KR101841646B1 - Method for the preparation of AIMP2-DX2 as a target for anti-cancer drug discovery - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 변이체의 제조방법 및 AIMP2-DX2 변이체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 인간 서열의 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 대장균에서 대량 발현할 수 있도록 벡터를 디자인하였고, 다양한 조건의 탐색을 거쳐 고효율로 정제할 수 있는 방법을 확립하였다. 그 결과, 본 발명에서 사용된 발현 정제 방법을 활용하여, 리터당 10mg 이상의 순수한 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 생산할 수 있었는바, 이러한 기술은 단백질 구조 연구, 상호 작용 연구, 및 인 비트로 어세이 등에 폭넓게 활용될 수 있다. The present invention relates to a process for producing a recombinant AIMP2-DX2 protein or a variant thereof and to an AIMP2-DX2 variant. According to the present invention, a vector was designed to express AIMP2-DX2 of human sequence or its variant in E. coli in large quantities, and a method of highly purified purification through various conditions was established. As a result, it was possible to produce pure AIMP2-DX2 or its variants of 10 mg or more per liter by utilizing the expression purification method used in the present invention. This technique is widely used for protein structure studies, interaction studies, and in vitro assays .

Description

암 억제 표적 단백질인 ＡＩＭＰ－ＤＸ2의 제조방법 {Method for the preparation of AIMP2-DX2 as a target for anti-cancer drug discovery}AIMP-DX2 as a target for anti-cancer drug discovery AIMP-

본 발명은 재조합 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 변이체의 제조방법 및 AIMP2-DX2 변이체에 관한 것이다.The present invention relates to a process for producing a recombinant AIMP2-DX2 protein or a variant thereof and to an AIMP2-DX2 variant.

AIMP2를 코딩하는 유전자는 7번 염색체에 위치하는데 네 개의 엑손으로 구성되어 있다. AIMP2는 어떤 세포로 분화되는지에 대한 세포 운명을 조절하는데 중심적인 역할을 하는데, TGF-β 신호의 성장억제 신호를 강화시킴으로써 항 증식 활성을 보여준다. 그리고 AIMP2는 DNA 손상에 반응한 MDM2에 의해 분해되는 과정으로부터 p53을 보호해줌으로써 활성화를 유도해 아포토시스 (apoptosis)를 촉진하고, 유비퀴틴에 의해 유도되는 TRAF2의 분해를 통하여 TNF-α의 세포사멸 신호가 유도됨으로써 세포사를 촉진시킨다. 이러한 AIMP2가 결핍된 쥐에서는 폐 상피세포의 급격한 증식으로 인해 폐의 형성이 제대로 이루어지지 않아 신생아에게 치명적이라고 하며, 이형 접합적 AIMP2를 가지는 쥐는 AIMP2의 발현양이 적을 뿐만 아니라 종양형성에 대해 보다 높은 민감성을 보였다. 이러한 결과들을 바탕으로, AIMP2는 특별한 작동기전을 가지고 있는 반가불충분성 종양 억제자로 분류되고 있다 (Choi, J. W. 등 2011 PLoS Genet 7(3):e1001351).The gene encoding AIMP2 is located on chromosome 7 and consists of four exons. AIMP2 plays a central role in regulating cell fate in differentiating into certain cells, showing anti-proliferative activity by enhancing the signal of TGF-β signaling growth. In addition, AIMP2 protects p53 from degradation by MDM2 in response to DNA damage, induces apoptosis by inducing activation, and induces apoptosis of TNF-α through the degradation of ubiquitin-induced TRAF2 Thereby promoting cell death. In mice lacking AIMP2, the lungs were not formed properly due to the rapid proliferation of lung epithelial cells, and thus they were said to be fatal to newborns. Rats with heterozygous AIMP2 not only had less expression of AIMP2, And showed sensitivity. Based on these results, AIMP2 has been classified as a semi-insufficient tumor suppressor with a specific mechanism of action (Choi, J. W. et al. 2011 PLoS Genet 7 (3): e1001351).

AIMP2-DX2는 AIMP2의 아미노산 중 69개를 코딩하는 엑손 2가 스플라이싱된 단백질이다. EST database에서 검색한 결과, 자궁경부암 (BI259092)과 횡문근육종 (BI115365)에서 발현됨이 보고된 바 있었으며, 특히, AIMP2-DX2의 발현은 폐암 세포에서 특이적으로 많이 증가됨이 보고되었다. 이러한 AIMP2의 이형체는 p53에 경쟁적으로 결합해 종양의 형성을 유도하는 것처럼 보여지고, 이러한 이유로 보통 AIMP2의 전세포사멸 (proapoptotic) 활성을 방해한다. AIMP2-DX2의 발현 비율은 폐암의 진행에 따라 증가되고 환자의 생존과 반비례한다. 두드러지는 점은 발암성의 AIMP2-DX2의 발현이 억제되면 폐암 이종이식 쥐 모델의 종양 성장이 감소되는 것이 관찰되었다는 것이다. 암 형성과의 연관성을 확인하기 위해 AIMP2와 AIMP2-DX2를 정상 폐세포와 폐암세포에서 확인하는 실험이 진행되었으며, 그 결과 폐암세포에서만 AIMP2-DX2가 발견되었다. 그리고 AIMP2-DX2가 사람의 암조직에서도 발견되는지 확인하기 위한 실험도 진행되었는데 정상조직과 비교해 많은 암환자의 임상조직에서 AIMP2-DX2의 발현이 증가됨이 확인되었다 (Choi, J. W. 등 2011 PLoS Genet 7(3):e1001351).AIMP2-DX2 is an exon 2 spliced protein encoding 69 of the amino acids of AIMP2. The expression of AIMP2-DX2 was found to be significantly increased in lung cancer cells, especially in cervical cancer (BI259092) and rhabdomyosarcoma (BI115365). Such a variant of AIMP2 appears to competitively bind to p53 and induce tumor formation, which usually hinders proapoptotic activity of AIMP2. The expression ratio of AIMP2-DX2 increases with progression of lung cancer and is inversely proportional to patient survival. Remarkably, inhibition of the expression of AIMP2-DX2 in carcinogenesis has been observed to reduce tumor growth in lung cancer xenograft models. To confirm the association with cancer formation, AIMP2 and AIMP2-DX2 were examined in normal lung and lung cancer cells. As a result, only AIMP2-DX2 was found in lung cancer cells. In addition, AIMP2-DX2 was found to be found in human cancer tissues, and the expression of AIMP2-DX2 was increased in clinical tissues of many cancer patients compared with normal tissues (Choi, JW et al 2011 PLoS Genet 7 3): e1001351).

AIMP2-DX2는 320개의 아미노산으로 이루어진 AIMP2에서 엑손2 부분이 스플라이싱되어 251개의 아미노산으로 이루어진 단백질로, 앞선 여러 연구결과에서 확인할 수 있듯이 암세포 형성에 관여하는 단백질이다. AIMP2-DX2는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)검색을 통해 확인해 본 결과, 사람, 쥐 (mouse, rat), 소, 제브라피시, 서양 발톱 개구리, 침팬지 등에서 유사 시퀀스가 발견되었다. 앞서 언급한 쥐를 통한 실험과 사람의 임상샘플을 통해 확인한 결과들은 AIMP2-DX2가 존재하면, 특히, 폐조직에서 종양형성이 유도되고 MDM2으로부터 p53을 보호해주지 못하게 되어 아포토시스가 일어나지 못하게 될 것이라는 것을 알 수 있다. 그러므로 AIMP2-DX2는 항암치료제를 개발하는데 있어 중요한 표적이 될 것으로 여겨지고 있다 (Won, Y. S. 등 2012 J Biotechnol 158(1-2):44-9).AIMP2-DX2 is a protein consisting of 251 amino acids spliced with two exons in AIMP2 consisting of 320 amino acids. It is a protein involved in cancer cell formation as shown in various previous research results. AIMP2-DX2 was found through BLAST search and found similar sequences in humans, mice, rats, cattle, zebrafish, Western claw frogs and chimpanzees. The results of the above-mentioned rat experiments and human clinical samples confirmed that the presence of AIMP2-DX2 would lead to tumor formation in lung tissue and apoptosis would not occur due to the inability to protect p53 from MDM2 . Therefore, AIMP2-DX2 is considered to be an important target in the development of anticancer drugs (Won, Y. S. et al. 2012 J Biotechnol 158 (1-2): 44-9).

일반적으로 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)은 유전자의 조절과 변화에 영향을 미친다. 비록 이런 과정이 유전자 조절에 관해 유연성을 제공할 수 있지만, 스플라이싱 변종들 간의 균형을 붕괴시킬 수 있고 특이적인 선택적 스플라이싱 변종들은 병리학적 장애를 일으킬 수 있다. 이런 유사한 특성을 보이는 AIMP2-DX2는 인간의 질병과 관련이 있으며, 특히, 암유전자 (oncogene)으로서 기능을 하는데 이런 작용 기전을 연구함으로써 진단 및 치료에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있다. 그러므로 AIMP2-DX2를 항암 관련 약물 표적으로 선택하고 이를 억제할 수 있는 물질을 발명하는 연구를 기반으로 새로운 항암제를 개발하는 것이 절실한 상황이다.In general, alternative splicing affects gene regulation and regulation. Although this process can provide flexibility in gene regulation, it can disrupt the balance between splicing variants and specific selective splicing variants can cause pathological disturbances. AIMP2-DX2, which has these similar characteristics, is associated with human disease, and in particular, functions as an oncogene. By studying this mechanism of action, it can provide important clues to diagnosis and treatment. Therefore, it is urgent to develop a new anticancer drug based on the research that invented AIMP2-DX2 as a target of anti-cancer drug and invented a substance that can inhibit it.

