KR101816063B1

KR101816063B1 - Compositon for treating atopic dermatitis comprising Patrinia scabiosaefolia extracts

Info

Publication number: KR101816063B1
Application number: KR1020170003522A
Authority: KR
Inventors: 김인식; 차경재; 조두형
Original assignee: 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2018-02-21

Abstract

Provided is an atopic dermatitis therapeutic agent containing a Patrinia scabiosaefolia extract, which is effective for atopic dermatitis and has few side effects, as an active ingredient.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for treating atopic dermatitis comprising at least one extract of Matari as an active ingredient, and a composition for treating atopic dermatitis comprising Patariia scabiosaefolia extracts,

본 발명은 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 마타리 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for treating atopic dermatitis, and more particularly, to a composition for treating atopic dermatitis, which contains a martari extract as an active ingredient.

아토피(atopy)의 발생 원인은 아직까지 확실히 밝혀져 있지 않으나 유전적, 면역학적 요인이 깊숙이 관계되리라 생각되며 동시에 환경적, 사회적, 정신적 요인 등 다양한 주변인자들도 연관이 있을 것으로 생각된다. "아토피"는 1925년 코카(Coca)라는 학자가 처음으로 사용한 용어로, 음식물이나 기타 흡입성 물질에 대한 선천성 알러지(allergy) 반응을 의미하는데 그리스어로 "알 수 없는", "괴상한" 이라는 뜻으로 그 의미에서도 알 수 있듯이 정확한 원인은 알 수 없고, 치료가 힘든 난치성 질환이다. 아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 보통 습진(eczema), 고초열(hayfever), 천식(asthma), 알레르기(allergy) 등을 잘 일으키는 유전적 경향을 보이는 체질을 가진 사람에게서 많이 발생되는 만성 피부염으로 흔히 태열이라 부르고 유아습진으로 시작, 만성, 재발성 경과를 보인다. 특히 생후 2개월 전후에 시작되는데, 이 중 약 50%가 생후 2세 이전에 발생하고, 거의 5세 이전에 증상이 나타나는 반면 성인에서 처음 증상이 나타나는 예는 극히 드물다. 대부분 성장과 더불어 증상이 완화되거나 사라지며 유아기 발생 환자의 절반 이상이 2세 전에 호전된다. 현재 일반인의 0.7%, 5세 이하 소아의 3-5%가 아토피 피부염을 앓고 있으며, 환경적인 요인으로 인하여 매년 그 숫자가 급격하게 증가하고 있다.The cause of atopy has not yet been clarified yet, but genetic and immunological factors are thought to be deeply related, and various environmental factors such as environmental, social, and psychological factors may be related. "Atopy" is the first term used by a Cocaologist in 1925 to refer to a congenital allergic reaction to food or other inhaled substances, meaning "unknown" or "odd" in Greek As it can be understood from the meaning, the exact cause is unknown, and it is a difficult and incurable disease. Atopic dermatitis is a common chronic dermatitis commonly seen in people with a genetic predisposition to develop eczema, hayfever, asthma and allergy. It starts with childhood eczema, and it is chronic and recurrent. Especially about two months after birth, about 50% of these occur before the age of 2 years old, almost 5 years before the symptoms appear in adults, but the first symptoms in adults are very rare. Most of the symptoms, along with growth, are alleviated or disappear, and more than half of the infantile patients develop before 2 years of age. At present, 0.7% of the general population and 3-5% of children under 5 years of age are suffering from atopic dermatitis, and the number is rapidly increasing every year due to environmental factors.

오늘날 아토피성 피부염의 치료는 약물투여 방법에 따라 외용 방법, 내복 방법, 그리고 면역 방법 등이 사용되고 있고 외용 방법으로는 피부를 세정하는 방법, 스테로이드 계열의 연고제를 바르는 방법, 그리고 보습제를 바르는 방법 등이 사용되고 있다. 특히 스테로이드는 일종의 부신피질 호르몬제로써 효과는 매우 우수하나 장시간 사용시 국소 및 전신 부작용으로 인하여 임상적으로 문제가 될 수 있으며, 약을 중지하면 오히려 증상이 악화되는 스테로이드제에 대한 내성을 나타낼 수있어 아토피 치료에 뛰어난 효과를 가지면서도 부작용이 적은 천연물을 이용한 새로운 아토피 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1226758호는 생약 추출물 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 대해 개시하고 있다. Currently, atopic dermatitis is treated by an external application method, an underwear method, an immunization method, and the like depending on the drug administration method. Examples of external application methods include a method of washing the skin, a method of applying a steroid-type ointment agent, . In particular, steroids are a kind of corticosteroids, which are very effective, but they can be clinically problematic due to local and systemic side effects when used for a long time, and they may show resistance to steroids, There is a demand for the development of a new treatment for atopic diseases using natural products having excellent effects on the treatment and low side effects. Korean Patent Registration No. 1226758 discloses a composition for preventing or treating atopic dermatitis including herbal medicine extract or lactobacillus fermented product thereof.

