KR101818365B1 - Stk32c 유전자가 결실된 노화 촉진 동물모델의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 STK32C ((Serine/threonine kinase 32C)) 유전자가 결실된 노화 촉진 동물모델의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자를 결실시킨 표적 벡터를 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하며, 상기 방법에 의해 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 조기 노화에 따른 체중, 피하 지방, 진피층의 감소, 등 굽음 및 상처 치유 지연을 구체적으로 확인하였는바, 항노화 물질 개발과 같은 노화 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 STK32C (Serine/threonine kinase 32C) 유전자가 결실된 노화 촉진 동물모델의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 노화 촉진 마우스 동물모델 및 이를 이용한 항노화 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
최근 우리나라는 급속한 경제 발전, 의료기술의 발달, 및 영양 상태의 개선에 의해 평균 수명도 빠른 속도로 증가하고 있다. 따라서 다수의 전문가들은 우리나라 역시 멀지 않은 장래에 고령화 사회에 들어설 것으로 예측하고 있으며, 이에 따라, 단순한 생명 유지가 아닌, 노화 현상에 대한 관심이 증대되고 있다.
노화는 수정란에서부터 시작하여 사람이 사망할 때까지 일어나는 전 과정으로서, 시간의 흐름에 따라 생물의 신체 기능이 퇴화하는 현상을 의미하며, 인체를 구성하고 있는 세포와 신체 조직 전체에서 일어난다. 사람이 늙어감에 따라 세포와 조직 단위에서 일어나는 변화는 기능적, 구조적, 생화학적 변화로 크게 대별할 수 있으며, 이때 나타나는 현상으로는 세포조직 수의 감소, 대사속도 저하, 질병 증가, 그리고 적응력 저하 등이 있다. 이러한 노화 현상의 원인으로는 활성산소 라디칼, 자외선, 약물 복용 등이 있으며, 일반적으로 한 가지 원인 및 기전이 아닌 다양한 방식이 복합적으로 혼재되어 나타난다.
따라서, 노화의 연구를 위해서는 개체 수준에서의 연구가 절실히 필요한 상황이며, 적합한 동물모델이 필요하다. 특히, 노화 연구는 사람의 노화를 어떻게 조절하느냐가 중요한 관건이므로 사람과 유전학적, 생리학적, 해부학적으로 유사하며 실험하기 용이한 실험동물을 선택하는 것이 매우 중요하다. 이러한 실험동물로는 마우스가 가장 적합한 것으로 알려져 있고, 실제로 많이 이용되고 있다(미국 특허 공개번호 2006-0212954). 이 밖에도 마우스 보다 하등 동물인 꼬마선충과 초파리를 이용한 노화 연구도 활발히 진행 중에 있다.
이러한 노력에도 불구하고, 노화 현상이 정확히 언제 또는 어떠한 경로를 거쳐서 나타나는지에 대해서는 명확히 알려져 있지 않다. 노화에 대한 과학적 연구가 많이 이루어지지 못한 여러 가지 이유가 있지만, 그중 가장 중요한 이유는 인간을 비롯한 대부분의 포유동물에서 개체 수준에서의 노화 연구는 시간이 매우 오래 걸린다는 점을 들 수 있다. 예를 들어, 널리 쓰이는 모델 포유동물인 마우스의 경우도 수명이 2년이 넘기 때문에 노화 및 수명 연장과 관련된 연구에 있어서, 많은 시간적 제약이 따른다.
이에, 본 발명자들은 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자 변이를 이용한 동물모델을 개발하였으며, 상기 동물모델에서, 노화 촉진 현상을 구체적으로 확인하고, 본 발명의 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자가 결실된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 노화 촉진 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 a) STK32C 유전자를 결실시킨 표적 벡터를 제조하는 단계; b) 상기 표적 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계; c) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반 포에 주입하는 단계; d) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; 및 e) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 수득하는 단계를 포함하는 노화 촉진 마우스 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 노화 촉진 마우스 동물모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 상기 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 노화의 정도를 평가하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 노화를 억제시키는 물질을 항노화 물질로 선정하는 단계를 포함하는 항노화 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) STK32C 유전자를 결실시킨 표적 벡터를 제조하는 단계; b) 상기 표적 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계; c) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하는 단계; d) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; 및 e) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 수득하는 단계를 포함하는 노화 촉진 마우스 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 a)에서, 표적 벡터는 좌측 팔 (7719 bp), puromycin 내성 유전자(1540bp), 및 우측 팔 (3960 bp)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 노화 촉진 마우스 동물모델을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 동물모델은 조로증 촉진 마우스 동물모델일 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 상기 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 노화의 정도를 평가하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 노화를 억제시키는 물질을 항노화 물질로 선정하는 단계를 포함하는 항노화 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 b) 단계는 피하 지방, 체중, 진피층의 변화, 등 굽음 또는 상처 치유 지연을 평가할 수 있다.
본 발명은 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자를 결실시킨 표적 벡터를 도입하여 형질 전환시키는 단계를 포함하는, 노화 촉진 동물모델에 관한 것으로서, 상기 방법에 의해 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 조기 노화에 따른 체중, 피하 지방, 진피층의 감소, 등 굽음 및 상처 치유 지연을 구체적으로 확인하였다. 따라서 본 발명은, 노화에 이르기까지 오랜 기간을 필요로 하는 종래 동물 모델과 달리, 노화의 진행을 보다 촉진시킴으로써, 노화 기전 또는 항노화 물질 발굴과 같은 노화 연구의 시간을 단축시켜 줄 것으로 기대된다.