새로운 항암제의 개발을 위해서는 천연물 유래의 항암 후보물질을 스크리닝하는 기존의 방법에서 벗어나 새로운 항암제 표적 단백질의 발굴과 함께 이에 관한 구조와 반응 기전을 규명하는 체계적이고 논리적인 방법이 필요한 상황이다. 신약 후보물질을 설계하기 위해서는 단백질의 3차 구조를 결정하는 것이 필수적이며 나아가서는 이 단백질의 작용 기전을 밝히는 것이 필요하다. 이를 위해서는 좋은 물성을 가지는 단백질을 선택하고 적절한 조건을 찾아 안정한 단백질을 생산하는 것이 필요하다. In order to develop a new anticancer agent, a systematic and logical method is needed to identify new anticancer agent target proteins and identify their structure and mechanism of reaction. In order to design a candidate substance for a new drug, it is essential to determine the tertiary structure of the protein, and further, it is necessary to identify the mechanism of action of the protein. To do this, it is necessary to select a protein having good physical properties and to produce a stable protein by searching for appropriate conditions.

종래 AIMP2-DX2의 생산 기술은 AIMP2-DX2 단백질을 동물 세포에서 미량 발현된 상태로 사용하거나, in vitro translation을 통하여 미량 발현된 단백질을 불순물을 가진 상태로 사용해 왔다. 그러나 이러한 종래 기술로는 AIMP2-DX2 단백질을 순수하게 대량 정제하여 3차원 구조 연구나 SPR 등 in vitro assay에 활용할 수 없는 문제점이 있는바, 순수한 AIMP2-DX2 단백질 및 동일한 생물학적 기능을 가지는 변이체를 대량 생산할 수 있는 기술에 대한 개발이 절실한 실정이다. Conventionally, AIMP2-DX2 production technology has used AIMP2-DX2 protein in a very small amount expressed in animal cells or in vitro translation to use a very small amount of protein as an impurity. However, such conventional techniques have a problem that pure AIMP2-DX2 protein can not be purified in large scale and can not be utilized for in vitro assays such as 3-dimensional structure studies and SPR, and thus mass production of pure AIMP2-DX2 protein and mutants having the same biological function The development of technologies that can be used in the future is urgent.

이에, 본 발명자들은 AIMP2-DX2 단백질을 활용한 신약 발굴 연구 및 3차원 구조 규명에 활용하기 위한 발현, 정제 방법을 도출하였으며, AIMP2-DX2의 3차 구조 및 기능에 영향을 미치지 않는 범위에서 단백질의 N 말단 부위가 제거되거나 일부 서열이 치환된 AIMP2-DX2 변이체를 제조하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.Thus, the inventors of the present invention derived expression and purification methods for use in AIMP2-DX2 protein digestion studies and three-dimensional structure identification, and found that the expression of AIMP2-DX2 in a range that does not affect the tertiary structure and function of AIMP2- The AIMP2-DX2 mutant in which the N-terminal region is deleted or a part of the sequence is substituted is prepared, and the present invention is completed based on this.

본 발명은 기존에 알려져 있는 암 억제단백질인 Aminoacyl tRNA synthase complex-Interacting Multifunctional Protein 2 (AIMP2)의 엑손2 (exon2)가 스플라이싱 (splicing)된 암 억제 표적 단백질인 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 대장균에서 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 X-ray 및 NMR을 사용해 AIMP2-DX2의 3차 구조를 결정하고자 할 때, 또는 AIMP2-DX2를 활용한 약물발굴 연구를 할 때, 이를 대장균에서 발현시켜 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 고효율로 생산하기 위한 방법을 제공한다.The present invention relates to a cancer suppressing target protein AIMP2-DX2 or a mutant thereof, which is a spliced spliced exon 2 of Aminoacyl tRNA synthase complex-Interacting Multifunctional Protein 2 (AIMP2), which is a known cancer suppressor protein, More specifically, when a tertiary structure of AIMP2-DX2 is to be determined using X-ray and NMR, or when a drug discovery study using AIMP2-DX2 is conducted, it is expressed in E. coli To provide a method for efficiently producing AIMP2-DX2 or its variants.

또한, 본 발명은, AIMP2-DX2의 구조 및 기능과 유사한 AIMP2-DX2 변이체를 제공한다. The present invention also provides AIMP2-DX2 variants similar in structure and function to AIMP2-DX2.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, In order to accomplish the object of the present invention as described above,

(a) AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제1 완충용액에 현탁한 후, 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;(a) suspending E. coli transformed with an expression vector comprising a polynucleotide encoding AIMP2-DX2 or a variant thereof in a first buffer solution, followed by disruption and centrifugation to obtain a supernatant;

(b) 상기 수득한 상층액으로부터 제1 완충용액 및 크로마토그래피를 이용하여 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 정제하는 단계; 및(b) purifying AIMP2-DX2 or its variants from the obtained supernatant using a first buffer solution and chromatography; And

(c) 상기 정제된 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 pH 6.내지 pH 6.8의 비스-트리스 (Bis-Tris)가 함유된 제2 완충용액에 용해하여 투석하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2 또는 이의 변이체의 제조방법을 제공한다. (c) dissolving the purified AIMP2-DX2 or a variant thereof in a second buffer solution containing Bis-Tris at a pH of 6 to a pH of 6.8, and dialyzing the purified AIMP2-DX2 or a variant thereof Thereby producing a mutant.

본 발명에서 사용되는 용어, "AIMP2-DX2"는 320개의 아미노산으로 이루어진 AIMP2에서 엑손2 부분이 스플라이싱되어 251개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 앞선 여러 연구결과에서 확인할 수 있듯이 암세포 형성에 관여하는 단백질이며, 항암 치료제를 개발하는데 있어 중요한 표적이 될 것으로 여겨지고 있다. 이러한 생물학적 중요성에도 불구하고, 종래 AIMP2-DX2의 생산 기술은 AIMP2-DX2 단백질을 동물 세포에서 미량 발현된 상태로 사용하거나, in vitro translation을 통하여 미량 발현된 단백질을 불순물을 가진 상태로 사용하였으며, 이러한 종래 기술로는 AIMP2-DX2 단백질을 순수하게 대량 정제하여 3차원 구조 연구나 SPR 등 in vitro assay에 활용할 수 없는 문제점을 지니고 있다. 이러한 종래의 문제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 단계를 포함하는, 재조합 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 변이체의 제조방법을 제공한다. As used herein, the term "AIMP2-DX2" refers to a protein consisting of 251 amino acids, spliced with two exons in AIMP2 consisting of 320 amino acids. As can be seen from previous studies, , Which is considered to be an important target in the development of anticancer drugs. In spite of this biological importance, the production technique of AIMP2-DX2 has used AIMP2-DX2 protein in a very small amount expressed in animal cells or in vitro translation to use a very small amount of protein as an impurity. In the prior art, AIMP2-DX2 protein has a problem that it can not be utilized for in vitro assays such as 3-dimensional structure studies and SPR by purely mass purification. In order to solve these conventional problems, the present invention provides a method for producing a recombinant AIMP2-DX2 protein or a variant thereof, comprising the steps described above.

이하에서는, 본 발명에 따른 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체의 제조방법의 각각 단계에 대하여 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, each step of the method for producing AIMP2-DX2 or a mutant thereof according to the present invention will be described in detail.

단계 (a)에서는 상기 형질전환된 대장균을 제1 완충용액에 현탁한 후, 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득한다. In step (a), the transformed Escherichia coli is suspended in a first buffer solution, followed by disruption and centrifugation to obtain a supernatant.

