KR101795633B1 - Method of Forming Spheroids of Stem cell - Google Patents

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KR101795633B1
KR101795633B1 KR1020160062663A KR20160062663A KR101795633B1 KR 101795633 B1 KR101795633 B1 KR 101795633B1 KR 1020160062663 A KR1020160062663 A KR 1020160062663A KR 20160062663 A KR20160062663 A KR 20160062663A KR 101795633 B1 KR101795633 B1 KR 101795633B1
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박준범
이성일
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a method for forming spheroids of stem cell, including a step for co-culturing stem cells and adult cells together. The method of the present invention enables excellent formation of spheroids compared to culture of stem cells only while maintaining cell viability and stemness of stem cells intact. Thus, when transplanted to tissues for therapies, the spheroid formation method and spheroids of the present invention can be useful.

Description

줄기세포의 스페로이드화 방법{Method of Forming Spheroids of Stem cell}Methods for Forming Spheroids of Stem Cells [

본 발명은 줄기세포의 스페로이드화 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 줄기세포의 공배양을 통한 스페로이드화 방법에 관한 것이다. [0001] The present invention relates to a method of speylization of stem cells, and more particularly, to a method of spewing through co-culture of stem cells.

최근 조직공학을 이용한 재생의학 분야에서 줄기세포의 이용 기술이 난치병 치료를 위한 새로운 분야로 제시되고 있다. 이에 줄기세포의 연구에 대한 관심이 높아지고, 증식과 분화를 통하여 조직을 형성할 수 있는 줄기세포가 대부분의 질병치료뿐만 아니라, 조직 훼손 등을 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있다.Recently, the use of stem cells in the field of regenerative medicine using tissue engineering has been proposed as a new field for the treatment of incurable diseases. Therefore, interest in stem cell research has increased, and it has been recognized that stem cells capable of forming a tissue through proliferation and differentiation can solve not only most diseases but also tissue damage.

줄기세포(stem cell)는 미분화 상태에서 자가 복제 능력을 가지면서 적당한 조건하에서 특정 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분이 될 수 있다. 인간의 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 얻어지기 때문에 세포 증식 및 분화 능력이 우수하나 생명윤리적인 문제점을 가지고 있다. Stem cells have the ability to self-replicate under undifferentiated conditions and differentiate into specific cells under appropriate conditions. Stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells depending on their origins. Since human embryonic stem cells are derived from embryos that can occur in human life forms, they have excellent cell proliferation and differentiation potential, but have bioethical problems.

그에 반해, 성체 줄기세포는 배아 줄기세포에 비해 분화 능력이 한정되어 있으나, 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 채취하여 줄기세포로 발전시킨 것으로 윤리적인 문제가 적다. 성체 줄기세포로는 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며, 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액 암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. On the other hand, adult stem cells have a limited ability to differentiate from embryonic stem cells, but they have been developed into stem cells from bone marrow, blood, brain, and skin, which already exist in various organs of the human body. . As adult stem cells, there are hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neuroblastoma, epithelial cells, etc. Hematopoietic stem cells can produce hematopoietic cells and lymphocytes, and are useful for the treatment of immune system diseases including hematologic malignancies. Stem cells are differentiated into bone, cartilage, fat, and fibrous tissue, and are involved in the recovery of each tissue when damaged.

즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화' 세포를 의미하는 것이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있어, 이를 이용한 질병의 치료 등의 연구가 활발히 이루어지고 있다.In other words, the term "stem cell" refers to a "undifferentiated" cell that has this differentiation ability but does not yet undergo differentiation. When appropriate conditions are met under such undifferentiated state, stem cells can be differentiated into various tissue cells, and studies for treating diseases using such cells have been actively conducted.

줄기세포를 이용하기 위해서는 특정 세포로 분화시켜 사용하기 전까지 줄기세포능(stemness)이 유지되는 것이 필요하며, 줄기세포능 유지를 위해서 3차원 배양 시스템이 연구되고 있다. 3차원 배양 시스템은 줄기세포의 자기-재생 및 분화를 조절함에 있어서 세포간 상호작용의 중요성을 나타낸다. 예를 들면, 인간 지방 유래 줄기세포 및 젤라틴 마이크로스피어로 형성된 세포 마이크로스피어 구조체는 줄기세포의 분화를 개선하고, 전-혈관형성 가능성을 조절하며, 이 3차원 구조체가 치료적 가능성을 개선하는 것이 연구된 바 있다.In order to utilize stem cells, it is necessary to maintain the stemness until the cells are differentiated into specific cells, and a three-dimensional culture system for stem cell function maintenance is being studied. The three-dimensional culture system represents the importance of intercellular interactions in regulating the self-renewal and differentiation of stem cells. For example, cell microsphere constructs formed from human adipose-derived stem cells and gelatin microspheres can improve the differentiation of stem cells, control the potential for pre-angiogenesis, and improve the therapeutic potential of this three- .

한편, 세포들의 병용이 뼈 결함의 치료를 위한 조직 공학 기술에서 이용될 수 있는 것이 비특허문헌 1에 개시되어 있다. 그러나, 비특허문헌 1에는 트랜스 웰을 이용한 2차원 배양으로 조골세포가 간엽 줄기세포의 골분화를 유도하는 점만 개시되어 있으므로, 줄기세포를 성체세포와 3차원 공배양시 줄기세포의 줄기세포능이 유지되는지는 알 수 없었다. On the other hand, non-patent document 1 discloses that the combination of cells can be utilized in tissue engineering techniques for treating bone defects. However, non-patent document 1 discloses that osteoblast induces bone differentiation of mesenchymal stem cells by two-dimensional culture using transwell. Therefore, when stem cells are co-cultured with adult cells in a three-dimensional culture, It was not known.

본 발명자들은 줄기세포의 생존도와 줄기세포능을 유지하면서 스페로이드로 만들 수 있는 방법을 연구하였으며, 치은 유래 줄기세포를 성체세포와 3차원 공배양하여 스페로이드 형태의 치은 유래 줄기세포가 여전히 줄기세포능과 생존도를 유지하고 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have studied how to make spleen while maintaining the survival and stem cell function of stem cells. The gingival-derived stem cells are co-cultured with adult cells in a three-dimensional manner, so that the spleen-shaped gingival- And thus the present invention has been completed.

Glueck M et al., Biores Open Access 4: 121-130, 2015Glueck M et al., Biores Open Access 4: 121-130, 2015

본 발명의 목적은 줄기세포를 스페로이드의 형태로 제조하되, 스페로이드 내의 세포들의 생존도가 유지되며 스페로이드 내의 줄기세포의 줄기세포능이 유지되도록 하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for producing stem cells in the form of spoloids so that the viability of the cells in the spoloid is maintained and the stem cell ability of the stem cells in the spoloid is maintained.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 줄기세포 및 성체세포를 공배양하는 단계;를 포함하는 줄기세포의 스페로이드화 방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, one aspect of the present invention provides a method for spleenogenesis of stem cells comprising co-culturing stem cells and adult cells.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 줄기세포 및 성체세포를 포함하는 세포 스페로이드를 제공한다. In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a cell spleod comprising stem cells and adult cells.

본 발명에 따른 세포 스페로이드는 줄기세포 단독으로 스페로이드를 제조할 때에 비해서 스페로이드화가 우수하며, 스페로이드 내에 포함된 세포들의 생존도가 유지되면서, 스페로이드에 포함된 줄기세포의 줄기세포능이 유지되는 효과가 있다. The cell spleod according to the present invention is superior to spleen alone in preparing spleen alone, and the viability of the cells contained in the spleoid is maintained, and the stem cell capacity of the stem cells contained in the spleoid is maintained .

