KR101835570B1

KR101835570B1 - 트리코데르마 속 J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법

Info

Publication number: KR101835570B1
Application number: KR1020160072751A
Authority: KR
Inventors: 강도형; 이영득; 오철홍; 박건후
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2018-03-08
Also published as: KR20170140493A

Abstract

본 발명은 트리코데르마 속 J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트리코데르마 속(Trichoderma sp.)의 J113 균주로부터 유래되고, 녹말 및 글리코겐의 글라코시딕 결합의 무작위 가수분해능을 가지는 알파-아밀라아제인 Ayt40 글리코시다아제와 녹말의 비환원성 말단(non-reducing end)으로부터 글루코스 생성능을 가지는 글루코아밀라아제인 Ayt70 글리코시다아제를 이용한 다당체(polysaccharide)의 가수분해방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법은 시아노박테리아(cyanobacteria), 미세조류(microalgae) 또는 식물세포 유래 바이오매스(biomass)에 포함된 다당체의 당화 효율(saccharification efficiency)을 증가시킬 수 있으므로 바이오에탄올 생산에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

트리코데르마 속 J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법{Ayt40 Glycosidase and Ayt70 Glycosidase Derived from Trichoderma sp. J113, and Method for Hydrolyzing Polysaccharide Using the Same}

본 발명은 트리코데르마 속 J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법에 관한 것이다.

지구온난화 및 석유자원 고갈로 인한 대체에너지의 필요성이 증가함에 따라 이러한 문제를 해결하려는 국제 사회의 노력이 활발해지고 있다. 기후변화 문제 해결 수단으로 수송용 바이오 연료의 중요성이 인식됨에 따라 바이오연료의 보급은 가파르게 증가하여 왔다. 바이오에탄올은 화석연료와 달리 연소 시 대기 중에 이산화탄소의 증가를 유발하지 않는 친환경 재생에너지로 각광받고 있다. 제 1세대 바이오에탄올은 곡물을 원료로 하는데 이의 원료가 되는 곡물수요가 급증하여 국제 곡물가격을 급등시키는 주요원인으로 작용하기 때문에 문제가 되고 있다.

세계적으로 화석연료에 대한 의존 완화와 지구온난화에 대한 대책으로 바이오에탄올에 대한 기대가 증가되어 왔으나 식량을 원료로 한다는 문제점으로 인하여 시장성장에 한계가 있어왔다. 이에 목질계에 의한 제 2세대 바이오에탄올에 대한 연구가 증가하였다. 하지만 목질섬유소계 바이오매스는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 등으로 구성되어 있어서 이들의 선택적 분리 분해 등의 전처리 및 당화기술, 헤미셀룰로스 유래의 목당(자일로스, 크실로오스, Xylose)등의 펜토오스류를 효율적으로 에탄올로 변환하는 미생물의 탐색 또는 육종기술의 곤란성이 아직까지 기술적인 문제로 남아있으며, 상업적으로 적용할 수 있는 생산 경제성 또한 극복해야 할 숙제로 남아있다.

신재생에너지를 위한 바이오매스로 광합성미생물(photosynthetic microorganism)에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 미세조류 및 남조류가 이에 속하는데, 이들 생물은 바이오연료를 생산하는데 있어 다른 육상작물에 비하여 다양한 이점을 가지고 있다. 첫째로 주요 식용작물을 이용하지 않기 때문에 국제 곡물시장에 악영향을 미치지 않으며, 대규모 경작지를 필요로 하지 않는다. 광합성미생물은 그 종류에 따라 해수, 담수 등에서 배양이 가능하며, 바이오디젤, 바이오에탄올 뿐만 아니라 다양한 형태의 바이오에너지의 원료로 사용할 수 있다.

최근, 남조류는 바이오에탄올 생산을 위한 옥수수와 사탕수수의 대체원료로 관심이 집중되고 있다. 남조류는 주로 생리활성에 의한 의약품산업 및 다양한 건강보조식품산업에 이용되어져 왔다. 광합성미생물은 바이오에탄올 생산을 위한 차세대원료로서의 다양한 이점을 보여주었으며 그중에서 남조류는 바이오에탄올 생산을위한 원료로써 매우 적합하다. 남조류는 주로 에너지를 글리코겐 형태로 저장하고 있으며, 배양조건에 따라 바이오매스의 50% 이상이 글리코겐 함량을 나타낸다고 알려져 있다. 또한, 세포벽이 주로 펩티도글라이칸층으로 이루어져 있고, 다른 미세조류에 비해 단순한 형태를 가지고 있어, 바이오에탄올 생산을 위한 글리코겐을 가수분해하기 위해 남조류 바이오매스의 전처리공정이 필요없는 장점을 가지고 있다.

곰팡이로부터 분리된 가수분해효소들은 셀룰로오스(cellulose), 자일란(xylan), 녹말(starch)과 같은 복잡한 다당류를 발효를 위한 당으로 전환하기 위하여 넓게 사용되고 있다. 특히, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.)에 속하는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)는 수십년 동안 산업적 이용을 위하여 많은 연구가 이루어졌다. 최근 트리코데르마 속(Trichoderma sp.)과 다양한 곰팡이 종을 대상으로 바이오에탄올 생산을 위하여 효율적인 셀룰로오스 및 리그노셀루로오스 바이오매스에 대한 가수분해 전처리시스템을 개발하기 위한 유전학적 연구가 많이 이루어지고 있다.

곰팡이 유래 아밀라아제에 대한 연구는 농업부산물 가공, 바이오에탄올 생산 등 다양한 산업에 적용할 수 있어 그 관심이 증가되고 있다. 효율적으로 낮은 생산가격으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서 새롭고 다양한 고효율의 미생물 유래 아밀라아제의 개발이 매우 중요하다. 따라서, 자연으로부터 새로운 아밀라아제를 발굴하거나 미생물, 식물, 동물 등 다양한 생물 유래의 아밀라아제에 유전적 변형을 가하여 바이오에탄올의 생산효율을 증가시키는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 시아노박테리아, 미세조류 또는 식물세포 유래 바이오매스에 포함된 다당체로부터 단당류, 이당류 및 올리고당류로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 가수분해산물을 용이하게 수득하고자, 트리코데르마 속(Trichoderma sp .) J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 정제하였고, 상기 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액을 이용한 다당체의 가수분해방법으로 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스의 당화 효율이 증가되는 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1483182호(등록일: 2015.1.09)

본 발명의 목적은 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법을 제공하는 데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법은, (a) 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주를 밀겨가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양된 J113 균주가 포함된 배양액을 교반 및 여과하여 상등액을 분리하고, 황산암모늄 40%~70% 포화도에서 상기 상등액의 단백질을 침전시키는 단계; (c) 침전된 상기 단백질을 크로마토그래피로 정제하여 분획(fraction)을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 분획 중 녹말분해활성(amylolytic activity)을 가지는 글리코시다아제 함유 분획을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

삭제

또한, 상기 (b) 단계에서 황산암모늄 40% 포화도에서 상기 상등액의 단백질이 침전되고, 상기 글리코시다아제 함유 분획은 알파-아밀라아제(α-amylase) 활성을 가지는 Ayt40 글리코시다아제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른, 상기 Ayt40 글리코시다아제는 39.6~40.4℃에서 최적 활성을 가지고, 30℃ 이하에서 열적 안정성(heat stability)을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른, 상기 Ayt40 글리코시다아제는 pH 3.96~5.05에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 글리코시다아제 함유 분획은 글루코아밀라아제(glucoamylase; glucan 1,4-α-glucosidase) 활성을 가지는 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 Ayt70 글리코시다아제는 단백질로서 최적온도 64.35~65.65℃; 최적 pH 4.95~5.05; 온도 50℃ 이하 및 pH 5에서 90분 이상 안정; 및 전기영동으로 확인된 분자량이 62.766~64.034KDa인 것을 특징으로 한다.