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환"은 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA 사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명의 목적상 형질전환은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 대장균 내에 삽입되어 AIMP2-DX2, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 대장균 내에 삽입되어 AIMP2-DX2 변이체가 발현되는 것을 의미한다.As used herein, the term "transformation" refers to a process in which a DNA strand or plasmid having a heterologous gene of a different kind from that of the original cell is transfected into cells and binds to DNA originally present in the cell, It is a molecular biologic technique that changes traits. For the purpose of the present invention, the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 is inserted into E. coli and a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of AIMP2-DX2, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 is inserted into E. coli to transform AIMP2- ≪ / RTI >

또한, 상기 제1 완충 용액으로 현탁하기 전, 형질전환된 대장균의 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체 발현을 위하여 적절한 조건에서 배양될 수 있다. 구체적으로, 형질전환체의 배양은 목적 단백질인 상기 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건 하에서 수행되며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환체는 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, LB 배지(Luria-Bertani Broth)를 사용할 수 있다. 형질전환체의 배양은 통상의 미생물 배양 조건상에서 가능하며, 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 (centrifugation) 또는 여과 (filtration) 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 과정은 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동 (frozen)하거나 냉동건조 (lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.In addition, it may be cultured under appropriate conditions for the expression of AIMP2-DX2 or its variants of the transformed E. coli before suspension in the first buffer solution. Specifically, the cultivation of the transformant is carried out under suitable conditions which allow the expression of the fusion protein as the target protein, and these conditions can be performed according to methods well known to those skilled in the art. The transformant can be cultured in a large amount by a conventional culture method. As the culture medium, a medium composed of carbon source, nitrogen source, vitamins and minerals can be used. For example, Luria-Bertani Broth can be used. The cultivation of the transformant can be carried out under conventional microorganism culture conditions, for example, at a temperature ranging from 15 ° C to 45 ° C for 10 to 40 hours. Centrifugation or filtration can be carried out to remove only the culture medium in the culture medium and to recover only the concentrated cells, and this process can be carried out as required by a person skilled in the art. The concentrated cells can be frozen or lyophilized according to a conventional method so as not to lose their activity.

상기 형질전환체를 배양하는 단계는 형질전환체의 종류에 따라 알맞은 생육 온도를 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 형질전환체가 대장균 (E.coli)인 경우, 바람직하게 생육 온도 조건은 35℃ 내지 40℃일 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the step of culturing the transformant, a suitable growth temperature may be selected by a person skilled in the art depending on the type of the transformant. For example, when the transformant is E. coli, the growth temperature condition may preferably be 35 ° C to 40 ° C, and most preferably 37 ° C, but is not limited thereto.

한 구체예로서, 호모사피엔스로부터 분리한 DNA를 주형으로 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하는, 서열번호 9의 염기서열을 가지는 AIMP-DX2를 증폭하는 단계; 상기 증폭된 AIMP-DX2 DNA를 제한 효소 (BamHI, XhoI)로 처리한 후, PET28a 벡터에 도입하여 플라스미드 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2를 제조하는 단계; 상기 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2로 대장균을 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 대장균을 0.5 내지 2mM의 IPTG가 포함된 배지에서 배양하는 단계 등으로 실시될 수 있으나 (실시예 1 내지 3 참조), 이에 제한되는 것은 아니다.As a specific example, AIMP-DX2 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 was subjected to polymerase chain reaction using a DNA fragment isolated from Homo sapiens as a template and a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: Amplifying; Treating the amplified AIMP-DX2 DNA with a restriction enzyme (BamHI, XhoI) and then introducing the amplified AIMP-DX2 DNA into a PET28a vector to prepare a plasmid pET28a_SUMO-AIMP2-DX2; Transforming E. coli with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2; And culturing the transformed Escherichia coli in a medium containing 0.5 to 2 mM IPTG (see Examples 1 to 3), but the present invention is not limited thereto.

단계 (b)에서는 상기 수득한 상층액으로부터 제1 완충용액 및 크로마토그래피를 이용하여 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 정제한다. In step (b), AIMP2-DX2 or its variants are purified from the supernatant obtained using the first buffer solution and chromatography.

상기 상층액에 존재하는 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 정제할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Ni-NTA (Nikel-nitrilotriacetic acid) 친화크로마토그래피 및 겔투과 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 정제할 수 있으며 (실시예 4 참조), 상기 제1 완충용액은 pH 7.0 내지 pH 7.8의 Tris-HCl을 함유할 수 있으며, 보다 구체적으로 Tris-HCl, NaCl, PMSF, 및 DTT로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.AIMP2-DX2 or its variants present in the supernatant may be purified in a conventional manner, for example, by salting out (e.g., ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (using acetone, Protein fraction precipitation), column chromatography such as dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, ultrafiltration and the like can be applied alone or in combination, and most preferably, Ni-NTA (Nickel- nitrilotriacetic acid) affinity chromatography and gel permeation chromatography (see Example 4), and the first buffer solution may contain Tris-HCl at pH 7.0 to pH 7.8, and more specifically, But are not limited to, Tris-HCl, NaCl, PMSF, and DTT.

단계 (c)에서는 상기 정제된 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 pH 6.0 내지 pH 6.8의 비스-트리스 (Bis-Tris)가 함유된 제2 완충용액에 용해하여 투석한다.In step (c), the purified AIMP2-DX2 or its mutant is dialyzed by dissolving in a second buffer solution containing Bis-Tris at pH 6.0 to pH 6.8.

상기 단계에서 이용된 투석막으로는 바람직하게 투과 분자량 10,000Da의 반투막을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 버퍼에 비해 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 이용한 경우, 상층액의 AIMP2-DX2 단백질 용해도가 증가되었으며, 동결 후, 이를 해동시키거나, 상온 (약 20℃)에 방치시킨 경우에도 단백질의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었는바, 상기 단계를 통해 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체에 대한 정제 효율 및 동결 보관 후 이용 과정에서 단백질의 안정성을 현저하게 증가시킬 수 있다 (실시예 6 참조).As the dialysis membrane used in the above step, a semipermeable membrane having a permeation molecular weight of 10,000 Da is preferably used, but the present invention is not limited thereto. According to one embodiment of the present invention, when 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer was used in comparison with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer, the solubility of AIMP2-DX2 protein in the supernatant was increased, And the stability of the protein was maintained even at room temperature (about 20 ° C). As a result, the purification efficiency of AIMP2-DX2 or its mutants and the stability of protein in the process of use after cryopreservation (See Example 6).

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 AIMP2-DX2 변이체, 상기 변이체를 코딩하며 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a polynucleotide comprising an AIMP2-DX2 mutant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 do.

본 발명에서 사용되는 용어, "AIMP2-DX2 변이체"는 AIMP2-DX2 단백질과 구조 및 기능이 유지되는 범위 내에서 변형된 단백질로서, 암 억제 표적 단백질인 AIMP2-DX2에 대한 3차원 구조 규명, 약물 작용 기전, 및 신약 발굴 등의 연구에 활용될 수 있다 (실시예 5 참조). 상기 AIMP2-DX2 변이체는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 포함하며, 바람직하게 AIMP2-DX2에서, N 말단의 50개 아미노산이 절단 (결실)된 AIMP2-DX2 (51-251), 및 상기 AIMP2-DX2 (51-251) 단백질 136번 및 222번 시스테인 (Cysteine) 잔기가 세린 (Serine)으로 치환된 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S일 수 있으며, 상기 AIMP2-DX2 (51-251)는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. As used herein, the term "AIMP2-DX2 mutant" is a protein modified within the extent that the structure and function of the AIMP2-DX2 protein are retained. The term " AIMP2-DX2 variant " (See Example 5), and the like. The AIMP2-DX2 variant comprises a deletion, insertion and / or substitution of a polynucleotide or amino acid sequence, and preferably AIMP2-DX2 (51-251) wherein 50 amino acids at the N-terminus are deleted (deleted) in AIMP2- And AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S in which the cysteine residues 136 and 222 of the AIMP2-DX2 (51-251) protein are substituted with serine, and the AIMP2-DX2 51 -251) may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11, and the AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Or a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.

또한, 본 발명의 AIMP2-DX2 변이체는 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열과 각각 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 또는 염기서열을 포함할 수도 있다.In addition, the AIMP2-DX2 variant of the present invention preferably has 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 80% or more, more preferably 90% or more, May comprise an amino acid or base sequence having 95% or more sequence homology.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 (재조합 벡터)를 제공한다.Further, as another embodiment of the present invention, an expression vector (recombinant vector) comprising the polynucleotide is provided.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"는 적당한 숙주세포에서 목전 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.As used herein, the term "recombinant vector" refers to a gene construct containing an essential regulatory element operatively linked to the expression of a gene or a target RNA in a suitable host cell.

본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA to perform a common function. For example, a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA can affect the expression of a nucleic acid sequence that is operably linked. Operational linkage with a recombinant vector can be made using recombinant techniques well known in the art and operative linkage with a recombinant vector can be made using recombinant techniques well known in the art, For site-specific DNA cleavage and linkage, enzymes generally known in the art are used.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 대장균용 발현벡터인 PET28a_SUMO를 사용하여 도 4에 나타낸 바와 같이 제조된 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251), pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S)일 수 있으나, AIMP2-DX2 변이체를 코딩하며, 이를 숙주세포에 발현시킬 수 있는 재조합 벡터라면, 제한없이 포함될 수 있다.The vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector. Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, initiation codon, termination codon, polyadenylation signal and enhancer, and can be prepared variously according to the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. Further, the expression vector includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and includes a replication origin in the case of a replicable expression vector. The recombinant vector according to the present invention may be pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251), pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S) prepared as shown in FIG. 4 using PET28a_SUMO, an expression vector for Escherichia coli , A recombinant vector that encodes an AIMP2-DX2 variant and is capable of expressing it in a host cell, can be included without limitation.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.In still another embodiment of the present invention, there is provided a transformant transformed with the expression vector.