도 1은 표적 벡터 도입에 따른 STK32C 유전자의 넉아웃(knockout)을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 표적 벡터를 도입한 마우스 배아줄기세포에서, STK32C 유전자의 넉아웃 여부를 Southern blot으로 확인한 결과이다.
도 3은 교배를 통해 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, STK32C 유전자 변이의 생식선 전이(germline transmission)를 확인한 결과이다.
도 4는 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 시간의 경과에 따른 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 16개월령 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 외관을 육안으로 확인한 결과이다.
도 6은 야생형 마우스(STK32C(+/+))에서, 피하지방과 진피층의 변화를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 피하지방과 진피층의 변화를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8은 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 등뼈가 굽는 형상을 관찰한 결과이다.
도 9는 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 시간의 경과에 따른 상처치유 정도를 관찰한 결과이다.
도 2는 표적 벡터를 도입한 마우스 배아줄기세포에서, STK32C 유전자의 넉아웃 여부를 Southern blot으로 확인한 결과이다.
도 3은 교배를 통해 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, STK32C 유전자 변이의 생식선 전이(germline transmission)를 확인한 결과이다.
도 4는 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 시간의 경과에 따른 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 16개월령 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 외관을 육안으로 확인한 결과이다.
도 6은 야생형 마우스(STK32C(+/+))에서, 피하지방과 진피층의 변화를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 피하지방과 진피층의 변화를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8은 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 등뼈가 굽는 형상을 관찰한 결과이다.
도 9는 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 및 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 시간의 경과에 따른 상처치유 정도를 관찰한 결과이다.
본 발명자들은, STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자가 결실된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 제조하였으며, 상기 마우스에서, 노화 촉진에 따른 체중, 피하 지방, 진피층의 감소, 등 굽음 및 상처 치유 지연을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 a) STK32C 유전자를 결실시킨 표적 벡터를 제조하는 단계; b) 상기 표적 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계; c) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하는 단계; d) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; 및 e) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 수득하는 단계를 포함하는 노화 촉진 마우스 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "노화"는 생물개체 혹은 세포가 분화나 성장을 한 후, 연령이 많아짐에 따라 쇠퇴하는 과정을 의미한다. 세포에서 관찰되는 노화 현상으로는 색소의 침착, 피하 지방의 감소 등이 있으나, 세포의 종류에 따라 나타내는 현상이 다르다. 또한, 체제가 복잡한 생물 개체에서는 노화현상이 개개의 세포에서 체세포 전체에 미치게 되는바, 개체 수준의 노화 연구, 즉 동물모델을 이용한 연구가 효과적이다. 본 발명에서, 노화 촉진 동물모델은 상기와 같이 개체 또는 세포 수준에서 분화 및 쇠퇴가 빠르게 진행되는 것을 특징으로 하며, 다양한 유형의 노화 촉진 동물모델 중 바람직하게는 조로증 촉진 마우스 동물모델일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그러나 종래 동물모델을 이용한 개체 수준의 연구에 있어서, 노화에 이르기까지 오랜 기간을 필요로 하는바, 시간적 제약이 존재하였다. 이에, 본 발명자들은 STK32C 유전자의 일부를 결실 시킨, 노화 현상이 조기에 진행되는 동물 모델을 제공함으로써, 노화 연구에 대한 노력과 비용을 절감시키고자 하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "결실(knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절 (down-regulation)을 의미하며, 상기 방법에 의한 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자가 결실된 돌연변이체는 동형 접합체(-/-) 또는 이형접합체 (+/-)를 포함한다.
또한, 본 발명에서, 결실(knock-out)되는 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자는 Serine/threonine protein 카이나제 중 하나로서, Sweet Taste Signaling과 관련되어 있다고 알려져 있으나, STK32C 기능이 억제된 노화 촉진 동물 모델에 대해서는 아직 보고된 바는 없는 실정이다.
이에, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 노화 촉진 동물 모델을 제공한다. 상기 동물의 종류로는 마우스, 랫트(rat), 소, 말, 돼지, 원숭이, 오리, 개, 고양이 등이 될 수 있고, 마우스인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 STK32C 유전자의 일부가 결실되어 STK32C 기능이 억제된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 제조하였다(실시예 1 참조). 또한, 상기 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))는 야생형 마우스와 비교하여, 노화 촉진에 따른 체중, 피하 지방, 진피층의 감소, 등 굽음 및 상처 치유 지연효과가 현저히 뛰어남을 확인하였는바, 항노화 물질 스크리닝 등과 같은 노화 연구에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 2 내지 5 참조).
한편, 본 발명의 다른 태양으로서, a) 상기 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 노화의 정도를 평가하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 노화를 억제시키는 물질을 항노화 물질로 선정하는 단계를 포함하는 항노화 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 노화의 정도를 평가하는 단계는 바람직하게 피하 지방, 체중, 진피층의 변화, 등 굽음 또는 상처 치유 지연을 평가하는 것일 수 있으나, 노화의 지표로 인정되는 생물학적 활성을 평가하는 것이라면 제한 없이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 이형접합체 마우스(
STK32C
(+/-))의 제조
본 발명의 노화 촉진 마우스를 제조하기 위하여, 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 표적 벡터(targeting vector)를 이용하여 형질 전환 마우스를 제조하였다.