삭제

또한, 상기 Ayt70 글리코시다아제는 Mn²⁺의 2가 양이온에 의해 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한,

(a) 상기 Ayt40 글리코시다아제 및 상기 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액을 준비하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 준비된 효소용액을 다당체(polysaccharide)가 함유된 혼합물에 첨가하고, 35~65℃에서 1~240분간 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 생성되고 당류를 함유하는 가수분해산물을 수득하는 단계;를 포함하는 트리코데르마 속(Trichoderma sp .) J113 균주 유래 글리코시다아제를 이용한 다당체의 가수분해방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 상기 Ayt40 글리코시다아제 및 상기 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액은 황산암모늄 침전 또는 겔 크로마토그래피(gel chromatography)를 통해 수득하여 준비되는 것을 특징으로 하는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제를 이용한 다당체의 가수분해방법을 제공한다.

본 발명에 따른 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법은 시아노박테리아(cyanobacteria), 미세조류(microalgae) 또는 식물세포 유래 바이오매스(biomass)에 포함된 다당체의 당화 효율(saccharification efficiency)을 증가시킬 수 있으므로 바이오에탄올 생산에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 2는 알파-아밀라아제(α-amylase)인 Ayt40 또는 글루코아밀라아제(gluco-amylase)인 Ayt70의 효소 활성을 30, 40 또는 50℃에서 확인한 것이다.
도 3은 Ayt40 또는 Ayt70의 처리시간에 따른 녹말의 가수분해산물을 TLC(Thin-layer chromatography)로 확인한 것이다.
도 4는 다양한 금속이온 또는 다양한 화학물질에 대한 효소의 활성을 나타낸 것으로, (A)는 Ayt40의 활성, (B)는 Ayt70의 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스에 대한 가수분해능을 나타낸 것으로, (A)는 40, 50 또는 60℃의 온도 변화, (B)는 pH 3~5의 pH 변화에 따른 가수분해활성을 당화율(reducing sugar, g/L)로 나타낸 것이다.
도 6은 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액에 망간 이온 첨가 여부에 따른 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스에 대한 가수분해능을 나타낸 것으로, (A)는 가압 멸균기(autoclave sterilizer) 멸균 전의 아쓰로스피라 맥시마 바이오매스, 및 (B)는 가압 멸균기로 멸균된 아쓰로스피라 맥시마 바이오매스를 이용한 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액의 아쓰로스피라 맥시마 바이오매스 유래 글리코겐 가수분해능을 당화율(reducing sugar, g/L)로 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.

그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서는 인천 연안의 영흥도에서 수집한 곰팡이로부터 분리되고, 아밀라아제 또는 글루코아밀라아제 활성을 가지는 효소들의 특성을 분석하였다. 더욱 상세하게는, 트리코데르마 속 J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제의 효소 활성을 최적화하기 위하여, 적정 온도, 적정 pH, 적정 이온 농도(Mn²⁺) 등 다양한 반응 조건에서 연구를 수행하였다. 아울러, 상기 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액을 다당체(polysaccharide)(예컨대, 전분, 글리코겐 또는 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스)에 첨가하고 적절한 반응조건에서 다당체의 가수분해를 수행한 다음, 당화율(reducing sugar, g/L)을 측정한 결과, 상기 효소용액은 상기 다당체에 대해 높은 당화 활성을 나타내었다. 따라서, Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액은 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스에 포함된 글리코겐과 같은 다당체를 단당류, 이당류 및/또는 올리고당류로 효율적으로 가수분해함으로써 바이오에탄올 생산에 용이하게 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 당화분해능을 가지는 곰팡이 균주를 인천 영흥도 해안가의 부패된 해초로부터 분리한 다음, 상기 균주로부터 genomic DNA를 추출하고, 상기 genomic DNA의 ITS(Internal transcribed spacer)(GenBank accession no. JX976325) 영역을 증폭하여 균주 종을 동정하고 계통수(phylogenetic tree)를 이용하여 계통학적 체계를 확립하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, J113 균주는 Trichoderma effusum ATCC MYA-4837과 Trichoderma sinense DAOM 230004에서 각각 99.6%과 99.4%의 유사도(similarity)를 나타내었다. 또한, J113 균주는 Longibrachiatum에 속하는 Trichoderma 종으로 동정되었다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주의 탄소원에 따른 가수분해능을 측정하였다. 그 결과, J113 균주는 포도당, 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101), 자일란(xylan) 또는 녹말이 탄소원으로 첨가된 Czapek-Dox agar 배지에서 빠르게 수평성장하였다. 특히, 배양 72시간 후에는 페트리디쉬의 주변에서 균사팁(hyphal tip)이 풍부하게 관찰되었다. 반면, CMC(carboxymethyl-cellulose)를 탄소원으로 함유하는 배지에서는 J113 균주의 수평성장이 느렸지만 균사체와 포자를 왕성하게(aggressively) 생성하였다. 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101)를 탄소원으로 첨가한 배지에서의 J113 균주의 수평성장은 포도당 및 녹말이 첨가된 배지와 같았으나 공기중 균사체(aerial mycelia)의 결핍이 육안으로 관찰되었다(데이터 미도시). 결국, J113 균주는 포도당, 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101) 또는 자일란(xylan)이 포함된 배지에서 성장할 수 있었고, J113 균주에서 탄수화물 복합체를 가수분해할 수 있는 가수분해효소가 분비되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 가수분해효소의 생산 및 정제를 수행하였다. 그 결과, CMC(carboxymethyl-cellulose), 자일란(xylan) 또는 녹말이 탄소원으로 첨가된 배양액에 J113 균주를 접종 및 배양하고, 원심분리하여 수득한 J113 균주 상등액에서는 셀룰라아제(cellulase), 자일란아제(xylanase) 및 아밀라아제(amylase)의 활성이 명확하게 관찰되지 않았다. 다만, 0.5%의 밀겨를 탄소원으로 하는 배양액에서 24시간 동안 배양된 J113 균주 상등액에서 자일란아제 및 아밀라아제 활성이 매우 명확하게 관찰되었다. 또한, J113 균주를 밀겨가 포함된 고체배지에 도포하여 배양시 매우 높은 자일란아제 및 아밀라아제 활성을 나타내었다(데이터 미도시). 결국, 배양액에 포함된 밀겨가 J113 균주의 아밀라아제 생성을 자극하는 주요 자극제로 작용하고 있음을 확인할 수 있었다(실시예 3 참조).