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 치은 유래 줄기세포와 골아전구세포로 세포 스페로이드를 형성하는 것에 대한 개략도이다.
도 2는 배양 1, 3, 5 및 7일자에 스페로이드의 형태이다. 스케일바는 200㎛를 나타내며, 배율은 X100이다. A-D는 그룹 1의 배양 1, 3, 5 및 7일자의 형태를 나타내고, E-H는 그룹 2의 배양 1, 3, 5 및 7일자의 형태를 나타내며, I-L는 그룹 3의 배양 1, 3, 5 및 7일자의 형태를 나타내고, M-P는 그룹 4의 배양 1, 3, 5 및 7일자의 형태를 나타내며, Q-T는 그룹 5의 배양 1, 3, 5 및 7일자의 형태를 나타낸다.
도 3은 배양 1, 3, 5 및 7일자에 스페로이드의 직경이다.
* 배양 1일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
** 배양 1일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
# 배양 3일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
## 배양 3일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
### 배양 3일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
§ 배양 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
§§ 배양 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
§§§ 배양 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
† 배양 7일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
†† 배양 7일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되었다(P<0.05).
도 4는 1일자의 세포 스페로이드의 Live/dead 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100㎛이고, 배율은 X200이다. A-C는 그룹 1의 배양 1일자를 나타내고, D-F는 그룹 2의 배양 1일자를 나타내며, G-I는 그룹 3의 배양 1일자를 나타내고, J-L은 그룹 4의 배양 1일자를 나타내며, M-O는 그룹 5의 배양 1일자를 나타낸다.
도 5는 3일자의 세포 스페로이드의 Live/dead 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100㎛이고, 배율은 X200이다. A-C는 그룹 1의 배양 3일자를 나타내고, D-F는 그룹 2의 배양 3일자를 나타내며, G-I는 그룹 3의 배양 3일자를 나타내고, J-L은 그룹 4의 배양 3일자를 나타내며, M-O는 그룹 5의 배양 3일자를 나타낸다.
도 6은 5일자의 세포 스페로이드의 Live/dead 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100㎛이고, 배율은 X200이다. A-C는 그룹 1의 배양 5일자를 나타내고, D-F는 그룹 2의 배양 5일자를 나타내며, G-I는 그룹 3의 배양 5일자를 나타내고, J-L은 그룹 4의 배양 5일자를 나타내며, M-O는 그룹 5의 배양 5일자를 나타낸다.
도 7은 7일자의 세포 스페로이드의 Live/dead 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100㎛이고, 배율은 X200이다. A-C는 그룹 1의 배양 7일자를 나타내고, D-F는 그룹 2의 배양 7일자를 나타내며, G-I는 그룹 3의 배양 7일자를 나타내고, J-L은 그룹 4의 배양 7일자를 나타내며, M-O는 그룹 5의 배양 7일자를 나타낸다.
도 8은 배양 1, 3, 5 및 7일자의 세포 생존도를 나타내는 그래프이다.
* 배양 1일자의 그룹 1과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
** 배양 7일자의 그룹 1과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
# 배양 1일자의 그룹 1과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
## 배양 1일자의 그룹 1과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
### 배양 1일자의 그룹 1과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
§ 배양 1일자의 그룹 2와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
§§ 배양 1일자의 그룹 2와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
† 배양 1일자의 그룹 3과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
†† 배양 1일자의 그룹 3과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
††† 배양 1일자의 그룹 3과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
‡ 배양 1일자의 그룹 4와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
‡ ‡ 배양 1일자의 그룹 4와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
‡ ‡ ‡ 배양 1일자의 그룹 4와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
Ⅰ 배양 1일자의 그룹 5와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
Ⅱ 배양 1일자의 그룹 5와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
Ⅲ 배양 1일자의 그룹 5와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
도 9는 배양 7일자에 면역화학적 염색으로 줄기세포능의 유지 정도를 평가한 결과이다. 세포 스페로이드는 NL493-접합된 SSEA-4(녹색) 및 NL557-접합된 TRA-1-60(적색) 항체로 염색하였다. SSEA-4 및 TRA-1-60는 줄기세포에 대한 양성 마커이다. 스케일바는 100㎛이며, 배율은 X200이다. A-C는 배양 7일자의 그룹 1이고, G-I는 배양 7일자의 그룹 3이고, J-L은 배양 7일자의 그룹 4이며, M-O는 배양 7일자의 그룹 5이다.
도 10은 1일과 5일자의 세포 스페로이드의 알칼리 포스파타제 활성을 나타내는 그래프이다.
* 배양 5일자의 그룹 1과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
# 배양 1일자의 그룹 1과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
§ 배양 1일자의 그룹 2와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
† 배양 1일자의 그룹 3과 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
‡ 배양 1일자의 그룹 4와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).
∥ 배양 1일자의 그룹 5와 비교하여 유의차가 확인되었다(P < 0.05).BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a schematic diagram of the formation of cell spheroids from gingival stem cells and osteoprogenitor cells.
Figure 2 is in the form of speroid on days 1, 3, 5 and 7 of culture. The scale bar represents 200 mu m and the magnification is X100. AD represents the morphology of Group 1 cultures 1, 3, 5 and 7, EH represents the morphology of Group 1 cultures 1, 3, 5 and 7, IL is the culture of Groups 3, 7, and MP represents the form of cultures 1, 3, 5 and 7 of group 4, and QT represents the cultures of group 1, 3, 5 and 7 respectively.
Figure 3 is the diameter of the sprooid on days 1, 3, 5 and 7 of culture.
* A significant difference was observed when compared to Group 1 of culture 1 day (P <0.05).
** Significant difference was observed when compared to group 1 of culture 1 day (P <0.05).
# A significant difference was observed when compared to group 1 of culture 3 days (P <0.05).
A significant difference was observed when compared to group 1 of # 3 cultures (P <0.05).
A significant difference was observed when compared to group 1 of culture 3 days (P <0.05).
§ Significant difference was observed when compared to group 1 of 5 days of culture (P <0.05).
§§ Significant difference was observed when compared to group 1 of culture 5 days (P <0.05).
§§§ Significant difference was observed when compared to group 1 of culture 5 days (P <0.05).
† A significant difference was observed when compared to group 1 of culture 7 days (P <0.05).
†† Significant difference was observed when compared to group 1 of culture 7 days (P <0.05).
Figure 4 shows live / dead cell images of cell spleens of day 1. The scale bar is 100 mu m and the magnification is X200. AC represents 1 day of culture of group 1, DF represents 1 day of culture of group 2, GI represents 1 day of culture of group 3, JL represents 1 day of culture of group 4, MO represents culture of group 5 1 date.
Figure 5 shows live / dead cell images of cell spleens on day 3; The scale bar is 100 mu m and the magnification is X200. AC represents three days of culture of group 1, DF represents three days of culture of group 2, GI represents three days of culture of group 3, JL represents three days of culture of group 4, MO represents culture of group 5 3 date.
Figure 6 shows live / dead cell images of 5-day cell spleens. The scale bar is 100 mu m and the magnification is X200. AC represents 5 days of culture of group 1, DF represents 5 days of culture of group 2, GI represents 5 days of culture of group 3, JL represents 5 days of culture of group 4, MO is culture of group 5 5 days.
Figure 7 shows live / dead cell images of cell spleens on day 7; The scale bar is 100 mu m and the magnification is X200. AC represents 7 days of cultivation of group 1, DF represents 7 days of cultivation of group 2, GI represents 7 days of culture of group 3, JL represents 7 days of culture of group 4, MO represents culture of group 5 7 days.
8 is a graph showing cell viability at days 1, 3, 5 and 7 of culturing.
* There was statistically significant difference (P <0.05) compared to group 1 of culture 1 day.
** statistically significant difference compared to group 1 of 7 days of culture (P <0.05).
(P <0.05) compared to group 1 of culture 1 day.
There was a significant difference (P <0.05) compared to group 1 of # 1 culture.
There was a significant difference (P <0.05) compared to group 1 of culture # 1 # 1.
§ Significant difference compared to group 2 on day 1 of culture (P <0.05).
§§ Significant difference compared to group 2 on day 1 of culture (P <0.05).
† A significant difference was observed compared to Group 1 of culture 1 day (P <0.05).
†† There was a significant difference (P <0.05) compared to group 3 of culture 1 day.
††† There was a significant difference compared to group 3 of culture 1 day (P <0.05).
‡ Significant differences were observed compared to group 1 on day 1 of culture (P <0.05).
‡ ‡ Significant difference was observed compared to group 1 of culture 1 day (P <0.05).
‡ ‡ ‡ A significant difference was observed compared to group 1 of culture 1 day (P <0.05).
Significant differences were observed compared to Group 5 of culture 1 day (P <0.05).
(P < 0.05) compared to Group 5 on day 1 of culture.
(P <0.05) compared with group 5 of day 1 culture.
FIG. 9 shows the result of evaluating the degree of maintenance of stem cell function by immunochemical staining on day 7 of culture. Cellular spleens were stained with NL493-conjugated SSEA-4 (green) and NL557-conjugated TRA-1-60 (red) antibodies. SSEA-4 and TRA-1-60 are positive markers for stem cells. The scale bar is 100 mu m and the magnification is X200. AC is group 1 of 7 days of culture, GI is group 3 of 7 days of culture, JL is group 4 of 7 days of culture, and MO is group 5 of 7 days of culture.
FIG. 10 is a graph showing the activity of alkaline phosphatase of cell spoloids at day 1 and day 5; FIG.
* A significant difference compared to group 1 of 5 days of culture (P <0.05).
(P <0.05) compared to group 1 of culture 1 day.
§ Significant difference compared to group 2 on day 1 of culture (P <0.05).
† A significant difference was observed compared to Group 1 of culture 1 day (P <0.05).
‡ Significant differences were observed compared to group 1 on day 1 of culture (P <0.05).
A significant difference was observed compared to group 5 of culture 1 day (P <0.05).