1-1. 표적 벡터의 제조 및 도입
우선, STK32C 유전자의 세 번째 exon이 deletion (결실)된 넉아웃 마우스 제조를 위해 표적 벡터(targeting vector)를 제조하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자의 세 번째 exon을 결실시키고, 표적 벡터를 이용하여 결실된 위치에 puromycin 내성 유전자를 도입하였다. 구체적으로, 상기 표적 벡터는 좌측 팔 (7719 bp), puromycin 내성 유전자(1540bp), 우측 팔 (3960 bp), 및 Diphtheria toxin A chain (1185bp) 등으로 구성되며, 상기 표적 벡터의 좌측팔, puromycin 내성 유전자 및 우측 팔은 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자의 대립형질 부위(10476~26862 bp)에 삽입되도록 설계하였다.
이후, 전기 천공법 (electroporation)을 이용하여 마우스 배아줄기세포 (E14Tg2A)에 표적 벡터를 도입한 후, puromycin 약제에 선택적으로 살아남는 배아줄기세포 클론 96개를 확보함으로써, 상동재조합 (homologous recombination)이 일어나 서열번호 2로 이루어지는 "targeted locus"를 가진 마우스 배아줄기세포 클론을 찾았다. 이후, 게놈 DNA를 XbaI 효소로 자른 다음, 도 1에 나타낸 Southern blot probe를 이용하여 Southern blot analysis를 실시하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자의 세 번째 exon이 결실되지 않은 야생형 배아 줄기세포(+/+) 는 14.158 kb 위치에서 시그널 (DNA band)을 확인할 수 있었던 반면, 표적 벡터가 도입된 배아 줄기세포(+/-)는 6427 bk 위치에서 시그널이 나타남을 확인하였다. 상기 결과는 표적 벡터를 도입함으로써, STK32C 유전자의 세 번째 exon이 결실된 배아줄기 세포를 수득할 수 있음을 나타낸다.
1-2. 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))의 제조
상기 STK32C 유전자의 세 번째 exon이 결실된 마우스 배아 줄기세포 클론을 수정란의 배반포(blastocyst)에 주입하고 대리모에 이식하였으며, 20일 경과 후, 키메라(chimera) 마우스를 수득하였다. 상기 키메라 마우스와 C57BL/6 마우스를 다시 교배시켰으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, PCR (polymerase chain reaction)을 통하여 STK32C(+/-) 마우스를 선별하였으며, 본 실험에서 사용된 PCR-A(Puro3 primer set), 및 PCR-B(puro5 primer set) 프라이머의 구체적인 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 교배하여 태어난 마우스 중 STK32C(+/-) 마우스를 선별하였으며, 상기 결과는 상기 표적 벡터를 도입함으로써, 세 번째 exon이 결실된 STK32C 유전자 변이의 생식선 전이(germline transmission)가 가능함을 의미한다.
실시예
2.
형접합체
마우스(
STK32C
(+/-))의 체중 변화 확인
상기 실시예 1에서 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))와 야생형 마우스(STK32C(+/+))의 체중의 변화를 비교하였다. 구체적으로, 시간의 경과(1 내지 16개월)에 따른 체중의 변화를 확인하였으며, 16개월령 마우스의 외관을 육안으로 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스(STK32C(+/+))와 비교하여 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))는 체중 증가율이 현격히 감소하였으며, 특히 11개월령 이후에는 오히려 체중이 감소하는 경향을 나타냈다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서, 육안을 통해 현저한 체중 감소 및 다수의 흰 털을 확인하였다.
실시예
3. 이형접합체 마우스(
STK32C
(+/-))의 피부 노화 확인
상기 실시예 1에서 제조된 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))와 야생형 마우스(STK32C(+/+))의 피부 노화의 정도를 비교하였다. 구체적으로, 16개월령 마우스의 등쪽 피부를 Hematoxylin & Eosin (H&E)로 염색한 후, 피하지방과 진피층의 변화를 현미경으로 관찰하여 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스(STK32C(+/+))에서는 피부의 피하지방 및 진피층이 상대적으로 넓고 다수의 층으로 분포하고 있는 반면, 도 7에 나타낸 바와 같이, 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))에서는 피하지방 및 진피층이 위축되어 감소되어 있음을 확인하였다.
실시예
4. 이형접합체 마우스(
STK32C
(+/-))의 등 상태 확인
노화의 진행에 따라 등뼈가 굽는 현상이 나타나는 바, 상기 실시예 1에서 제조된 이형접합체 마우스(STK32C (+/-))가 노화에 기인한 등뼈가 굽는 현상이 나타나는지를 확인하였다. 구체적으로, 16개월령 이형접합체 마우스(STK32C (+/-))의 피부를 벗겨 등의 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 16개월령 이형접합체 마우스(STK32C (+/-))의 등이 현저하게 굽는 현상을 관찰하였다.
실시예
5. 이형접합체 마우스(
STK32C
(+/-))의 상처 치유 지연 효과 확인
노화의 진행됨에 따라 상처 치유가 잘 안 되는 현상이 나타나는바, 상기 실시예 1에서 제조된 이형접합체 마우스(STK32C (+/-))와 야생형 마우스(STK32C(+/+))의 상처 치유 진행 정도를 비교하였다. 구체적으로, 16개월령 이형접합체 마우스(STK32C (+/-)) 및 야생형 마우스(STK32C(+/+)) 등 피부에 상처를 내고 상처가 아무는 정도를 시간대 (0일, 2일 및 4일)별로 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스(STK32C(+/+))의 상처 부위가 아물어진 반면에, 16개월령 이형접합체 마우스(STK32C (+/-))의 상처 부위가 잘 아물지 않는 것이 관찰되었다.