한편, 밀겨가 첨가된 배지에서 J113 균주를 배양한 다음, 황산암모늄으로 침전시킨 총 단백질을 겔 크로마토그래피(gel chromatography)를 통해 분획으로 수득한 다음, 녹말분해활성(amylolytic activity)을 측정하고 녹말분해활성을 가지는 단백질이 포함된 분획에 대해 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 실제 녹말분해활성을 나타내는 가수분해효소의 분자량을 겔 상에서 확인하였다. 그 결과, 40% 또는 40~70%의 황산암모늄으로 침전된 총 단백질로부터 정제된 녹말분해활성을 나타내는 단백질은 약 29.3과 약 63.4kDa의 분자량을 가지고, 각각 Ayt40 및 Ayt70으로 명명하였다(데이터 미도시).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 특성 분석을 수행한 결과,

(1) Ayt40 및 Ayt70의 최적 활성 온도: 도 2A에 나타난 바와 같이, Ayt40은 40℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 30~45℃의 범위에서 80%이상의 활성을 유지하였으나 75℃ 이상에서는 전혀 활성을 갖지 않았다. Ayt70의 경우는 65℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 55~70℃의 범위에서 60% 이상의 상대적 활성을 유지하였다.

(2) Ayt40 및 Ayt70의 최적 pH: 도 2B에 나타난 바와 같이, Ayt40의 최적 pH(효소 활성: 95% 이상)는 4~5이고, Ayt70의 최적 pH는 5로 나타났다.

(3) Ayt40 및 Ayt70의 열적 안정성(heat stability): 도 2C에 나타난 바와 같이, Ayt40은 30℃에서 30분간 전처리(pre-incubation)시 상대적 활성의 감소는 없었고, 90분간 전처리가 지속되면 80% 이상의 상대적 활성을 나타내어 열적 안정성(heat stability)을 유지하였으나, 40℃ 또는 50℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성이 급격하게 감소하였다.

또한. 도 2D에 나타난 바와 같이, Ayt70은 50℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성의 감소는 없었고, 90분간 전처리가 지속되면 80% 이상의 상대적 활성을 나타내어 열적 안정성을 유지하였으나, 60℃ 또는 70℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성이 급격하게 감소하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 가수분해 패턴 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, Ayt40 효소용액은 포도당(glucose, G). 맥아당(maltose, M) 및 다양한 크기의 올리고당을 생성하는 것으로 확인되었다. 반면, 도 3B에 나타난 바와 같이, Ayt70 효소용액은 대부분 포도당만을 생성하는 것으로 나타났다. 결국, Ayt40 및 Ayt70은 각각 알파-아밀라아제 활성 및 글루코아밀라아제 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 활성에 Mn²⁺가 미치는 영향분석을 수행하였다. 그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, Ayt70 분획과 녹말이 포함된 반응물에 Mn²⁺를 최종 농도가 5mM가 되도록 첨가시 Ayt70의 활성이 약 191% 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 도 4B에 나타난 바와 같이, Mn² ⁺첨가에 따른 Ayt40의 유의적인 활성 변화는 나타나지 않았다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 이용한 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스의 가수분해 패턴 분석을 온도 및 pH 조건하에서 수행하였다.

그 결과,

(1) 최적 온도: 도 5A에 나타난 바와 같이, Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 첨가한 다음, 40, 50 및 60℃에서 240분간 반응시 각각 3.9, 4.6 및 5.3g/L의 환원당을 생성하였다.

(2) 최적 pH: 도 5B에 나타난 바와 같이, Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 첨가한 다음, pH 4에서 240분간 반응시 가장 높은 가수분해 활성을 나타내었으며, pH 3.5, pH 4.5, pH 3 순으로 활성을 나타내었다. 또한, 글리코겐 대신 녹말을 기질로 사용하였을 때는 Ayt40 및 Ayt70 모두 pH 5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 아울러, 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)를 기질로 사용하였을 때는 pH 4에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 5에서는 50%의 활성만이 나타났다(데이터 미도시)(실시예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Mn²⁺첨가 여부에 따른 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 효소용액을 이용한 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)의 가수분해 패턴 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, Mn²⁺를 첨가하지 않고 상기 효소용액을 사용하여 150분간 반응시킬 경우, 20g/L의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)로부터 4.09g/L의 환원당이 생성되었다. 반면, Mn² ⁺를 첨가하고 상기 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 20g/L의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)로부터 7.81g/L의 환원당이 생성되었다.

또한, 도 6A에 나타난 바와 같이, Mn²⁺를 첨가하지 않고 상기 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 5.1g/L에 도달하는데 240분이 소요되었고, Mn² ⁺ 를 첨가하고 상기 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 8.3g/L에 도달하는데 210분이 소요되어 나타나 환원당의 생성효율이 증가한 것으로 확인되었다. 결국, 트리코데르마 속 J113 균주 유래 효소용액에 Mn² ⁺를 첨가한 다음, 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)와 반응시킬 경우 환원당의 생성효율 및 생성량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(실시예 8 참조).

따라서, 본 발명은 일 관점에서,

트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

상기 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주는 서열번호 1로 표시되는 ITS(Internal transcribed spacer)(GenBank accession No. JX976325)를 포함하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt40 글리코시다아제는 알파-아밀라아제(α-amylase) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt40 글리코시다아제는 26.007~29.593KDa, 바람직하게는 29.3KDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 분자량은 단백질 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정되었으며, 상기 Ayt40 글리코시다아제의 분자량은 단백질 번역 후 변형(post-translational modification)으로 증가 또는 감소될 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt40 글리코시다아제는 39.6~40.4℃, 바람직하게는 40℃에서 최적 활성을 가지고, 40℃ 이하, 바람직하게는 30℃에서 열적 안정성(heat stability)을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt40 글리코시다아제는 pH 3.96~5.05, 바람직하게는 pH 4~5, 더욱 바람직하게는 pH 5에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서,

트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 Ayt70 글리코시다아제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt70 글리코시다아제는 글루코아밀라아제(glucoamylase; glucan 1,4-α-glucosidase) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt70 글리코시다아제는 62.766~64.034KDa, 바람직하게는 63.4KDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 분자량은 단백질 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정되었으며, 상기 Ayt70 글리코시다아제의 분자량은 단백질 번역 후 변형(post-translational modification)으로 증가 또는 감소될 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt70 글리코시다아제는 64.35~65.65℃, 바람직하게는 65℃에서 최적 활성을 가지고, 65℃ 이하, 바람직하게는 50℃에서 열적 안정성(heat stability)을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt70 글리코시다아제는 pH 4.95~5.05, 바람직하게는 pH 5에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt70 글리코시다아제는 Mn²⁺의 2가 양이온에 의해 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(a) 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주를 적절한 배지에서 배양하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 J113 균주를 회수하고, 상기 회수된 J113 균주로부터 세포 추출액을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 세포 추출액을 크로마토그래피로 정제하여 분획(fraction)을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 분획 중 다당체(polysaccharide)를 특이적으로 가수분해하는 글리코시다아제 함유 분획을 수득하는 단계;를 포함하는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp .) J113 균주 유래 글리코시다아제의 정제방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