본 발명의 형질전환체는 바람직하게 E.coli(대장균, Escherichia coli)일 수 있으며, 상기 본 발명의 E.coli로는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어, BL21(DE), Rosetta2(DE3)pLysS, BL21-codonPlus(DE3)-RIPL, C43(DE3) 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게 BL21 (DE)일 수 있다.The transformant of the present invention is preferably transformed into E. coli (Escherichia coli, Escherichia coli) may be, but are not limited to E.coli roneun of the present invention, for example, BL21 (DE), Rosetta2 ( DE3) pLysS, BL21-codonPlus (DE3) -RIPL, C43 (DE3) and so on are used And may preferably be BL21 (DE).

본 발명에 따르면, 인간 서열의 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 대장균에서 대량 발현할 수 있도록 벡터를 디자인하였고, 다양한 조건의 탐색을 거쳐 고효율로 정제할 수 있는 방법을 확립하였다. According to the present invention, a vector was designed to express AIMP2-DX2 of human sequence or its variant in E. coli in large quantities, and a method of highly purified purification through various conditions was established.

그 결과, 본 발명에서 사용된 발현 정제 방법을 활용하여, 리터당 10mg 이상의 순수한 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 생산할 수 있고, 10mg/mL 농도 및 상온에서 144시간 이상 안정한 단백질 용액을 유지할 수 있음을 확인할 수 있었는바, 이러한 기술은 단백질 구조 연구, 상호 작용 연구, 및 인 비트로 어세이 등에 폭넓게 활용될 수 있다. As a result, it was confirmed that it is possible to produce pure AIMP2-DX2 or its variant of 10 mg or more per liter by using the expression purification method used in the present invention, and to maintain a stable protein solution at a concentration of 10 mg / mL and at room temperature for 144 hours or more These techniques can be widely used for protein structure studies, interaction studies, and in vitro assays.

도 1은 AIMP2-DX2의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 AIMP2-DX2 (51-251)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S를 대장균에 도입하여 형질전환시키기 위한 발현벡터 (pET28a_SUMO-AIMP2-DX2, pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251), 및 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S)를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 5는 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 세포 침전물에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 6은 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 세포 침전물에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 7은 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 세포 침전물에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 8은 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 세포 침전물에 대하여 AIMP2-DX2 단백질을 정제한 후, SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 9는 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 세포 침전물에 대하여 AIMP2-DX2 (51-251) 단백질을 정제한 후, SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 10은 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 수득한, 침전물에 대하여 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 단백질을 정제한 후, SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 11은 정제된 AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251) 및 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 단백질을 이용하여 2D TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy) NMR을 실시한 결과이다.
도 12는 AIMP2-DX2 단백질의 정제 후 농축과정에서, 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 또는 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 사용하여 수득한, 상층액 (sup) 또는 침전물 (ppt)에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 13은 AIMP2-DX2 단백질의 정제 후 농축과정에서, 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 또는 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 사용하고, 이후, 동결 및 해동시켜 수득한, 상층액 (sup) 또는 침전물 (ppt)에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 14는 AIMP2-DX2 단백질의 정제 후 농축과정에서, 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 또는 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 사용하고, 동결 및 상온에서 보관한 뒤 수득한, 상층액 (sup) 또는 침전물 (ppt)에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of AIMP2-DX2.
2 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of AIMP2-DX2 (51-251).
3 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S.
4 shows the expression vector (pET28a_SUMO-AIMP2-DX2, pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51 (SEQ ID NO: 2)) for the transformation by introducing AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S into E. coli. -251), and pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S).
FIG. 5 shows the result of SDS-PAGE of the cell precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 expression vector.
FIG. 6 shows the result of SDS-PAGE of the cell precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) expression vector.
Fig. 7 shows the result of SDS-PAGE of the cell precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S expression vector.
FIG. 8 shows the result of SDS-PAGE after purification of AIMP2-DX2 protein against cell precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 expression vector.
9 shows the result of SDS-PAGE after purification of AIMP2-DX2 (51-251) protein on cell precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) expression vector to be.
10 shows the results of SDS-PAGE after purification of the AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S protein against the precipitate obtained by culturing Escherichia coli transformed with pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S expression vector Results.
FIG. 11 shows the results of 2D TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy) NMR analysis using purified AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251) and AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S proteins.
Figure 12 shows the effect of the concentration of the AIMP2-DX2 protein on the supernatant (sup) or precipitate (ppt) obtained using 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) or 20 mM Bis-Tris SDS-PAGE.
FIG. 13 is a graph showing the relationship between the concentration of supernatant (sup) obtained by freezing and thawing using 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) or 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer in the concentration step after purification of AIMP2- Or the precipitate (ppt) was subjected to SDS-PAGE.
Fig. 14 shows the results of the purification of the AIMP2-DX2 protein after concentration of the supernatant (sup) obtained after freezing and storage at room temperature using 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) or 20 mM Bis- ) Or precipitate (ppt) on SDS-PAGE.

(단계 1) (Step 1) AIMP2AIMP2 -DX2 유전자의 증폭-DX2 gene amplification

N-말단이 아미노산 1번 (메티오닌-프롤린-메티오닌)으로부터 시작되는 AIMP2-DX2 유전자를 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 통해 합성하고 증폭하기 위해 각각의 프라이머 올리고 뉴클레오타이드를 다음과 같은 과정으로 고안하여 유전자 증폭을 수행하였다.In order to synthesize and amplify the AIMP2-DX2 gene whose N-terminus starts from amino acid No. 1 (methionine-proline-methionine) through polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR), each primer oligonucleotide is Gene amplification was performed.

Figure 112016048632217-pat00001
Figure 112016048632217-pat00001

서열번호 1의 염기서열을 가지는 프라이머는 BamHI 제한효소 인지부위 (밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함하고, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프라이머는 종결코돈 (박스), 제한효소 XhoI 인지부위 (밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함한다. The primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 includes the base sequence corresponding to the BamHI restriction enzyme recognition site (underlined), the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 includes the termination codon (box), the restriction enzyme XhoI recognition site ). ≪ / RTI >

호모사피엔스의 DNA를 주형으로 사용해 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 100ng/㎕의 주형 DNA 1㎕, 2.5㎕의 10mM dNTP (최종농도:0.5mM), 각 2㎕의 10pmol 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 (최종농도: 0.4pmol), Solg™ Pfu DNA 중합효소 0.5㎕ (2.5U/㎕, solgent, korea), 5㎕ PCR 완충용액 (solgent)에 37㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분을 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 1분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃, 5분의 조건으로 반응시켰다. 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 약 750개의 염기쌍으로 이루어진 AIMP2-DX2 유전자를 용출하였다. 이 용출액 16㎕에 10배 농축 제한효소 반응 완충액 2㎕와 제한효소 BamHI, XhoI을 각 1㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 이 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 원하는 DNA 절편을 용출해 30㎕의 용출버퍼에 용존시켰다.PCR was carried out using homo sapiens DNA as a template in the following procedure. 1 μl of template DNA, 2.5 μl of 10 mM dNTP (final concentration: 0.5 mM), 2 μl of each 10 pmol of the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (final concentration: 0.4 pmol), Solg ™ Pfu DNA polymerase 0.5 μl (2.5 U / μl, solgent, korea) and 5 μl of PCR buffer solution (solgent) to prepare 37 μl of distilled water. After the mixture was allowed to stand at 95 캜 for 5 minutes, the mixture was incubated at 95 캜 for 30 seconds; 55 占 폚 1 min; The reaction was repeated 35 times at 72 DEG C for 1 minute and then at 72 DEG C for 5 minutes. The reaction solution was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel, and about 750 base pairs of AIMP2-DX2 gene were eluted. To each 16 ㎕ of the eluate was added 2 쨉 l of a 10-fold concentrated restriction enzyme reaction buffer and 1 쨉 l of each of restriction enzymes BamHI and XhoI, followed by reaction at 37 째 C for 2 hours. Finally, the reaction solution was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel, and the desired DNA fragment was eluted and dissolved in 30 μl of elution buffer.

