KR101832381B1

KR101832381B1 - 인지질을 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101832381B1
Application number: KR1020170094076A
Authority: KR
Inventors: 최성현
Original assignee: 최성현
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2018-02-26
Also published as: KR20170091542A

Abstract

본 발명은 인지질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 돼지 폐 조직으로부터 정제된 인지질 혼합물의 항 염증, 통증억제 및 혈관신생억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

인지질을 포함하는 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising phospholipid}

인지질은 세포막, 순환 플라즈마 리포단백질, 위장관 점막질 층 등을 구성한다. 폐 표면활성제의 인지질 조성은 DPPC (대략 55%) 및 다른 인지질(대략 45%)을 포함하는 지질 및 단백질을 포함하는 약 80%의 표면활성제 물질을 차지한다.(Veldhuizen R, Nag K, Orgeig S, Possmayer F. The role of lipids in pulmonary surfactant. Biochim Biophys Acta 1998;1408:90-108)

한편 염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 총칭한다. 상기 염증질환은 외부 자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절내에서의 질환, 건선등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식등의 알러지성 염증질환 등을 포함한다.

염증질환을 유도하는 핵심적인 염증 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandins), 수산화 지방산류(hydroxy fatty acids), 히드록시에이코사테트라에노익 산(hydroxyeicosatetraenoic acid) 및 류코트리엔류(leukotrienes)같은 에이코사노이드(eicosanoid)라 총칭되는 물질이고, 이들은 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)로부터 생성된다.

상기 염증질환의 치료를 위하여, 여러 가지 항염증 물질이 개발되었는데, 현재까지 보고된 항염증 물질들은 급성염증에서 손상된 조직세포, 염증에 관여하는 세포 또는 주화인자에 의해 유주된 백혈구의 세포막으로부터 물리화학적 및 생리적 자극에 의해 활성화되는 프로스타글란딘류의 생합성을 억제하는 약물들이다. 그러나 상기 물질들은 급성염증에 대해서는 치료효과를 가지고 있지만 류마티스 관절염 같은 만성염증에 대해서는 1차적인 염증현상만을 완화할 뿐이며, 면역학적 치료효과는 기대할 수 없다고 보고되고 있다[Moyazawa, K and Mikami, T., Japan J. Pharmacol.,38, 199,1985].

한편 신생혈관생성(Angiogenesis)이란 기존의 혈관에서부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 의미하며, 종양의 성장과 전이(metastasis), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 만성 염증(chronic inflammation), 궤양(ulcer)과 같은 다양한 질환의 원인이 되고 있다[Carmeliet 등, Nature, 407, p249,2000]. 특히, 암과 같은 과도한 신생혈관생성이 일어나는 경우는, 이러한 신생혈관생성을 억제하는 것만으로도 종양의 성장과 전이를 효과적으로 억제할 수 있다[Garcea 등, European Journal of Cancer 40, p1302,2004].

신생혈관생성 억제를 기전으로 하는 항암제의 선두주자로는 아바스틴이 있으며, 이는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody)로서 전이성 대장직장암 환자에 5-플루오로우라실(5-FU: 5-Fluorouracil)을 포함한 화학요법제와 병용 투여하여 쓰이는 1차약으로 2004년 2월 혈관 생성 억제제로서는 첫번째로 미국 식품의약청(FDA : Food and Drug Administration)에서 승인[Hurwitz 등, Clin Colorector Cancer 4, S62, 2004] 받았고, 뒤를 이어 바이엘(bayer)과 오닉스(onyx)가 공동 개발한 경구용 표적 항암제 넥사바(Nexavar) 역시 2005년 신장암에 대하여 승인을 받았고, 화이자(Pfizer)의 SU11248은 진행성 신장암과 위장관기저암 (GIST)에 대해 1차약으로 2006년 1월 승인 받아 수텐트(sutent) 라는 제품명으로 팔리고 있다[Kim, Biochem. Mol. Biol. News, 12, p263,2005; Thomas 등, Semin Oncol 30, p32, 2003].

관련 특허로 대한민국 특허공개번호 제 10-2003-0028234호는 항염증 활성을 가지는 메밀 및/또는 메밀껍질 추출물, 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증 식품 조성물에 관한 것으로, 항염증 활성을 가지는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것으로, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있고, 세균의 내독소 및 염증 유발 물질에 의한 염증을 억제할 수 있는 항염증 조성물, 가공식품, 기능성 식품, 또는 식품첨가제를 제공하는 동시에, 메밀껍질을 재활용함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다고 기재되어 있으며,

또 다른 관련특허로 대한민국 특허공개번호 특2002-0070062호는 항염증 활성 및 항동맥경화 활성을 나타내는 배초향 추출물에 관한 것으로, 염증반응인자로서의 보체계(complement system)의 활성 억제, 세포부착물질-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)의 발현 억제 및 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 억제에 대한 활성이 우수함은 물론이고, 염증반응에 근거한 동맥경화성 병변의 발달을 현저하게 감소시키는 효과를 가지고 있어 염증 질환 이외에도 염증반응과 관련된 동맥경화 그리고 이로 인한 순환기 질환의 예방 및 치료에 유용한 배초향(Agastache rugosa) 추출물에 관한 것이 기재되어 있다.