상기 (d) 단계에서 다당체(polysaccharide)를 특이적으로 가수분해하는 글리코시다아제 함유 분획은 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase; glucan 1,4-α-glucosidase)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 효소 활성을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서,

상기 다당체는 녹말 또는 글리코겐이거나, 시아노박테리아(cyanobacteria), 미세조류(microalgae) 또는 식물세포 유래 바이오매스(biomass)에 포함된 다당체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(b) 상기 (a) 단계에서 준비된 효소용액을 다당체(polysaccharide)가 함유된 혼합물에 첨가하고, 35~65℃에서 1~240분간 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 생성되고 당류를 함유하는 가수분해산물을 수득하는 단계;를 포함하는 트리코데르마 속(Trichoderma sp .) J113 균주 유래 글리코시다아제를 이용한 다당체의 가수분해방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

상기 Ayt40 글리코시다아제 및 상기 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액은 황산암모늄 침전 또는 겔 크로마토그래피(gel chromatography)를 통해 수득하여 준비될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서,

상기 황산암모늄 침전 방식으로 침전되고, Ayt40 글리코시다아제 및 상기 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 총 단백질 침전물은 적절한 버퍼 용액에 용해시키고, 추가적으로 탈염 공정(예컨대, 투석)을 거친 후 적절한 버퍼 용액에 희석하여 효소용액을 제조한 다음, 상기 효소용액을 다당체(polysaccharide)가 함유된 혼합물에 첨가하고, 반응시킨 다음, 당류를 함유하는 가수분해산물을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 효소용액을 다당체 함유 혼합물에 적절 함량으로 첨가하고, 35~65℃, 바람직하게는 40~60℃, 더욱 바람직하게는 40℃ 온도조건에서 1~240분간 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 생성된 포도당 함유 가수분해산물을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 효소용액은 "다당체 함유 혼합물:효소용액"의 단백질 중량비율이 100:0.6, 바람직하게는 100:0.12, 더욱 바람직하게는 100:0.24가 되도록 다당체 함유 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서,

상기 다당체 함유 혼합물은 시아노박테리아(cyanobacteria), 미세조류(microalgae) 및 식물세포로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 바이오매스(biomass)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서,

상기 시아노박테리아는 아쓰로스피라 속(Arthrospira sp.), 아그메넬륨 속(Agmenellum sp.), 아나바에나 속(Anabaena sp.), 아나바에놉시스 속(Anabaenopsis sp.), 아나시스티스 속(Anacystis sp.), 아파니조메논 속(Aphanizomenon sp.), 아스테로캡사 속(Asterocapsa sp.), 보르지아 속(Borzia sp.), 칼록쓰릭스 속(Calothrix sp.), 카마에시폰 속(Chamaesiphon sp.), 클로로글로에옵시스 속(Chlorogloeopsis sp.), 크로오코시디옵시스 속(Chroococcidiopsis sp.), 크로오코쿠스 속(Chroococcus sp.), 크리날륨 속(Crinalium sp.), 시아노박테리움 속(Cyanobacterium sp .), 시아노븀 속(Cyanobium sp .), 시아노시스티스 속(Cyanocystis sp .), 시아노스피라 속(Cyanospira sp .), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 실린드로스페르몹시스 속(Cylindrospermopsis sp.), 실린드로스페르뭄 속(Cylindrospermum sp.), 닥틸로코콥시스 속(Dactylococcopsis sp.), 데르모카르펠라 속(Dermocarpella sp.), 피체렐라 속(Fischerella sp.), 프레미엘라 속(Fremyella sp.), 게이틀레리아 속(Geitleria sp.), 게이틀레리네마 속(Geitlerinema sp.), 글로에박테르 속(Gloeobacter sp.), 글로에오캡사 속(Gloeocapsa sp.), 글로에오테세 속(Gloeothece sp.), 할로스피룰리나 속(Halospirulina sp.), 이엔갈리엘라 속(Iyengariella sp.), 렙톨링비아 속(Leptolyngbya sp.), 림노트릭스 속(Limnothrix sp.), 린그비아 속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 속(Microcoleus sp.), 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.), 마익소사르시나 속(Myxosarcina sp.), 노둘라리라 속(Nodularia sp.), 노스토크 속(Nostoc sp.), 노스토촙시스 속(Nostochopsis sp.), 옥실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 포르미디움 속(Phormidium sp.), 플랑크토트릭스 속(Planktothrix sp.), 플루로캅사 속(Pleurocapsa sp.), 프로클로로코쿠스(Prochlorococcus sp.), 프로클로론(Prochloron sp.), 프로클로로스릭스 속(Prochlorothrix sp.), 슈다나바에나 속(Pseudanabaena sp.), 리불라리아 속(Rivularia sp.), 쉬조쓰릭스 속(Schizothrix sp.), 시토네마 속(Scytonema sp.), 스피룰리나 속(Spirulina sp.), 스타니에리아 속(Stanieria sp.), 스타리아 속(Starria sp.), 스티고네마 속(Stigonema sp.), 심플로카 속(Symploca sp.), 시네콜코쿠스 속(Synechococcus sp.), 시네코시스티스 속(Synechocystis sp.), 톨리포쓰릭스 속(Tolypothrix sp.), 트리코데스뮴 속(Trichodesmium sp.), 티코네마 속(Tychonema sp.) 및 제노코쿠스 속으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 아쓰로스피라 속(Arthrospira sp.), 더욱 바람직하게는 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)이다.