그러나 상기 선행기술의 경우, 한방 혼합물들을 가열하여 추출함으로써 아토피성 피부염을 악화시킬 수 있는 자극 인자들도 같이 추출되는 문제점이 있다. However, in the case of the prior art, there is a problem that stimulants that can worsen atopic dermatitis are also extracted by heating the herbal mixtures by heating.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 아토피성 피부염에 효율적인 마타리 추출물의 유효성분을 함유한 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a therapeutic agent containing an effective ingredient of Matali extract effective for atopic dermatitis. However, these problems are exemplary and do not limit the scope of the present invention.

본 발명의 일 관점에 따르면, 마타리(Patrinia scabiosaefolia) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피성 피부염 치료용 조성물이 제공된다. According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for treating atopic dermatitis, which comprises Matari ( Patrinia scabiosaefolia ) extract as an active ingredient.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 마타리(Patrinia scabiosaefolia) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피성 피부염 개선용 화장료 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for improving atopic dermatitis, which comprises an extract of Patrinia scabiosaefolia as an active ingredient.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 아토피 피부염 환자로부터 분리된 피부조직에서 필라그린 단백질의 발현정도를 측정하는 단계; 및 상기 필라그린 단백질의 발현양이 정상군에 비해 낮은 아토피 피부염 환자를 마타리 추출물 투여대상으로 선별하는 단계를 포함하는 마타리 추출물 투여대상 판정을 위한 정보제공 방법이 제공된다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing and treating atopic dermatitis, comprising the steps of: measuring the expression level of pilar green protein in skin tissue isolated from a patient suffering from atopic dermatitis; And a step of screening a patient suffering from atopic dermatitis, wherein the amount of expression of the pilar green protein is lower than that of a normal group, as a subject to be administered with a matari extract, is provided.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 마타리 추출물의 유효성분을 함유한 치료제를 이용하여 효율적인 아토피성 피부염 치료효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present invention as described above, an effective treatment for atopic dermatitis can be achieved by using a therapeutic agent containing an active ingredient of Matai extract. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 마타리 추출물의 세포 독성 여부를 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HaCaT 세포에서 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8 및 TARC에 대한 마타리 추출물의 억제효과를 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 HaCaT 세포에서 필라그린 발현에 대한 마타리 추출물의 유도효과를 확인한 겔사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스의 피부조직을 적출한 후 H&E 염색과 알시안 블루 염색을 수행 후 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스의 피부조직을 대상으로 필라그린 항체를 이용한 면역조직화학염색을 수행 후 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스의 피부조직단백질에서 필라그린의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스의 혈청에서 총 면역글로불린E의 양을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스의 비장세포 세포에서 마타리 추출물의 처리가 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현을 억제하는 효과를 관찰한 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 마우스에 마타리 추출물의 처리에 따른 혈청 AST와 ALT의 수치를 분석한 그래프이다. FIG. 1 is a graph showing cytotoxicity of a matari extract according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of the matary extract on the inflammatory cytokines IL-6, IL-8 and TARC in HaCaT cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a gel photograph showing the induction effect of matari extract on expression of pilar green in HaCaT cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a photograph of a skin tissue of an atopic dermatitis-induced mouse, followed by H & E staining and Alcian blue staining, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a photograph of a skin tissue of an atopic dermatitis-induced mouse according to an embodiment of the present invention, followed by immunohistochemical staining using a pill green antibody.
FIG. 6 is a gel photograph showing the expression of pilar green in the skin tissue protein of atopic dermatitis-induced mice according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the amount of total immunoglobulin E measured in the serum of atopic dermatitis-induced mice according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing the effect of treatment with Matali extract on the expression of IL-4, IL-5 and IL-13 in spleen cells of atopic dermatitis induced mice according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a graph showing the levels of serum AST and ALT according to the treatment of matari extract with atopic dermatitis-induced mice according to an embodiment of the present invention.