또 다른 관련 특허로 대한민국 특허공개번호 제10-2001-0035617호는 5-디메틸오발리신을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물 및 이를 생산하는 방법에 관한 것으로 화합물 5-디메틸오발리신은 신생혈관 형성에 관여하는 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2(MetAP2)에 대해 우수한 선택적 저해활성을 나타내므로 이를 포함하는 약학 조성물은 암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증 또는 혈관종의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다고 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항염증 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 통증억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 혈관신생억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인지질을 유효성분으로 함유하는 혈관신생억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인지질은 다이팔미토일포스파티딜콜린과 다이팔미토일포스파티딜이노시톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 인지질을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 인지질을 유효성분으로 함유하는 통증억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어"약학 조성물"은 본 발명에서 설명한 한 종 이상의 활성 성분과 함께 생리학적으로 적당한 담체 또는 부형재와 같은 기타 화학적 성분을 포함하는 제제를 말한다. 약학적 제제의 목적은 생물체에의 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유효 성분"은 생물학적 효과를 나타내는 화합물(예, 인지질)을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 표현"생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체에 상당한 자극을 주지않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저하시키지 않는 담체 또는 증량제를 나타낸다. 이러한 의미에는 아쥬반트(adjuvant)도 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 더 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러가지 당 및 형태의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.

약물의 제형화 및 투여 방법은 다음 문헌을 참조할 수 있다. "Remington's Pharmaceutical Science", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition. 적당한 투여 경로의 예로는 경구, 직장내, 경점막, 비강내(transnasal), 장내, 근육내, 피하, 골수내 주사, 뇌척수내, 심실내, 정맥내, 복막내 및 안내 투여가 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 예를 들어 환자의 조직 영역내로 직접 주사함으로써 국소적으로 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효 성분의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 한 종이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 통상의 방법으로 제형화할 수 있다. 적당한 제제는 선택된 투여 경로에 의존한다.

주사용의 경우, 약학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거액, 또는 생리 식염수와 같은 생리학적으로 적합한 완충액에서 제형화할 수 있다. 경점막 투여의 경우, 장벽을 관통하기에 적합한 침투물(penetrant)이 제제에 사용된다. 이러한 침투물은 당업계에 잘 알려져 있다.

경구 투여를 위하여, 상기 약학적 조성물은 상기 활성 화합물을 당업계에서 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 결합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체를 이용하여 약학적 조성물을 환자에게 경구 투여하기 위한 정제, 환제,당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 약학적 조성물을 고체 부형제를 이용하여 만들 수 있는데, 얻어지는 혼합물을 분쇄하고, 필요한 경우 적당한 보조제를 첨가한 후 그래뉼 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 특히 적당한 부형제는 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함한 당류와 같은 충진제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 생리학적으로 허용가능한 중합체가 있다. 필요한 경우, 붕해제를 첨가할 수 있는데, 이의 예로는 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알킨 산 또는 알긴산 나트륨과 같은 염이 있다.

당의정 코어에는 적당한 코팅이 제공된다. 이를 위하여, 아라비아검, 탤크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄, 래커 용액 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 진한 당 용액을 이용할 수 있다. 확인하거나 또는 상이한 조합의 활성 화합물 투여량을 특징지우기 위해 정제 또는 당의정 코어에 염료 또는 안료를 첨가할 수 있다.

경구용으로 이용돨 수 있는 약학적 조성물로는 젤라틴으로 이루어지는 푸시 피트 캡슐(push-fit capsule)외에도, 젤라틴 및 가소제(예, 글리세롤 또는 소르비톨)로 이루어지는 연질 밀봉 캡슐이 있다. 상기 푸시 피트 캡슐은 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 바인더, 탤크 또는 스테이르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 임의적으로 안정화제와의 혼합물 상태로 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 상기 활성 성분은 지방 오일, 액상 파리핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액체에 용해 또는 현탁할 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다.

모든 경구투여용 제제는 선택된 투여 경로에 적당한 투여량이어야 한다.

경구 투여를 위하여, 상기 조성물은 통상의 방법으로 제형화한 정제 또는 로젠지의 형태를 가질 수 있다.

비강내 흡입에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따른 활성 성분은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화 탄소 등의 적당한 추진제를 이용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무제의형태로 적절히 투여될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 계측량을 투여하기 위한 밸브를 마련함으로써 투여 단위를 결정할 수 있다. 상기 화합물과 락토오스나 전분 등의 적당한 분말 베이스로 구성된 분말 혼합물을 함유하도록, 디스펜서에 사용하기 위한 젤라틴 등의 캡슐 또는 카트리지를 제형화할 수 있다.

