KR101838729B1 - 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법 - Google Patents

미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 에 관한 것으로, 미세조류(1)를 분석하여 생태독성을 평가하고 분석하는 장치에 있어서, 미세조류(1)를 위치하는 배치부(15)가 상단에 구비되고 미세조류(1)의 현미경 이미지와 그림자 이미지를 촬영하고 이미지를 분석하는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 상보형금속산화반도체부(10); 및 상보형금속산화반도체부(10)의 배치부(15)에 위치된 미세조류(1)에 광원을 조사하는 발광다이오드부(20);를 포함하여 구성된다.

Description

미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법{Eotoxicity evaluation analyzer device using microalgae image-analysis program and method thereof}
본 발명은 생태독성평가 분석장치 및 그 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 독성 물질에 노출되었을 때 발생하는 미세조류의 상태 변화를 인지하는 기술이 포함된 상보형금속산화반도체 및 발광다이오드로 구성된 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법에 관한 것이다.
환경분석을 위하여 종래에는 이화학적인 분석기술을 적용해 독성 물질을 정량적으로 분석하였다. 그러나 이화학적인 분석기술은 분석에 소요되는 비용, 시간, 기술, 인력적인 측면에서 광활한 측정영역을 분석하기에는 현실적으로 불가능하다. 그러므로 환경분석을 위한 과학적이고 효율적인 관리방안으로 생태독성평가 분석기술이 대두된다.
생태독성평가 분석기술은 생물을 사용하여 환경 내에 존재하는 물질의 잠재적인 유해성을 평가하는 기술이다. 이 기술은 사용되는 이질적인 물질이 생물에 농축되었을 시 발생하는 피해나 다양한 화합물이 공존했을 시 발생할 수 있는 생물학적 이용성에 대한 정보를 파악할 수 있다.
국제적으로 ISO, OECD, ASTM, NIWA 그리고 US EPA 등의 기관에서 물벼룩, 어류, 조류 등 다양한 시험 생물종으로 생태독성평가 기술을 공인하고 있으며, 새로운 기술에 대해 인증해주고 있다. 국내에서는 상기 기관들에서 권장하는 평가 기술을 활용하여 생태독성평가를 진행하고 있으며, 국내 종으로 국제적 인증을 거치려는 연구가 활발하다.
분석기술의 연구는 종래의 이화학적인 분석기술의 단점을 보완하는 면과 활용공간규모의 축소화, 고가기기 사용의 불필요성, 적용절차의 간편화 등의 실리적인 방향으로 기술 자체가 진화하고 있다. 그럼에도 불구하고 분석 결과를 도출하기 위해서는 시험 생물종의 형태, 계수, 상태를 현미경으로 분석하는 수동분석 장치에 의존하는 실정이다.
따라서 분석에 소요되는 시간, 기술, 인력적인 측면에서 진화한 분석 기술의 개발 및 현미경 기반의 수동분석 장치에서 벗어난 진화된 생태독성 분석장치에 대한 연구가 요구되고 있다.
현재 생태독성평가를 국제표준 시험법으로 개발하기 위해서 다양한 연구가 진행 중이지만 생태독성평가를 분석하는 장치는 여전히 현미경 기반의 수동분석에 머무르고 있다.
그리고, 수동분석 장치는 측정에 소요되는 시간이 크며 생태독성평가가 가능한 전문가가 요구되고 있으며, 전문가라 하더라고 분석 계수의 오차가 상당히 큰 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 상기한 문제를 개선하기 위한 것으로 상보형금속산화반도체와 발광다이오드를 이용하여 자동화된 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 문제를 개선하기 위한 것으로 특히 독성평가 분석 장치에는 미세조류의 상태를 분석할 수 있는 기술이 포함되어 사용자에게 효용적인 다양한 연구 분석 결과를 제공하는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치 및 그 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치는 미세조류를 분석하여 생태독성을 평가하고 분석하는 장치에 있어서, 상기 미세조류를 위치하는 배치부가 상단에 구비되고 상기 미세조류의 현미경 이미지와 그림자 이미지를 촬영하고 상기 이미지를 분석하는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 상보형금속산화반도체부; 및 상기 상보형금속산화반도체부의 상기 배치부에 위치된 상기 미세조류에 광원을 조사하는 발광다이오드부;를 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게는, 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류의 상태를 구분하고 분석할 수 있다.