상기 결과를 종합해 볼 때, 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))는 조기 노화가 진행됨에 따라, 피하지방 또는 체중의 감소, 등 굽음 및 상처 치유 지연등과 같은 노화 현상이 야생형에 비해 현저히 높게 관찰됨을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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causing deficiency of STK32C gene and uses thereof
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tgcctacctt ctgggatgtg attgctggga tgattaatgc tgaatcatgg ggtccagggt 60
cacccctggg gctgctggaa ccagttctcc ctgcagctaa tgtggatcac ccaagatacc 120
aggatgagag gcagcctgtg tcagctcagc cgggcaggtg ctcctcgttc tgtgctctgt 180
gctccttgtt cttagccagt ggactctgat accagccgga tagagggcca tgttctgacc 240
tttgatgctt atatcaatgt caagtgactt tcttaccttt aacattatct ccaccatttt 300
cttccaagac atccaggcca tgaatcttga actctggggt tttgcatctc aaatatttat 360
actgtagctg tcaaagccat tgcccagtag accccattat gggattatct gtcacagtgt 420
ggatagcatc tatgaaaagc gtcactagag taagctcaag gtggtcacta gagttgtcaa 480
tagcagtgac aagtctccag atgctgcctg gtgctgctga ccctgatcac agctgctgtg 540
ctccctgcag gtgcctgggc tttattctcg acagcttgtg agcctccagt cctgcagcac 600
acaggctctg gctaaggcat ctgcctcttc tcctcttaca gacatcctgc cgagtctacc 660
ccaccggcag aggctgatga gaccttaccg ggcccaagca gatttggtgg agccatctca 720
tttgtcaggg agtgtgcctc ggagacttca gaacagtggc atctgttagc tgtgttggtt 780
gtgacctaag atggcttgaa actgcctctt gtttgtacct ttgctgactg tgggaaaggg 840
gtcagaaacc atgtacacag cagtcgggag ggagagaggt gaaggagctg cttctaagag 900
gacctgatgt ccccctgtgg gaccacagca gcagatgggg cccagggaat gactgcagag 960
acactcagag tggacagttg tcaggtccaa gtgagtcccg tatggggtgg cccagctgca 1020
gggtgcttgc cctcacctgc ccactgaaga actctgtcac tcaggcccag gctgactctg 1080
gggtgtaaat tttgagtgaa ctgtgaactt ttctgcctga gaagtggcct tgggacactc 1140
agtctgcctg atgtcttttg aacttccctt ctgtgggccc caaagcacag acctctgcag 1200
aagccatctg ggccctgtcc tcaccctagg aggctccctg tgcctgccca cacagagtga 1260
ttctccttca gtagcctttc tccatgagtc agggctgctg gctagggtgg ctttgaagag 1320
gggaaaatgc tgaagatcaa atagaaatct accccttcca ggactggagg tgaaagaaac 1380
actacaggag tcctgagcat agctacagtg cttcctcaaa agtcctgaag gtcaggaggt 1440
gaggcagtgg cagctgcagg aggcttatca aggggagggg cttagttctc cagagagcag 1500
ctacactctg agtcttatgg ggtccaggag tgtcacatga actacggtac tgtgggcacc 1560
aagggtgcca tgggatctag ggatgctgtg gtcttgggca tcaggagcct gttgcaagtc 1620
cctcttctaa cagcttgttc tggacttggc tctgctgcca ccataggata aagaaagcct 1680
gctggccacc gccccacaga gccaccatgc agcagagcat ttatcacatg ttcctaagtg 1740
ggccaaaaca cgatgtgaat gtgccaggct tgcctctcag ggtcacccag gcagcgctgg 1800
tgccttaaaa atagctgttt cccttgcaac agacttgggt ggagagctct tgctttcttc 1860
cctgcatagg cgtaggaagg ccacctgtca tctccctggc atccttgatc cctgggtggc 1920
tttgacttgg gaggacccag caagggtgtt cagctgaggg tggtcctgct gacagccagg 1980
agcaggatgg ctgcccccag cttgttggac ttggaggagc tccccttgct ggtgaagcac 2040
atggggctgg cggacaaggc tgtccaagat acaggccatg cttaggcttc gtaggaggct 2100
ttgactgcct tgcgtgacgt ctgctcacca tgcaccttgc tcccttctct acctgtacac 2160
tccaaagaca cctctgtcct gagtcatcag ctgatctgtg tgtcaccctc tgtgggagcc 2220
tcatgccttg cgatacttca caagtttcta cgtcttggac aacagggcaa gtgttgaccc 2280
ttaccaggga acgctgtcct atcctaagtc tggggttcca ggccctcaca gagcagagcc 2340
cagtgctagt gctgagtgca cccctccact gaccactgtg aacggcagct ttcagttcat 2400
cctgagccac tgaagtccac agctcaaaaa cagagggaag acctacaatg gcctactatg 2460
tgcctgacca ccctgtgaaa gccaagtctc ttccttgtcc ttctcttgaa ttaaactgaa 2520
tcacagaaag cagtccacct ctttgtgctt cagttgttgt cttcaaaaca caaggatggt 2580
tgcctcaaac atggctacag aacttttcca cacctaaaat agtcgacagt gtggtcatat 2640
gagcactagt cagattcagg gctttcctgg tggccttgtg gctgttatta ttgctactgc 2700
tctgagtcag gttgacagtg aggccgtaca ggagtggttg ggtccccttg ctctgtctct 2760
gcccctcctt cccctgccgt gtgatttgat tgaggcccag gctgctttgt cctgagggac 2820
cctattctgt gagctcttct ccatctctgc atagtcttta tcagatcatc tgtgaccgaa 2880
gcaaggcttc gtcatcagag agccatactt ctgcctgaga cccgtgtgca tctaactttg 2940
tcagcggcta tccaggactg cttaccactt gtctattgca gcctggtgtg ggctggattg 3000