본 발명에서 설명한 약학적 조성물은 예를 들어 볼러스 주사(bolus injection) 또는 연속적 주입에 의해 비경구 투여하기 위한 것으로 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 앰풀과 같은 단위 투여 형태 또는 방부제가 임의로 첨가된 멀티도우즈(multidose) 용기 등의 형태로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 부형제에 용해된 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제 등을 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학적 조성물로는 수용액 형태의 활성 제제의 수용액이 포함된다. 또한, 활성 성분의 현탁액을 적절한 유성 또는 수성 주사 현탁액의 형태로 제조할 수도 있다. 적당한 친유성 용매 또는 부형제로는 참기름과 같은 지방 기름, 에틸 올레이트, 트리글리세리드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르가 있다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란 등과 같은, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 필요한 경우, 상기 현탁액은 고농축 용액의 제조가 가능하도록 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적당한 안정화제를 함유할 수도 있다.

또는, 상기 활성 성분은 사용에 앞서 발열물질이 없는 살균 수용액 등의 적당한 부형제와 혼합하기 위한 분말 형태로 존재할 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 이용하여 좌약 또는 관장약과 같은 직장용 조성물로 제형화할 수도 있다.

본 발명에서 사용하기에 적당한 약학적 조성물에는 활성 성분이 원하는 목적을 달성하기에 충분한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료에 유효한 양은 질병(예, 종양)의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 또는 치료중인 개체의 생명을 연장하기에 효과적인 활성 성분의 양을 의미한다.

치료적 유효량은 특히 본 발명의 상세한 설명을 참조로 당업자가 충분히 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 어떠한 제제의 경우, 치료적 유효량 또는 투여량은 시험관내 및 세포 배양 분석을 통해 초기에 추정할 수 있다. 예를 들어, 동물 모델에서 투여량을 구하여 원하는 농도 또는 역가를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인체에 대한 유용한 투여량을 정확히 결정할 수 있다.

본 발명에서 설명한 유효 성분의 독성 및 치료 효능은 표준 시험관내 제약 과정, 세포 배양 또는 실험 동물을 통해 측정할 수 있다. 이러한 시험관내, 세포배양 분석 및 동물 연구를 통해 얻은 데이터를 이용하여 인체에 사용하기 위한 투여량 범위를 구할 수 있다. 상기 투여량은 이용되는 투여형태 및 투여 경로에 따라 변화할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 의사가 적당히 선택할 수 있다(Fingl 등, 1975, "The Pharmnacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p. 1 참조).

투여량 및 간격은 신혈관 형성을 유도 또는 억제하기에 충분한 활성 성분의 혈장 또는 뇌 수준(최소 유효 농도, MEC)이 제공되도록 개별적으로 조절될 수 있다. 상기 MEC는 제제마다 변화할 수 있지만, 시험관내 데이터를 이용하여 구할 수 있다.

MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 개인의 특성 및 투여 경로에 따라 변화할 수 있다. 검출 분석을 이용하여 혈장 농도를 측정할 수 있다.

치료하고자 하는 증상의 심각성 및 반응성에 따라, 치료가 달성되거나 또는 질병 상태의 완화가 달성될 때 까지 수일 내지 수주 동안 지속하여 단일 또는 다중 투여 방식으로 투여를 실시할 수 있다.

투여되는 조성물의 양은 치료되는 개체, 고통의 심각성, 투여 방식, 담당 의사의 판단 등에 따라 변화할 수 있음은 물론이다.

필요한 경우, 본 발명의 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치에 제공될 수도 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 돼지 폐 조직으로부터 정제된 인지질(이하, 'KT&G 101'이라 함)의 항염증 및 관련 특성을 밝혔다. KT&G101은 주로 phosphatidylcholine (PC) 및 phosphatidylinositol (PI)과 phosphatidylserine (PS)과 같은 다른 인지질로 구성된다. 그것의 주된 PC 종류는 1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)이다. KT&G101는 chick chorioallantoic membrane (CAM) 분석에서 항-안지오제닉 활성을 나타내었다. KT&G101 100, 200 및 400 mg/kg 체중의 용량의 경구 투여는 각각 15.4%, 25.3% 및 30.1%의 저해를 혈관 투과성 분석에서 나타내었다. 에어 파우치에서 카라기난-유도된 염증에서, KT&G101는 파우치에서 삼출액의 부피를 현저하게 감소시켰고, 삼출액에서 polymorphonuclear leukocytes의 수 및 nitrite 양도 현저하게 감소시켰다. 초산-유도된 뒤틀림 반응에서, KT&G101의 50, 100 및 200 mg/kg 체중의 경구 투여는 마우스의 통증 반응에서 각각 21.6%, 51.6% 및 60.8%의 감소를 나타내었다. 또한 그것은 nitric oxide (NO) 및 reactive oxygen species (ROS) 수준을 lipopolysaccharide (LPS)-자극된 RAW264.7 대식세포에서 감소시킬 수 있었다. KT&G101는 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 유도에 대한 억제를 자극된 RAW264.7 세포에서 나타내었다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

