inactivated for 5 hours with a vitrification agent and the brain of the immobilized mouse for 5 hours, It is an image to represent. 2 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
Fig. 3 shows the results of comparing the brains of the mice pretreated with sucrose to the immobilized brains and the vitrification for 48 hours with the vitrification agent, and the brains of mice that had undergone vitrification for 48 hours with a vitrification agent only in the immobilized mice It is an image to represent. 3 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
Fig. 4 is an image obtained after incubation of mouse brain in which transparency has progressed in sterilized distilled water. The lower fluorescence image of FIG. 4 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
5 is an image showing the result of clearing the mouse brain with a transparentizing agent after washing with sterile distilled water. The lower fluorescence image of Figure 5 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 고정화된 생체 조직에 당류를 함유하는 용액을 처리하는 단계를 포함하는, 생체 조직의 투명화 전처리 방법을 제공한다.The present invention provides a method for pretreatment of transparency of a living tissue, comprising the step of treating a solution containing a saccharide in an immobilized biological tissue.
이때, 상기 고정화된 생체 조직은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 폴리아크릴아마이드 등으로부터 고정화된 생체 조직일 수 있고, 바람직하게는 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정화된 생체 조직을 사용할 수 있다.At this time, the immobilized biotissue may be selected from the group consisting of paraformaldehyde, ethylene glycol diglycidyl ether, dipropylene glycol diglycidyl ether, 1,4-butanediol But may be a biotissue immobilized from a 1,4-butanediol diglycidyl ether, a glycerol polyglycidyl ether, a glutaraldehyde, a polyacrylamide or the like, Biotissues immobilized with paraformaldehyde can be used.
또한, 상기 생체 조직은 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 장(intestine) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological tissue may be, but is not limited to, a brain, a blood vessel, a liver, a lung, a kidney, a pancreas, an intestine, etc. .
나아가, 상기 당류는 단당류, 이당류, 다당류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 단당류는 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose) 또는 만노스(mannose)이고; 상기 이당류는 수크로오스(sucrose), 락토스(lactose), 말토스(maltose), 트레할로스(trehalose), 투라노스(turanose) 또는 셀로비오스(cellobiose)이고; 상기 다당류는 덱스트란(dextran), 디에틸아미노에틸-덱스트란(diethylamino ethyl-dextran), 덱스트린(dextrin), 셀룰로오스(cellulose) 또는 베타-글루칸(β-glucans)를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 당류로서 수크로오스를 사용할 수 있다. 또한, 상기 당류를 함유하는 용액은 당류를 함유하는 수용액인 것이 바람직하다.Furthermore, the saccharide may be a monosaccharide, a disaccharide, a polysaccharide and the like. More specifically, the monosaccharide may be fructose, galactose, glucose, or mannose; The disaccharide may be sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose or cellobiose; The polysaccharide may be selected from the group consisting of dextran, diethylaminoethyl-dextran, dextrin, cellulose, and beta-glucans. Preferably, sucrose can be used as the saccharide. It is also preferable that the solution containing the saccharide is an aqueous solution containing a saccharide.
상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도는 10 내지 70 w/v% 범위일 수 있고, 20 내지 60 w/v% 범위일 수 있고, 25 내지 50 w/v% 범위일 수 있고, 30 내지 40 w/v% 범위일 수 있다.The saccharide concentration of the saccharide-containing solution can range from 10 to 70 w / v%, can range from 20 to 60 w / v%, can range from 25 to 50 w / v% / v% range.