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.First, terms used in the specification of the present invention will be described.

본 발명에서 일컫는 '줄기세포'는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.The term " stem cell " referred to in the present invention refers to a cell having pluripotent or totipotent self-renewal capable of differentiating into cells of all tissues of the individual Cells, and includes embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, and adult stem cells.

상기 용어 '배아 줄기세포'는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다.The term &quot; embryonic stem cell &quot; refers to a cell obtained by extracting an inner cell mass from a blastocyst embryo immediately before fertilization of the embryo into the uterus of a mother, cultivating the same in vitro, (Pluripotent) or omnipotent (totipotent) self-renewal stem cells (self-renewal) refers to stem cells.

상기 용어 '유도 다능성 줄기세포'는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.The term ' inducible pluripotent stem cells ' refers to cells that have been induced so that the differentiated cells have pluripotent differentiation potential through an artificial reprogramming process, which is also referred to as iPSC (induced pluripotent stem cells).

상기 용어 '성체 줄기세포'는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다.The term ' adult stem cells ' is a primitive cell just before differentiation, isolated from the tissues of mammals, including humans, and has the ability to grow indefinitely and various types of cells (eg, adipocytes, cartilage Cells, muscle cells, bone cells, etc.).

본 발명에서 일컫는 '골아전구세포(osteoprecursor cells)'는 조골세포로 분화되기 전의 세포를 나타내며, 골아전구세포는 BMP-2, 4, 6, 9 등과 같은 BMP 패밀리에 의하여 조골세포로 분화된다.The term 'osteoprecursor cells' referred to in the present invention refers to cells before osteoblast differentiation, and osteoprogenitor cells are differentiated into osteoblasts by the BMP family such as BMP-2, 4, 6, and 9.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은 줄기세포 및 성체세포를 공배양하는 단계;를 포함하는 줄기세포의 스페로이드화 방법을 제공한다.One aspect of the present invention provides a method for spleenogenesis of stem cells comprising co-culturing stem cells and adult cells.

상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세포(iPS 세포) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 치은(gingiva) 유래 성체 줄기세포일 수 있다. The stem cells may be any one selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, inducible pluripotent stem cells (iPS cells) in which various differentiated cells are initialized, and combinations thereof. Preferably, the stem cells are adult stem cells . The adult stem cells may be gingiva-derived adult stem cells.

상기 성체세포는 성체세포의 전구세포일 수 있고, 바람직하게는 골아전구세포일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 성체세포가 골아전구세포가 아닌 다른 성체세포 또는 성체세포의 전구세포일 경우에는 본 발명의 방법으로 스페로이드를 형성하여도, 스페로이드 내의 세포들의 생존도가 유지되지 않거나, 줄기세포의 줄기세포능이 유지되지 않는다. The adult cell may be a precursor cell of an adult cell, and preferably, it may be an osteocyte precursor cell, but is not limited thereto. When the adult cells are progenitors of adult cells or adult cells other than osteoprogenitor cells, even if spheroids are formed by the method of the present invention, the survival of the cells in the spheroids is not maintained, The capacity is not maintained.

상기 공배양은 0.5일 내지 30일 동안 실시될 수 있고, 바람직하게는 1일 내지 25일 동안 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1.5일 내지 20일 동안 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 공배양 기간이 하한값 미만으로 실시될 경우에는 스페로이드화가 충분히 일어나지 않아, 조직 치료에 이용시 단일 세포로 다시 분리되어 활용하기 어려운 문제점이 있다. 또한, 상기 공배양 기간이 상한값을 초과하여 실시될 경우에는 세포의 밀도가 높아짐에 따라 영양 성분이 빠르게 고갈되고, 세포의 특성이 변하게 되며, 생존도가 낮아지고, 줄기세포의 줄기세포능(stemness)이 유지되지 않고, 스페로이드 내부의 세포가 사멸하게 되어 스페로이드를 활용하기 어렵다. The co-cultivation may be carried out for 0.5 to 30 days, preferably 1 to 25 days, more preferably 1.5 to 20 days, but is not limited thereto. When the co-incubation period is carried out below the lower limit value, the spolylation does not sufficiently take place, so that it is difficult to separate it into a single cell and utilize it when used for tissue treatment. In addition, when the co-cultivation period is over the upper limit, as the density of the cells increases, the nutrients are rapidly depleted, the characteristics of the cells are changed, the viability is lowered, ) Is not maintained, and the cells inside the sphere are killed, making it difficult to utilize the sphere.

상기 스페로이드의 크기는 50㎛ 내지 600㎛일 수 있으며, 바람직하게는 70㎛ 내지 550㎛일 수 있고, 더욱 바람직하게는 100㎛ 내지 500㎛일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 스페로이드의 크기가 하한값 미만일 경우에는 이식하여 사용하고자 할 때 스페로이드의 크기가 너무 작아 다루기 어렵다. 또한, 상기 스페로이드의 크기가 상한값을 초과할 경우에는 배양 조건 하에서 가스 및 영양분의 확산이 어려워 사멸하는 세포가 많아져, 치료하고자 하는 조직에 이식하였을 때 치료 효과를 충분히 발휘할 수 없게 된다. The size of the spheroid may be 50 탆 to 600 탆, preferably 70 탆 to 550 탆, and more preferably 100 탆 to 500 탆, but is not limited thereto. If the size of the spleoid is less than the lower limit value, the size of the spleoid is too small to handle because it is intended to be used after being transplanted. In addition, when the size of the steroid is higher than the upper limit, diffusion of gas and nutrients is difficult under the culture conditions, resulting in an increase in the number of dead cells, so that the therapeutic effect can not be sufficiently exerted when transplanted into the tissue to be treated.