본 발명에 있어서,

상기 미세조류는 스피룰리나 속(Spirulina sp.), 아크난테스 속(Achnanthes sp.), 암피프로라 속(Amphiprora sp.), 암포라 속(Amphora sp.), 안키스트로데스무스 속(Ankistrodesmus sp.), 아스테로모나스 속(Asteromonas sp.), 보에켈로비아 속(Boekelovia sp.), 보로디넬라 속(Borodinella sp.), 보트리오코쿠스 속(Botryococcus sp.), 브락테오코쿠스 속(Bracteococcus sp.), 챠에토세로스 속(Chaetoceros sp.), 카르테리아 속(Carteria sp.), 클라미도모나스 속(Chlamydomonas sp.), 클로로코쿰 속(Chlorococcum sp.), 클로로고늄 속(Chlorogonium sp.), 클로넬라 속(Chlorella sp.), 크로모나스 속(Chroomonas sp.), 크리소스파에라 속(Chrysosphaera sp.), 크리코스파에라 속(Cricosphaera sp.), 크립테코디늄 속(Crypthecodinium sp.), 크립토모나스 속(Cryptomonas sp.), 사이클로텔라 속(Cyclotella sp.), 두날리엘라 속(Dunaliella sp.), 엘립소이돈 속(Ellipsoidon sp.), 에밀리아니아 속(Emiliania sp.), 에레모스파에라 속(Eremosphaera sp.), 에르노데스미우스 속(Ernodesmius sp.), 유글레아 속(Euglena sp.), 프란세이아 속(Franceia sp.), 프라길라리아 속(Fragilaria sp.), 글로에오탐니온 속(Gloeothamnion sp.), 하에마토코쿠스 속(Haematococcus sp.), 할로카페테리아 속(Halocafeteria sp.), 히메노모나스 속(Hymenomonas sp.), 아이소크리시스 속(Isochrysis sp.), 레포신클리스 속(Lepocinclis sp.), 마이크락티늄 속(Micractinium sp.), 모노라피듐 속(Monoraphidium sp.), 난노클로리스 속(Nannochloris sp.), 난노클롭시스 속(Nannochloropsis sp.), 바니쿨라 속(Navicula sp.), 네오클로리스 속(Neochloris sp.), 네프로클로리스 속(Nephrochloris sp.), 네프로셀미스 속(Nephroselmis sp.), 니츠치아 속(Nitzschia sp.), 오크로모나스 속(Ochromonas sp.), 오에도고늄 속(Oedogonium sp.), 오오시스티스 속(Oocystis sp.), 오스트레오코쿠스 속(Ostreococcus sp.), 파블로바 속(Pavlova sp.), 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.), 파스케리아 속(Pascheria sp.), 파에도닥틸륨 속(Phaeodactylum sp.), 파구스 속(Phagus sp.), 플라티모나스 속(Platymonas sp.), 플루로크리시스 속(Pleurochrysis sp.), 플루로코코스 속(Pleurococcus sp.), 프로토쎄카 속(Prototheca sp.), 슈도클로렐라 속(Pseudochlorella sp.), 피라미모나스 속(Pyramimonas sp.), 피로보트리스 속(Pyrobotrys sp.), 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.), 스켈레토네마 속(Skeletonema sp.), 스피로기라 속(Spyrogyra sp.), 스티코코쿠스 속(Stichococcus sp.), 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp.), 탈라시오시라 속(Thalassiosira sp.), 비리디엘라 속(Viridiella sp.), 코코믹사 속(Coccomyxa sp.), 시조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 및 볼복스 속으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서,

상기 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulina laxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta) 및 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 바람직하게는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima)이다.

본 발명에 있어서,

상기 식물세포는 유용물질 생성능을 가지는 식물세포라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서,

상기 당류를 함유하는 가수분해산물은 단당류(monosaccharides), 이당류(disaccharides) 및 올리고당류(oligosaccharides)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서,

상기 단당류 및 이당류는 포도당, 과당, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 자당, 멜리비오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 락토오스, 및 말토오스로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예1: 당화분해능을 가지는 곰팡이 균주의 분리

곰팡이 J113 균주는 인천 영흥도 해안가의 부패된 해초로부터 분리하였다(Kim et al., J. Microbiol. Biotechnol., 24(11):1559-1565, 2014). 먼저, 해수에 해초를 첨가하고 보텍스(vortex)한 다음, 단계희석(serial dilution)하여 YPD 한천배지(Yeast peptone dextrose agar medium)에 도말하고, 단일 포자(single spore)를 분리하였다. 그다음, 분리된 상기 단일 포자를 순수배양하여 균주의 형태로 수득하고, 상기 균주로부터 genomic DNA를 추출하였다.

상기 genomic DNA의 ITS(Internal transcribed spacer)(GenBank accession no. JX976325) 영역을 프라이머 세트(ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 및 ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 이용하여 증폭하여 균주 종을 동정(fungal identification)하고 계통수(phylogenetic tree)를 이용하여 트리코데르마 속(Trichoderma sp.)의 다른 종들과 비교하였으며(계통학적 체계 확립), out-group으로 Hypocrea albolutescens 및 Hypocrea aeruginea의 ITS 서열을 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, J113 균주는 Trichoderma effusum ATCC MYA-4837과 Trichoderma sinense DAOM 230004에서 각각 99.6%과 99.4%의 유사도(similarity)를 나타내었다.

또한, Hypocrea albolutescens와 Hypocrea aeruginea를 out-group으로 하고 다른 Trichoderma 종들과 J113 균주의 유전적 관계를 계통분류학적 분석을 통하여 확인하였다.

그 결과, J113 균주는 Longibrachiatum에 속하는 Trichoderma 종으로 동정되었다.

트리코데르마 속(Trichoderma sp .)에 속하는 Trichoderma reesei의 가수분해효소 생산에 대한 연구는 광범위하게 이루어진 반면, J113 균주와 진화적으로 더 가까운 T. effusum , T. sinense , T. ghanense 및 T. saturnisporum의 생물·생리학적 특성 및 병원성에 대한 특성은 잘 알려져 있지 않다. 최근, longibrachiatum에 속하는 종에서 자일란(xylan) 가수분해효소의 생산에 관한 연구가 한편 보고되었으며, J113 균주와 진화적으로 가까운 Trichoderma 종은 T. reesei QM6a 및 T. reesei RUT30 변종(strain)과 비교시 자일란(xylan) 가수분해가 효율적이지 못한 것으로 보고된 바 있다.

한편, J113 균주의 경우 다양한 탄수화물에 대해 왕성한 가수분해활성을 나타내어 J113 균주 유래 가수분해효소의 특성에 대한 분석을 수행하였다(데이터 미도시).

실시예 2: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주의 탄소원에 따른 가수분해능 측정

트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주가 이용하는 탄소원에 따른 균주의 성장을 확인하고자 하였다.

탄소원으로는 0.5% 포도당 외에 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101), CMC(carboxymethyl-cellulose), 자일란(xylan), 녹말 및/또는 밀겨(wheat bran)를 사용하였다.

탄소원에 따른 균주의 성장을 확인하기 위해 변형된 Czepak-dok 배지(1g/L K₂HPO₄, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.5g/L MgSO₄, 0.5g/L KCl, 2g/L NH₄NO₃를 함유하고, pH 6으로 보정된 배지)에 0.5%의 포도당 및 다양한 탄소원이 첨가된 배지를 이용하여 배양하였다.

먼저, 직경 6.5mm의 코르크보러(cork borer)를 이용하여 J113 균주가 자란 PDA에서 한천디스크(agar disc)를 분리하고, 상기 한천디스크를 각각의 다른 탄소원을 포함하는 Czapek-Dox 한천배지(고체성 한천배지)의 중앙에 놓고, J113 콜로니의 성장 및 기중 균사체(mycelium)의 성장을 관찰하였고, 상기 균사체의 색소 생성 여부를 확인하였다.