바람직하게는, 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 자동화된 이미지 분석 기술을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 상기 미세조류를 건강한 상태, 포낭 상태, 그리고 죽은 상태로 각각 분류하여 분석할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법은 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치를 사용하여 생태독성을 평가하고 분석하는 방법에 있어서, (a) 이미지를 로드하는 단계; (b) 상기 이미지에서 중심점을 찾는 단계; (c) 상기 중심점의 CMV 값을 분석하는 단계; (d) 상기 중심점에서 오른쪽으로 일정 크기만큼의 화소를 선택하는 단계; (e) MMD(max-min)를 계산하는 단계; (f) 상기 MMD 값을 판단하는 단계; (g) 상기 (f)단계에서 참(True)인 경우 SMD(MMD의 SD)를 계산하는 단계; 및 (h) 상기 SMD를 저장하는 단계;를 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게는, 상기 (f) 상기 MMD 값을 판단하는 단계가 거짓(False)일 경우 각도를 변경하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류의 개체수를 분석할 수 있다.
바람직하게는, 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류의 상태를 구분하고 분석할 수 있다.
바람직하게는 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 자동화된 이미지 분석 기술을 이용할 수 있다.
바람직하게는 상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 상기 미세조류를 건강한 상태, 포낭 상태, 그리고 죽은 상태로 각각 분류하여 분석할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법을 구현하기 위한 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체일 수 있다.
기타 실시예의 구체적인 사항은 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용" 및 첨부 "도면"에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 각종 실시예를 참조하면 명확해질 것이다.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 각 실시예의 구성만으로 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로도 구현될 수도 있으며, 단지 본 명세서에서 개시한 각각의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구범위의 각 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐임을 알아야 한다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체와 발광다이오드를 이용한 미세조류 측정 장치는 고가의 광원, 광학스테이지 그리고 광학렌즈 등이 불필요하므로 저가의 장치 제작이 가능하다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체부로 촬영한 이미지를 이미지 프로세싱 기술로 분석하므로 자동화 분석 시스템으로 개발가능하다. 이는 생태독성평가가 가능한 전문가가 측정에 소모하는 시간이 비약적으로 줄어든다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체로 실시간 촬영하고, 촬영한 이미지를 분석하므로 미세조류를 고정(편모 기능을 제거)하는 과정 및 시약이 불필요하다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류의 상태를 분석할 수 있는 기술은 미세조류를 건강한 상태, 포낭 상태, 그리고 죽은 상태로 각각 분류하여 분석 가능한 기술이다.
본 발명의 기술은 현재 수행되는 전문가의 수동개수 과정에서 발생하는 건강한 상태와 포낭 상태의 미세조류 구분을 수월하게 하며, 염색과정을 통해 분류 가능한 죽은 상태의 미세조류를 염색과정 없이 분류할 수 있다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류의 상태 분석 기술을 통해 세포 상태분석 자동화 및 무염색 장치 개발이 가능하다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류 상태 분석 기술은 기존의 생태독성평가에서 수행중인 96 시간의 급성 분석에서 측정 시간뿐만 아니라 미세조류에 독성 물질이 미치는 영향을 분석하는 시간이 비약적으로 단축된다.
본 발명에 의할 경우, 현재의 생태독성평가는 죽은 개체수를 측정하거나 살아있는 개체수를 측정하고 이를 분석하여 결과를 도출한다. 하지만 본 발명 기술은 독성 물질에 노출되었을 시 발생하는 미세조류의 상태변화를 분석할 수 있으므로 기존의 없던 다양한 연구 자료를 제공할 수 있다. 예를 들어 독성 물질 농도에 따라 미세조류가 죽지 않고 회복하는 기전에 대한 연구나 미세조류의 회복능력에 대한 연구 등에 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 개념도이다.