생체 조직에 상기 당류 용액을 처리하면 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분이 생체 조직으로부터 미리 제거되고, 탈수가 유도되어 결과적으로 조직을 고정화하는 시약과 생체조직 단백질과의 구조적 결합력이 증가하여 변성을 일으키지 않고, 조직을 더 단단하게 할 수 있으며, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어오름을 방지하고, 항체 처리과정, 세척 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있는 현저한 효과가 발생한다. 다만, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 10 w/v% 미만일 경우 상기 효과가 발생하지 않는 문제가 있고, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 70 w/v% 초과일 경우 경제적이지 못한 문제가 있다.When the saccharide solution is treated on the living tissue, the lipid component that blocks the transmission of light and other molecules is removed from the living tissue in advance, and the dehydration is induced, resulting in an increase in the structural binding force between the reagent for immobilizing the tissue and the biotissue protein, It is possible to make the tissue harder and to prevent the swelling of the tissue appearing in the tissue transparency process and to prevent the breakage of the tissue occurring in the antibody treatment process and the washing process. However, if the saccharide concentration of the saccharide-containing solution is less than 10 w / v%, the above effect is not generated. If the sugar concentration of the saccharide-containing solution exceeds 70 w / v% there is a problem.
또한, 본 발명은 고정화된 생체 조직에, 당류를 포함하는 용액을 처리하는 전처리 단계(단계 1); 및Further, the present invention provides a method for treating a liquid containing a saccharide, comprising the steps of: a pretreatment step (step 1) of treating a solution containing a saccharide to immobilized biotissue; And
상기 단계 1에서 전처리된 생체 조직을 하기 화학식 1로 표시되는 CHAPS 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화제와 접촉시켜 투명화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법을 제공한다.And a step of making the biotissue pretreated in step 1 contact with a biotissue-clarifying agent comprising a CHAPS compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof to make the biotissue transparent (step 2).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
이하, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, a method of transparentizing a living tissue according to the present invention will be described step by step.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 상기 단계 1은 고정화된 생체 조직에, 당류를 포함하는 용액을 처리하는 전처리 단계이다.In the method of vitrification of a living tissue according to the present invention, the step (1) is a pretreatment step of treating a solution containing a saccharide to immobilized biotissue.
이때, 상기 고정화된 생체 조직은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 폴리아크릴아마이드 등으로부터 고정화된 생체 조직일 수 있고, 바람직하게는 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정화된 생체 조직을 사용할 수 있다.At this time, the immobilized biotissue may be selected from the group consisting of paraformaldehyde, ethylene glycol diglycidyl ether, dipropylene glycol diglycidyl ether, 1,4-butanediol But may be a biotissue immobilized from a 1,4-butanediol diglycidyl ether, a glycerol polyglycidyl ether, a glutaraldehyde, a polyacrylamide or the like, Biotissues immobilized with paraformaldehyde can be used.
또한, 상기 생체 조직은 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 장(intestine) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological tissue may be, but is not limited to, a brain, a blood vessel, a liver, a lung, a kidney, a pancreas, an intestine, etc. .
나아가, 상기 당류는 단당류, 이당류, 다당류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 단당류는 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose) 또는 만노스(mannose)이고; 상기 이당류는 수크로오스(sucrose), 락토스(lactose), 말토스(maltose), 트레할로스(trehalose), 투라노스(turanose) 또는 셀로비오스(cellobiose)이고; 상기 다당류는 덱스트란(dextran), 디에틸아미노에틸-덱스트란(diethylamino ethyl-dextran), 덱스트린(dextrin), 셀룰로오스(cellulose) 또는 베타-글루칸(β-glucans)를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 당류로서 수크로오스를 사용할 수 있다. 또한, 상기 당류를 함유하는 용액은 당류를 함유하는 수용액인 것이 바람직하다.Furthermore, the saccharide may be a monosaccharide, a disaccharide, a polysaccharide and the like. More specifically, the monosaccharide may be fructose, galactose, glucose, or mannose; The disaccharide may be sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose or cellobiose; The polysaccharide may be selected from the group consisting of dextran, diethylaminoethyl-dextran, dextrin, cellulose, and beta-glucans. Preferably, sucrose can be used as the saccharide. It is also preferable that the solution containing the saccharide is an aqueous solution containing a saccharide.