cattctttct ggacactctg gcgtagagtt catctcagat ctgcctccca ggtctagagg 3060
tctcaggcct cttgtttctg tcttgtgttt cctctctgac ttgccccccc tcgcccccgc 3120
ctccatcact gtctttaagg accatagggc agcatccgat gccctcagtc caggatgatg 3180
tcctcctctt aaagtcaaca tcacagctgc aaagtccctt ttccatgcat atctacagat 3240
tccagaattc ggtcatgtgt gtctctagag gacatcattt tgccagccat catgttgtga 3300
tttgttgtta tgattaaagg tgtgccaaca agtcccgctg tcctcatgtc tcctgcttta 3360
gccatgcctg catgcttctg cagtatgcct tggggttagt tcctagaagt ggagtgtgtg 3420
ggctggaggg tggggaacat gacttgtgct agagattgcc aagtccccct gcatggggtg 3480
tcaccattgt tttccatggg gcatctgcca tagggcgtgc tgccagatgc ttggagtttt 3540
gccagcctaa cagacaaggc acagcaactc ggctagcctg gccttgcact tctcttgtgg 3600
tagtctaact tgcctatttt attattttta tttatctctt tagttggtat ttctgtttgt 3660
ttctagagtg caatgtctat taggaataac aacctttatt tctgtcctta agttgcaaat 3720
attttctgtc tgtctaccaa gtttgtttat acaccttttc ctatgcatat tattttcttt 3780
tatgcagcta ttttgtttag tcaatcactt tccaagttgt ttttggattt cagagctgca 3840
gaactttgtc cgtacttcca ttccgagaca tcttcatgtt ttcttctgtt gcttccaggt 3900
tttaggtgtc aggataaaaa gcataacccg gagctcattc tggcttgtag tgtcaggcca 3960
ggatcaactt ttcatgcgac aacttggttg atgttgataa cgtcacttat taaaaattct 4020
taagtctgag aagccgctgt aatggcaaaa gaagtatctt tgtgcagttt ggtctgtttc 4080
atgatttttc tgttctgttc ccctggcctg tttgtctctc cccatattgc tgtcgtgctt 4140
atgagacaac ccctgggtgt gcagggaaaa cccacttgca atgggcacag cgacatccca 4200
tgggctggag atgcagacta aagaaaaggc gaggaaaagg agaaaaagag ccaaggacca 4260
gcattcatca tgctacttga tcctatagga tatgggagtc cccggcctag gtgtctgcta 4320
ccatggcctc tgtcctacct tccccaccat aatgaaccgt gccttattaa tctctgagcc 4380
gaaacaaatc tttcagtcct ggagctgctt ctgtcaggta acccgttaga gtgatgagaa 4440
gtgactgaca cactgggaca tccgaagctt tagtttcacc aactgctgcc cagagagcag 4500
tgcttagagc cgagaaaacc aagtctttgt cccacctgct cctctcctct ttgcgtgtgt 4560
ccctctcctc atcacatgac gcagtggtac ctcctcaagg acaaatattc ccctgaagta 4620
agtctctgag ggacagaggt taggggacag taagggagag tcggaagtag acatagagtt 4680
gagggagatg gtctagatgg agggcaggtg caggccacat tatctcacta gggaagtgcg 4740
ggtgctgatc caggcagggg ctcggcacgg gagtcacaac ctctcgagag aagcaggatt 4800
ctagcgtggt ctctgctgct ctgtcaggga cacctgcgag tggtctgagc atccttctct 4860
gctctatcct ttgctctgct gtgcttctgc ttgagtcacc tcgctctctg ttcagggaca 4920
ctgttcttat tgtacattac ccaggcaacc ctctcccaag gtcaactctc tggcagccac 4980
atactcctcc agaccccatc atgtagtttt gtttctggtt tttgttttgt tttggttttg 5040
gtttttgtgc ttctggcact gcccaccaaa agagtcctgg ggaaggcagg gtccttccct 5100
ggtgccctgt ggtccaggtt tgccttccct aggctccgct actcgcggga ggtacgttca 5160
ttatggtatt caggggcttt gagtacctgt tgtcagctct ttgccttctg gggaacaaaa 5220
gaaaaatgac ttggaaagaa aaagagcttg tggtgaatca cttaagtctg cacgatgtgt 5280
aaacagcact caattagaat ggcacttaca ccgccattag ccaccagctt acgccaggct 5340
gagcagtggc aatttgaagg gtgccctgca gaccaggagc agcagggctc aactcctctg 5400
agatctgatc ccacttcctc tttgtaagtg gattactgag gaagtggccc agaaagcccc 5460
gaccaacttc ctttggggag acagtgcatt gggacctgtg gctaaggctt aggtagaaaa 5520
gacccgtctc aaagcgttgc tctctcagac ctgcctctca aatcagggca gcataaaccc 5580
ccttcttgga gcctctctga gggcgctggc gttggaggcc agcagagcca ggcttttgca 5640
gctgacctgt tcgttagttg aaactcagct ctgtcccttg tagctgtggg tgtgtccaga 5700
gtccagagct cggcagtgac atgaccaagc cagcctgggt gggaagatgg tgaaggttag 5760
gatgactaag gagaaggact atgagtcaga ttgggagaga ggagagagag agagagaaga 5820
tgtccaggtg aggatgtagt acagggttag gccaaggtct ctgctcctca gggcgcctgt 5880
gtatccatga tagatgtgct cgggatggca tgccatttga cttcttggga ccacaacaat 5940
gacccaccac atgccaactc caaacagcca cctccttgta ctctttagag actgaggtct 6000
gatgtgggaa cagggctggc tgttcctgca gctgagcgag aaaggcattt tgaggctctt 6060
ggactctggc tcctgcaggc tgcagcagtc ttcatgatct ttagcaatcg ttggcttgtg 6120
gctgtctgcc actgtggcca ggatcagtat cttcatatcc atcccctctc catgtgacct 6180
tgttccttat tccttcctat acttttattc ccgtcttctg tgaggacatc tggcattgat 6240
ttagggtcca cccatgatct ccaggctgtc agcttggtcc tgttcttgga gaccatcacc 6300