도 2는 도 1의 미세조류 상태의 현미경 이미지와 그림자 이미지 사진이다.
도 3은 도 1의 미세조류 형태 및 그림자 파라미터 그래프이다.
도 4는 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치를 이용한 생태독성평가 분석 방법의 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과를 표준 수동 분석 장치와 비교한 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과를 표준 수동 분석 방법과 비교한 생태독성평가(EC50) 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과인 추후 성장저해시험 측정 단축 기술 가능성을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
더 나아가서, 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소의 "내부에 존재하거나, 연결되어 설치된다"고 기재한 경우에는, 이 구성 요소가 다른 구성 요소와 직접적으로 연결되어 있거나 접촉하여 설치되어 있을 수 있고, 일정한 거리를 두고 이격되어 설치되어 있을 수도 있으며, 일정한 거리를 두고 이격되어 설치되어 있는 경우에 대해서는 해당 구성 요소를 다른 구성 요소에 고정 내지 연결시키기 위한 제 3의 구성 요소 또는 수단이 존재할 수 있으며, 이 제 3의 구성 요소 또는 수단에 대한 설명은 생략될 수도 있음을 알아야 한다.
반면에, 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소에 "직접 연결"되어 있다거나, 또는 "직접 접속"되어 있다고 기재되는 경우에는, 제 3의 구성 요소 또는 수단이 존재하지 않는 것으로 이해하여야 한다.
마찬가지로, 각 구성 요소 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 " ~ 사이에"와 "바로 ~ 사이에", 또는 " ~ 에 이웃하는"과 " ~ 에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지의 취지를 가지고 있는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서 "일면", "타면", "일측", "타측", "제 1", "제 2" 등의 용어는, 사용된다면, 하나의 구성 요소에 대해서 이 하나의 구성 요소가 다른 구성 요소로부터 명확하게 구별될 수 있도록 하기 위해서 사용되며, 이와 같은 용어에 의해서 해당 구성 요소의 의미가 제한적으로 사용되는 것은 아님을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에서 "상", "하", "좌", "우" 등의 위치와 관련된 용어는, 사용된다면, 해당 구성 요소에 대해서 해당 도면에서의 상대적인 위치를 나타내고 있는 것으로 이해하여야 하며, 이들의 위치에 대해서 절대적인 위치를 특정하지 않는 이상은, 이들 위치 관련 용어가 절대적인 위치를 언급하고 있는 것으로 이해하여서는 아니된다.
더욱이, 본 발명의 명세서에서는, "부", "기", "모듈", "장치" 등의 용어는, 사용된다면, 하나 이상의 기능이나 동작을 처리할 수 있는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어, 또는 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있음을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에서는 각 도면의 각 구성 요소에 대해서 그 도면 부호를 명기함에 있어서, 동일한 구성 요소에 대해서는 이 구성 요소가 비록 다른 도면에 표시되더라도 동일한 도면 부호를 가지고 있도록, 즉 명세서 전체에 걸쳐 동일한 참조 부호는 동일한 구성 요소를 지시하고 있다.
본 명세서에 첨부된 도면에서 본 발명을 구성하는 각 구성 요소의 크기, 위치, 결합 관계 등은 본 발명의 사상을 충분히 명확하게 전달할 수 있도록 하기 위해서 또는 설명의 편의를 위해서 일부 과장 또는 축소되거나 생략되어 기술되어 있을 수 있고, 따라서 그 비례나 축척은 엄밀하지 않을 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
도 1은 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 개념도이다.
도 2는 도 1의 미세조류 상태의 현미경 이미지와 그림자 이미지 사진이다.
도 3은 도 1의 미세조류 형태 및 그림자 파라미터 그래프이다.