용어의 정의:Definition of Terms:

본 문서에서 사용되는 용어 "마타리(Patrinia scabiosaefolia)"는 우리나라 각처의 산과 들에서 나는 산토끼꽃목 마타리과의 여러해살이풀로 생육환경은 물 빠짐이 좋은 양지 혹은 반그늘에서 자란다. 키는 60~150㎝이고, 잎은 새의 깃 모양으로 깊이 갈라지고 마주난다. 꽃은 황색이고 가지 끝과 원줄기 끝에 달리며 지름이 약 0.5㎝가량 되는 꽃들이 많이 달린다.As used herein, the term " Patariia scabiosaefolia "is a perennial herbaceous herbaceous perennial herbaceous perennial herbaceous perennial plant that grows in sunny or semi-dry areas. Its height is 60 ~ 150㎝, and the leaf is deeply cracked and faced with bird's feather shape. The flower is yellow and runs on the tip of the branch and the end of the main stem, and there are many flowers with a diameter of about 0.5㎝.

본 문서에서 사용되는 용어 "아토피성 피부염"은 그 발생의 직ㅇ간접적인 원인을 불문하고 당업계에서 아토피 피부염으로 분류되는 모든 질환을 포함하는 의미하는 것으로 그 발병 시기 또는 그 발명 대상에 따라 유아형 아토피 피부염과 소아형 아토피 피부염과 성인형 아토피 피부염 및 임산부 아토피 피부염으로 분류되는데, 본 발명에서 아토피 피부염은 이러한 모든 유형의 아토피 피부염을 포함하는 것으로 정의된다.As used herein, the term "atopic dermatitis" means any disease classified as atopic dermatitis in the art regardless of its indirect or immediate cause. The term " atopic dermatitis " Atopic dermatitis, pediatric atopic dermatitis, adult atopic dermatitis and maternal atopic dermatitis. In the present invention, atopic dermatitis is defined as including all these types of atopic dermatitis.

본 문서에서 사용되는 용어 "필라그린(filaggrin)"은 포유류의 표피세포에서 분리한 케라틴 결합단백질로 분자량이 약 260,000의 염기성 단백질이고 케라틴의 단위체와 약 3:2의 비율로 결합하며 그 섬유를 다발모양으로 응집시켜 거대피브릴을 형성한다. As used herein, the term "filaggrin" is a keratin binding protein isolated from mammalian epidermal cells, which is a basic protein of about 260,000 molecular weight and binds to keratin units at a ratio of about 3: 2, To form giant fibrils.

발명의 상세한 설명:DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [

상기 아토피성 피부염 치료용 조성물에 있어서, 상기 마타리 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알콜, 주정 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조하는 것을 특징으로 할 수 있고 상기 추출은 초임계추출, 상온침지추출 또는 열수추출일 수 있다. In the composition for treating atopic dermatitis, the matari extract may be prepared by extracting with C1 to C4 lower alcohol, alcohol, or a mixed solvent thereof. The extraction may be performed by supercritical extraction, Lt; / RTI >

상기 아토피성 피부염 치료용 조성물에 있어서, 상기 아토피성 피부염은 피부에서의 필라그린 단백질 층이 얇아짐에 의해 발생하는 것일 수 있다. In the composition for treating atopic dermatitis, the atopic dermatitis may be caused by thinning of the pilar green protein layer in the skin.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 아토피 피부염 환자로부터 분리된 피부조직에서 필라그린 단백질의 발현정도를 측정하는 단계; 및 상기 필라그리 단백질의 발현양이 정상군에 비해 낮은 아토피 피부염 환자를 마타리 추출물 투여대상으로 선별하는 단계를 포함하는 마타리 추출물 투여대상 판정을 위한 정보제공 방법이 제공된다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing and treating atopic dermatitis, comprising the steps of: measuring the expression level of pilar green protein in skin tissue isolated from a patient suffering from atopic dermatitis; And a step of screening a patient for atorvastatin dermatitis, the amount of which is lower than that of the normal group, as a subject to be administered with a matari extract.