상기 당류를 포함(함유)하는 용액의 당류 농도는 10 내지 70 w/v% 범위일 수 있고, 20 내지 60 w/v% 범위일 수 있고, 25 내지 50 w/v% 범위일 수 있고, 30 내지 40 w/v% 범위일 수 있다.The saccharide concentration of the solution containing (containing) the saccharide can range from 10 to 70 w / v%, can range from 20 to 60 w / v%, can range from 25 to 50 w / v% To 40 w / v%.
생체 조직에 상기 당류 용액을 처리하면 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분이 생체 조직으로부터 미리 제거되고, 탈수가 유도되어 결과적으로 조직을 고정화하는 시약과 생체조직 단백질과의 구조적 결합력이 증가하여 변성을 일으키지 않고, 조직을 더 단단하게 할 수 있으며, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어오름을 방지하고, 항체 처리과정, 세척 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있는 현저한 효과가 발생한다. 다만, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 10 w/v% 미만일 경우 상기 효과가 발생하지 않는 문제가 있고, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 70 w/v% 초과일 경우 경제적이지 못한 문제가 있다.When the saccharide solution is treated on the living tissue, the lipid component that blocks the transmission of light and other molecules is removed from the living tissue in advance, and the dehydration is induced, resulting in an increase in the structural binding force between the reagent for immobilizing the tissue and the biotissue protein, It is possible to make the tissue harder and to prevent the swelling of the tissue appearing in the tissue transparency process and to prevent the breakage of the tissue occurring in the antibody treatment process and the washing process. However, if the saccharide concentration of the saccharide-containing solution is less than 10 w / v%, the above effect is not generated. If the sugar concentration of the saccharide-containing solution exceeds 70 w / v% there is a problem.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 전처리된 생체 조직을 하기 화학식 1로 표시되는 CHAPS 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화제와 접촉시켜 투명화시키는 단계이다.In the method of vitrification of biotissue according to the present invention,
이때, 상기 생체 조직 투명화제는 상기 CHAPS 화합물 또는 이의 수화물을 2 내지 55 w/v%(중량/부피%)의 농도로 포함될 수 있으며, 4 내지 50 w/v% 농도가 바람직하다. 이때, 상기 농도를 나타내기 위한 용액으로는 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 증류수, PBS(phosphate buffer saline), TBS(tris buffer solution) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CHAPS 화합물의 농도가 2 w/v% 미만으로 포함되는 경우에는 생체 조직의 투명화 속도가 현저히 느려질 수 있고, 55 w/v% 초과로 포함되는 경우에는 CHAPS 화합물이 생체 조직 투명화제에 완전히 용해되지 않을 수 있다.At this time, the biotissue-clarifying agent may contain the CHAPS compound or its hydrate at a concentration of 2 to 55 w / v% (weight / volume%), and preferably a concentration of 4 to 50 w / v%. In this case, the solution for indicating the concentration may be a simulated body fluid used in a conventional field, and more specifically, a distilled water, a phosphate buffered saline (PBS), a tris buffer solution (TBS) But is not limited thereto. When the concentration of the CHAPS compound is less than 2 w / v%, the rate of transparency of the biotissue can be significantly slowed. When the concentration of the CHAPS compound is more than 55 w / v%, the CHAPS compound is not completely dissolved in the biotissue- .
또한, 상기 생체 조직 투명화제는 삼투압을 조절하여 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 역할을 하는 물질을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질은 우레아(urea)를 포함할 수 있다.In addition, the biological tissue clarifying agent may further include a substance that plays a role in rapidly promoting transparency of a living tissue by controlling osmotic pressure. At this time, the substance that promptly promotes transparency of the living tissue may include urea.