도 4는 본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)를 이용한 생태독성평가 분석 방법의 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과를 표준 수동 분석 장치와 비교한 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과를 표준 수동 분석 방법과 비교한 생태독성평가(EC50) 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 성장저해시험(HNS;acetone)을 통한 발명된 생태독성평가 분석장치의 검증 결과인 추후 성장저해시험 측정 단축 기술 가능성을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)는 미세조류(1)를 분석하여 생태독성을 평가하고 분석하는 장치에 있어서, 상기 미세조류(1)를 위치하는 배치부(15)가 상단에 구비되고 상기 미세조류(1)의 현미경 이미지와 그림자 이미지를 촬영하고 상기 이미지를 분석하는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 상보형금속산화반도체부(10) 및 상기 상보형금속산화반도체부(10)의 상기 배치부(15)에 위치된 상기 미세조류(1)에 광원을 조사하는 발광다이오드부(20);를 포함하여 구성된다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)는 상보형금속산화반도체부(10) 위에 배치부(15)를 구비하고 배치부(15)에 미세조류(1)를 위치시킨 후, 발광다이오드(20)을 미세조류(1)에 조사하는 간단한 구조로 구현된다. 특히, 상보형금속산화반도체부(10)를 통해 획득한 이미지는 전용 분석 프로그램으로 분석되어 사용자에게 미세조류(1)의 농도와 상태 결과를 제공한다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)는 상보형금속산화반도체부(10)를 통해 획득한 미세조류(1)의 상태와 그에 따라 얻어지는 이미지를 확보하였다.
사용된 미세조류(1)는 두날리엘라 테르티올레타(dunaliella tertiolecta)로 스트레스(독성)에 노출되면, 본래의 모습(51)에서 포낭의 형태(61)로 상태를 변형하며 운동성을 상실하게 된다.
나아가 스트레스의 정도가 심해지면 세포벽이 허물어져 사세포의 형태(71)로 상태를 변형한다.
현미경으로 획득한 미세조류(1)의 이미지와 그에 따라 변화하는 CMOS 이미지를 확보하여 미세조류(1)의 그림자를 분석할 수 있는 파라미터를 도 3과 같이 수립하였다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 도 4에 도시된 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100) 알고리즘을 활용하여 미세조류(1)의 농도와 상태를 분석한 결과를 보여준다.
사용된 분석 파라미터는 CMV(Central Maxima Value) 와 SMD(standard deviation of MMD) 값으로, 각각의 정의는 도 4에 포함되어 있다. 533개의 건강한 상태의 미세조류(1)와 501개의 포낭 상태의 미세조류(1)와 485개의 죽은 상태의 미세조류(1)를 CMV와 SMD 값으로 분석하면 각각의 상태에 따라 구분 가능하다.
세포의 상태는 절대적인 것이 아니므로 구분 경계가 모호할 순 있지만, 건강한 상태의 미세조류(1)는 초록색 동그라미 영역에, 포낭 상태의 미세조류(1)는 파란색 동그라미 영역에, 죽은 상태의 미세조류(1)는 빨간색 동그라미 영역에 포함된다.
이를 분석하면, 건강한 상태의 미세조류(1)가 스트레스에 노출되면, SMD 값이 작아지지만 CMV 값의 변화는 없다. 하지만 더 많은 스트레스에 노출되어 세포가 죽으면, SMD 값이 작아지며 CMV 값은 커진다. 죽은 상태의 미세조류(1)와 포낭 상태의 미세조류(1)를 비교하면, SMD 값은 변화가 없으며, CMV 값이 커지는 형태를 보인다.
본 발명의 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 분석방법을 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 분석방법은 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치를 사용하여 생태독성을 평가하고 분석하는 방법에 있어서, 이미지를 로드하는 단계(S110 단계); 상기 이미지에서 중심점을 찾는 단계(S120 단계); 상기 중심점의 CMV 값을 분석하는 단계(S125 단계); 상기 중심점에서 오른쪽으로 일정 크기만큼의 화소를 선택하는 단계(S130 단계); MMD(max-min)를 계산하는 단계(S140 단계); 상기 MMD 값을 판단하는 단계(S150 단계); 상기 S150 단계에서 참(True)인 경우 SMD(MMD의 SD)를 계산하는 단계(S160 단계); 및 상기 SMD를 저장하는 단계(S170 단계); 및 S150 단계인 MMD 값을 판단하는 단계가 거짓(False)일 경우 각도를 변경하는 단계(S155 단계);를 포함하여 구성된다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 분석방법은 다음과 같은 단계로 실시된다.