상기 줄기세포 및 성체세포의 양은 6×104 내지 6×106개일 수 있고, 바람직하게는 7×104개 내지 5.5×106개일 수 있고, 더욱 바람직하게는 8×104개 내지 5×106개일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 줄기세포 및 성체세포의 양이 하한값 미만일 경우에는 두 세포를 혼합하여 스페로이드화하여도 50㎛ 내지 600㎛ 사이의 크기의 스페로이드가 제조되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포 및 성체세포의 양이 상한값을 초과할 경우에는 많은 수의 세포를 사용하기 위해서 장기간의 배양이 필요하고, 스페로이드의 크기가 커짐에 따라서, 배양에 사용되는 웰의 크기에 적용하기 어려운 문제점이 있고, 가스 및 영양분의 확산이 어려워 사멸하는 세포의 수가 증가하게 된다.The amount of the stem cells and adult cells may be 6 × 10 4 to 6 × 10 6 , preferably 7 × 10 4 to 5.5 × 10 6 , more preferably 8 × 10 4 to 5 × 10 can six days, but shall not be limited thereto. When the amount of the stem cells and the adult cells is less than the lower limit value, the spleen of the size between 50 μm and 600 μm is not produced even when the two cells are mixed and spoiled. In addition, when the amount of stem cells and adult cells exceeds the upper limit, long-term culture is required to use a large number of cells, and as the size of the spoil increases, it is applied to the size of the well used for culture There is a problem that it is difficult to diffuse, and diffusion of gas and nutrients is difficult, so that the number of dead cells increases.

상기 줄기세포 및 성체세포의 혼합 비율은 1:5~5:1일 수 있고, 바람직하게는 2:4, 3:3 및 4:2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 비율일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 줄기세포가 하한값 미만의 비율로 포함될 경우 줄기세포의 줄기세포능이 유지되지 않게 된다. 상기 줄기세포가 상한값을 초과하여 포함될 경우에는 스페로이드의 직경이 작아져 조직에 이식시 다루기 힘들고, 스페로이드를 이식함으로써 얻을 수 있는 효과 정도가 낮아진다. 상기 성체세포가 하한값 미만의 비율로 포함될 경우에는 활용하기 어려울 정도로 스페로이드의 직경이 작아진다. 상기 성체세포가 상한값을 초과하여 포함될 경우에는 성체세포의 양이 줄기세포의 양보다 상대적으로 많아지므로, 줄기세포의 줄기세포능이 유지되지 않아 스페로이드를 이식함으로써 얻을 수 있는 효과 정도가 낮아진다. The mixing ratio of the stem cells and adult cells may be 1: 5 to 5: 1, preferably 2: 4, 3: 3 and 4: 2, Not limited. When the stem cells are contained at a ratio lower than the lower limit value, the stem cell ability of the stem cells is not maintained. When the stem cells are contained in excess of the upper limit, the diameters of the spleoid become smaller, which is difficult to handle in transplantation into tissues, and the degree of effect obtained by implanting the spleoid is lowered. When the adult cells are contained at a ratio lower than the lower limit value, the diameters of the spheroids are small enough to be difficult to use. When the adult cells are contained in excess of the upper limit value, the amount of adult cells is relatively larger than that of the stem cells, so that the stem cell ability of the stem cells is not maintained and the effect obtained by implanting the spheroids is lowered.

상기 공배양시 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.The medium for co-culture includes all media conventionally used for culturing stem cells. For example, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F- 10, F-12, MEM (Minimal Essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) and the like.

상기 공배양은 폴리디메틸실록산과 같이 세포 증식을 저해하지 않는 재료로 제조된 웰에서 수행될 수 있고, 상기 웰은 컨케이브 마이크로몰드(concave micromold)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. The co-culture may be performed in a well made of a material that does not inhibit cell proliferation such as polydimethylsiloxane, and the well is preferably a concave micromold, but is not limited thereto.

상기 스페로이드는 3차원 지지체에서 배양될 수 있다. 상기 지지체를 구성하는 성분은 생체적합한 물질을 사용할 수 있고, 지지체에서 배양된 스페로이드는 지지체로부터 별도로 분리하지 않고 치료를 위하여 지지체에 부착된 상태로 생체에 이식될 수 있다. The spheroids can be cultured in a three-dimensional support. The component constituting the support may be a biocompatible material, and the spheroids cultured in the support may be transplanted into the living body while being attached to the support for treatment without being separated from the support separately.

상기 배양은 인 비트로 상태 또는 인 비보 상태에서 수행될 수 있고, 특히 인 비트로 상태에서 수행되는 경우에는 CO2 배양기 내에서 수행될 수 있다.The cultivation can be performed in an in-vitro state or an in-vivo state, and can be performed in a CO 2 incubator, particularly when performed in an in-vitro state.

상기 CO2 배양기 내에서의 배양은 CO2 농도가 5 내지 15%인 환경에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10%, 더욱 바람직하게는 5 내지 8%인 환경에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한 상기 CO2 배양기 내부는 상기 CO2 외에 O2로 채워질 수 있다.The culture in the CO 2 incubator can be carried out in an environment with a CO 2 concentration of 5 to 15%, preferably 5 to 10%, more preferably 5 to 8% It is not limited. The inside of the CO 2 incubator may be filled with O 2 in addition to the CO 2 .

또한, 상기 배양은 25 내지 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 34 내지 37℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 배양 온도가 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포의 줄기세포능이 유지되지 않고, 사멸되는 줄기세포가 많아지는 문제점이 있다. In addition, the cultivation can be carried out in a temperature range of 25 to 45 DEG C, preferably 30 to 40 DEG C, more preferably 34 to 37 DEG C, but is not limited thereto. When the incubation temperature is outside the above temperature range, the stem cell ability of stem cells is not maintained and the number of stem cells to be killed is increased.

본 발명의 다른 측면은 줄기세포 및 성체세포를 포함하는 세포 스페로이드를 제공한다. Another aspect of the present invention provides a cell spleod comprising stem cells and adult cells.