아토피 피부염 환자의 발병원인은 다양하며, 필라그린(filaggrin), 로리크린(loricrin), 인볼루크린(involucrin)과 같은 피부장벽 단백질의 발현량의 감소가 중요한 원인으로 최근 피부장벽에 중요한 역할을 담당하는 단백질인 필라그린(filaggrin) 유전자(FLG)의 기능 결함 돌연변이로 인해 플라그린 단백질 층이 얇아져서 아토피피부염과 이와 동반된 천식의 발생과 밀접한 연관(대한민국 등록특허 제1629439호)이 있음을 본 발명자들은 주목하고 이를 해결하고자 예의 노력한 결과, 피부장벽 단백질인 필라그린의 발현을 증가시켜 아토피성 피부염을 치료할 수 있는 마타리 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료제를 개발하였다. The causes of atopic dermatitis are varied, and the decrease in the expression of skin barrier proteins such as filaggrin, loricrin and involucrin is an important cause of skin barrier. The inventors of the present invention found that there is a close relationship between atopic dermatitis and the accompanying occurrence of asthma due to the thinning of the flavon protein layer due to the functional defect mutation of the filaggrin gene (FLG) As a result of efforts to solve this problem, we have developed a therapeutic agent for atopic dermatitis comprising an extract of Matari, which can treat atopic dermatitis, as an active ingredient, by increasing the expression of fila green, a skin barrier protein.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It should be understood, however, that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, Is provided to fully inform the user.

실시예 1: 마타리 추출물 제조 Example 1: Preparation of matari extract

본 발명의 일 실시예에 따른 마타리(Patrinia scabiosaefolia) 추출물은 한국식물추출물은행(KPEB)에서 구입한 것으로 건조된 마타리 전초(충북 제천시 천등산) 130g에 Burdick & Jackson, AH230-4(Methyl alcohol 99.9 % HPLC grade)를 1L를 첨가하고 실온에서 15분 sonication(SD-ULTRASONIC CLEANER, SDN-900H) 후 2시간 정치, 10회/1일 추출하였다. 그 후 상등액을 원심분리(4500 ×g, 5분)하였고 분석하기 전에 시린지 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였으며 분액은 필터 후 사용하였다(추출량:4.6 g, 추출수율:3.54 %). The extract of Patrinia scabiosaefolia according to one embodiment of the present invention was obtained from Burdick & Jackson, AH230-4 (Methyl alcohol 99.9% HPLC (trade name)) in 130 g of dried martarius japonica (SD-ULTRASONIC CLEANER, SDN-900H) at room temperature for 15 min. The supernatant was then centrifuged (4500 × g, 5 min) and filtered through a syringe filter (0.22 μm) before analysis. The filtrate was used after filtration (extraction volume: 4.6 g, extraction yield: 3.54%).

실시예 2: 세포 배양 (Cell culture) Example 2: Cell culture

본 발명에 사용된 사람 각질세포주인 HaCaT 세포주는 10% FBS(16000, Gibco, USA)와 100 U/ml penicillin/streptomycin(15240, Gibco, USA)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 12800, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간동안 배양하였고 100 mm dish(174905, NUNC, USA)에서 충분히 증식될 때까지 배양 2-3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 그 후 계대배양은 100 mm dish를 약 70~80% 정도 채울 정도로 증식시킨 후에 진행하였으며, 2 mL의 0.5% trypsin-EDTA (15400, Gibco, USA)용액으로 세포를 탈착하여 배양하였다.The human keratinocyte cell line HaCaT cell line used in the present invention was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 12800, Gibco, USA) supplemented with 10% FBS (16000, Gibco, USA) and 100 U / ml penicillin / streptomycin , USA) medium at 37 ° C and 5% CO ₂ for 48 hours and replaced with fresh medium at 2-3 days intervals until 100 mm dish (174905, NUNC, USA) was fully proliferated. Subsequently, subculture was carried out after proliferation of about 70-80% of a 100-mm dish, and cells were desorbed and cultured with 2 mL of 0.5% trypsin-EDTA (15400, Gibco, USA).