J113 균주의 가수분해효소의 생산을 확인하기 위하여, J113 균주를 YPD 배지(Yeast peptone dextrose broth)에 접종한 다음, 25℃에서 150rpm으로 48시간 배양하였다. 그다음, 여과지(Whatman, USA)를 이용하여 균사체를 회수한 다음, 증류수로 2번 세척하였다. 1g의 J113 균주(생체중량, fresh cell weight)를 각각 다른 탄소원을 포함하는 Czapek-Dox 배지에 옮긴 후 28℃에서 180rpm으로 배양하였다. 배양 시간에 따라 J113 균주 배양액을 수득하고, 수득한 상등액을 탄소원인 CMC(carboxymethyl-cellulose), 자일란(xylan) 또는 녹말을 기질로 사용하여 반응시킨 후 DNS 방법(Dinitrosalicylic colorimetric method)으로 탄소원의 가수분해능을 확인하였다.

그 결과, J113 균주는 포도당, 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101), 자일란(xylan) 또는 녹말이 탄소원으로 첨가된 Czapek-Dox agar 배지에서 빠르게 수평성장하였다. 특히, 배양 72시간 후에는 페트리디쉬의 주변에서 균사팁(hyphal tip)이 풍부하게 관찰되었다. 반면, CMC(carboxymethyl-cellulose)를 탄소원으로 함유하는 배지에서는 J113 균주의 수평성장이 느렸지만 균사체와 포자를 왕성하게(aggressively) 생성하였다. 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101)를 탄소원으로 첨가한 배지에서의 J113 균주의 수평성장은 포도당 및 녹말이 첨가된 배지와 같았으나 공기 중 균사체(aerial mycelia)의 결핍이 육안으로 관찰되었다(데이터 미도시).

결국, J113 균주는 포도당, 알파-셀룰로오스(Avicel(등록상표) PH101) 또는 자일란(xylan)이 포함된 배지에서 성장할 수 있었고, J113 균주에서 탄수화물 복합체를 가수분해할 수 있는 가수분해효소가 분비되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 가수분해효소의 생산 및 정제

밀겨는 곰팡이의 가수분해효소 생산을 유도하는 적합한 재료라는 것은 이전 연구에서 보고된 바 있다. 따라서, 밀겨가 J113 균주의 가수분해효소의 생산을 유도할 수 있는지 확인하고자 하였다.

먼저, J113 균주를 0.5% CMC(carboxymethyl-cellulose), 0.5% 자일란(xylan), 0.5% 녹말 또는 0.5% 밀겨가 탄소원으로 첨가된 Czapek-Dox broth(용량: 100 mL)에서 배양하였다. 그 다음, 상기 배양액으로부터 24, 48, 72시간 간격으로 1 mL의 J113 균주 배양물을 수집하고, 원심분리하여 상등액만을 수득한 다음, DNS 방법으로 가수분해효소의 활성을 측정하였다.

상기 DNS 방법(Dinitrosalicylic colorimetric method)은 유리된 카로보닐 작용기(free carbonyl group) 또는 환원 당(reducing sugars)을 측정하는 방법으로, 본 발명에서는 90μL의 citrate phosphate buffer(pH 5) 및 100μL의 기질(탄소원)이 포함된 반응용액에 10μL의 J113 균주 상등액(시료: 탄소원의 종류에 따른 시간대별 수집 배양물의 상등액)을 첨가하고, 45℃에서 반응시켰다.

그 결과, CMC(carboxymethyl-cellulose), 자일란(xylan) 또는 녹말이 탄소원으로 첨가된 배양액에 J113 균주를 접종 및 배양하고, 원심분리하여 수득한 J113 균주 상등액에서는 셀룰라아제(cellulase), 자일란아제(xylanase) 및 아밀라아제(amylase)의 활성이 명확하게 관찰되지 않았다. 다만, 0.5%의 밀겨를 탄소원으로 하는 배양액에서 24시간 동안 배양된 J113 균주 상등액에서 자일란아제 및 아밀라아제 활성이 매우 명확하게 관찰되었다. 또한, J113 균주를 밀겨가 포함된 고체배지에 도포하여 배양시 매우 높은 자일란아제 및 아밀라아제 활성을 나타내었다(데이터 미도시).

결국, 배양액에 포함된 밀겨가 J113 균주의 아밀라아제 생성을 자극하는 주요 자극제로 작용하고 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 25mL의 증류수 및 10g의 밀겨가 첨가된 250mL 삼각플라스크를 멸균하였다. 밀겨가 첨가된 배지에서 6.5mm 직경의 J113 한천 블락(agar block)을 각각 5개씩 접종하여 상온에서 7일간 배양한 다음, 50%의 phosphate citrate buffer solution(pH 5.2)을 첨가하여 1시간 동안 180rpm으로 교반하고, 교반된 배양액을 여과지를 이용하여 상등액만 분리하였다.

상기 상등액 용액(400mL)을 황산암모늄 40% 포화도에서 침전시킨 총 단백질과 40~70%의 포화도에서 침전시킨 총 단백질을 각각 4℃에서 11,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 제거하고, Tris-HCl, pH 6.9 버퍼를 사용하여 재현탁한 다음, 탈염과정을 거친 후, DEAE-sepharose A50을 사용한 이온교환(ion exchange)과 Sephadex G-75를 이용한 겔 크로마토그래피(gel chromatography)를 통해 총 단백질을 분획으로 수득하였다. 각각의 상기 분획에 대한 녹말분해활성을 측정하였다.

또한, 분획의 녹말분해활성을 비교하여 녹말분해활성을 가지는 단백질이 포함된 분획에 대해 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 실제 녹말분해활성을 나타내는 가수분해효소의 분자량을 겔 상에서 확인하였다.

그 결과, 40% 또는 40~70%의 황산암모늄으로 침전된 총 단백질로부터 정제된 녹말분해활성(amylolytic activity)을 나타내는 단백질은 약 29.3과 약 63.4kDa의 분자량을 가지고, 각각 Ayt40 및 Ayt70으로 명명하였다(데이터 미도시).

실시예 4: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 특성 분석

J113 균주 배양액으로부터 정제된 Ayt40 및 Ayt70의 생화학적 특성분석은 DNS 방법을 이용하여 수행하였다.

먼저, 실시예 3에서 수득하고, Ayt40 또는 Ayt70을 포함하는 분획을 적정 비율로 희석한 효소용액을 준비하고, 10μL의 희석된 효소용액을 100μL의 1% 녹말 및 90μL의 DNS 방법에 이용되는 버퍼가 포함된 용액에 첨가한 다음, 하기와 같이 효소 활성을 측정하였다.

효소의 단백질 농도는 BCA 어세이(bicinchoninic acid assay)로 측정하였다.

(1) Ayt40 및 Ayt70의 최적 활성 온도: pH 4 및 30~80℃의 온도 범위에서 5℃ 간격으로 Ayt40 및 Ayt70의 상대적 활성(relative activity)을 1분간 측정하였다.

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, Ayt40은 40℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 30~45℃의 범위에서 80% 이상의 활성을 유지하였으나 75℃ 이상에서는 전혀 활성을 갖지 않았다. Ayt70의 경우는 65℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 55~70℃의 범위에서 60% 이상의 상대적 활성을 유지하였다.