상기 줄기세포는 치은 유래 성체 줄기세포일 수 있고, 상기 성체세포는 골아전구세포일 수 있다. The stem cells may be gingival-derived adult stem cells, and the adult cells may be osteoprogenitor cells.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 치은 유래 줄기세포와 쥐 유래의 골아전구세포를 0:6(그룹 1), 2:4(그룹 2), 3:3(그룹 3), 4:2(그룹 4), 및 6:0(그룹 5)의 비율로 하고 총 세포 수 6×105개로 하여 600㎛ 직경인 폴리디메틸실록산 기반의 컨케이브 마이크로몰드(Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc.)에서 7일 동안 배양한 결과, 골아전구세포의 양이 적어질수록 스페로이드 직경이 작아지며, 치은 유래 줄기세포를 단독으로 하는 것보다 치은 유래 줄기세포를 골아전구세포와 함께 공배양할 경우 스페로이드의 직경이 커져, 스페로이드화 정도가 우수함을 확인하였다(도 3 참조). 또한, 이들 그룹의 생존도를 비교해 보았을 때도 치은 유래 줄기세포를 골아전구세포와 공배양하면(그룹 2, 3, 4) 세포의 생존도가 증가하는 것을 알 수 있었다(도 8 참조). 아울러, 치은 유래 줄기세포의 줄기세포능을 확인한 결과, 골아전구세포만을 배양한 그룹 1의 경우 줄기세포 마커인 SSEA-4와 TRA-1-60를 발현하지 않았고, 골아전구세포와 치은유래줄기세포를 공배양한 경우(그룹 3 내지 4) 및 치은유래 줄기세포(그룹 5)에서 SSEA-4와 TRA-1-60가 발현하는 것을 확인하였다(도 9 참조). In a specific example of the present invention, gingival stem cells and mouse osteoclast precursor cells were cultured at 0: 6 (Group 1), 2: 4 (Group 2), 3: 3 (Group 3) ) And 6: 0 (Group 5), and the total number of cells was 6 × 10 5 cells. The cells were cultured in a polycimethylsiloxane-based concave micromole (Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc.) having a diameter of 600 μm for 7 days As a result of culturing, the smaller the amount of the osteoprogenitor cells, the smaller the diameter of the spheroids. When the gingival stem cells are co-cultured with the osteoprogenitor cells, the diameter of the spheroids becomes larger than that of the gingival stem cells alone , And the degree of spoilization was excellent (see Fig. 3). In addition, when the viability of these groups were compared, it was found that the viability of the cells was increased by co-culturing the gingival stem cells with the osteoprogenitor cells (Groups 2, 3 and 4) (see FIG. 8). In addition, stem cell performance of gingival stem cells was confirmed. As a result, Group 1, which only cultured osteoblast progenitor cells, did not express stem cell markers SSEA-4 and TRA-1-60, and osteoprogenitor cells and gingival stem cells (Group 3 to 4) and gingival stem cells (group 5), SSEA-4 and TRA-1-60 were expressed (see FIG. 9).

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Production Examples, Examples and Experimental Examples.

단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following Production Examples, Examples and Experimental Examples are for illustrating the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following Production Examples, Examples and Experimental Examples.

[실시예 및 실험예] [Examples and Experimental Examples]

치은 유래 줄기세포의 분리 및 배양Isolation and culture of gingival stem cells

가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 의학연구윤리심의위원회에서 승인 받아, 치관 확장술 진행 중인 4명의 건강한 환자로부터 정상적인 치은(gingiva) 조직을 얻었다. Approved by the Ethical Review Committee of the Medical Research Ethics Committee of the Catholic University Medical College Seoul, we obtained normal gingiva tissue from four healthy patients undergoing crown enlargement.

상기 치은 조직은 즉시 100U/㎖ 페니실린(시그마 알드리치, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국)이 포함된 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)에 넣어 4℃에 두었다. 상기 치은 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)하여 1-2mm2으로 분쇄하였고, 1mg/㎖ 농도의 디스파제(시그마 알드리치) 및 2mg/㎖ 농도의 콜라게나제 Ⅳ를 함유하는 α-MEM(Gibco) 배지로 소화시킨 후, 5% CO2 및 95% O2의 습윤 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 24시간 후, 인산완충식염수(Welgene)로 씻어서 제거하였고, α-MEM 배지를 기본으로 하는 배지로 교체하였다. 상기 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)를 포함한다. 그 이후, 2-3일 마다 배지를 갈아줌으로써, 인간 치은 유래의 성체 줄기세포를 확립하였다. The gingival tissues were immediately placed in sterile phosphate buffered saline (PBS, Welgene) containing 100 U / ml penicillin (Sigma Aldrich, USA) and 100 ug / ml streptomycin (Sigma Aldrich, USA) at 4 ° C. The gingival tissues were de-epithelialized and pulverized to 1-2 mm 2 , and were suspended in α-MEM (Gibco) containing collagenase IV at a concentration of 1 mg / ml of dispase (Sigma Aldrich) and 2 mg / ) Medium and then cultured at 37 ° C in a humidified incubator of 5% CO 2 and 95% O 2 . After 24 hours of culture, the cells were washed with phosphate-buffered saline (Welgene), and replaced with a medium based on? -MEM medium. The medium was prepared by mixing 15% fetal bovine serum (Gibco), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 200 mM L-glutamine (Sigma Aldrich, USA) and 10 mM ascorbic acid 2- phosphate (Sigma Aldrich, ). Thereafter, human adult gingival adult stem cells were established by changing the medium every 2-3 days.

상기 세포는 콜로니-형성 능력, 부착능(plastic adherence) 및 다양한 계통으로 분화능(골형성, 지방형성, 연골형성)과 같은 줄기세포 특성을 나타냄이 확인되었고, 또한 상기 세포는 유동 세포 분석법에 의해 CD44, CD73, CD90 및 CD105는 발현하지만, CD14, CD45, CD34 및 CD19는 발현하지 않는 것이 확인되었다.These cells have been shown to exhibit stem cell characteristics such as colony-forming ability, plastic adherence and various lines of differentiation ability (osteogenesis, lipogenesis, cartilage formation), and these cells have been identified by flow cytometry as CD44 , CD73, CD90 and CD105 but not CD14, CD45, CD34 and CD19.

인간 치은 유래 줄기세포와 골아전구세포로 스페로이드 형성 확인Confirm formation of spheroids from human gingival stem cells and osteoprogenitor cells

실시예 1에서 얻은 치은 유래 줄기세포와 쥐 유래의 골아전구세포(MC3T3-E1 세포)를 600㎛ 직경인 폴리디메틸실록산 기반의 컨케이브 마이크로몰드(Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc.)에 각각 6×105개의 양으로 접종하여 배양하였으며, 그 후 세포의 거동을 확인하기 위해 배양하였다.The gingival stem cells obtained from Example 1 and rat oocyte precursor cells (MC3T3-E1 cells) were seeded on a polydimethylsiloxane-based concave micromole (Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc.) having a diameter of 600 μm, 10 5 , and then cultured in order to confirm the behavior of the cells.

줄기세포와 골아전구세포 사이의 비율은 0:6(그룹 1), 2:4(그룹 2), 3:3(그룹 3), 4:2(그룹 4), 및 6:0(그룹 5)였고(도 1 참조), 세포 응집 및 세포-스페로이드 형성을 위상차 현미경(Leica DM IRM, Leica Microsystems) 하에서 관찰하였다.The ratio between stem cells and osteoprogenitor cells was 0: 6 (Group 1), 2: 4 (Group 2), 3: 3 (Group 3), 4: 2 (Group 4) (See Fig. 1), cell aggregation and cell-sphere formation were observed under a phase contrast microscope (Leica DM IRM, Leica Microsystems).

그 결과, 치은 유래 줄기 세포 및/또는 골아전구세포가 스페로이드를 형성함이 확인되었다(도 2 참조). 3, 5 및 7일자에서 스페로이드의 형태는 1일자의 스페로이드와 유사하였다. 스페로이드의 직경은 골아전구세포의 수의 감소에 따라 현저히 감소하였다(도 3 참조). 1일자의 스페로이드 직경의 평균은 그룹 1 내지 5가 각각 371.9 ± 27.4, 358.0 ± 11.8, 305.5 ± 18.1, 291.6 ± 35.3, 및 219.2 ± 67.0㎛였으며, 배양 1일자의 그룹 4의 스페로이드의 직경은 배양 1일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되고(P<0.05)(도 3의 *), 배양 1일자의 그룹 5는 배양 1일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되어(P<0.05)(도 3의 **) 치은 유래 줄기세포를 골아전구세포와 함께 공배양하면, 치은 유래 줄기세포를 단독으로 이용한 경우보다 직경이 크게, 즉 스페로이드가 보다 양호하게 제조되는 것을 알 수 있었다.As a result, it was confirmed that the gingival-derived stem cells and / or the osteoprogenitor cells form spleoid (see Fig. 2). On days 3, 5 and 7, the morphology of spoloids was similar to that of day 1 spleens. The diameter of the spheroids markedly decreased with the decrease in the number of osteoprogenitor cells (see FIG. 3). The average of the diameters of the spheroids on day 1 was 371.9 ± 27.4, 358.0 ± 11.8, 305.5 ± 18.1, 291.6 ± 35.3, and 219.2 ± 67.0 μm in the groups 1 to 5, respectively, A significant difference (P <0.05) (* in FIG. 3) was observed when compared to group 1 of culture 1 day, and a significant difference was observed between group 1 of culture 1 day and group 1 of culture 1 day (P < 0.05) (** in FIG. 3) When the gingival stem cells were co-cultured with the osteogenic precursor cells, it was found that the diameters were larger, that is, the spheroids were better produced than when the gingival-derived stem cells were used alone .