(단계 2) (Step 2) AIMP2AIMP2 -DX2 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조Preparation of Expression Vector Containing DX2 Gene

Yeast SUMO sequence가 삽입되어있는 pET28a_SUMO 플라스미드를 제한효소 BamHI과 XhoI을 이용하여 완전 절단하고 1% 아가로즈 젤 상에서 분리하였다. 분리된 AIMP2-DX2 500ng과 위의 플라스미드 100ng을 반응 튜브에 넣은 후, 2ul의 5배 연결 반응용액 (250mM Tris-HCl, pH7.8, 50mM MgCl2, 50mM DTT, 5mM ATP), 10U의 T4 DNA 리가아제를 넣고 총 부피가 10㎕가 되도록 증류수를 넣어준 다음, 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응용액을 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질전환시킨 다음, 50μg/ml 농도의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에 도말하여 대장균 형질전환체를 선발하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 유전자의 삽입유무를 확인하였다. 상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 AIMP2-DX2 유전자의 염기서열 확인은 Sanger 등 (Sanger, F. et al. 1977. PNAS. 74:5463)의 방법에 따라 Big Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.The pET28a_SUMO plasmid in which Yeast SUMO sequence was inserted was completely digested with restriction enzymes BamHI and XhoI and separated on 1% agarose gel. 500 ng of the separated AIMP2-DX2 and 100 ng of the above plasmid were put into a reaction tube, and then 2 ul of 5-fold connected reaction solution (250 mM Tris-HCl, pH 7.8, 50 mM MgCl 2 , 50 mM DTT, 5 mM ATP) After adding ligase, distilled water was added so that the total volume became 10 다음, and the reaction was carried out at 4 캜 for 16 hours. This reaction solution was transformed into E. coli DH5? Competent cells, transformed, and plated on LB medium supplemented with kanamycin at a concentration of 50 μg / ml to select E. coli transformants. Plasmids were extracted from them and the presence of pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 gene was confirmed by restriction enzyme and base sequence analysis. AIMP2-DX2 cloned into the recombinant plasmid obtained above Sequencing of the genes was carried out using the Big Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, USA) according to the method of Sanger et al. (1972. Sanger, F. et al., 1977. PNAS 74: 5463) Lt; / RTI >

(단계 3) (Step 3) AIMP2AIMP2 -DX2의 대장균에서 발현Expression of DX2 in E. coli

상기 단계 2에서 얻은 발현벡터 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2를 발현 숙주인 대장균 BL21-Codon Plus (DE3)-RIPL에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 균주를 50μg/ml의 카나마이신이 함유된 LB배지에서 12시간 동안 진탕배양한 후 이중 100㎕를 100ml의 LB배지에 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때 IPTG를 최종농도 0.5mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 전과 첨가 후 4시간이 지난 박테리아를 각각 1ml씩 취하고 13,000rpm에서 2분간 원심분리한 후 각각 세포 펠릿을 수거하였다. 수거한 펠릿을 램리 등의 방법 (Laemmli, et al. 1970. Nature. 227:680)에 따라 15% SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마지블루 (Coomasie Brilliant Blue)로 단백질을 염색하여 분석한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, SUMO-AIMP2-DX2 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. The expression vector pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 obtained in the above step 2 was transformed into the expression host E. coli BL21-Codon Plus (DE3) -RIPL. The transformed E. coli strain was shake-cultured in LB medium containing 50 μg / ml of kanamycin for 12 hours, and 100 μl of the transformant was transferred to 100 ml of LB medium. When the absorbance of bacteria at 600 ° C. was about 0.4-0.6 at 37 ° C. IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM. 1 ml of each of the bacteria before and 4 hours after the addition of IPTG was centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes, and the cell pellets were collected. The collected pellets were subjected to 15% SDS-PAGE according to the method of Laemmli et al., 1970. Nature, 227: 680, and the protein was stained with Coomasie Brilliant Blue. As shown in Fig. 5, the expression of the SUMO-AIMP2-DX2 protein was confirmed.

실시예Example 2.  2. AIMP2AIMP2 -DX2 (51-251) 유전자의 증폭 및 발현-DX2 (51-251) gene amplification and expression

(단계 1) (Step 1) AIMP2AIMP2 -DX2 (51-251) 유전자의 증폭-DX2 (51-251) gene amplification

N-말단이 51번(라이신-아스파틱산-아이소류신)으로 시작되는 AIMP2-DX2 (51-251) 유전자를 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 통해 합성하고 증폭하기 위해 각각의 프라이머 올리고 뉴클레오타이드를 다음과 같은 과정으로 고안하여 유전자 증폭을 수행하였다.To synthesize and amplify the AIMP2-DX2 (51-251) gene whose N-terminus starts with 51 (lysine-aspartic acid-isoleucine) through Polymerase Chain Reaction (PCR) Oligonucleotides were designed by the following procedure to perform gene amplification.

Figure 112016048632217-pat00002
Figure 112016048632217-pat00002

서열번호 3의 염기서열을 가지는 프라이머는 BamHI 제한효소 인지부위 (밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함하고, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프라이머는 종결코돈 (박스), 제한효소 XhoI 인지부위(밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함한다. The primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 contains the base sequence corresponding to the BamHI restriction enzyme recognition site (underlined), the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 includes the termination codon (box), the restriction enzyme XhoI recognition site ). ≪ / RTI >

호모사피엔스의 DNA를 주형으로 사용해 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 100ng/㎕의 주형 DNA 1㎕, 2.5㎕의 10mM dNTP (최종농도:0.5mM), 각 2㎕의 10pmol 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 (최종농도: 0.4pmol), Solg™ Pfu DNA 중합효소 0.5㎕ (2.5U/㎕, solgent, korea), 5㎕ PCR 완충용액 (solgent)에 37㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분을 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 1분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 약 600개 염기쌍의 AIMP2-DX2 (51-251) 유전자를 용출하였다. 이 용출액 16㎕에 10배 농축 제한효소 반응 완충액 2㎕와 제한효소 BamHI, XhoI을 각 1㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 이 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 원하는 DNA 절편을 용출해 30㎕의 용출버퍼에 용존시켰다.PCR was carried out using homo sapiens DNA as a template in the following procedure. (Final concentration: 0.4 pmol), 2 쨉 l of 10 pmol of each of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, 1 袖 g of Solg ™ Pfu DNA polymerase 0.5 μl (2.5 U / μl, solgent, korea) and 5 μl of PCR buffer solution (solgent) to prepare 37 μl of distilled water. After the mixture was allowed to stand at 95 캜 for 5 minutes, the mixture was incubated at 95 캜 for 30 seconds; 55 占 폚 1 min; The reaction was repeated 35 times at 72 DEG C for 1 minute and then at 72 DEG C for 5 minutes. The reaction solution was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel, and about 600 base pairs of AIMP2-DX2 (51-251) genes were eluted. To each 16 ㎕ of the eluate was added 2 쨉 l of a 10-fold concentrated restriction enzyme reaction buffer and 1 쨉 l of each of restriction enzymes BamHI and XhoI, followed by reaction at 37 째 C for 2 hours. Finally, the reaction solution was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel, and the desired DNA fragment was eluted and dissolved in 30 μl of elution buffer.

(단계 2) (Step 2) AIMP2AIMP2 -DX2 (51-251) 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조-DX2 (51-251) < / RTI >

Yeast SUMO sequence가 삽입되어있는 pET28a_SUMO 플라스미드를 제한효소 BamHI과 XhoI을 이용하여 완전 절단하고 1% 아가로즈 젤 상에서 분리하였다. 분리된 AIMP2-DX2 (51-251) 500ng과 위의 플라스미드 100ng을 반응 튜브에 넣은 후 2ul의 5배 연결 반응용액 (250mM Tris-HCl, pH7.8, 50mM MgCl2, 50mM DTT, 5mM ATP), 10U의 T4 DNA 리가아제를 넣고 총 부피가 10㎕가 되도록 증류수를 넣어준 다음, 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응 용액을 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질전환시킨 다음, 50μg/ml 농도의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에 도말하여 대장균 형질전환체를 선발하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)의 유전자의 삽입유무를 확인하였다. 상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 AIMP2-DX2 (51-251) 유전자의 염기서열 확인은 Sanger 등 (Sanger, F. et al. 1977. PNAS. 74:5463)의 방법에 따라 Big Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.The pET28a_SUMO plasmid in which Yeast SUMO sequence was inserted was completely digested with restriction enzymes BamHI and XhoI and separated on 1% agarose gel. 500 ng of the separated AIMP2-DX2 (51-251) and 100 ng of the above plasmid were placed in a reaction tube, and then 2 ul of a 5-fold coupling reaction solution (250 mM Tris-HCl, pH 7.8, 50 mM MgCl 2 , 50 mM DTT, 5 mM ATP) 10 U of T4 DNA ligase was added, and distilled water was added thereto so that the total volume became 10 쨉 l, followed by reaction at 4 째 C for 16 hours. This reaction solution was transformed into E. coli DH5? Competent cells, transformed, and plated on LB medium supplemented with kanamycin at a concentration of 50 μg / ml to select E. coli transformants. Plasmids were extracted from these plasmids and the presence or absence of pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) gene was confirmed by restriction enzyme and base sequence analysis. The nucleotide sequence of the AIMP2-DX2 (51-251) gene cloned into the recombinant plasmid obtained above was confirmed by the Big Dye Cycle Sequencing System (Sanger, F. et al., 1977. PNAS 74: 5463) Applied Biosystems, USA) and analyzed by ABI 377 DNA sequencer.