상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질은 상기 생체 조직 투명화제에 5 내지 80 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 5 내지 75 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 10 내지 70 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 5 내지 50 w/v% 농도로 포함될 수 있으며, 35 내지 60 w/v% 농도로 포함될 수 있다. 이때, 상기 농도가 5 w/v% 미만인 경우 조직의 투명화 속도가 느려지며 80 w/v% 초과인 경우 결정이 유발되거나 용액에 녹지 않을 수 있다.The material for rapidly promoting transparency of the living tissue may be contained in the biotissue-clarifying agent at a concentration of 5 to 80 w / v%, may be contained at a concentration of 5 to 75 w / v%, and may be contained at 10 to 70 w / v%, and may be included at a concentration of 5 to 50 w / v%, and may be included at a concentration of 35 to 60 w / v%. At this time, if the concentration is less than 5 w / v%, the transparency of the tissue is slowed down. If the concentration exceeds 80 w / v%, crystals may be induced or not dissolved in the solution.
하나의 구체적인 일례로, 만약 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질로 우레아(urea)를 사용할 경우, 상기 우레아는 10 내지 70 w/v%의 농도가 포함될 수 있으며, 20 내지 60 w/v% 농도가 보다 바람직하다. 또한, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질의 농도는 상기 CHAPS 화합물의 바람직한 농도 범위와 함께 적절히 조절할 수 있다.In one specific example, if urea is used as a substance that rapidly promotes transparency of the biotissue, the urea may include a concentration of 10 to 70 w / v%, and may be 20 to 60 w / v% The concentration is more preferable. In addition, the concentration of the substance that promptly promotes transparency of the biotissue can be appropriately adjusted together with the preferable concentration range of the CHAPS compound.
상기 생체 조직의 투명화 방법은 4℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 10℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 12 내지 48℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 14 내지 46℃ 범위에서 수행할 수 있고, 16 내지 44℃ 범위에서 수행할 수 있고, 18 내지 42℃ 범위에서 수행할 수 있고, 20 내지 40℃ 범위에서 수행할 수 있고, 24 내지 39℃ 범위에서 수행할 수 있고, 28℃ 내지 38℃에서 수행할 수 있고, 30℃ 내지 37℃에서 수행할 수 있고, 33 내지 34℃에서 수행할 수 있다.The vitrification process may be performed at a temperature range of 4 ° C to 50 ° C, may be performed at a temperature range of 10 ° C to 50 ° C, may be performed at a temperature range of 12 to 48 ° C, And may be carried out in the range of 16 to 44 캜, may be carried out in the range of 18 to 42 캜, may be carried out in the range of 20 to 40 캜, may be carried out in the range of 24 to 39 캜, 28 ° C to 38 ° C, 30 ° C to 37 ° C, and 33 ° C to 34 ° C.
또한, 본 발명은 상기 투명화된 생체 조직 내 중요 정보, 즉, DNA, RNA, 단백질, 형광신호 등의 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting important information in the vitrified tissue, that is, DNA, RNA, protein, fluorescent signal, and the like.
본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP 형광, 면역 염색을 통하여 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있다. 단백질의 경우 고정과정 동안 아미노산에 존재하는 아미노기끼리의 공유결합을 이루면서 서로 네트워크를 이루기 때문에, 매우 안정적인 반면, RNA나 DNA와 같은 핵산의 경우 아미노기가 존재하지 않기 때문에, 고정된 조직에서도 상대적으로 불안정하다. 특히, 전기영동 과정이 포함되는 경우, 핵산이 가진 전기적 성질에 의해 조직 내 위치가 바뀔 우려가 있다. 반면, 본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP(Green Fluorescent Protein) 세포 및 cholinergic neuron 마커 항체인 Choline Acetyltransferase 등에 대한 형광 염색이 우수하게 수행된다.The transparent biotissue according to the present invention can detect protein or mRNA by GFP fluorescence and immunostaining. Proteins are very stable because they form a covalent bond between the amino groups present in the amino acid during the immobilization process and are very stable, while nucleic acids such as RNA and DNA are relatively unstable in fixed tissues because amino groups are not present . In particular, when the electrophoresis process is included, there is a fear that the position of the tissue may be changed due to the electrical properties of the nucleic acid. On the other hand, the transparent biotissue according to the present invention is excellent in fluorescence staining for GFP (Green Fluorescent Protein) cells and Choline Acetyltransferase, which is a cholinergic neuron marker antibody.