gtaactgggc taacgttaga cgtagggatc aagaacgcaa tgcaacaacc caggaacccc 6360
acatctgcct gctgctccct ttgtttctct gtggctctgt agctagtagc agctcctagt 6420
ggttcattgt agtgggaaaa ttatagagtc tccttggcaa tggctgtggg gtatctgcac 6480
tgagttatgg aaggtttttt tttttcccct agagatcctg gagacaaggc ctgtggcgtg 6540
tgtgtgggcg tgcacaactg acctcaggag ggcggggaat tatgcaggca gtttttatag 6600
gggagccaca caagggacag aatcacctag ggctctgcgc ctgctaggca gagacgcctc 6660
cctcccccgc ccacaaaggg gggcctccct tggggagttt gccaggctgc tcacttctgc 6720
ctcagaagta attggccttc tctgcctcct gctcagagtg aaggtgtatt tgcaagagaa 6780
ggcccccagc ccatgttctg actggccagg cctgtgaccg acagccccat aattctgctc 6840
actgggagca gaatgaatcg tcagtcagag aagggcctgg atacaggacc aggtaggctg 6900
ggtggcctgc tgaggctgac atgtattttc attctgaaat tttcaatagg cttttaaaat 6960
aataatttga ggaaggattg tagctagctc aggggaaaaa aatctgaggc tcaacacttg 7020
gccgttggtg ccttccccgt cattgcctgc tttgacctcc caacctcctg ctagcttagt 7080
cttggagcag acgtggcctt ttcctacctt caggagtcct ctgttcacac gcttaatgtc 7140
tcagcagccc ccacccctgc ctcccactct tcctgtcaca ttcgtggaat tgggcaaagt 7200
gatctgtgtc atccactcac tggagcagac cactgaggac ctgtggtgaa tgactgggtc 7260
atgtcctcca gcactctcta ccctctagtc acagtccaca cgagccatcc ctcacaagcc 7320
agcagaaggg cttcctagca gcctatgcta aatgaactgc agctgctttg tctcctgtct 7380
gcaccctata ccaccaccct ggaaaactgg agaaagtgag ggaagcgtga gtctcagaga 7440
ggggacccca gggacacctc agacccaggc aggtgtctcc aggggcaaca tgactatctt 7500
cacaggttcc tctgtgatca cagaaccacc cccccaagct ttccagaatg tctcaggatg 7560
ggttccaggt acacaagagg gtggcagggt gcatacaaca cctaaaaatg ttttggtgca 7620
gaagctttgg gggcagctgt aaggaagcct gaggcaggga gggacacctc cagcttagag 7680
atgaagcaca aggctccttc catttctctg ctccaactg 7719
<210> 2
<211> 1540
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> puromycin-resistance gene
<400> 2
aggtctgaag aggagtttac gtccagccaa gctagaattc ctgcagccct cgacctcgaa 60
attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc 120
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 180
cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc 240
cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga 300
agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt 360
aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct 420
gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg 480
aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt 540
ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcatccat ctagatcagc ttaccatgac 600
cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac 660
cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca 720
catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg 780
caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt 840
cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg 900
gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc 960
gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc 1020
cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac 1080
ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt 1140
cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgacgccc 1200
gccccacgac ccgcagcgcc cgaccgaaag gagcgcacga ccccatgcat cgatgatcta 1260
gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 1320
cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 1380
aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 1440
aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 1500
ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctcgac 1540
<210> 3
<211> 3960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Right arm
<400> 3
gatatcccct ggcctagggg ttttcattga ctccttctgt cttagttagg gttatactgc 60
tgtgaacaga caccatgacc aaggcaactc ttataaggac aacatttaat tggggctgac 120
ttataggttc agaggttcag tccagtatca tcaatgtgag agcatccagg caggcacggc 180
tagggaggag ctgagagttc tatatcttca tctgaaggct gctagcagaa tactggctcc 240
cagacagcta ggatgagagt cttaaagccc atactcacag tgatacacct actccaacag 300
ggccacaccc tcgaatagtg ccactctctg ggctgagcat atacaaacca tcatattcca 360