(2) Ayt40 및 Ayt70의 최적 pH: 40℃ 또는 60℃의 온도범위, pH 3~10의 pH 범위에서 pH 1의 간격으로 Ayt40 및 Ayt70의 상대적 활성을 30분 동안 측정하였다.

상기 DNS 방법에 이용되는 버퍼는 pH 범위에 따라 달라지며, pH 3~6 범위에서는 citrate buffer, pH 7~8 범위에서는 phosphate buffer, pH 9~10 범위에서는 glycine-NaOH 버퍼를 이용하였다.

그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, Ayt40의 최적 pH(효소 활성: 95% 이상)는 4~5이고, Ayt70의 최적 pH는 5로 나타났다.

(3) Ayt40 및 Ayt70의 열적 안정성(heat stability): pH 5 조건에서, Ayt40의 경우 30, 40, 50℃에서 30, 60, 90분간 전 보온(pre-incubation)한 조건에서 활성을 측정하였고, Ayt70의 경우 50, 60, 70℃에서 30, 60, 90분간 전 보온한 조건에서 Ayt40 및 Ayt70의 상대적 활성(열적 안정성)을 측정하였다.

그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, Ayt40은 30℃에서 30분간 전처리(pre-incubation)시 상대적 활성의 감소는 없었고, 90분간 전처리가 지속되면 80% 이상의 상대적 활성을 나타내어 열적 안정성(heat stability)을 유지하였으나, 40℃ 또는 50℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성이 급격하게 감소하였다.

또한. 도 2D에 나타난 바와 같이, Ayt70은 50℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성의 감소는 없었고, 90분간 전처리가 지속되면 80% 이상의 상대적 활성을 나타내어 열적 안정성을 유지하였으나, 60℃ 또는 70℃에서 30분간 전처리시 상대적 활성이 급격하게 감소하였다.

실시예 5: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 가수분해 패턴 분석

Ayt40 및 Ayt70의 가수분해 패턴을 확인하기 위하여 반응물의 최종부피가 200μL(90μL의 citrate phosphate buffer 및 100μL의 1% 녹말에 10μL의 Ayt40 또는 Ayt70 효소용액을 첨가한 것)가 되도록 한 다음, 45℃(Ayt40)와 60℃(Ayt70)에서 각각 90분간 반응시켰고, 30분 간격으로 반응생성물(product)을 수집하였다.

여기서, 상기 Ayt40 또는 Ayt70 효소용액은 실시예 3에서 수득한 Ayt40 또는 Ayt70을 포함하는 분획을 적정 비율로 희석한 효소용액이다.

수집된 각각의 반응생성물은 100℃에서 10분간 열처리하여 반응을 종료시킨 다음, 열처리된 각각의 반응생성물을 2μL씩 사용하여 Silica gel 60 TLC 플레이트(Merck, Germany)상에서 녹말의 가수분해산물을 확인하였다. 전개용액은 acetonitrile 및 증류수를 85:15의 부피비율(%v/v)로 혼합하여 사용하였다. TLC(Thin-layer chromatography) 전개가 완료된 TLC 플레이트를 완전히 건조시키고, 상기 건조된 TLC 플레이트에 10%의 황산용액을 분무한 후 완전히 건조시킨 다음, 120℃의 드라이 오븐(dry oven)에서 15분간 건조시켰다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, Ayt40 효소용액은 포도당(glucose, G). 맥아당(maltose, M) 및 다양한 크기의 올리고당을 생성하는 것으로 확인되었다.

반면, 도 3B에 나타난 바와 같이, Ayt70 효소용액은 대부분 포도당만을 생성하는 것으로 나타났다.

녹말을 가수분해하는 효소는 녹말 다당체의 반응부위에 따라 알파-아밀라아제(α-amylase, endo-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase, exo-amylase)의 2가지 유형으로 나뉘어진다. 알파-아밀라아제는 녹말 분자의 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 무작위적으로 가수분해하며 다양한 길이의 올리고당(oligosaccharide)의 가지를 절단하는 기능을 가진다. 글루코아밀라아제는 녹말분자의 비환원성 말단(non-reducing end)으로부터 포도당을 생성하는 역할을 한다.

결국, Ayt40 및 Ayt70은 각각 알파-아밀라아제 활성 및 글루코아밀라아제 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 6: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70의 활성에 Mn ²⁺ 가 미치는 영향분석

다양한 금속이온 또는 다양한 화학물질이 아밀라아제 활성에 미치는 영향(효과)에 대한 연구는 이전 연구를 통하여 보고된 바 있다. 본 발명에서는 2가지 농도(2.5mM 또는 5mM)에서 다양한 금속이온 및 화학물질이 효소 활성에 미치는 효과를 확인하였다.

즉, 실시예 3에서 수득한 Ayt40 분획 또는 Ayt70 분획에 CaCl₂, CuSO₄, EDTA, FeSO₄, KCl, MgSO₄, MnSO₄, NaCl 또는 ZnSO₄를 각각 2.5mM 또는 5mM의 농도로 첨가하고 45℃에서 30분간 반응시킨 후 상대적 활성을 비교하였다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, Ayt70 분획과 녹말이 포함된 반응물에 Mn²⁺를 최종 농도가 5mM가 되도록 첨가시 Ayt70의 활성이 약 191% 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 도 4B에 나타난 바와 같이, Mn² ⁺첨가에 따른 Ayt40의 유의적인 활성 변화는 나타나지 않았다.

실시예 7: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70를 포함하는 효소용액을 이용한 아쓰로스피라 맥시마( Arthrospira maxima ) 바이오매스의 가수분해 패턴 분석(온도 및 pH 조건)

바이오매스 중 50% 이상이 탄수화물인 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)는 유용한 탄수화물 공급원이 될 수 있다.

한국해양과학기술원(KIOST)의 20톤급 semi-outdoor 배양 시스템을 이용하여 배양된 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)의 바이오매스를 회수한 다음, 동결건조하였다. 상기 바이오매스의 화학적 조성은 AOAC(Association of Official Agricultural Chemists) 방법에 따라 분석되었다. 상기 바이오매스의 탄수화물 함유량은 페놀-황산(phenol-sulfuric acid) 어세이 방법으로, 조 지질(crude lipid)의 함유량은 Soxhlet 방법으로, Crude ash는 550℃의 건조화로에서 확인하였다. 또한, 상기 바이오매스의 수분 함량은 바이오매스를 105℃의 드라이 오븐(dry oven)에서 24시간 동안 열처리한 후 열처리 전과 비교하여 정량하였다. 상기 바이오매스에 포함되고, 정제되지 않은 단백질(Crude protein)은 Kjeldahl 방법을 이용하여 정량하였다.