혈관신생 억제 활성(Anti-angiogenic activity)

병아리 응모요막(chick chorioallantoic membrane;CAM)을 혈관 발달에 대한 KT&G101의 저해활성을 조사하기 위하여 사용하였다. 분석에 대한 양성 대조군으로 Retinoic acid (RA)를 사용하였고, 그것이 pro-angiogenic 인자의 발현 및 분비를 다운 조절하여서 혈관신생을 저해하기 때문이다. 디스크 자체는 혈관 밀도의 변화를 야기하지 않았고, 그것은 CAM 분석에서 혈관의 성장을 조절할 수 없다는 것을 나타낸다(도시 안함). 2-일 처리 후, RA 1 ㎍/계란으로 처리된 달걀은 혈관의 브랜칭 패턴에서 약 72.7% 저해를 나타내었다(도 1). 0.1, 1.0 및 10.0 ㎍/계란의 KT&G101를 그 CAMs 상에 적용할 때, CAM 혈관신생에서 저해 패턴이 각각 20.0%, 35.7% 및 70.0%이었다(도 1). 이것은 KT&G101이 용량의존적으로 항-혈관신행 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 10 ㎍/계란의 용량에서 KT&G101의 혈관신생저해 활성은 RA (1 ㎍/계란)의 것과 비슷하였다. KT&G101의 IC₅₀ 에 필요한 용량은은 6.2 ㎍/계란이었다.

인 비보 항 염증 활성

KT&G101의 인 비보 항 염증 활성은 혈관 투과성(vascular permeability) 및 에어 파우치 두 다른 동물 모델을 채택하여 조사하였다. 혈관 투과성 모델에서, 전형적인 첫번 단계의 염증 반응에서 염증 매개체가 자극 후에 분비되어 혈관의 투과성을 증가시킨다. KT&G101의 100, 200 및 400 mg/kg 체중의 구강 용량은 각각 15.4%, 25.3% 및 30.1%의 혈관 투과성의 저해를 나타내었다(도 2). 이 결과는 KT&G101의 항 염증 활성이 부분적으로 첫번 단계에서 염증 매개체의 분비를 저해하는 것으로부터 유래한다는 것을 시사한다. 에어 파우치에서 카라기난-유도된 염증도 본 발명에서 사용하였다. 쥐의 등 표면 상 피하 에어 파우치에 카라기난의 주사는 염증 과정을 개시한다. 에어 파우치에서 카라기난-유도된 염증에서, 비선택성 사이클로옥시게네이즈 저해제인, dexamethasone (DEXA, 0.01 mg/파우치)는 삼출물의 부피를 63.6% 감소시켰다(도 3A). KT&G101의 0.03, 0.1 및 0.3 mg/파우치 처리는 대조군 삼출액 부피에 대하여 각각 7.3%, 10.9% 및 32.7%의 저해를 유발하였다(도 3A). 에어 파우치에서 polymorphonuclear leukocytes의 전체 수는 KT&G101 0.03, 0.1 및 0.3 mg/파우치에 처리에 의하여 감소되었고, 그 저해 퍼센트는 각각 0.8%, 27.5% 및 39.4%이었다(도 3B).

nitric oxide (NO)는 중요한 세포내 pro-inflammatory 매개체이므로, 에어 파우치에서 NO 수준 변화를 KT&G101의 처리 후에 측정하였다. NO는 peroxynitrite 이온을 생성하는 슈퍼옥사이드 자유기와 반응하여 과잉 염증 활성 및 관절염, 폐혈증, 궤양성 대장염, 및 전신성 홍반성 루푸스와 같은 질환을 야기한다고 알려졌다.(Lechner M, Lirk P, Rieder J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: the two sides of the same coin. Sem Cancer Biol 2005;15:277-289) NO 생산의 저해는 항 염증 작용과 밀접하게 관련이 있다. NO 수준에 대한 인덱스로 에어 파우치에 축적된 nitrite는 KT&G101 0.03, 0.1 및 0.3 mg/파우치로 처리하여 감소하였고, 그 저해 퍼센트는 각각 7.3%, 13.9% 및 43.3%이었다(도 3C).

통증억제(Antinociceptive) 활성

KT&G101의 통증억제 활성을 초산 유도된 뒤틀림 반응에 의하여 평가하였다. 초산은 통증 신경 말단을 활성화하는 내생적인 물질을 분비하여 통증을 야기하는 것으로 알려졌다. KT&G101의 50, 100 및 200 mg/kg 체중의 경구 용량은 뒤틀림 반응에 대하여 각각 21.6%, 51.4% 및 60.8%의 저해를 나타내었고(도 4), 이것은 KT&G101이 초산 유도된 뒤틀림 반응을 용량의존적으로 저해한다는 것을 시사한다.