본 발명에 따른 생체 조직 투명화 방법은 손상되지 않은 생체 조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체 조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 수백 마이크로미터 이상의 크기로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 뇌질환 등의 다양한 질환의 원인을 규명하는데 효과적으로 사용할 수 있다.The method of transparency of living body tissue according to the present invention can image and observe the three-dimensional distribution of cells and molecules of uncompromised living tissue. Therefore, it is possible to measure a living body tissue having a complicated structure in one complete structure with a size of several hundred micrometers or more Observational studies can be performed, so that useful information can be acquired within the organization to effectively identify the causes of various diseases such as brain diseases.
나아가, 본 발명은 당류 용액을 포함하는 생체 조직 투명화 전처리용 조성물을 제공하고, 이와 함께 CHAPS 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화제를 포함하는, 생체 조직 투명화용 키트를 제공한다.Further, the present invention provides a biotissue transparency kit comprising the saccharide solution and a biotissue-clarifying agent comprising the CHAPS compound or a hydrate thereof.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법은 투명화제를 생체 조직에 처리하기 이전에 생체 조직에 당류 용액을 처리하는 전처리 단계를 포함함에 따라,The pretreatment method of transparency of a living tissue according to the present invention and the method of transparency of a living tissue including the method of the present invention include a pretreatment step of treating a saccharide solution in a living body tissue before the vitreous tissue is treated with the clarifying agent,
빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분이 생체 조직으로부터 미리 제거되고, 탈수가 유도되어 결과적으로 조직을 고정화하는 시약과 생체조직 단백질과의 구조적 결합력이 증가하여 변성을 일으키지 않고, 조직을 더 단단하게 할 수 있으며, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어오름을 방지하고, 항체 처리과정, 세척 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있는 현저한 효과가 있다.The lipid component blocking the transmission of light and other molecules is removed from the living tissue in advance and the dehydration is induced, resulting in an increase in the structural bonding force between the reagent for immobilizing the tissue and the biotissue protein, resulting in no denaturation, And it has a remarkable effect of preventing the swelling of the tissue appearing in the process of tissue transparency and preventing the tissue from being broken in the course of antibody treatment and washing.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 전처리 단계를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 CHAPS 화합물을 포함하는 생체 조직 투명화제와 접촉시킴으로써, 생체 조직의 물리화학적 특성을 변형하여 투명하게 함으로써 보다 깊이 빛이 침투할 수 있도록 만들어 투명하게 하는 것이며, 이러한 효과는 후술하는 <실험예 1>과 <실험예 2>에서 입증하고 있다.More specifically, the method of transparency of a living tissue including a pretreatment step according to the present invention includes contacting the immobilized biological tissue with a biotissue-clarifying agent containing a CHAPS compound to transform the physiochemical characteristic of the biotissue to make it transparent And the light is made transparent so that the light penetrates deeply. Such effects are proved in Experimental Example 1 and Experimental Example 2 which will be described later.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples and experimental examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.
<< 실험예Experimental Example 1> 당류 전처리에 따른 생체 조직의 투명화 확인 1> Confirmation of transparency of biotissue by pretreatment of saccharides
당류 전처리 과정의 존재 여부에 따라 조직의 투명화 정도에 어떤 변화가 있는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 단, 본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 안전성평가연구소 동물 자원 대학위원회의 지침서(Approval No. RS17003)에 따라 수행하였다.The following experiment was conducted to evaluate the degree of transparency of the organization depending on the presence of the sugar pretreatment process. However, all animal testing procedures in this specification were performed in accordance with the Guide No. (Approval No. RS17003) of the Animal Resources College of the Safety Evaluation Institute.