(단계 3) (Step 3) AIMP2AIMP2 -DX2 (51--DX2 (51- 251)의251) 대장균에서 발현 Expression in E. coli

상기 단계 2에서 얻은 발현벡터 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)를 발현 숙주인 대장균 BL21-Codon Plus (DE3)-RIPL에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 균주를 50μg/ml의 카나마이신이 함유된 LB배지에서 12시간 동안 진탕배양한 후, 이중 100㎕를 100ml의 LB배지에 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때 IPTG를 최종 농도 0.5mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 전과 첨가 후 4시간이 지난 박테리아를 각각 1ml씩 취하고 13,000rpm에서 2분간 원심분리한 후 각각 세포 펠릿을 수거하였다. 수거한 펠릿을 램리 등의 방법 (Laemmli, et al. 1970. Nature. 227:680)에 따라 15% SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마지블루 (Coomasie Brilliant Blue)로 단백질을 염색하여 분석한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. The expression vector pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) obtained in the above step 2 was transformed into the expression host E. coli BL21-Codon Plus (DE3) -RIPL. The transformed Escherichia coli strain was shake-cultured in LB medium containing 50 μg / ml of kanamycin for 12 hours, and then 100 μl of the transformant was transferred to 100 ml of LB medium and the absorbance of the bacteria at 37 ° C. was 0.4-0.6 at 600 nm IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM. 1 ml of each of the bacteria before and 4 hours after the addition of IPTG was centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes, and the cell pellets were collected. The collected pellets were subjected to 15% SDS-PAGE according to the method of Laemmli et al., 1970. Nature, 227: 680, and the protein was stained with Coomasie Brilliant Blue. As shown in Fig. 6, expression of the SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) protein was confirmed.

실시예Example 3.  3. AIMP2AIMP2 -DX2 (51--DX2 (51- 251)C136S251) C136S __ C222SC222S 유전자의 발현 Gene expression

(단계 1) (Step 1) AIMP2AIMP2 -DX2 (51--DX2 (51- 251)C136S251) C136S 유전자의 돌연변이 Mutation of the gene

136번 아미노산 시스테인 (TGC)이 세린 (AGC)으로 돌연변이 되도록 코딩하는 AIMP2-DX2 (51-251)C136S 유전자를 PCR을 통해 증폭하기 위해 올리고 뉴클레오타이드인 프라이머 2개를 다음과 같이 고안하여 유전자 증폭을 수행하였다.To amplify the AIMP2-DX2 (51-251) C136S gene encoding 136 amino acid cysteine (TGC) to be mutated to serine (AGC) by PCR, two primers which are oligonucleotides were designed as follows to perform gene amplification Respectively.

Figure 112016048632217-pat00003
Figure 112016048632217-pat00003

실시예 2의 단계 2에서 제조한 발현벡터 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)의 DNA를 주형으로 사용해 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 20ng/㎕의 주형 DNA 1ul, 2.5㎕의 10mM dNTP (최종농도:0.5mM), 각 2㎕의 10pmol 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 (최종농도: 0.4pmol), Solg™ Pfu-X DNA 중합효소 0.5㎕ (2.5U/㎕, solgent, korea), 5㎕ PCR 충용액(solgent)에 37㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 30초를 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 6분 30초의 반응을 15회 반복한 후, 4℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. 이후 반응용액에 제한효소 DpnI을 1㎕ 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 반응용액을 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 10㎕ 첨가하여 형질전환시킨 다음, 50μg/ml 농도의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에 도말하여 대장균 형질전환체를 선발하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S의 유전자 돌연변이를 확인하였다. 상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 AIMP2-DX2 (51-251)C136S 유전자의 염기서열 확인은 Sanger 등 (Sanger, F. et al. 1977. PNAS. 74:5463)의 방법에 따라 Big Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.PCR was carried out using the DNA of the expression vector pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) prepared in step 2 of Example 2 as a template in the following procedure. (Final concentration: 0.4 pmol), Solg (TM) Pfu-X DNA Polymerization (final concentration: 0.5 mM), 2 pmol each of 10 pmol and 4 pmol of each template DNA, 0.5 μl of enzyme (2.5 U / μl, solgent, korea) and 5 μl of PCR solution (solgent) were added to 37 μl of distilled water to prepare a reaction solution. The mixture was allowed to stand at 95 DEG C for 30 seconds, followed by heating at 95 DEG C for 30 seconds; 55 占 폚 1 min; The reaction at 72 캜 for 6 minutes and 30 seconds was repeated 15 times, followed by reaction at 4 캜 for 5 minutes. Thereafter, 1 μl of restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution, followed by reaction at 37 ° C for 2 hours. This reaction solution was transformed into E. coli DH5? Competent cells, transformed and plated on LB medium supplemented with kanamycin at a concentration of 50 μg / ml to select E. coli transformants. Plasmids were extracted from them and gene mutations of pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S were confirmed by restriction enzyme and base sequence analysis. The nucleotide sequence of the AIMP2-DX2 (51-251) C136S gene cloned into the above-obtained recombinant plasmid was determined according to the method of Sanger, F. et al., 1977. PNAS 74: 5463, (Applied Biosystems, USA) and analyzed by ABI 377 DNA sequencer.

(단계 2) (Step 2) AIMP2AIMP2 -DX2 (51--DX2 (51- 251)C136S251) C136S __ C222SC222S 유전자의 돌연변이 Mutation of the gene

136번 아미노산 시스테인(TGC)이 세린(AGC)으로, 222번 아미노산 시스테인(TGC)이 세린(AGC)으로, 돌연변이 되도록 코딩하는 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 유전자를 PCR을 통해 증폭하기 위해 올리고 뉴클레오타이드인 프라이머 2개를 다음과 같이 고안하여 유전자 증폭을 수행하였다.The AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S gene coding for mutation in the amino acid cysteine (TGC) at position 136 (AGC) and the amino acid cysteine (TGC) at position 222 in AGC was amplified by PCR. Two primers, which are nucleotides, were designed as follows to perform gene amplification.

Figure 112016048632217-pat00004
Figure 112016048632217-pat00004

실시예 3의 단계 1에서 제조한 발현벡터 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S의 DNA를 주형으로 사용해 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 20ng/㎕의 주형 DNA 1ul, 2.5㎕의 10mM dNTP (최종농도:0.5mM), 각 2㎕의 10pmol 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머 (최종농도: 0.4pmol), Solg™ Pfu-X DNA 중합효소 0.5㎕ (2.5U/㎕, solgent, korea), 5㎕ PCR 완충용액 (solgent)에 37㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 30초를 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 6분 30초의 반응을 15회 반복한 후, 4℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. 이후, 반응용액에 제한효소 DpnI을 1㎕ 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 반응용액을 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 10㎕ 첨가하여 형질전환시킨 다음, 50μg/ml 농도의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에 도말하여 대장균 형질전환체를 선발하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S의 유전자 돌연변이를 확인하였다. 상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 유전자의 염기서열 확인은 Sanger 등 (Sanger, F. et al. 1977. PNAS. 74:5463)의 방법에 따라 Big Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.PCR was carried out using the DNA of the expression vector pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S prepared in step 1 of Example 3 as a template in the following procedure. (Final concentration: 0.4 pmol), Solg (TM) Pfu-X DNA Polymerization (final concentration: 0.5 mM), 2 pmol each of 10 pmol and 5 pmol of template DNA, 0.5 μl of enzyme (2.5 U / μl, solgent, korea), and 37 μl of distilled water were added to 5 μl of the PCR buffer solution (solgent). The mixture was allowed to stand at 95 DEG C for 30 seconds, followed by heating at 95 DEG C for 30 seconds; 55 占 폚 1 min; The reaction at 72 캜 for 6 minutes and 30 seconds was repeated 15 times, followed by reaction at 4 캜 for 5 minutes. Thereafter, 1 쨉 l of restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution, followed by reaction at 37 째 C for 2 hours. This reaction solution was transformed into E. coli DH5? Competent cells, transformed and plated on LB medium supplemented with kanamycin at a concentration of 50 μg / ml to select E. coli transformants. Plasmids were extracted from these plasmids and gene mutations of pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S were confirmed by restriction enzyme and base sequence analysis. The nucleotide sequence of the AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S gene cloned into the above-obtained recombinant plasmid was confirmed by the method of Sanger, F. et al., 1977. PNAS 74: 5463, (Applied Biosystems, USA) and analyzed by ABI 377 DNA sequencer.

(단계 3) (Step 3) AIMP2AIMP2 -DX2 (51--DX2 (51- 251)C136S251) C136S __ C222S의C222S 대장균에서 발현 Expression in E. coli

상기 단계 2에서 얻은 발현벡터 pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S를 발현 숙주인 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 균주를 50μg/ml의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕배양한 후, 이중 100㎕를 100ml의 LB배지에 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때 IPTG를 최종농도 0.5mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 전과 첨가 후 4시간이 지난 박테리아를 각각 1ml씩 취하고 13,000rpm에서 2분간 원심분리한 후 각각 세포 펠릿을 수거하였다. 수거한 펠릿을 램리 등의 방법 (Laemmli, et al. 1970. Nature. 227:680)에 따라 15% SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마지블루 (Coomasie Brilliant Blue)로 단백질을 염색하여 분석한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. The expression vector pET28a_SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S obtained in the above step 2 was transformed into the expression host E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL. The transformed Escherichia coli strain was shake-cultured in LB medium containing 50 μg / ml of kanamycin for 12 hours, and then 100 μl of the transformant was transferred to 100 ml of LB medium and the absorbance of the bacteria at 37 ° C. was 0.4-0.6 at 600 nm IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM. 1 ml of each of the bacteria before and 4 hours after the addition of IPTG was centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes, and the cell pellets were collected. The collected pellets were subjected to 15% SDS-PAGE according to the method of Laemmli et al., 1970. Nature, 227: 680, and the protein was stained with Coomasie Brilliant Blue. As shown in Fig. 7, the expression of SUMO-AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S protein was confirmed.