NO 생성에 대한 억제 활성

KT&G101의 항 염증 효과를 RAW264.7 대식세포에서 LPS-유도된 NO 생산에 대하여 평가하였다 (도 5A). 대식 세포를 LPS로 자극하였을 때, 그 nitrite 양은 약 7.6-배 증가하였다(도 5A). 대식세포를 5, 15 및 50 ㎍/ml KT&G101로 전처리한 경우, nitrite 수준은 LPS만 처리한 세포의 97.6%, 74.6% 및 20.0%로 감소하였다(도 5A). 이것은 KT&G101이 용량 의존적으로 LPS에 의하여 유도되는 NO생성을 저해할 수 있다는 것을 시사한다. 도 6에서 나타낸 것과 같이, KT&G101은 베타 액틴의 수준의 변화없이 농도 의존적으로 iNOS 유도를 저해하였고 이것은 KT&G101에 의한 iNOS 발현의 특이적 저해를 나타낸다. 따라서 상기의 결과들은 KT&G101이 항 염증 활성을 가지는 것을 강하게 지지한다.

reactive oxygen species 수준에 대한 저해

도 5B에서 나타낸 것과 같이, 대식 세포를 LPS 만으로 처리한 경우, 세포내 ROS 수준은 약 6.3-배 증가하였다. RAW264.7 대식 세포를 5, 15 및 50 ㎍/ml KT&G101로 전처리한 경우, ROS 수준은 LPS만 처리한 세포의 71.4%, 65.4% 및 34.8%로 감소하였다(도 5B). 요약하면, KT&G101는 염증활성과 밀접하게 관련 있는 세포내 ROS 수준을 다운 레귤레이팅에 역할을 한다.

cyclooxygenase-2 (COX-2) 유도에 대한 효과

도 6에 나타낸 것과 같이, KT&G101은 NO 생성을 감소시킬 수 있는 농도에서 자극된 대식 세포에서 COX-2의 유도를 저해하는 것을 나타내었다. 이것은 KT&G101의 항 염증 활성이 COX-2에 대한 그것의 저해에 의존한다는 것을 강하게 시사한다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KT&G101는 인 비보 항 염증 활성 이외에 혈관신생 억제(anti-angiogenic) 및 통증억제(antinociceptive) 활성을 가진다.

도 1은 CAM 분석에서 KT&G101의 용량 의존적 혈관신생 억제 활성을 나타낸다. Retinoic acid (RA, 1 ㎍/계란)을 양성 대조군으로 사용하였다. 각 군은 적어도 20 계란을 포함하였다. 각 컬럼은 세 독립적인 실험의 평균±SE이다. *, P<0.05; ***, P<0.001 대 대조군.
도 2는 마우스에서 초산 유도된 혈관 투과성에 대한 KT&G101의 저해 효과를 나타낸다. KT&G101 (100, 200 또는 400 mg/kg 체중), 양성 대조군으로 사용된 indomethacin (IND, 10 mg/kg 체중) 또는 비히클[1% (w/v) CMC in saline]을 경구 투여하였다. 혈관 투과성을 590 nm에서 흡광도에 의하여 나타내었다. 각 컬럼을 평균±SE를 나타내었다. 각 군은 7 마우스를 포함하였다. 이 실험을 3회 반복 수행하였다. *, P<0.05; **, P<0.01 대 대조군.
도 3은 카라기난-유도된 에어 파우치 모델에서 KT&G101의 저해 효과를 나타낸다. KT&G101 (0.03, 0.1 또는 0.3 mg/파우치), 양성 대조군 dexamathasone (DEXA, 0.01 mg/파우치) 또는 비히클[1% (w/v) CMC in saline]을 에어 파우치에 주사하였다. 삼출액의 부피(A), 전체 polymorphonuclear leukocytes 수(B) 및 nitrite 양(C)을 2% (w/v) λ-카라기난 용액의 주사 16시간 후 측정하였다. nitrite 양을 16시간 후 제조된 삼출액에서 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 전체 leukocytes를 16시간 후 제조된 삼출액에서 계수하였다. 각 컬럼은 7 마우스의 평균±SE을 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P<0.001 대 대조군.
도 4는 마우스에서 초산 유도된 뒤틀림 반응에 대한 KT&G101의 저해효과를 나타낸다. KT&G101 (100, 200 또는 400 mg/kg 체중), 양성 대조군으로 사용된 indomethacin (IND, 10 mg/kg 체중) 또는 비히클[1% (w/v) CMC in saline]을 경구 투여하였다. 0.7% (w/v) 초산 용액 복강내 주사 10분 후, 추가 10 분 기간 동안에 뒤틀림의 수를 계수하였다. 이 결과를 평균±SE로 나타내었다. 각 군은 7 마우스를 포함한다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P<0.001 대 대조군.
도 5는 LPS-유도된 RAW264.7 대식세포에서 NO (A) 및 reactive oxygen species (ROS) 수준(B)에 대한 KT&G101의 효과를 나타낸다. 1 x 10⁶ 포유류 세포를 기재된 농도의 KT&G101의 존재 또는 부존재에서 LPS (1 ㎍/ml)로 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지에 축적된 nitrite를 Griess 반응에 의하여 결정하였다. ROS 수준을 DCF 형광으로 나타내었다. 그 값들은 세 독립적인 실험의 평균치이다. * P<0.05; ** P<0.01, LPS 만으로부터 유의적인 차이.
도 6은 RAW264.7 대식 세포에서 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 LPS-유도된 발현에 대한 KT&G101의 효과를 나타낸다. 포유류 세포를 기재된 농도의 KT&G101의 존재 또는 부존재에서 LPS (1 ㎍/ml)로 24시간 동안 배양하였다. 세포 파쇄액에서 iNOS 및 COX-2 수준을 웨스턴 블럿을 사용하여 결정하였다. 베타-Actin을 웨스턴 블럿에 대한 내부 대조군으로 사용하였다. 세 독립적인 실험의 대표를 나타내었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단 본 발명의 실시예는 본 발명을 설명하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정되지 아니한다.