먼저, 흡입 마취제인 Isoflurane (1cc/min) 을 사용하여 성인 생쥐(8주령)를 마취시키고, 경심 관류로 차가운 1X PBS에 50 mL을 관류시킨 후, 차가운 4% PFA (Paraformaldehyde)를 관류시켰다. 그 다음 기관을 적출하고 4%의 PFA용액(수용액)에 담근 후 4℃에서 24 h 동안 인큐베이션 하였다. 이때, 상기 차가운 온도 범위는 특별히 제한되는 것은 아니지만 0℃~10℃ 범위일 수 있다. (고정화 단계)First, adult mice (8 weeks old) were anesthetized with an inhalation anesthetic, Isoflurane (1 cc / min), perfused with 50 ml of cold 1 × PBS and perfused with cold 4% PFA (Paraformaldehyde). The organs were then removed and immersed in 4% PFA solution (aqueous solution) and incubated at 4 ° C for 24 h. At this time, the cold temperature range is not particularly limited, but may be in the range of 0 ° C to 10 ° C. (Immobilization step)
다음으로, 상기 샘플(기관)을 40% 수크로오스 용액에 0℃~10℃ 범위에서 24h 동안 인큐베이션 하였다. 이때, 상기 40% 수크로오스의 농도는 w/v%(중량/부피%)이며 수용액을 사용하였다. (전처리 단계)Next, the sample (organs) was incubated in a 40% sucrose solution at 0 ° C to 10 ° C for 24 hours. At this time, the concentration of the 40% sucrose was w / v% (weight / volume%) and an aqueous solution was used. (Preprocessing step)
대조군으로는 상기 전치리 단계를 수행하지 않고 상기 고정화 단계만 수행한 것으로 설정하였다.As the control group, it was set that the immobilization step was performed without performing the pre-treatment step.
도 1에 상기 고정화 단계와 전처리 단계를 모두 수행한 마우스의 뇌 이미지와, 상기 고정화 단계만 수행한 마우스의 뇌 이미지를 나타내었다. 도 1의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.FIG. 1 shows a brain image of the mouse in which both the immobilization step and the pretreatment step are performed, and the brain image of the mouse carried only by the immobilization step. 1 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
상기 샘플 조직을 투명화하기 위하여, 20% CHAPS w/v%, 50 w/v% Urea, 50 mM 소듐 아자이드(Sodium azide)의 혼합 수용액을 35℃에서 100 rpm으로 5h, 48h 동안 인큐베이션 하였다. (투명화 단계)To make the sample tissue transparent, a mixed aqueous solution of 20% CHAPS w / v%, 50 w / v% Urea, 50 mM sodium azide was incubated at 35 ° C and 100 rpm for 5 h for 48 hours. (Transparency step)
이때, 상기 CHAPS란 본 명세서 내 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물이다.Here, the CHAPS is a compound represented by the formula (1) or a hydrate thereof in the present specification.
도 2에 상기 고정화 단계, 전처리 단계, 5h 동안의 투명화 단계를 모두 수행한 마우스의 뇌와, 전처리 단계만 수행하지 않은 상기 대조군 뇌 이미지를 나타내었다. 도 2의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.FIG. 2 shows the mouse brain in which both the immobilization step, the pretreatment step, and the transparency step for 5 h were performed, and the control brain image in which the pretreatment step alone was not performed. 2 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
도 3에 상기 고정화 단계, 전처리 단계, 48h 동안의 투명화 단계를 모두 수행한 마우스의 뇌와, 전처리 단계만 수행하지 않은 상기 대조군 뇌 이미지를 나타내었다. 도 3의 아래 형광 이미지는 Ultraviolet(UV)를 통해 뇌에 있는 Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP (GAD 67-GFP) 형광의 밝기의 변화를 나타내는 이미지이다.FIG. 3 shows the mouse brain in which the immobilization step, the pretreatment step, and the transparency step for 48 h were all performed, and the control brain image in which the pretreatment step alone was not performed. 3 is an image showing the change in the brightness of Glutamic Acid Decarboxylase 67-GFP (GAD 67-GFP) fluorescence in the brain via Ultraviolet (UV).