실시예Example 4.  4. AIMP2AIMP2 -DX2 또는 이의 -DX2 or its object 변이체Mutant 단백질의 정제 Purification of proteins

(단계 1) 대장균 세포의 배양 및 파쇄(Step 1) Culture and disruption of E. coli cells

실시예 1,2,3에서 제조된 AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S (이하, 실시예 4에서는 상기 단백질들을 AIMP2-DX2 단백질로 명명함.)가 발현된 대장균 세포를 각 실시예의 단계 3과 같은 방법으로 2리터 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하고, 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM DTT pH7.4 조성의 완충용액에 현탁시킨 후, 얼음중탕에서 초음파 분쇄기 (Sonic Dismembrator, Fisher, USA)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 용액을 원심분리기로 18,000rpm에서 90분간 원심분리한 후, 그 상층액을 이용해 정제를 진행하였다.AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S (hereinafter referred to as AIMP2-DX2 protein in Example 4). ) Were cultured in the same manner as in Step 3 of each Example, and then cultured for 2 minutes at 5,000 rpm for 20 minutes using a centrifuge to recover the E. coli cell pellets. The cells were washed with 20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, pH 7.4, and the cells were disrupted using an ultrasonic disintegrator (Fisher, USA) in an ice bath. The pulverized solution was centrifuged at 18,000 rpm for 90 minutes using a centrifuge, and purification was carried out using the supernatant.

(단계 2) (Step 2) 20mM20mM TrisTris -HCl, -HCl, 300mM300mM NaCl,  NaCl, 1mM1 mM PMSFPMSF , , pH7pH7 .4 조성의 .4 compositional 완충용액에서의Of buffer 정제 refine

단계 1에서 얻은 상층액을 PMSF가 없는 상기의 완충용액으로 미리 평형된 니켈-니트릴로트리아세틱 액시드(Ni-NTA) 칼럼 (GE healthcare, USA)에 결합시킨 후 0-0.5M 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출한 후, SDS-PAGE하여 His-yeast SUMO-AIMP2-DX2 단백질 부분만 모은 후, 다음 과정에 이용하였다. 상기 과정에서 얻은 His-yeast SUMO-AIMP2-DX2 단백질에 ULP (Yeast SUMO cleavage protease)를 첨가하여 4℃에 12시간 동안 두어 His-Yeast SUMO를 잘라내었다. 이때, 다음 스텝을 위해서 이미다졸 농도를 줄여야 하므로 20mM Tris-HCl pH 7.5, 300mM NaCl 완충용액에 dialysis하였다. His-Yeast SUMO가 잘린 AIMP2-DX2 단백질은 Ni-NTA칼럼을 통과하므로, Yeast SUMO를 잘라낸 AIMP2-DX2 단백질 용액을 상기의 완충용액으로 미리 평형된 Ni-NTA 칼럼에 통과시킨 후, 통과한 용액만을 모았다. 상기 과정에서 얻은 AIMP2-DX2 단백질을 5ml까지 농축한 후, 20mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT, 1mM PMSF 조성의 완충용액으로 평형된 젤 필트레이션 칼럼 (Superdex 200, 16/60, GE Healthcare, USA)에 주입시킨 후, 단백질의 분자량에 의해 분리하여 전기영동으로 확인하고 AIMP2-DX2 단백질의 부분만 모아 SDS-PAGE로 확인한 결과, 도 8 내지 도 10에 나타낸 바와 같이, AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 단백질이 높은 수율로 수득될 수 있음을 알 수 있었다.The supernatant obtained in Step 1 was bound to a pre-equilibrated nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) column (GE healthcare, USA) with the above buffer solution without PMSF and then a 0-0.5 M imidazole concentration gradient , Followed by SDS-PAGE to collect the portion of the His-yeast SUMO-AIMP2-DX2 protein, which was then used in the next step. Yeast SUMO cleavage protease (ULP) was added to the His-yeast SUMO-AIMP2-DX2 protein obtained in the above procedure and the mixture was incubated at 4 ° C for 12 hours to remove His-Yeast SUMO. In order to reduce the imidazole concentration, the following step was dialyzed in a buffer solution of 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl. Since the AIMP2-DX2 protein whose His-Yeast SUMO is cleaved is passed through the Ni-NTA column, the AIMP2-DX2 protein solution with the Yeast SUMO cut out is passed through the Ni-NTA column previously equilibrated with the above buffer solution, Gathered. The AIMP2-DX2 protein obtained in the above procedure was concentrated to 5 ml, and then purified using a gel filtration column (Superdex 200, 16/60, GE (trade name), manufactured by GE Corp.) in a buffer solution of 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT and 1 mM PMSF (AIMP2-DX2, DMSO-2, DMSO-2, DMSO-2, DMSO-2, DMSO-2) AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S protein could be obtained in high yield.

실시예Example 5. 정제된  5. Refined AIMP2AIMP2 -DX2 또는 이의 -DX2 or its object 변이체Mutant 단백질을 이용한 구조분석 Structural analysis using proteins

본 실시예에서는, 상기 실시예 4에서 정제된 AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251), AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S 단백질을 이용한 실험의 일례로서, 이에 대한 구조 분석을 실시하였으며, 구체적으로, 상기 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체 단백질을 대상으로 2D TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy) NMR을 실시하였다.In this example, structural analysis was conducted as an example of experiments using AIMP2-DX2, AIMP2-DX2 (51-251) and AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S proteins purified in Example 4, Specifically, 2D TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy) NMR was performed on the AIMP2-DX2 or its mutant protein.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 2D TROSY NMR을 통한 구조 분석이 가능한 양의 단백질을 상기 실시예 1 내지 4의 방법을 통해 수득할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이를 기초로, 상기 AIMP2-DX2 단백질 N 말단의 50개 아미노산이 절단 (결실)된, AIMP2-DX2 (51-251), 및 상기 AIMP2-DX2 (51-251) 단백질 136번 및 222번 시스테인 (Cysteine) 잔기가 세린 (Serine)으로 치환된, AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S는 결실 또는 치환에 의해서도 AIMP2-DX2 단백질 본연의 구조와 기능에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이를 통해 AIMP2-DX2 단백질 자체 뿐만 아니라, AIMP2-DX2 (51-251) 및 AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S를 이용하여 암 억제 표적단백질인 AIMP2-DX2에 대한 3차원 구조 규명, 약물 작용 기전, 및 신약 발굴 등의 연구에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 11, it was confirmed that a protein capable of analyzing the structure through 2D TROSY NMR can be obtained through the methods of Examples 1 to 4 above. Based on this, AIMP2-DX2 AIMP2-DX2 (51-251) in which 50 amino acids of protein N-terminal are deleted (deleted), and AIMP2-DX2 (51-251) proteins 136 and 222 cysteine residues are serine The deletion or substitution of the substituted AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S did not significantly affect the original structure and function of the AIMP2-DX2 protein. AIMP2-DX2 (51-251) and AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S as well as the AIMP2-DX2 protein itself were used to identify the three-dimensional structure of AIMP2-DX2, a cancer-inhibiting target protein, And to discover new drugs.

실시예Example 6. 완충 용액에 따른 정제 효율 및 안정성 증진 효과 6. Improvement of purification efficiency and stability by buffer solution