실시예 3: 세포생존율 분석(MTT assay) Example 3: Cell viability analysis (MTT assay)

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 1에서 추출한 마타리의 세포독성 (cytotoxicity)과 세포 보호효과를 분석하기 위하여 96 웰 플레이트(30096, SPL, Korea)에 HaCaT 세포주를 1×10⁴ cells/well로 분주하고 48시간동안 안정화하였다. 이 후 마타리 추출액을 농도별(10~50 ㎍/mL)로 48시간 동안 처리하고 Cell Proliferation kit I(11465007001, Roche, USA)을 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 10 ㎕를 첨가하였다. 4시간 경과 후 가용화(solubilization) 용액 100㎕를 첨가하였고 12시간 후에 540 nm에서 ELISA reader기(Emax, Molecular Devices, USA)를 통해 흡광도를 측정하여, 대조군 및 마타리 처리군의 세포생존율(%)을 분석하였다.In order to analyze the cytotoxicity and cytoprotective effect of matari extracted in Example 1 according to an embodiment of the present invention, a HaCaT cell line was cultured in a 96 well plate (30096, SPL, Korea) at 1 x 10 ⁴ cells / well &Lt; / RTI > and stabilized for 48 hours. (MTT) (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -tetrahydrothiazol-2-yl) thioglycolate was prepared by treating the extract of Matari with concentration (10 ~ 50 ㎍ / mL) for 48 hours and using Cell Proliferation kit I (11465007001, Roche, USA) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) was added. After 4 hours, 100 sol of solubilization solution was added. After 12 hours, the absorbance was measured at 540 nm through an ELISA reader (Emax, Molecular Devices, USA) and the cell viability (%) Respectively.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 HaCaT 세포에 10 ㎍/mL 마타리 추출물을 처리한 실험군에서 세포 생존율의 변화가 없는 것을 확인되어 마타리 추출물이 상기 농도에서 각 세포들에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 1, it was confirmed that there was no change in cell survival rate in HaCaT cells treated with 10 ㎍ / mL matari extract compared with the control group, and thus the matari extract showed toxicity to each cell at the above concentrations .

실시예 4: 사이토카인 측정 Example 4: Measurement of cytokine

본 발명의 일 실시예에 따라 염증성 사이토카인에 대한 마타리 추출물의 억제 효과를 관찰하기 위하여 HaCaT 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM에 혼합한 후 24 웰 플레이드에 분주(1.5 x 10⁵/mL)하였고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 16시간동안 배양하였다. 그 후, 마타리 추출물(최종 농도 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 상기 처리하였고 TNF-α(10 ng/㎖ )와 IFN-γ(10 ng/ ㎖ )를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-6, IL-8 및 TARC의 양을 측정하였다. HaCaT cells were mixed with DMEM supplemented with 10% FBS, and then seeded (1.5 x 10 ⁵ / mL) in 24 well plates in order to observe the inhibitory effect of the matari extract on inflammatory cytokines according to one embodiment of the present invention. And cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO ₂ for 16 hours. (10 ng / ml) and IFN-γ (10 ng / ml) were treated for 24 hours, respectively, , And then the amounts of IL-6, IL-8 and TARC were measured in the supernatant using ELISA.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 마타리 추출물을 처리하여 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 및 TARC의 생성이 억제되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that the production of IL-6, IL-8 and TARC, which are inflammatory cytokines, was suppressed by treating matricariae extracts with HaCaT cells.

실시예 5: 필라그린 발현 측정 Example 5: Measurement of pilar green expression

본 발명의 일 실시예에 따라 사람 각질세포에서의 피부장벽 단백질인 필라그린의 발현을 측정하기 위하여 HaCaT 세포(5 x 10⁶/mL)를 6 웰 플레이트에 분주한 후 마타리 추출물(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)과 TNF-a/IFN-r를 처리 후 HaCaT 세포(50 ㎕)를 용해완충액(lysis buffer)에 용해하여 단백질 샘플을 획득하였고 이를 전기영동을 통해서 분리하였으며 나이트로셀룰로스 필터로 옮긴 후 필라그린 항체(Santa Crutz)로 감작(sensitization)하는 화학발광 방법을 이용하여 블랏(blot)을 확인하였다.HaCaT cells (5 x 10 ⁶ / mL) were divided into 6-well plates in order to measure the expression of filargrin, a skin barrier protein in human keratinocytes according to an embodiment of the present invention. Then, Matari extract (5 μg / , 10 μg / ml) and TNF-a / IFN-r were treated with HaCaT cells (50 μl) in a lysis buffer to obtain protein samples, which were then separated by electrophoresis and washed with a nitrocellulose filter After the transfer, a blot was confirmed using a chemiluminescence method of sensitizing with a pillar green antibody (Santa Crutz).

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에서 TNF-α와 IFN-γ처리에 의해 감소한 필라그린의 발현이 마타리 추출물 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났다. As a result, as shown in Fig. 3, expression of filaggrin reduced by treatment with TNF-a and IFN-y in HaCaT cells was found to increase with treatment with matari extract.