도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 수크로오스로 전처리한 마우스 뇌는, 수크로오스로 전처리하지 않은 마우스 뇌보다 CHAPS와 Urea를 사용한 조직 투명화시 형광의 밝기를 유지함을 알 수 있다. 반면, 수크로오스로 전처리하지 않은 마우스의 뇌는 GFP의 형광이 감소하는 것을 알 수 있다. GFP 형광의 감소는 단백질 구조의 손상을 의미한다. 수크로오스 전 처리는 단백질 구조를 유지를 위해서 중요한 단계임을 의미한다.As shown in FIG. 2 and FIG. 3, the mouse brain pretreated with sucrose maintains the brightness of fluorescence upon transparency of tissues using CHAPS and Urea rather than mouse brain not pretreated with sucrose. On the other hand, the brain of mice not pretreated with sucrose showed a decrease in fluorescence of GFP. Reduction of GFP fluorescence implies damage to the protein structure. This means that sucrose pretreatment is an important step in maintaining the protein structure.
이로부터, 본 발명에 따른 당류를 전처리하는 단계를 포함하는 생체 조직 투명화 방법은, 당류를 전처리하는 단계를 포함하지 않는 생체 조직 투명화 방법에 비해 단백질 구조를 유지하는데 현저한 효과가 있음을 알 수 있다.From this, it can be seen that the biotissue transparency method including the step of pre-treating the saccharide according to the present invention has a remarkable effect for maintaining the protein structure as compared with the biotissue transparency method not including the step of pretreating the saccharide.
<< 실험예Experimental Example 2> 세척과정 후 생체 조직의 투명화 확인 2> Confirmation of transparency of living tissue after washing process
상기 <실험예 1>에서 투명화한 조직을 세척한 후 다시 투명화시킬 경우, 당류 전처리 과정의 존재 여부에 따라 조직의 투명화 정도에 어떤 변화가 있는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was conducted to evaluate the degree of transparency of the tissue depending on the presence or absence of the saccharide pretreatment process when the transparentized tissue was washed and then clarified again in the <Experimental Example 1>.
상기 <실험예 1>에서 투명화가 진행된 조직을 50ml의 멸균 증류수로 0℃~10℃ 범위에서 20 rpm으로 24 h 동안 3회 교체하며 인큐베이션 하였다. (도 4 참조)In the <Experimental Example 1>, the vitrified tissue was incubated with 50 ml of sterilized distilled water in the range of 0 ° C. to 10 ° C. at 20 rpm for 24 h for 3 times. (See Fig. 4)
그 후, 다시 20% CHAPS w/v%, 50 w/v% Urea, 50 mM 소듐 아자이드(Sodium azide)의 혼합 수용액을 35℃에서 100 rpm으로 24h 동안 인큐베이션 하였다. (도 5 참조)Thereafter, a mixed aqueous solution of 20% CHAPS w / v%, 50 w / v% Urea, and 50 mM sodium azide was further incubated at 35 ° C and 100 rpm for 24 hours. (See Fig. 5)
도 5에 나타난 바와 같이, 세척 과정 후 조직을 다시 투명화 용액에 다시 넣었을 때 조직의 투명도가 현저히 좋아지는 것을 알 수 있다. 세척 과정 또한 조직의 투명화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 더 나아가 수크로오스로 전처리한 마우스 뇌는, 세척 과정을 거친 후, 다시 조직 투명화를 하여도 형광의 밝기를 유지함을 알 수 있다. 반면, 수크로오스로 전처리하지 않은 마우스의 뇌는 GFP의 형광이 여전히 감소되어 있다. GFP 형광의 감소는 단백질 구조의 손상을 의미한다. 수크로오스 전 처리는 단백질 구조를 유지를 위해서 중요한 단계임을 의미한다.As shown in FIG. 5, it can be seen that the transparency of the tissue is remarkably improved when the tissue is put back into the vitrifying solution again after the washing process. The cleaning process also played an important role in the transparency of the organization. Furthermore, it can be seen that mouse brain pretreated with sucrose maintains the brightness of fluorescence even after tissue cleansing after washing. On the other hand, the brain of mice not pretreated with sucrose still has a reduced fluorescence of GFP. Reduction of GFP fluorescence implies damage to the protein structure. This means that sucrose pretreatment is an important step in maintaining the protein structure.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 40% 수크로오스(Sucrose)의 전처리 과정은 생체 조직 투명화 조성물로 유발될 수 있는 단백질 및 조직의 손상으로부터 보호 효과가 우수하여 투명화된 조직에서 형광을 유지시킬 수 있는 현저한 효과가 있음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the pretreatment of 40% sucrose according to the present invention has a remarkable effect of maintaining fluorescence in a transparent tissue because of its excellent protective effect against damages of proteins and tissues which can be induced by a vitreous tissue transparent composition .