ctccctgccc cccccatagg tttgtttaaa catgtgagtc tatggggcca tatgtaaaca 420
caacagcatg cacagaaccc tatgcccacc tgccccaact gcaacctgct gtcttgtttt 480
ctgctacagt aagtcaagaa tctacaaagt agacagtggc cacttcccag aggctacata 540
gcatggctcc agaatggctt gcttcctact tagaatctcc aagatgcttg tggctggtta 600
ttcccaggca ggctgagaag tgacagactc aggtagcatt tttgtggtac acattccatc 660
ttgttttagc atactggaca tcataaagca gggagaaggt ctaaatgaga catacccctc 720
aaacccaccc ttgtcagggg aaaggaggaa gtttgctgtg aggtgggaac acagttggca 780
ctgaggcttt ttggaaagaa ggaaggacag gatttttgtc tttggggcct cagcaaccca 840
gcctcccagg cactctaaaa gacagtgttg cctaatgatc agacacacac acacacacac 900
acacaacctc tgggcctgca cttctgccgt ccacaactgt tcaggtgctg cagtgacatg 960
ggccacagcc aggacttcag actctatttt cctaacctcc tgcagctgca ctcccccttc 1020
cacaccccag agccctagat gtcacctgcc acctaggctt gtgtgcactg gggacatccc 1080
aagtctcctt gcccctcttc ctgacctctt cctcaaaatc ctgcctgtgc caccttctcc 1140
agcctccttc cactgaggct gagagagaat ggcttatgga ggacagggaa caagataacc 1200
accatcacta tcaccactac catcactatc atcaccagct cttttatcac cagcaccatc 1260
actgtcatca ccagcaccag cactatcatc acactatcgt cactatcaca agtactatct 1320
tgctatcaac atcaccacca ccatcattat aactagcacc accaccatca tcaccatggt 1380
cattaaatac caattcctca cccagatctg tactcagcat tttactggca tggtctcatg 1440
ttcttctctt acaaaccact tttgtgtgtc ctcatagaag aagccaggga agcctggaac 1500
agctcggaaa tgtgcagttt ctgttctcca gttgtcactt acaggcatct atgctcacag 1560
ccaaaccgct ctcatggaca tggctgttct gtcttccctg gggtcttggc acagctctga 1620
gcagggtgtg gggaatgccc caggcaggat ggtgatcaga ctggaaggag ggaggagccg 1680
ctgctctgga tccctaaacc attcataggc caagtcttcc cctggtaccc acaggtactc 1740
cttccaggat gaggaggaca tgttcatggt ggtggatctg cttctggggg gagacctgcg 1800
ctaccaccta cagcagaatg tccagttctc agaggacaca gtgaggctgt acatctgtga 1860
gatggccctg gccctggact acctgcgtag ccaacacatc atccacaggt gtgtgaacac 1920
ctgtggcatg aggcatcttc ctgggctgaa cggttgggaa tacccttggg tcacactcaa 1980
gcctggtctg gctcctcttc ccagcggtgg gccctgtcca aactacccac tttgaggatg 2040
gacgcagagg acttagtcct catgggtgta ccacagagcc tggccacacc cagtggctct 2100
tatttatcta ttgaccacat catgggactt catactgatt gtggcatttg tagaaaccac 2160
atggaattgg ggaaatgtct aattagaaag caggtaggat cagggagcag aaattaggct 2220
aaaaccctgc agtcttggct caaactgagg tgcgttataa ggcagataaa cctgatttct 2280
aacctctctg ccctgggatt ctgttgtctg gacaggattc aggtatgtga tggttattga 2340
gtgctagatg tgttcctaga agtcaaggtg gagaggactg atgtcagatt gtgagcagag 2400
tgtagacaag tcctcttctg tgcagttcca ggggtctagt gagggcatca tgggaacccg 2460
gccctgaggg tcttctacag tccccagagg cttccagctg taggtgcctt ctgcacctac 2520
atgtcctctg gccaagactc catggattgc tggtggctcc cttgtagctg tcttctagga 2580
ggccctggtg ccctctgaat agtgtgcggt atgccctcta tgacactagg ttctatgtta 2640
ggattcactc taaaagccaa gccttccaag cctctgcctc tgatgggagc atctgtcaga 2700
gacgtcaggg catgaatagt gtgggtctaa gctcattttc ttgttacctt ctgtcctcct 2760
agagatgtca agcctgacaa catcctcctg gatgaacaag gtgagtccct ggagctctgg 2820
gacacagaga ggagcatggg tacccggccc aggacctgga aagccatgtc tgccctttct 2880
tcacaggaca tgcacacctt actgacttca acattgccac catcataaag gatggggaga 2940
gggcgacagc tttagctggg accaaaccgt acatgggtaa gccaaaggcg tcagatgaca 3000
cctgactatg cagagccatg cccctgccta gtccttactc catagtcaga taaagtctta 3060
gagcaaagga ccttggggtg caaccaaatg gcaatgcagt gttttatctg ctgtgggctg 3120
gtccagaagg gggctcctcc ctgcaggtgg cacagtgcag aactgtggcg ggtagggttc 3180
tcttttagat ctggtgcaga cctggctggc ggtgtgatac ggggtcatca gaccctctag 3240
ccccacagct cagctctttc ttctcttcgt tggaaagctc cagagatctt ccactctttc 3300
gtcaatggcg ggactggcta ctccttcgag gtggactggt ggtcggtggg ggtgatggct 3360
tacgagctgc tacgaggatg ggtacggagc cttgtaaccc taagctagcc acttccttgc 3420
cccggactgg ctgagagcca tggatggagg atgatacccc tccccccata acctcagagg 3480
actcgggctt ttaagcatat taagacagat gcctgagtta gcaagtctcc ttgggtggct 3540
ggtggtggat gggatgttgt atgcagcagg ttcttgggag ggacttgctt ttctctaggg 3600
gcagaggcag tgatctgcgt aggtctcata cggtatcctc taccattcca tggagcccca 3660