본 발명에 사용된 Retinoic acid (RA), Evans blue, indomethacin (IND, 합성, 순도 =95%), dexamethasone (DEXA, 합성, 순도=100%), phosphatidylcholine (PC, egg yolk), phosphatidylinositol (PI, soybean), phosphatidylserine (PS, 소 뇌), 1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC, 합성), carboxymethyl cellulose (CMC) 및 Griess reagent는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MI, USA)로부터 구입하였다. Sodium dodecyl sulfate, leupeptin, pepstatin, phenylmethanosulfonyl fluoride (PMSF), E. coli lipopolysaccharide (LPS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), HEPES, 및 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)도 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MI, USA)로부터 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 및 trypsin-EDTA는 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 신선한 돼지 폐 조직은 대한민국 강원도 홍천 소재 HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) 인증 도살장으로부터 구입하였다. 수정된 brown Leghorn 계란은 대한민국 서울의 풀무원 식품에서 구입하였다.

수컷 ICR 마우스(25 ±2 g)는 대한민국 오산 소재 삼타코 동물 농장에서 구입하였다. 동물 실은 23 ±2 ℃에서 12-h 명/암 주기를 유지하였다. 사료 및 수도물은 자율급식하였다. 각 실험군 당 적어도 7 마리 마우스로 나누었다. 실험은 동물실험에 대한 NIH 가이드에 기재된 윤리위원회의 가이드라인을 준수하였다. 본 발명에서 수행된 동물 실험은 대한민국 춘천 강원대 윤리위원회에 의하여 레퍼런스 번호 KNU1450 하에서 승인되었다.

실시예 1:세포 배양

RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하여서, 10% 열 불활성 FBS, 25 mM HEPES (pH 7.5), 100 U/mL penicillin 및 100 ㎍/mL strepto mycin을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 그 RAW264.7 세포를 1 x 10⁶ 밀도로 플레이트하고 37℃에서 24시간 미리배양하고 5% CO₂.함유하는 습도 조건에서 유지하였다

실시예 2:KT&G101 정제

돼지 폐를 도살된 동물로부터 적출하자마자 바로 얼음 수조에 유지시킨 후 5시간 이내에 실험에 사용하였다. 돼지 폐 조직을 잘라서 3 부피의 얼음 냉각 식염수(5 mM CaCl₂ 포함)에서 금속 날 믹서(Model HM-390, 한일전기, 대한민국)에서 1분 동안 균질화하고 1시간 동안 얼음 수조에서 유지하고 혈액을 제거하기 위하여 섭씨 4도, 5,000 g로 45 분 동안 원심분리하고 그 침전물을 수집하였다. 그 침전물을 6 부피의 저장 NaCl 용액(70 mM NaCl 농도, 5 mM CaCl₂ 함유)에 재부유하고 믹서에서 1분간 균질화하였다. 그 균질액을 1시간 동안 얼음 수조에 저장하고 섭씨 4도에서 5,000 g에서 45분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 저 원심력에서 침전을 가능하게하는 표면체 지질 및 단백질의 응집을 유도하기 위하여 칼슘 이온을 첨가하였다. 최종 펠렛을 상온에서 2부피의 chloroform/methanol (2:1 부피)에서 녹였다. 수용액 상과 유기 용매에 불용인 물질을 제거하였다. 인지질과 유기용매 상에서 녹아있는 중성 지질의 부분을 제거하기 위하여, 클로로포름/메탄올 혼합물을 로터리 진공 증류기(Model N-1000S, Tokyo Rikakakai Co., 일본)를 사용하여 65 ℃에서 증류하고 과량의 콜드 아세톤을 그 잔류물에 투여하였다. 그 아세톤에 녹는 인지질 혼합물을 침전물로서 회수하였다. 클로로포름에 녹아있는 인지질 혼합물은 아세톤으로 미리 세척하고 포화된 오픈 실리카겔 컬럼[Kieselgel 60 (230 - 400 mesh, Merck No. 7729), 직경/높이(1: 2 ~ 1:2.5)]을 사용하여 더 정제하였다. 중성 지질을 제거하기 위하여, 아세톤과 클로로포름과 같은 비극성 용매를 컬럼에 먼저 적용하였다. 순수한 인지질을 얻기 위하여 클로로포름, 메탄올 및 물의 극성용매 혼합물을 추가로 적용하였다. 순수한 인지질 분획을 얻기 위하여, 각 용매를 하기의 순서로 컬럼에 적용하였다; 1 베드 부피의 순수 아세톤, 1 베드 부피의 클로로포름, 1/3 베드 부피의 chloroform/methanol (9:1 부피) 혼합물, 1/3 베드 부피의 chloroform/methanol (4:1 부피) 혼합물 및 5~6 베드 부피의 chloroform/methanol/water (6:8:1 부피) 혼합물. chloroform/methanol/water 혼합물에 의하여 용출된 분획을 수집하여 전개 용매로 chloroform/methanol/water (65:25:4 부피)를 채택한 TLC를 사용하여 분석하였다. TLC 플레이트 상에서 0.3에서 0.55의 Rf값을 가지는 지질 스팟들을 보이는 분획을 선택하였다. 그 선택된 분획을 진공 로터리 증류기를 사용하여 농축한 후 -98 ℃에서 20시간 동안 동결건조하여 KT&G101로 명명된 인지질 혼합물 분말을 얻었다. 약 4 g의 분말 인지질을 2 kg의 돼지 폐 조직으로부터 얻었다.