본 실시예에서는, 상기 실시예 4의 AIMP2-DX2 단백질 정제 과정 후, 농축하는 단계에서 버퍼 조성, 즉, pH 변화가 상기 단백질의 정제 효율 및 안정성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4와 동일한 과정으로 AIMP2-DX2 단백질을 정제하였으며, 다만, 이후 농축 단계에서, 하나는 20mM Tris-HCl (pH 7.4)를 이용한 반면, 다른 하나는 20mM Bis-Tris (pH 6.0)를 이용하여 dialysis (10,000Da의 반투막 사용)하였다. 이후, 동일한 양을 농축하고, 이들의 상층액 (sup)과 침전물 (ppt)을 수거하여 SDS-PAGE를 수행함으로써, 이들간 정제 효율을 비교하였다. 이 뿐만 아니라, 상기 농축물을 액체 질소로 동결시키고, 다시 이를 해동시키거나, 상온 (약 20℃)에 방치시킨 후, 원심분리하여 상층액 (sup)과 침전물 (ppt)을 수득하였으며, 다시 이에 대한 SDS-PAGE를 수행하여 정제된 단백질의 안정성을 평가하였다.In this example, the effect of the buffer composition, that is, the pH change, on purification efficiency and stability of the protein in the step of concentrating the AIMP2-DX2 protein of Example 4 was examined. Specifically, the AIMP2-DX2 protein was purified by the same procedure as in Example 4, except that 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) was used in one concentration and 20 mM Bis-Tris ) Was used for dialysis (10,000 Da translucent membrane). Thereafter, the same amount was concentrated, and their supernatant (sup) and precipitate (ppt) were collected and subjected to SDS-PAGE to compare the efficiency of purification between them. In addition, the concentrate was frozen with liquid nitrogen and thawed or allowed to stand at room temperature (about 20 ° C) and then centrifuged to obtain supernatant (sup) and precipitate (ppt) SDS-PAGE was performed to evaluate the stability of the purified protein.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 버퍼에 비해 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 이용한 경우, 침전물 내 존재하는 AIMP2-DX2 단백질의 양이 감소하고 상층액에 대한 용해도가 증가하여 정제할 수 있는 AIMP2-DX2 단백질의 양, 즉, 정제 효율이 증진됨을 알 수 있었다. 특히, 액체 질소로 동결시킨 후 해동시킨 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, Tris-HCl (pH 7.4) 버퍼에서는 침전물 내 다량의 AIMP2-DX2가 관찰되어 동결 및 해동 과정에서 단백질의 안정성 변화가 관찰된 반면, 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼에서는 동결 전과 마찬가지로 상층액 내 다량의 AIMP2-DX2가 용해되어 있었는바, 동결 및 해동과정에서도 단백질의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 액체 질소로 동결시킨 후 상온에 방치시킨 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 결과들과 마찬가지로 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 버퍼에 비해 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 이용한 경우, 상층액 내 다량의 AIMP2-DX2가 용해되어 있었고, 침전물에서는 적은 양만이 관찰되었는바, 동결 후 상온 조건에서도 단백질의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 12, when 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer was used in comparison with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer, the amount of AIMP2- And the amount of AIMP2-DX2 protein that can be purified, i.e., the purification efficiency, was increased. In particular, as a result of freezing with liquid nitrogen and thawing, as shown in FIG. 13, a large amount of AIMP2-DX2 was observed in the precipitate in the Tris-HCl (pH 7.4) buffer and the stability of the protein was observed during the freezing and thawing On the other hand, in a 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer, a large amount of AIMP2-DX2 was dissolved in the supernatant similarly to the case before freezing, and protein stability was maintained during freezing and thawing. As shown in FIG. 14, when 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer was used in comparison with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer as in the above results after freezing with liquid nitrogen, A large amount of AIMP2-DX2 was dissolved in the supernatant, and only a small amount of AIMP2-DX2 was observed in the supernatant. As a result, it was confirmed that protein stability was maintained even at room temperature after freezing.

상기 결과들을 종합해 볼 때, 농축 과정에서 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 버퍼 가 아닌, 20mM Bis-Tris (pH 6.0) 버퍼를 사용함으로써, AIMP2-DX2 단백질에 대한 정제 효율 및 동결 후 해동 등 과정에서 단백질의 안정성이 개선됨을 알 수 있었다.In view of the above results, the purification efficiency of the AIMP2-DX2 protein and the post-thawing process such as the thawing process using the 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) buffer instead of the 20 mM Tris- The stability of the protein was improved.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Method for the preparation of AIMP2-DX2 as a target for anti-cancer drug discovery <130> P16U13C0945_DP-2015-0325 <150> KR 10-2015-0071834 <151> 2015-05-22 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 forward primer <400> 1 cgcggatcca tgccgatgta ccaggtaaa 29 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 reverse primer <400> 2 ccgctcgagt tacttaagga gcttgagggc 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251) forward primer <400> 3 cgcggatcca aagacatcgt gatcaacgc 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251)C136S forward primer <400> 4 atccagacga tgagccccat cgaaggc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251)C136S reverse primer <400> 5 gccttcgatg gggctcatcg tctggat 27 <210> 6 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Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 9 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 polynucleotide <400> 9 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag 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Asn Val Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe 65 70 75 80 Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg 85 90 95 Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr 100 105 110 Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly 115 120 125 Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu 130 135 140 Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val 145 150 155 160 Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val 165 170 175 Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro 180 185 190 Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 <210> 11 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251) polynucleotide <400> 11 aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac 60 aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag 120 agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa 180 gactatcagc tgggattcac tttaatttgg aagaatgtgc cgaagacgca 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90 95 Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr 100 105 110 Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly 115 120 125 Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu 130 135 140 Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val 145 150 155 160 Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Ser Ser Val Thr Val 165 170 175 Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro 180 185 190 Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 <210> 13 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251)C136S_C222S polynucleotide <400> 13 aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac 60 aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag 120 agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa 180 gactatcagc tgggattcac tttaatttgg aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc 240 agcatccaga cgatgagccc catcgaaggc gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct 300 ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt 360 gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg 420 aactctgctc ttgggaagag cccttggctc gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg 480 gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga ggcagcagtg tgacagtgcc agccaatgtg 540 cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg gctcctttta acacggccct caagctcctt 600 aagtga 606 <110> KOREAN UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION          Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Method for the preparation of AIMP2-DX2 as a target for          anti-cancer drug discovery <130> P16U13C0945_DP-2015-0325 <150> KR 10-2015-0071834 <151> 2015-05-22 <160> 13 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 forward primer <400> 1 cgcggatcca tgccgatgta ccaggtaaa 29 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 reverse primer <400> 2 ccgctcgagt tacttaagga gcttgagggc 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251) forward primer <400> 3 cgcggatcca aagacatcgt gatcaacgc 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 (51-251) C136S forward primer <400> 4 atccagacga tgagccccat cgaaggc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 (51-251) C136S reverse primer <400> 5 gccttcgatg gggctcatcg tctggat 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S forward primer <400> 6 agcagatcgg aggctgcagt gtgacagtg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S reverse primer <400> 7 cactgtcaca ctgcagcctc cgatctgct 29 <210> 8 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 polypeptide <400> 8 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu   1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly              20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly          35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro      50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu  65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu                  85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr             100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met         115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile     130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys                 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Ser Met Asn Ser             180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala         195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val     210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys                 245 250 <210> 9 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 polynucleotide <400> 9 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300 ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360 aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420 gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480 gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540 ccgctgttc gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga 660 ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg 720 gctcctttta acacggccct 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Cys Ser Val Thr Val                 165 170 175 Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro             180 185 190 Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys         195 200 <210> 11 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 (51-251) polynucleotide <400> 11 aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac 60 aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag 120 agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa 180 gactatcagc tgggattcac tttaatttgg aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc 240 agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct 300 ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt 360 gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg 420 aactctgctc ttgggaagag cccttggctc gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg 480 gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg 540 cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg gctcctttta acacggccct caagctcctt 600 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Ser Ser Val Thr Val                 165 170 175 Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro             180 185 190 Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys         195 200 <210> 13 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AIMP2-DX2 (51-251) C136S_C222S polynucleotide <400> 13 aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac 60 aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag 120 agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa 180 gactatcagc tgggattcac tttaatttgg aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc 240 agcatccaga cgatgagccc catcgaaggc gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct 300 ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt 360 gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg 420 aactctgctc ttgggaagag cccttggctc gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg 480 gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga ggcagcagtg tgacagtgcc agccaatgtg 540 cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg gctcctttta acacggccct caagctcctt 600 aagtga 606

Claims (10)

SUMO와 융합된 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제1 완충용액에 현탁한 후, 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
상기 수득한 상층액으로부터 제1 완충용액 및 크로마토그래피를 이용하여 상기 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 정제하는 단계; 및
상기 정제된 AIMP2-DX2 또는 이의 변이체를 pH 6.0 내지 pH 6.8의 비스-트리스 (Bis-Tris)가 함유된 제2 완충용액에 용해하여 투석하는 단계를 포함하며,
상기 제1 완충용액은 Tris-HCl, NaCl, PMSF, 및 DTT를 포함하는 것인, AIMP2-DX2 또는 이의 변이체의 제조방법.
Suspending Escherichia coli transformed with an expression vector comprising a polynucleotide encoding AIMP2-DX2 or a variant thereof fused with SUMO in a first buffer solution, followed by disruption and centrifugation to obtain a supernatant;
Purifying the AIMP2-DX2 or a variant thereof using the first buffer solution and chromatography from the obtained supernatant; And
Dialyzing the purified AIMP2-DX2 or a variant thereof in a second buffer solution containing Bis-Tris at pH 6.0 to pH 6.8,
Wherein the first buffer solution comprises Tris-HCl, NaCl, PMSF, and DTT.
제1항에 있어서,
상기 변이체는 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein said mutant is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
제1항에 있어서,
상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the polynucleotide encoding the mutant is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
제1항에 있어서,
상기 제1 완충용액은 pH 7.0 내지 pH 7.8의 Tris-HCl을 함유하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first buffer solution comprises Tris-HCl at a pH of 7.0 to pH 7.8.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 정제하는 단계는 Ni-NTA (Nikel-nitrilotriacetic acid) 친화크로마토그래피 및 겔투과 크로마토그래피를 순차적으로 실시하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein said purifying step is performed sequentially with Ni-NTA (Nickel-nitrilotriacetic acid) affinity chromatography and gel permeation chromatography.
서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진, AIMP2-DX2 변이체.
AIMP2-DX2 variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
제7항의 AIMP2-DX2 변이체를 코딩하며, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드.
11. A polynucleotide encoding the AIMP2-DX2 variant of claim 7, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현벡터.
9. An expression vector comprising the polynucleotide of claim 8.
제9항의 발현벡터로 형질전환된 대장균. An E. coli transformed with the expression vector of claim 9.
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