3일자의 스페로이드 직경의 평균은 그룹 1 내지 5가 각각 67.9 ± 11.3, 356.0 ± 15.8, 281.7 ± 22.3, 208.3 ± 47.8, 및 177.5 ± 43.6㎛였다.. 5일자의 스페로이드 직경의 평균은 그룹 1 내지 5가 각각 386.8 ± 16.8, 379.8 ± 20.6, 301.5 ± 23.4, 268.8 ± 18.4, 및 203.3 ± 30.8㎛였다. 배양 3일, 5일자의 그룹 3의 스페로이드의 직경은 각각 배양 3일, 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되며(P<0.05)(도 3의 # 및 §), 배양 3일, 5일자의 그룹 4의 스페로이드는 각각 배양 3일, 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되고(P<0.05)(도 3의 ## 및 §§), 배양 3일, 5일자의 그룹 5의 스페로이드는 각각 배양 3일, 5일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되어(P<0.05)(도 3의 ### 및 §§§), 치은 유래 줄기세포를 골아전구세포와 함께 공배양하면, 치은 유래 줄기세포를 단독으로 이용한 경우보다 직경이 크게, 즉 스페로이드가 보다 양호하게 제조되는 것을 알 수 있었다. 7일자의 스페로이드 직경의 평균은 그룹 1 내지 5가 각각 368.9 ± 15.9, 341.2 ± 62.6, 299.2 ± 35.9, 262.8 ± 28.3, 및 189.4 ± 25.1㎛였고, 배양 7일자의 그룹 4의 스페로이드의 직경은 배양 7일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되고(P<0.05)(도 3의 †), 배양 7일자의 그룹 5는 배양 7일자의 그룹 1과 비교하였을 때 유의차가 확인되어(P<0.05)(도 3의 ††), 치은 유래 줄기세포를 골아전구세포와 함께 공배양하면, 치은 유래 줄기세포를 단독으로 이용한 경우보다 직경이 크게, 즉 스페로이드가 보다 양호하게 제조되는 것을 알 수 있었다. The mean of the spheroid diameters on day 3 were 67.9 ± 11.3, 356.0 ± 15.8, 281.7 ± 22.3, 208.3 ± 47.8, and 177.5 ± 43.6 μm in groups 1-5, respectively. To 5 were 386.8 ± 16.8, 379.8 ± 20.6, 301.5 ± 23.4, 268.8 ± 18.4, and 203.3 ± 30.8 μm, respectively. (P < 0.05) (# and § in FIG. 3) when compared with the group 1 of 3 days and 5 days of culture, respectively, and the diameter of the group 3 of the 3 days and 5 days of culturing was 3 days (P < 0.05) (Fig. 3 &amp; cir &amp; section of Fig. 3) were compared with group 1 of group 3 of day 3 and group 5 of day 5 of culture, (P < 0.05) (Fig. 3, ### and §§§), respectively, and the gingival stem cells were divided into three groups, When the cells were co-cultured with the cells, it was found that the diameters were larger, that is, the spheroids were better produced than when the gingival-derived stem cells were used alone. The average diameter of the spheroids on day 7 was 368.9 ± 15.9, 341.2 ± 62.6, 299.2 ± 35.9, 262.8 ± 28.3, and 189.4 ± 25.1 μm in groups 1 to 5, respectively, and the diameters of group 4 spheroids on day 7 (P <0.05) († in FIG. 3), and the group 5 of 7 days of culture showed a significant difference when compared with group 1 of 7 days of culture (P < 0.05) (Fig. 3), when the gingival-derived stem cells were co-cultured together with the osteogenic precursor cells, it was found that the diameters were larger, that is, the spoloid was better produced than when the gingival-derived stem cells were used alone there was.

위와 같은 결과로부터, 줄기세포와 골아전구세포를 스페로이드 형태로 공배양하여도 스페로이드의 형태가 유지되며, 스페로이드의 직경이 증가하여 스페로이드 형성이 잘 되는 것을 알 수 있고, 스페로이드 형태가 유지되며, 스페로이드화 정도가 우수하므로 본 발명의 스페로이드를 조직 공학 목적으로 이용시에 활용할 수 있다.From the above results, it can be seen that even when the stem cells and the osteoprogenitor cells are co-cultured in the form of spheroids, the spheroid shape is maintained, the diameter of the spheroid is increased, and the spheroids are formed well. And the degree of spolodization is excellent, so that the spoloid of the present invention can be utilized for tissue engineering purposes.

세포 생존도 확인Check cell viability

[3-1] Live/Dead Kit로 정성 분석[3-1] Qualitative Analysis with Live / Dead Kit

세포 스페로이드의 생존도를 1, 3, 5, 및 7일자에 Live/Dead Kit assay(Molecular Probes)로 분석하였다. Live/Dead Kit 분석에서는 살아있는 세포는 강하고, 단일한 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포는 적색 형광을 나타낸다. 세포 스페로이드를 PBS로 2회 씻은 후에 50mM 칼신 아세톡시메틸 에스테르 작용 용액 2㎕와 2mM 에티듐 호모다이머-1 4㎕를 함유하는 1㎖ α-MEM에 부유한 뒤 실온에서 15분 동안 두었다. 칼신 아세톡시메틸 에스테르 및 에티디움 호모다이머-1로 염색된 스페로이드를 형광현미경 하에서 관찰하였다(Axiovert 200; Zeiss).The viability of the cell spleens was analyzed by Live / Dead Kit assay (Molecular Probes) at days 1, 3, 5, and 7. In live / dead kit analysis, living cells are strong and exhibit a single green fluorescence, and dead cells exhibit red fluorescence. Cellspheroids were washed twice with PBS, then suspended in 1 ml α-MEM containing 2 μl of 50 mM calcein acetoxymethyl ester working solution and 2 μM ethidium homodimer-1 4 μl, and then left at room temperature for 15 minutes. Kresin acetoxymethyl ester and ethidium homodimer-1 stained spleoid were observed under a fluorescence microscope (Axiovert 200; Zeiss).

Live/Dead Kit로 분석된 세포 스페로이드의 생존도의 정성 결과를 도 4 내지 7에 나타낸다. 세포 스페로이드 내의 대부분의 세포가 녹색 형광을 방출하였고, 형태는 실험 기간 동안 양호하게 유지되었다. 7일자에 스페로이드 내의 대부분의 세포가 녹색을 나타내었다(도 7 참조).The qualitative results of the viability of the cell spoloids analyzed by Live / Dead Kit are shown in Figs. Most cells in the cell spleoid released green fluorescence, and morphology remained good during the experiment. At day 7, most of the cells in the sphere showed green (see FIG. 7).