상보형금속산화반도체부(10)를 통해 촬영된 미세조류(1)는 촬영된 이미지의 현미경 이미지 및 그림자 이미지를 로드한다(S110 단계),
이미지 분석을 통해 중심점을 찾는다(S120단계).
중심점의 CMV 값을 분석한다(S125단계).
중심점으로부터 오른쪽으로 일정 크기만큼의 화소의 밝기를 측정한다(S130 단계),
이중 최대 밝기와 최소 밝기의 화소를 찾아 이를 빼준다. 이를 MMD(maxima minima distance) 값이라 명명한다(S140 단계).
여기서 MMD 값을 판단한다(S150 단계).
만일 S150 단계에서 360도의 MMD 값을 확보하지 아니하여 S150 단계가 거짓(False)로 판정되면, 중심점으로부터 오른쪽으로 일정 크기만큼의 화소에 가상의 선을 만들고 함수를 이용하여 각도를 변경시킨다. 회전시킨 선과 동일 선상에 있는 일정 크기만큼의 화소를 선택하여 2번째 MMD 값을 도출한다(S155 단계). 이렇게 360도 회전하는 동안 다수의 MMD 값을 확보할 수 있다.
S150 단계와 S155 단계를 반복하여 360도의 MMD 값을 확보하여 S150 단계가 참이면 확보된 MMD 값의 표준편차를 계산한다(S160 단계). 이를 SMD(standard deviation of MMD) 값이라 명명한다.
계산된 SMD를 저장한다(S170 단계).
이와 같은 단계들을 거쳐 본 발명의 실시예에 의한 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 분석방법이 종료된다.
본 발명의 실시예를 통해 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100) 및 그 분석방법의 동작을 설명하면 다음과 같다.
[실시예]
본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100) 및 그 분석방법을 독성 시험 평가 적용해 성능을 확인해 보았다.
독성 물질로는 아세톤(acetone)을 사용하였으며, 지수식을 사용하는 시험방법으로 온도는 20oC를 유지시켰으며, 백색형광등을 사용해 조도를 6,000~7,000 lx으로 연속해서 조사했다.
3개의 반복구에 초기 농도 20,000 cells/mL를 접종하였으며 진탕속도는 100 r/min으로 설정하였다. 희석수는 영양배지를 포함한 무독성 여과해수를 사용하였으며, 72시간동안 성장저해를 분석하였다.
생태독성 평가 유효기준은 표 1에 제시된 바와 같다.
항목
 조건
시험방법
 지수식
온도
 (20± 2) ˚C
광원
 백색형광등
조도
 (6,000-10,000) lx
광주기
 연속조명
시험용기부피
 250 mL
시험물질 용량
 100 mL
접종밀도
 10,000~20,000 cells/mL
환수
 없음
반복구의 수
 3 ~ 4
진탕속도
 100 r/min
폭기
 없음
희석수
 영양배지를 포함한 무독성 여과해수
시험기간
 72h
시험종말점
 성장저해
본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100) 및 그 분석방법 실시예의 실험 조건은 표 2에 제시된 바와 같다. 실험 조건은 생태독성 평가 유효기준에 만족한다.
항목
 조건
시험방법
 지수식
온도
 (20) ˚C
광원
 백색형광등
조도
 (6,000-7,000) lx
광주기
 연속조명
시험용기부피
 250 mL
시험물질 용량
 100 mL
접종밀도
 20,000 cells/mL
환수
 없음
반복구의 수
 3
진탕속도
 100 r/min
폭기
 없음
희석수
 영양배지를 포함한 무독성 여과해수
시험기간
 72h
시험종말점
 성장저해
도 5를 참조하면, 본 발명의 일실시예에서는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 미세조류 분석 방법 중 대표적인 SR 챔버와 헤마사이토미터를 대조군으로 사용하여 본 연구 기술의 성능을 검증하였다. 여기서, 24 시간마다 시료에 포함된 미세조류(1)의 농도를 분석하였다.