실시예 3:KT&G101 조성 분석

KT&G101의 조성을 결정하기 위하여, chloroform/methanol/water (65:25: 4 부피) 용매 시스템을 채택한 TLC를 사용하여 분석하였다. TLC 플레이트 상에서 스팟들을 동정하여, PC, PI 및 PS이 주로 동정되었다. 그러나, 두 palmitoyl 체인을 함유한 특정 타입의 PC인 DPPC는 폐 표면활성제의 주된 구성요소는 5% (w/v) sulfuric acid 분무에 의하여 효과적으로 염색되지 않았다. KT&G101에서 DPPC의 양은 HPLC-ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) 시스템을 사용하여 결정하였다. Capcell Pak C18 (4.6 mm x 250 mm, Shiseido Co., Tokyo, Japan) 컬럼을 50 ℃에서 인지질을 분석하기 위하여 채택하고 그 검출은 65 ℃, 350 kPa의 질소 가스에서 수행하였다. 그 HPLC 분석은 KT&G101가 중량 베이스로 34.2% DPPC를 포함하는 것을 나타내었다. KT&G101내에는 콜레스테롤이나 트리아실글리세롤은 검출되지 않았다. KT&G101의 주된 구성요소는 PC이고 PC의 주된 종은 DPPC이다.

실시예 4:Chorioallantoic membrane (CAM)분석

KT&G101의 항-안지오제닉 활성은 Song YS, 등. J Ethnopharmacol 2004;90:17-20에 기재된 것과 같이 CAM 분석을 채택하여 결정하였다. 수정된 계란은 37 ℃에서 계란 배양기에서 유지하였다. 3.5-일 배양 후, 약 2 mL의 난백(albumen)을 계란의 좁은 말단에 천공된 작은 구멍을 통해서 계란으로부터 뽑아내어서, 작은 융모요막 및 난황낭(yolk sac)이 껍질 막으로부터 떨어지게 하였다. 공기 낭(air sac)을 커버하는 껍질을 천공하고 포셉(forcep)으로 제거하고, 공기낭의 floor 상 껍질막을 벗겨 내었다. 4.5-일령 병아리 배아에서, KT&G101-로딩된 Thermanox 커버슬립을 CAM 표면에 적용하였다. 그 병아리 배아를 배양기로 옮긴 2일 후, 적당한 부피의 10% 지방 에멀젼(Intralipose^® 10%)을 6.5-일령 배아 장요막(chorioallantois)에 주사하였다. 다음 그 계란을 현미경 하에서 관찰하였다. 각 계란의 브랜칭 패턴을 0, 1+ 또는 2+로 등급화하였다. CAM 표면을 향한 수개의 혈관의 컨버젼스를 CAM 표면에 대한 혈관의 길이 및 증가된 밀도를 반영한 1+ 및 2+로 명명하였다.

실시예 5:초산 유도된 혈관 투과성

초산-유도된 혈관 투과성 테스트를 Whittle BA. Br J Pharmacol Chemother 1964;22:246-253에 기재된 방법을 변형하여서 KT&G101의 항 염증 활성을 평가하기 위하여 수행하였다. 비히클[1% (w/v) CMC in saline], KT&G101 (100, 200 또는 400 mg/kg 체중) 또는 양성 대조군으로 indomethacin (IND, 10 mg/kg 체중)의 경구 투여 30분 후 0.1 mL/10 g 체중의 1% Evans blue 용액을 각 마우스에 정맥내 주사하였다. 30분 후, 0.1 mL/10 g 체중의 0.7% (w/v) 초산을 복막 주사하였다. 초산 투여 20분 후, 마우스를 희생하였다. 10 mL의 식염수를 복강 내 주사한 후, 그 세척액을 시험관에 모았다. 복강 내로 누출된 Evans blue의 농도를 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈관 투과성을 흡광도(A₅₉₀)의 관점에서 나타내었다.