Claims (13)
상기 단계 1에서 전처리된 생체 조직을 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물과, 우레아(urea)를 포함하는 생체 조직 투명화제와 접촉시켜 투명화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법:
[화학식 1]
A pretreatment step (step 1) of treating the immobilized biotissue with a solution containing saccharides; And
(Step 2) of bringing the biotissue pretreated in step 1 into contact with a compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof and a biotissue-clarifying agent containing urea to make the biotissue transparent (step 2) Way:
[Chemical Formula 1]
상기 고정화된 생체 조직은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 및 폴리아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 고정화된 생체 조직인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
The immobilized biotissue may be selected from the group consisting of paraformaldehyde, ethylene glycol diglycidyl ether, dipropylene glycol diglycidyl ether, 1,4-butanediol diglycidyl ether, Which is immobilized from at least one member selected from the group consisting of 1,4-butanediol diglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, glutaraldehyde and polyacrylamide. Wherein the biocompatibility of the living body tissue is improved.
상기 생체 조직은 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas) 또는 장(intestine)인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the biological tissue is a brain, a blood vessel, a liver, a lung, a kidney, a pancreas, or an intestine.
상기 당류는 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the saccharide is at least one selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides and polysaccharides.
상기 단당류는 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose) 또는 만노스(mannose)이고;
상기 이당류는 수크로오스(sucrose), 락토스(lactose), 말토스(maltose), 트레할로스(trehalose), 투라노스(turanose) 또는 셀로비오스(cellobiose)이고; 및
상기 다당류는 덱스트란(dextran), 디에틸아미노에틸-덱스트란(diethylamino ethyl-dextran), 덱스트린(dextrin), 셀룰로오스(cellulose) 또는 베타-글루칸(β-glucans)인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
5. The method of claim 4,
The monosaccharide is fructose, galactose, glucose or mannose;
The disaccharide may be sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose or cellobiose; And
Wherein the polysaccharide is dextran, diethylamino ethyl-dextran, dextrin, cellulose, or beta-glucans. Way.
상기 당류를 함유하는 용액은 당류를 함유하는 수용액인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the solution containing the saccharide is an aqueous solution containing a saccharide.
상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도는 10 내지 70 w/v% 인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the saccharide concentration of the saccharide-containing solution is 10 to 70 w / v%.
상기 생체 조직의 투명화 방법은 4℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the method of vitrification of the living tissue is carried out at a temperature range of 4 ° C to 50 ° C.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물과, 우레아(urea)를 포함하는 생체 조직 투명화제;를 포함하는, 생체 조직 투명화용 키트:
[화학식 1]
A biotissue clarifying agent comprising a compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof and a biotissue-clarifying agent comprising urea:
[Chemical Formula 1]
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