실시예 3에서 J113 균주로부터 이온교환(ion exchange) 및 겔 크로마토그래피(gel chromatography)를 사용하여 분획으로 분리되고, 녹말분해활성(amylolytic activity)을 가지는 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 다양한 조건하에서 상기 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima) 바이오매스에 처리하여 상기 바이오매스의 가수분해 정도를 측정하였다.

(1) 최적 온도: 동결건조된 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)(0.5g)를 25mL의 citrate phosphate buffer(pH 4)에 녹이고, 1.2mg의 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액(BCA 어세이로 단백질 정량)을 첨가한 다음, 40, 50 또는 60℃에서 240분간 반응시켰다. 그다음, 상기 효소용액에 의해 생성된 가수분해산물을 매 30분마다 수집한 후 10분간 10,000rpm에서 원심분리하고, DNS 방법으로 가수분해산물인 환원당을 정량하였다.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 첨가한 다음, 40, 50 및 60℃에서 240분간 반응시 각각 3.9, 4.6 및 5.3g/L의 환원당을 생성하였다.

(2) 최적 pH: 동결건조된 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)(0.5g)를 20mL의 pH 버퍼(pH 3, pH 3.5, pH 4, pH 4.5 또는 pH 5)에 녹인 다음, 1.2mg의 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액(BCA 어세이로 단백질 정량)을 첨가하여 60℃에서 240분간 반응시켰다. 그다음, Ayt40-Ayt70 효소용액에 의해 생성된 가수분해산물을 매 30분마다 수집한 후 10분간 10,000rpm에서 원심분리하고, DNS 방법으로 가수분해산물인 환원당을 정량하였다.

그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액을 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 첨가한 다음, pH 4에서 240분간 반응시 가장 높은 가수분해 활성을 나타내었으며, pH 3.5, pH 4.5, pH 3 순으로 활성을 나타내었다.

아울러, 글리코겐 대신 녹말을 기질로 사용하였을 때는 Ayt40 및 Ayt70 모두 pH 5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 아울러, 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)를 기질로 사용하였을 때는 pH 4에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 5에서는 50%의 활성만이 나타났다(데이터 미도시).

실시예 8: 트리코데르마 속( Trichoderma sp. ) J113 균주 유래 Ayt40 및 Ayt70를 포함하는 효소용액을 이용한 아쓰로스피라 맥시마( Arthrospira maxima )의 가수분해 패턴 분석(Mn ²⁺ 첨가 여부)

실시예 3에서 분리된 Ayt40 및 Ayt70을 포함하는 효소용액(이하, Ayt40-Ayt70 효소용액)에 Mn² ⁺의 첨가로 Ayt40 및 Ayt70의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 대한 가수분해능에 변화가 있는지 당화율(reducing sugar, g/L)로 확인하였다.

그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, Mn² ⁺를 첨가하지 않고 Ayt40-Ayt70 효소용액을 사용하여 150분간 반응시킬 경우, 20g/L의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)로부터 4.09g/L의 환원당이 생성되었다. 반면, Mn² ⁺를 첨가하고 Ayt40-Ayt70 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 20g/L의 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)로부터 7.81g/L의 환원당이 생성되었다.

또한, 도 6A에 나타난 바와 같이, Mn² ⁺를 첨가하지 않고 Ayt40-Ayt70 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 5.1g/L에 도달하는데 240분이 소요되었고, Mn² ⁺을 첨가하고 Ayt40-Ayt70 효소용액을 사용하여 반응시킬 경우, 8.3g/L에 도달하는데 210분이 소요되어 나타나 환원당의 생성효율이 증가된 것을 확인하였다.

결국, Ayt40-Ayt70 효소용액에 Mn² ⁺를 첨가한 다음, 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)와 반응시킬 경우 환원당의 생성효율 및 생성량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.

박테리아 또는 남조류는 가압 멸균기(autoclave sterilizer) 멸균에 의한 열 및 압력에 의한 세포용해가 쉽게 일어난다고 알려져 있다. 기존문헌에 의하면 남조류의 전처리에 lysozyme이 활용된다는 것이 알려져 있다. 이와는 달리, 본 발명에서는 복잡한 전처리 과정없이 바로 J113 유래 효소에 의한 가수분해만으로 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)의 충분한 당화가 이루어지는지 확인하였다. 즉, 가압 멸균기 멸균 전후에 따른 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)에 포함된 글리코겐(glycogen)의 가수분해에 차이가 있는지 확인하였다.

그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, 아쓰로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)의 가압 멸균기(autoclave sterilizer) 멸균 여부에 따른 당화효율 및 가수분해산물 회수량의 차이는 없었다.

지금까지 본 발명에 따른 트리코데르마 속 균주 유래 Ayt40 글리코시다아제 및 Ayt70 글리코시다아제, 및 이를 이용한 다당체의 가수분해방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.

그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주를 밀겨가 첨가된 배지에서 배양하는 단계;
(b) 배양된 J113 균주가 포함된 배양액을 교반 및 여과하여 상등액을 분리하고, 황산암모늄 40%~70% 포화도에서 상기 상등액의 단백질을 침전시키는 단계;
(c) 침전된 상기 단백질을 크로마토그래피로 정제하여 분획(fraction)을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 분획 중 녹말분해활성(amylolytic activity)을 가지는 글리코시다아제 함유 분획을 수득하는 단계;를 포함하고,
트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.
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제1항에 있어서,
상기 글리코시다아제 함유 분획은 글루코아밀라아제(glucoamylase; glucan 1,4-α-glucosidase) 활성을 가지는 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.
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제6항에 있어서,
상기 Ayt70 글리코시다아제는 Mn²⁺의 2가 양이온에 의해 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 황산암모늄 40% 포화도에서 상기 상등액의 단백질이 침전되고,
상기 글리코시다아제 함유 분획은 알파-아밀라아제(α-amylase) 활성을 가지는 Ayt40 글리코시다아제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.
(a) 제12항의 Ayt40 글리코시다아제 및 제6항, 제11항 중 어느 한 항의 Ayt70 글리코시다아제를 포함하는 효소용액을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 준비된 효소용액을 다당체(polysaccharide)가 함유된 혼합물에 첨가하고, 35~65℃에서 1~240분간 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 생성되고 당류를 함유하는 가수분해산물을 수득하는 단계;를 포함하는 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제를 이용한 다당체의 가수분해방법.
제6항에 있어서,
상기 Ayt70 글리코시다아제는 단백질로서 최적온도 64.35~65.65℃; 최적 pH 4.95~5.05; 온도 50℃ 이하 및 pH 5에서 90분 이상 안정; 및 전기영동으로 확인된 분자량이 62.766~64.034KDa인 것을 특징으로 하는,
트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.
제12항에 있어서,
상기 Ayt40 글리코시다아제는 단백질로서 최적온도 39.6~40.4℃; 최적 pH 3.96~5.05; 온도 30℃ 이하 및 pH 5에서 90분 이상 안정; 및 전기영동으로 확인된 분자량이 26.007~29.593KDa인 것을 특징으로 하는,
트리코데르마 속(Trichoderma sp.) J113 균주 유래 글리코시다아제의 제조 방법.