실시예 6: 아토피 피부염 유발 동물모델 제작 Example 6: Production of animal model inducing atopic dermatitis

본 발명의 일 실시예에 따라 아토피 피부염 유발 NC/Nga 마우스를 대상으로 한 생체내(in vivo) 실험에서 마타리 추출물의 항아토피 효과를 관찰하였다. 구체적으로, 아토피 피부염 유발 마우스 모델 제작을 위해 각 실험군 당 5개체의 마우스의 등 부위의 털을 제거한 후 1% 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)를 피부에 도포하였고 1주일 경과시점에서 0.3% DNCB를 5주 동안 상기 피부에 도포하였다. 실험군은 아토피 피부염 유발 및 마타리 추출물 처리를 하지 않은 정상군과 아토피 피부염은 유발시켰으나 마타리 추출물을 처리하지 않은 대조군으로 분류하였고 상기 아토피 피부염 유발 마우스군은 마타리 추출물 처리군 및 덱사메타손 (3mg/kg, Dex) 처리군으로 분류하였으며 마타리 추출물 처리군은 매일 마타리 추출물 100 ㎍/kg을 처리한 실험군(PS100), 매일 마타리 추출물 200 ㎍/kg을 처리한 실험군(PS 200) 및 매일 마타리 추출물 500 ㎍/kg을 처리한 실험군(PS500)으로 분류하였다. According to one embodiment of the present invention, the anti-atopic effect of the martari extract was observed in an in vivo experiment on atopic dermatitis-induced NC / Nga mice. Specifically, for the production of atopic dermatitis-induced mouse model, hair was removed from the dorsal area of 5 mice per each experimental group, and 1% 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) was applied to the skin. After 1 week, 0.3% DNCB Was applied to the skin for 5 weeks. The experimental group was classified as a control group in which atopic dermatitis-induced and non-matrimonial-treated normal group and atopic dermatitis were induced, but matari extract-treated mice were treated with matari extract and dexamethasone (3 mg / kg, Dex) (PS 200), 200 ㎍ / kg of matary extract (PS 200) and 500 ㎍ / kg of daily extracts of matary extract were treated with 100 ㎍ / kg of matary extract And one experimental group (PS500).

실시예 7: 피부 조직 관찰 Example 7: Observation of skin tissue

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 6에서 제작한 아토피 피부염 유발 마우스의 피부조직을 적출한 후, 10% 중성 포르말린으로 고정하여 파라핀 조직 블록으로 제작하였고 박절기(microtome)를 이용하여 조직 절편을 만든 다음, H&E 염색(hematoxylin & eosin stain)과 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행하였고 필라그린 항체를 이용한 면역조직화학염색을 실시하여 현미경으로 관찰하였으며 상기 마우스 피부조직을 용해시켜 획득한 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. In accordance with an embodiment of the present invention, the skin tissue of the atopic dermatitis-induced mouse prepared in Example 6 was extracted, fixed with 10% neutral formalin and made into a paraffin tissue block. Using a microtome, Hematoxylin & eosin stain and alcian blue staining were performed. Immunohistochemical staining was performed using a pella green antibody. The cells were observed under a microscope. The protein obtained by dissolving the mouse skin tissue Expression was confirmed by Western blot.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 정상군과 비교하여 아토피 피부염 유발군에서 피부에 침윤된 세포의 수가 증가하였고 피부의 배열이 비정상적으로 나타났다. 그러나 마타리 추출물 처리군에서는 침윤된 세포의 수가 감소하였고 피부의 형태가 정상군과 유사하게 유지되고 있음을 확인하였다. 또한, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이 정상군과 비교하여 아토피 피부염 유발군에서 필라그린의 발현이 감소한 반면 마타리 추출물 처리군에서는 정상군과 유사하게 필라그린의 발현이 증가한 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 4, the number of cells infiltrated into the skin increased and the arrangement of the skin was abnormal in the atopic dermatitis-induced group as compared with the normal group. However, the number of infiltrated cells decreased and the skin shape remained similar to that of the normal group in the matari extract - treated group. In addition, as shown in FIGS. 5 and 6, the expression of filaggrin in the atopic dermatitis-induced group was decreased compared with the normal group, but the expression of filaggrin was increased in the matari extract-treated group similarly to the normal group.