[3-2] Cell Counting Kit로 정량 분석[3-2] Quantitative analysis using Cell Counting Kit

정량적 세포 생존도 분석은 Cell Counting Kit-8(Dojindo)를 이용하여 1, 3, 5, 및 7일자에 수행하였다. cell counting kit는 세포 생존도를 확인하기 위한 분석 방법으로, 수용성 테트라졸륨염이 배양 배지 내에 있는 세포의 디히드로게나제에 의해 환원되어 포르마잔이 되는 원리를 이용한 것이며, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하므로, 상기 포르마잔의 생성량을 비색 분석(colorimetric assays)으로 확인함으로써 세포의 생존도를 확인할 수 있다. 스페로이드를 96웰 플레이트에 넣은 후, CCK-8 용액 10㎕를 각 웰에 더하였다. 5% CO2 및 95% O2의 습윤 배양기에서 37℃로 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더(BioTek, 미국)를 이용하여 분광 광학적 흡광도를 측정함으로써, 줄기세포의 생존도 정도를 확인하였다. 상기 분석은 3회 반복하여 수행하였다. 데이터는 실험의 평균±표준편차로 나타내며, 상업적으로 이용가능한 프로그램인 SPSS 12 for Windows(SPSS Inc)를 이용하였다. 그룹간의 차이를 결정하기 위하여 Student's t-test 또는 사후검증(post hoc test)이 있는 ANOVA(two-way analysis of variance)를 수행하였다. 유의성의 수준은 0.05였다. 배양 1, 3, 5 및 7일 후 세포 생존도 결과를 도 8에 나타낸다. Quantitative cell viability assays were performed on days 1, 3, 5, and 7 using Cell Counting Kit-8 (Dojindo). Cell counting kit is an assay method for confirming cell viability. It is based on the principle that water-soluble tetrazolium salt is reduced by dehydrogenase in cells in culture medium to become formazan, and the amount of formazan produced is living Since the amount of formazan produced is proportional to the number of cells, the degree of cell viability can be confirmed by confirming the amount of formazan by colorimetric assays. Spheroids were placed in 96-well plates and 10 CC of CCK-8 solution was added to each well. Gt; 37 C &lt; / RTI &gt; for 2 hours in a humidified incubator of 5% CO 2 and 95% O 2 . The viability of the stem cells was confirmed by measuring the spectrophotometric absorbance of the cultured 96-well plate using a microplate reader (BioTek, USA). The analysis was repeated three times. Data are presented as the mean ± standard deviation of the experiments, and a commercially available program, SPSS 12 for Windows (SPSS Inc), was used. Two-way analysis of variance (ANOVA) with Student's t-test or post hoc test was performed to determine differences between groups. The level of significance was 0.05. The cell viability results after 1, 3, 5 and 7 days of culture are shown in Fig.

배양 1일자에서 그룹 1 내지 5의 상대적인 Cell Counting Kit-8 분석 값은 각각 100.0 ± 7.2, 131.3 ± 9.2, 129.3 ± 4.2, 115.5 ± 5.7, 및 116.4 ± 3.5였다. 배양 3일자에서 그룹 1 내지 5의 상대적인 Cell Counting Kit-8 분석 값은 각각 175.4 ± 7.1, 199.1 ± 4.2, 187.4 ± 8.6, 192.8 ± 10.6, 및 202.8 ± 14.6였다. 배양 5일자에서 그룹 1 내지 5의 상대적인 Cell Counting Kit-8 분석 값은 각각 178.5 ± 11.2, 164.7 ± 7.8, 166.6 ± 3.3, 164.5 ± 4.6, 및 162.5 ± 4.0였다. 배양 7일자에서 그룹 1 내지 5의 상대적인 Cell Counting Kit-8 분석 값은 각각 156.8 ± 3.6, 147.0 ± 6.6, 151.5 ± 3.0, 158.7 ± 4.2, 및 141.2 ± 5.8였다.The relative cell counting Kit-8 assay values for Groups 1 to 5 at day 1 were 100.0 ± 7.2, 131.3 ± 9.2, 129.3 ± 4.2, 115.5 ± 5.7, and 116.4 ± 3.5, respectively. The relative Cell Counting Kit-8 assay values for Groups 1 to 5 at 3 days of culture were 175.4 ± 7.1, 199.1 ± 4.2, 187.4 ± 8.6, 192.8 ± 10.6, and 202.8 ± 14.6, respectively. The relative cell counting Kit-8 assay values for Groups 1-5 were 178.5 ± 11.2, 164.7 ± 7.8, 166.6 ± 3.3, 164.5 ± 4.6, and 162.5 ± 4.0 at 5 days of culture. Relative Cell Counting Kit-8 assay values for Groups 1 to 5 at 7 days in culture were 156.8 ± 3.6, 147.0 ± 6.6, 151.5 ± 3.0, 158.7 ± 4.2, and 141.2 ± 5.8, respectively.

위와 같은 결과로부터 단일 세포 또는 두 종류의 세포를 스페로이드 형태로 배양하면, 생존도가 유지되며, 3차원 환경에서 증식이 개선될 수 있는 것을 알 수 있고, 세포들의 생존도가 유지되므로 조직 공학 목적으로 이용시에 본 발명의 스페로이드를 활용할 수 있다. From the above results, it can be seen that when single cells or two kinds of cells are cultured in the spoold form, the viability is maintained, the proliferation can be improved in the three-dimensional environment, and the viability of the cells is maintained. The spleoid of the present invention can be utilized.

줄기세포능의Stem cell function 유지 평가 Maintenance evaluation

SSEA-4와 TRA-1-60은 인간 줄기세포의 양성 마커로서 사용된다. 치은 유래 줄기세포와 골아전구세포를 스페로이드 배양시에 치은 유래 줄기세포의 줄기세포능이 유지되는지 확인하기 위해 위의 두 마커를 사용하여 평가하였다. SSEA-4 and TRA-1-60 are used as positive markers for human stem cells. The gingival stem cells and osteoprogenitor cells were evaluated using the above two markers in order to determine whether the stem cell viability of the gingival stem cells was maintained during the spoloid culture.

배양 7일자에 스페로이드를 회수하고, 회수한 스페로이드를 1X 농도로 희석된 NHL493(녹색)이 접합된 인간 SSEA-4(Clone MC-813-70) 및 NL557(적색)(R&D Systems)이 접합된 인간 TRA-1-60(R)(Clone TRA-1-60)와 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후에 스페로이드를 형광현미경(Axiovert 200, Zeiss) 하에서 시각화하였다. Spheroids were recovered on the 7th day of culturing, and recovered spheroids were treated with human SSEA-4 (Clone MC-813-70) and NL557 (red) (R & D Systems) conjugated with NHL493 And then reacted with human TRA-1-60 (R) (Clone TRA-1-60) for 1 hour. After the reaction was completed, the spoloids were visualized under a fluorescence microscope (Axiovert 200, Zeiss).

배양 7일자 그룹 3 내지 그룹 5의 세포 스페로이드가 NL493-접합된 SSEA-4(녹색) 및 NL557-접합된 TRA-1-60(R)(적색) 항체로 염색되었으나(도 9 참조), 그룹 1의 스페로이드는 줄기세포 마커인 SSEA-4 및 TRA-1-60이 염색되지 않았다. Cells of group 7 to day 7 of culture were stained with NL493-conjugated SSEA-4 (green) and NL557-conjugated TRA-1-60 (R) (see FIG. 9) 1 did not stain the stem cell markers SSEA-4 and TRA-1-60.