2개의 대조군은 세포를 염색하였으며, 제안한 기술은 세포를 염색하지 않고 측정하였다. 대조군은 현미경(200x)을 사용하였으며, 숙련된 전문가가 미세조류(1) 계수를 수기로 담당하였다.
그러므로 대조군의 분석방법에 비해 자동화된 제안된 기술이 헤마사이토미터와 비교하여 2배, SR 챔버와 비교하여 6배 개선된 측정 시간 단축 효과를 확인할 수 있었다.
SR 챔버를 기준으로 헤마사이토미터와 제안된 기술의 측정 오차를 비교하면 4번의 측정 오차 평균으로 헤마사이토미터는 9.5%이며, 제안된 기술은 12.075%의 오차율을 보였다. 반면 헤마사이토미터를 기준으로 SR 챔버와 제안된 기술의 오차율을 계산하면, SR 챔버는 10.58%이며, 제안된 기술은 13.68%의 오차율을 보인다.
본 발명의 일실시예에서는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100) 및 그 분석방법의 실시예에서 계수 오차율(SR chamber 기준)은 표 3에 제시된 바와 같다.
0h
 24h
 48h
 72h
Hemocytometer
 17%
 10%
 8%
 3%
Developed analyzer 19%
 21%
 8%
 0.3%
도 6을 참조하면, 독성 물질의 반수영향농도(EC50)를 확보하기 위하여 미세조류(1)를 이용한 성장저해시험을 진행한다. 반수영향농도는 다양한 독성 분석에 기본이 되는 중요한 자료로 취급된다.
아세톤으로 독성시험을 수행한 결과를 분석하면, SR 챔버는 25.6 mL/L의 결과를 획득하였고, 헤마사이토미터는 24.9 mL/L의 결과를 획득하였으며, 제안한 기술은 24.2 mL/L의 결과를 획득하였다.
결론적으로, SR 챔버 기준으로 제안한 기술의 오차율은 5.47%이며, 헤마사이토미터 기준으로 제안한 기술의 오차율은 2.81%이다.
본 발명의 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치(100)의 일실시예에서 실험 결과는 표 4에 제시된 바와 같다.
SR chamber
 Hemocytometer
 Developed analyzer
EC50
25.6 mL/L
 24.9 mL/L
 24.2 mL/L
오차율
 기준
 2.7 %
 5.4 %
도 7을 참조하면, 성장저해시험은 독성 물질의 반수영향농도를 구하기 위한 시험임으로 고농도(세포를 죽이는 독성 농도)의 독성 물질을 사용하지 않는다.
그러므로 CMV는 도 3에서 설명한 바와 같이 변화가 없다. 그러나 독성 물질에 노출되는 시간에 따라 미세조류(1)에 가해지는 스트레스가 커지므로 SMD 값의 변화가 나타난다.
독성 물질에 노출 후 6시간 경과한 시점에서의 SMD와 성장저해시험이 마무리된 72시간 경과한 시점에서의 SMD 값을 비교해보면, 독성 농도가 높을수록 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
이는 타원형인 두날리엘라 테르티올레타(dunaliella tertiolecta)가 원형에 가깝게 변형되었다는 것을 의미한다. 다시 말해, 분열과 성장 기능을 보유하고 있는 타원형의 세포가 동적이고 분열하지 않는 원형의 세포로 변화하는 것이다. 결국 원형 세포로 변형된 개체수가 많을수록 추후 측정되는 조류의 개체수 농도가 낮을 것을 신속하게 예측할 수 있다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체부(10)와 발광다이오드(20)를 이용한 미세조류 측정 장치(100)는 고가의 광원, 광학스테이지 그리고 광학렌즈 등이 불필요하므로 저가의 장치 제작이 가능하다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체부(10)로 촬영한 이미지를 이미지 프로세싱 기술로 분석하므로 자동화 분석 시스템으로 개발가능하다. 이는 생태독성평가가 가능한 전문가가 측정에 소모하는 시간이 비약적으로 줄어든다.