실시예 6:에어 파우치에서 카라기난-유도된 염증

KT&G101의 항 염증 활성을 평가하기 위하여, λ-카라기난-유도된 에어 파우치 형성을 사용한 분석을 Ghosh AK, 등. J Pharmacol Exp Ther 2000;295:802-809 에 의한 과정을 일부 변경하여 수행하였다. 약제 처리 6일 전에, 4 mL 멸균 공기의 초기 피하 주사 및 그것의 patency를 유지하기 위하여 3일 마다 2ml 멸균 공기의 연속 주사에 의하여 마우스의 견갑골 내 부위에 공기 파우치를 형성하였다. 0일에, 비히클[1% (w/v) CMC in saline], KT&G101 (0.03, 0.1 또는 0.3 mg/파우치) 또는 dexamethasone (DEXA, 0.01 mg/파우치)를 λ-카라기난[1 mL의 2.0% (w/v) 용액]의 주사 직후에 파우치에 투여하였다. 16 시간 후, 그 파우치 cavity를 열고 공기 파우치에 고여있는 삼출액을 모았다. 그 삼출액의 각 부피를 눈금 튜브를 사용하여 측정하였다. Aliquots를 Turk 용액으로 희석하고, 그 polymorphonuclear leukocytes들을 현미경 하에서 표준 헤마사이토미터 챔버를 사용하여 계수하였다.

실시예 7:초산 유도된 뒤틀림(writhing) 반응

KT&G101의 통증억제(Antinociceptive) 활성을 Olajide OA, 등 J Ethnopharmacol 2000;71:179-186에 기재된 방법에 기초하여 조사하였다. 통증수용(Nociception)을 0.7% (w/v) 초산 용액을 0.1 mL/10 g 체중의 용량으로 복막내 주사하여 유도하였다. 각 군의 마우스를 비히클[1% (w/v) CMC in saline], KT&G101 (50, 100 또는 200 mg/kg 체중) 또는 대조군으로 indomethacin (IND, 10 mg/kg 체중)를 구강투여하였다. 구강 투여 1시간 후, 0.7% (w/v) 초산 용액을 주사하였다. 5분 후, 추가 10분 동안 뒤틀림 수를 계수하였다.

실시예 8:Nitrite 분석

λ-카라기난- 유도된 에어 파우치로부터 제조된 삼출액 내의 축적된 Griess 반응에 기초한 발색법을 사용하여 결정하였다. 샘플(100 ㎕)을 100 ㎕ Griess reagent (6 mg/mL)과 상온에서 10분간 반응한 후 NO₂ ^- 농도를 540 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 그 표준 곡선을 공지된 sodium nitrite 농도를 사용하여 구축하였다.

실시예 9:웨스턴 블럿 분석

RAW264.7 세포를 KT&G101의 존재 또는 부존재에서 24시간 동안 LPS (1 ㎍/mL)로 배양한 후 얼음 냉각된 phosphate-buffered 식염수로 2회 세척하였다. 그 세포들을 20 mM HEPES (pH 7.9), 100 mM KCl, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM PMSF, 1 ㎍/ml leupeptin 및 1 ㎍/ml pepstatin를 함유한 버퍼에서 파쇄하였다. 면역블럿팅을 위하여, 항-inducible nitric oxide synthase (anti-iNOS; Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), anti-cyclooxygenase-2 (anti-COX-2; Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), 및 anti-베타 actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 항체를 사용하였다.

실시예 10:세포내 ROS의 결정

세포내 ROS의 분석을 위하여, redox-민감성 형광 프로브 DCFH-DA를 Royall JA, Arch. Biochem. Biophys 1993;302:348-355에 기재된 것과 같이 사용하였다. 1시간 동안 여러 농도의 KT&G101로 전처리한 후, 1 x 10⁶ RAW264.7 세포를 LPS로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 그들을 5 μM DCFH-DA로 30분 동안 37^oC에서 배양하였다. 세포들을 수확하고 그 세포내 ROS 수준을 유동 세포분석기로 즉시 분석하였다. 그 ROS 수준을 임의 단위(arbitrary units)로 나타내었다.

상기 결과들은 평균±SE로 나타내었다. 실험군 사이의 통계 비교는 ANOVA 테스트 및 Tukey's 다중 범위(multiple range) 테스트를 수반하여 수행되었다. 0.05 이하의 P 값들을 유의한 것으로 간주하였다. 최대 저해값의 절반 (IC₅₀) 값들을 용량/반응 선행 회귀 플롯으로부터 계산하였다.

Claims

다이팔미토일포스파티딜콜린과 다이팔미토일포스파티딜이노시톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인지질을 유효성분으로 함유하는 통증 억제용 조성물.