aacctggaaa aaaaaaccag cacctcctgt ccttttggac tgaaccaccc aggcctcaga 3720
accacccttg gtggtggtag agggggcata cccttgacag atgagcttct ggcctctgat 3780
acccagttca gtcggggcgc aagctctacc ccctggcctc tggatcaggt ggctgctgtt 3840
ctcagagcct ggccttcacc tgggcctgaa gctgggttcc tagggtgttt gtacttttgt 3900
ctgggtgcca tgctggggaa ggcactggtg tagtgcttcc ctgcccacag agaccctacg 3960
3960
<210> 4
<211> 1185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Diphtheria toxin A chain
<400> 4
cggtccgctc tagaactacg atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 60
cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 120
atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttagatcc tagtggatct gcattccacc 180
actgctccca ttcatcagtt ccataggttg gaatctaaaa tacacaaaca attaggaatc 240
agtagtttaa cacattatac acttaaaaat tttatattta ccttagagct ttaaatctct 300
gtaggtagtt tgtccaatta tgtcacacca cagaagtaag gtttccttca caaagagatc 360
gcctgacacg atttcctgca caggcttgag ccatatactc atacatcgca tcttggccac 420
gttttccacg ggtttcaaaa ttaatctcaa gttctacgct taacgctttc gcctgttccc 480
agttattaat atattcaacg ctagaactcc cctcagcgaa gggaaggctg agcactacac 540
gcgaagcacc atcaccgaac cttttgataa actcttccgt tccgacttgc tccatcaacg 600
gttcagtgag acttaaacct aactctttct taatagtttc ggcattatcc acttttagtg 660
cgagaacctt cgtcagtcct ggatacgtca ctttgaccac gcctccagct tttccagaga 720
gcgggttttc attatctaca gagtatcccg cagcgtcgta tttattgtcg gtactataaa 780
accctttcca atcatcgtca taatttcctt gtgtaccaga ttttggcttt tgtatacctt 840
tttgaatgga atctacataa ccaggtttag tcccgtggta cgaagaaaag ttttccatca 900
caaaagattt agaagaatca acaacatcat cagggtccat ggcgaggacc tgcaggtcgc 960
agatcctgaa cggcagaggt tacggcagtt tgtctctccc ccttccggga gccaccttct 1020
tctccaaccg tcccggtcgc gctctcggcg cttctgagga gagaactggc tgagtgacgc 1080
cctttataga ttcgcccttg tgtcccgccc ttcctttccc gccctccctt gcgctacggg 1140
gccgcccgca ccggcctaca cggagcgcgc gcggcggagt tgttc 1185
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR-A Forward
<400> 5
gcacaaggct ccttccattt ctc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR-A Reverse
<400> 6
ccatttgtca cgtcctgcac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR-B Forward
<400> 7
caacctcccc ttctacgagc 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR-B Reverse
<400> 8
taagagttgc cttggtcatg gtg 23
Claims (6)
- 하기의 단계를 포함하는 노화 촉진 마우스 동물모델의 제조방법.
a) 마우스 게놈에서 STK32C (Serine/threonine kinase 32C) 유전자를 결실시키기 위한 표적 벡터를 제조하는 단계;
b) 상기 표적 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계;
c) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하는 단계;
d) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; 및
e) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스(STK32C(+/-))를 수득하는 단계.
- 제 1항에 있어서,
상기 단계 a)에서, 표적 벡터는 서열번호 1로 이루어지는 좌측 팔, 서열번호 2로 이루어지는 퓨로마이신 내성 유전자 및 서열번호 3으로 이루어진 우측 팔을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제 1항의 방법에 의해 제조된, 노화 촉진 마우스 동물모델.
- 제 3항에 있어서,
상기 동물모델은 조로증 촉진 마우스 동물모델인 것을 특징으로 하는, 동물모델.
- 하기의 단계를 포함하는 항노화 물질의 스크리닝 방법:
a) 상기 제 3항의 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 노화의 정도를 평가하는 단계; 및
c) 비처리군과 비교하여 노화를 억제시키는 물질을 항노화 물질로 선정하는 단계.
- 제 5항에 있어서,
상기 b) 단계는 피하 지방, 체중, 진피층의 변화, 등 굽음 또는 상처 치유 지연을 평가하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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Citations (1)
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| WO2013106662A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Advanced Genomic Technology, Llc | Transgeneic non-human animal model for accelerated aging and/or age-related symptom, and use thereof |
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2016
- 2016-08-04 KR KR1020160099458A patent/KR101818365B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013106662A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Advanced Genomic Technology, Llc | Transgeneic non-human animal model for accelerated aging and/or age-related symptom, and use thereof |
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