본 발명에 의할 경우, 상보형금속산화반도체로 실시간 촬영하고, 촬영한 이미지(51,61,71)를 분석하므로 미세조류(1)를 고정(편모 기능을 제거)하는 과정 및 시약이 불필요하다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류(1)의 상태를 분석할 수 있는 기술은 미세조류(1)를 건강한 상태(51), 포낭 상태(61), 그리고 죽은 상태(71)로 각각 분류하여 분석 가능한 기술이다.
본 발명의 기술은 현재 수행되는 전문가의 수동개수 과정에서 발생하는 건강한 상태(51)와 포낭 상태(61)의 미세조류(1) 구분을 수월하게 하며, 염색과정을 통해 분류 가능한 죽은 상태(71)의 미세조류(1)를 염색과정 없이 분류할 수 있다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류(1)의 상태 분석 기술을 통해 세포 상태분석 자동화 및 무염색 장치 개발이 가능하다.
본 발명에 의할 경우, 미세조류(1) 상태 분석 기술은 기존의 생태독성평가에서 수행중인 96 시간의 급성 분석에서 측정 시간뿐만 아니라 미세조류(1)에 독성 물질이 미치는 영향을 분석하는 시간이 비약적으로 단축된다.
본 발명에 의할 경우, 현재의 생태독성평가는 죽은 개체수를 측정하거나 살아있는 개체수를 측정하고 이를 분석하여 결과를 도출하지만 본 발명은 독성 물질에 노출되었을 시 발생하는 미세조류(1)의 상태변화를 분석할 수 있으므로 기존의 없던 다양한 연구 자료를 제공할 수 있다. 예를 들어 독성 물질 농도에 따라 미세조류(1)가 죽지 않고 회복하는 기전에 대한 연구나 미세조류(1)의 회복능력에 대한 연구 등에 적용이 가능하다.
이상, 일부 예를 들어서 본 발명의 바람직한 여러 가지 실시예에 대해서 설명하였지만, 본 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용" 항목에 기재된 여러 가지 다양한 실시예에 관한 설명은 예시적인 것에 불과한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이상의 설명으로부터 본 발명을 다양하게 변형하여 실시하거나 본 발명과 균등한 실시를 행할 수 있다는 점을 잘 이해하고 있을 것이다.
또한, 본 발명은 다른 다양한 형태로 구현될 수 있기 때문에 본 발명은 상술한 설명에 의해서 한정되는 것이 아니며, 이상의 설명은 본 발명의 개시 내용이 완전해지도록 하기 위한 것으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐이며, 본 발명은 청구범위의 각 청구항에 의해서 정의될 뿐임을 알아야 한다.
1 : 미세조류
10 : 상보형금속산화반도체부
15 : 배치부
20 : 발광다이오드부
51 : 미세조류(1)의 정상형태의 현미경 이미지와 그림자 이미지
61 : 미세조류(1)의 포낭형태의 현미경 이미지와 그림자 이미지
71 : 미세조류(1)의 사세포형태의 현미경 이미지와 그림자 이미지
100 : 생태독성평가 분석장치

Claims (12)

  1. 미세조류(1)를 분석하여 생태독성을 평가하고 분석하는 장치에 있어서,
    상기 미세조류(1)를 위치하는 배치부(15)가 상단에 구비되고 상기 미세조류(1)의 현미경 이미지와 그림자 이미지를 촬영하고 상기 이미지를 분석하는 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 상보형금속산화반도체부(10); 및
    상기 상보형금속산화반도체부(10)의 상기 배치부(15)에 위치된 상기 미세조류(1)에 광원을 조사하는 발광다이오드부(20);를 포함하여 구성되고,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 상기 미세조류(1) 이미지의 중심점의 CMV(Central Maxima Value)를 계산하고, 상기 중심점으로부터 일정 개수의 복수개의 화소의 최대밝기와 최소밝기의 차이로 MMD(Maxima Minima Distance)를 계산하고, 상기 MMD의 표준편차로 상기 SMD(Standard Deviation of MMD)를 계산하고, 상기 CMV와 상기 SMD를 비교하여 상기 미세조류(1)를 건강한 상태(51), 포낭 상태(61), 그리고 죽은 상태(71)로 각각 분류하여 분석하고,
    상기 미세조류(1)가 스트레스에 노출되면 상기 건강한 상태(51)는 상기 SMD가 작아지지만 상기 CMV가 일정하고,
    상기 미세조류(1)가 더 많은 스트레스에 노출되어 죽으면 상기 죽은 상태(71)는 상기 SMD가 작아지지만 상기 CMV가 증가하고,
    상기 죽은 상태(71)와 상기 포낭 상태(61)를 비교하면 상기 SMD는 변화가 없으며 상기 CMV가 증가하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류(1)의 개체수를 분석하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류(1)의 상태를 구분하고 분석하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 자동화된 이미지 분석 기술을 이용하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치.