실시예 8: 항아토피 효과 확인 Example 8: Confirmation of anti-atopic effect

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 제조한 아토피 피부염 유발 마우스의 혈청에서 총 면역글로불린E를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 또한 마우스의 비장세포에 대한 사이토카인의 생성을 관찰하기 위하여 각 실험군의 마우스에서 비장조직을 적출한 후, 비장세포를 분리하였고 적혈구 용해액으로 적혈구를 제거 후 24 웰 플레이트에 분주(5 x 10⁶/mL)하였으며 코카나발린(concanavalin) 1 μg/mL를 24시간 및 48시간 동안 처리하였다. 그 후, 상층액을 수집한 다음 ELISA를 이용하여 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성량을 측정하였다. 아울러, 마타리 추출물 처리에 따른 독성 존재 여부를 확인하기 위하여 마우스 혈청으로부터 AST, ALT의 증가 수치를 측정하여 판단하는 간독성 검사를 수행하였다.Total immunoglobulin E was measured in the serum of the atopic dermatitis-induced mouse prepared above according to one embodiment of the present invention using the ELISA method. In order to observe cytokine production in mouse spleen cells, spleen tissues were isolated from mice of each experimental group, splenocytes were separated, and red blood cells were removed with a red blood cell solution, and the mixture was dispensed into a 24-well plate (5 x 10 ⁶ / mL) and treated with 1 μg / mL of concanavalin for 24 hours and 48 hours. The supernatants were then collected and the amount of IL-4, IL-5 and IL-13 produced was measured using an ELISA. In addition, hepatotoxicity tests were performed to determine the presence of toxicity by treatment with Matari extract, by measuring the levels of AST and ALT in mouse serum.

그 결과, 정상군과 비교하여 아토피 피부염 유발군에서 총 면역글로불린E가 급격히 증가하였으나, 마타리 추출물의 투여에 의해서 감소한 것으로 나타났고(도 7). 비장세포에서 사이토카인의 생성량 관찰 결과, 정상군과 비교하여 아토피 피부염 유발군에서 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현이 증가하였으나 마타리 추출물 투여군들에서 상기 사이토카인들의 발현이 감소하여 정상군과 유사하게 나타났으며(도 8) 혈청의 AST, ALT의 양을 측정한 결과, 정상군, 아토피 피부염 유발군 및 마타리 추출물 처리군 모두에서 AST, ALT의 수치가 증가하지 않았으므로 마타리 추출물이 마우스 내에서 독성을 가지고 있지 않음을 확인하였다(도 9). As a result, total immunoglobulin E was rapidly increased in atopic dermatitis induced group compared to normal group, but decreased by administration of matari extract (Fig. 7). The expression levels of IL-4, IL-5 and IL-13 were increased in the atopic dermatitis-induced group compared to the normal group, but the expression of the cytokines was decreased in the matari extract- (AST and ALT) levels in the normal group, the atopic dermatitis-induced group and the matari extract-treated group were not increased. As a result, It was confirmed that it was not toxic in mouse (Fig. 9).

결론적으로, 본 발명의 마타리 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료제는 아토피성 피부염의 조직에서 감소되는 사람 각질세포에서의 피부장벽 단백질인 필라그린의 발현을 증가시켜 부작용이 적고 효율적인 아토피성 피부염의 치료제로 활용될 수 있다. In conclusion, the therapeutic agent for atopic dermatitis containing the malaria extract of the present invention as an active ingredient increases the expression of filargreen, a skin barrier protein in human keratinocytes, which is reduced in the tissue of atopic dermatitis, Can be used as a therapeutic agent.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. Accordingly, the true scope of the present invention should be determined by the technical idea of the appended claims.

Claims

Treatment of atopic dermatitis caused by the thinning of the pillared green protein layer in the skin, containing the matari extract of Patrinia scabiosaefolia extracted from C1 to C4 lower alcohol, alcohol or mixed solvent thereof as an active ingredient &Lt; / RTI >

delete

The method according to claim 1,
Wherein the extract is supercritical extraction or normal-temperature immersion extraction.

delete

Improvement of atopic dermatitis caused by the thinning of the pillared green protein layer in the skin, which contains the martari extract prepared by extracting Patariia scabiosaefolia with C1 to C4 lower alcohol, alcohol, or a mixed solvent thereof. / RTI >

Measuring the expression level of pilar green protein in skin tissue isolated from atopic dermatitis patients; And
The method of claim 1, wherein the amount of the pilar green protein is lower than that of the normal group.