  5. 삭제
  6. 미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치를 사용하여 생태독성을 평가하고 분석하는 방법에 있어서,
    (a) 이미지를 로드하는 단계;
    (b) 상기 이미지에서 중심점을 찾는 단계;
    (c) 상기 중심점의 CMV(Central Maxima Value) 를 분석하는 단계;
    (d) 상기 중심점에서 오른쪽으로 일정 개수의 복수개의 화소를 선택하는 단계;
    (e) 상기 복수개의 화소의 최대밝기와 최소밝기의 차이로 MMD(Maxima Minima Distance)를 계산하는 단계;
    (f) n도 회전하여 360/n 개의 상기 MMD 를 확보하였는지 여부를 판단하는 단계;
    (g) 상기 (f)단계에서 n도씩 360/n회, 360도 회전하여 360/n 개의 상기 MMD 를 확보한 경우 SMD(Standard Deviation of MMD)를 계산하는 단계;
    (h) 상기 SMD를 저장하는 단계; 및
    (i) 상기 미세조류 이미지분석 프로그램이 상기 CMV와 상기 SMD를 비교하여 상기 미세조류(1)를 건강한 상태(51), 포낭 상태(61), 그리고 죽은 상태(71)로 각각 분류하여 분석하는 단계;를 포함하여 구성되고,
    상기 미세조류(1)가 스트레스에 노출되면 상기 건강한 상태(51)는 상기 SMD가 작아지지만 상기 CMV가 일정하고,
    상기 미세조류(1)가 더 많은 스트레스에 노출되어 죽으면 상기 죽은 상태(71)는 상기 SMD가 작아지지만 상기 CMV가 증가하고,
    상기 죽은 상태(71)와 상기 포낭 상태(61)를 비교하면 상기 SMD는 변화가 없으며 상기 CMV가 증가하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (f)단계에서 n도씩 360/n회, 360도 회전하지 못하여 360/n 개의 상기 MMD 를 확보하지 못한 경우,
    상기 중심점으로부터 오른쪽으로 일정 개수의 복수개의 화소에 가상의 선을 만들고 함수를 이용하여 상기 가상의 선을 n도 회전시키고,
    n도 회전시킨 상기 가상의 선과 동일 선상에 있는 일정 개수의 복수개의 화소를 선택하여 2번째 MMD 를 도출하고,
    이를 360/n회 반복하여 360도 회전하는 동안 360/n 개의 상기 MMD를 확보하는 단계;를 더 포함하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류(1)의 개체수를 분석하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 시약을 사용하지 않고 상기 미세조류(1)의 상태를 구분하고 분석하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 미세조류 이미지분석 프로그램은 자동화된 이미지 분석 기술을 이용하는 것을 특징으로 하는,
    미세조류 이미지분석 프로그램이 탑재된 생태독성평가 분석장치의 분석방법.
  11. 삭제
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 구현하기 위한 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.
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