위와 같은 결과로부터 치은 유래 줄기세포와 골아전구세포를 스페로이드 형태로 공배양하면, 세포 스페로이드는 분화되지 않은 인간 줄기세포를 포함하며, 공배양을 통해 줄기세포능이 유지되는 것을 알 수 있다. 줄기세포능이 유지되므로 다른 조직으로 분화시켜 이용하고자 할 때 본 발명의 스페로이드를 활용할 수 있다. 아울러, 그룹 3 및 그룹 4의 경우 그룹 6에 비해서 줄기세포의 양이 적음에도 불구하고, 그룹 6과 유사하게 또는 더 강하게 줄기세포 마커를 발현하므로 줄기세포와 성체세포를 스페로이드화하여 배양하여도 줄기세포능이 유지되는 효과가 현저한 것을 알 수 있다.From these results, it can be seen that when the germinal stem cells and the osteoprogenitor cells are co-cultured in the form of spoloid, the cell sphere contains the non-differentiated human stem cells and the stem cell ability is maintained through the co-culture. Since the stem cell ability is maintained, the spleroid of the present invention can be utilized when it is used to differentiate into another tissue. In addition, although Group 3 and Group 4 have a smaller amount of stem cells than Group 6, they express stem cell markers similarly or more strongly than Group 6. Therefore, even when stem cells and adult cells are spoiled and cultured The effect of maintaining the stem cell ability is remarkable.

실시예Example 2의  2 of 스페로이드의Spearoid 골분화능Bone vertebrae 평가 evaluation

[5-1] 알칼리 [5-1] Alkali 포스파타제Phosphatase 활성 분석 Activity analysis

실시예 2에서 제조한 스페로이드들을 각각 골분화 유도 배지(STEMPRO® Osteogenesis Differentiation Kit; Gibco)에서 배양하였고, 1일과 5일에 수득하였다. 각 스페로이드의 알카리 포스파타제 활성은 BioVision사의 K412-500를 이용하여 확인하였다. 상기 세포를 분석 완충액에 부유하고, 초음파처리하였으며 그 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상청액을 p-니트로페닐포스페이트 기질과 혼합한 후에 25℃에서 60분 동안 배양하였다. 결과물인 p-니트로페놀의 흡광도를 405nm에서 분광 광도로(spectrophotometrically) 확인하였다.Spheroids prepared in Example 2 were each cultured in a STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco) and were obtained on days 1 and 5. The alkaline phosphatase activity of each of the spheroids was confirmed using BioVision K412-500. The cells were suspended in assay buffer, sonicated, and then centrifuged to remove insoluble material. The supernatant was mixed with the p-nitrophenyl phosphate substrate and then incubated at 25 DEG C for 60 minutes. The absorbance of the resulting p-nitrophenol was determined spectrophotometrically at 405 nm.

그 결과, 그룹 1, 2, 3 및 4에서 1일과 5일 사이에 통계적으로 유의한 차이가 확인되었다(P < 0.05)(도 10). 그룹 1, 2, 3, 4 및 5에 대한 405nm에서 흡광도 값은 각각 0.609 ± 0.031, 0.603 ± 0.004, 0.630 ± 0.024, 0.568 ± 0.022 및 0.519 ± 0.026였다. 그룹 1의 5일자 값과 그룹 5의 5일자 값 사이에서 유의한 차이가 있었다(P < 0.05). As a result, statistically significant differences were observed between days 1 and 5 in groups 1, 2, 3 and 4 (P <0.05) (FIG. 10). Absorbance values at 405 nm for Groups 1, 2, 3, 4 and 5 were 0.609 ± 0.031, 0.603 ± 0.004, 0.630 ± 0.024, 0.568 ± 0.022 and 0.519 ± 0.026, respectively. There was a significant difference between the 5th day value of group 1 and the 5th day value of group 5 (P <0.05).

상기와 같은 결과로부터, 줄기세포와 골아전구세포를 공배양할 경우 실시예 4와 같이 줄기세포능이 유지되는 효과도 있고, 골 분화 조건으로 처리시, 공배양한 스페로이드가 공배양하지 않고 줄기세포만으로 이루어진 스페로이드보다도 골 분화 효율이 현저히 우수한 것을 알 수 있었다. From the above results, when the stem cells and the osteoprogenitor cells were co-cultured, the stem cell ability was maintained as in Example 4. In the case of the bone differentiation condition, the co-cultured spoloids did not co- It was found that the bone morphogenesis efficiency was significantly superior to that of the spleen alone.

[5-2] 알리자린 [5-2] Alizarin 레드Red S 염색을 통한 칼슘 침착 정도 평가 Evaluation of Calcium Deposition by S-staining

실시예 2에서 제조한 스페로이드들을 각각 골분화 유도 배지(STEMPRO® Osteogenesis Differentiation Kit; Gibco)에서 배양하였고, 배양 7일자에 회수하였다. 배양 7일자에 세포 스페로이드를 PBS(Welgene)로 2회 세정하였고, 70% 에탄올 수용액으로 고정하였으며, 탈이온수로 세정하였다. 세포 스페로이드를 알리자린 레드 S로 30분 동안 실온에서 염색하였다. 세포 스페로이드를 도립 현미경(Leica DM IRM)으로 관찰하고, 이미지를 촬영하였다. Spheroids prepared in Example 2 were cultured in STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco), respectively, and were collected at 7 days of culture. Cells were washed twice with PBS (Welgene), fixed with 70% ethanol solution, and rinsed with deionized water at 7 days of culture. The cell spoloids were stained with alizarin red S for 30 minutes at room temperature. Cell spleens were observed with an inverted microscope (Leica DM IRM) and images were taken.

그 결과, 칼슘 침착이 실시예 5-1과 유사한 경향으로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이 결과로부터 공배양된 그룹 2 내지 그룹 4의 스페로이드가 골분화 조건에서 골분화로 유도되는 것을 알 수 있다. As a result, calcium deposition was observed with a similar tendency as in Example 5-1 (data not shown). From these results, it can be seen that the spheroids of Group 2 to Group 4 co-cultured were induced to bone differentiation under bone differentiation conditions.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the scope of the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be possible to change it appropriately.

Claims (9)

줄기세포 및 성체세포를 공배양하는 단계;를 포함하는 줄기세포의 스페로이드화 방법으로서,
상기 줄기세포는 치은(gingiva) 유래의 줄기세포이고, 상기 성체세포는 골아전구세포(osteoprecursor cells)인 줄기세포의 스페로이드화 방법.Culturing a stem cell and an adult cell, and co-culturing the stem cell and the adult cell,
Wherein said stem cells are stem cells derived from gingiva, and said adult cells are osteoprecursor cells. 삭제delete 삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 공배양은 0.5일 내지 30일 동안 실시되는 줄기세포의 스페로이드화 방법.The method according to claim 1,
Wherein the co-culture is performed for 0.5 to 30 days. 청구항 1에 있어서,
상기 줄기세포 및 성체세포의 양은 6×104 내지 6×106인 줄기세포의 스페로이드화 방법.The method according to claim 1,
Wherein the amount of the stem cells and the adult cells is 6 × 10 4 to 6 × 10 6 . 청구항 1에 있어서,
상기 줄기세포 및 성체세포의 혼합 비율은 1:5~5:1인 줄기세포의 스페로이드화 방법.The method according to claim 1,
Wherein the mixing ratio of the stem cell and the adult cell is 1: 5 to 5: 1. 줄기세포 및 성체세포를 포함하는 세포 스페로이드로서,
상기 줄기세포는 치은 유래의 줄기세포이고, 상기 성체세포는 골아전구세포인 세포 스페로이드.As a cell sphere containing stem cells and adult cells,
The stem cell is a germ-derived stem cell, and the adult cell is an osteoblast progenitor cell. 삭제delete 삭제delete
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CN102533640A (en) * 2010-11-11 2012-07-04 徐善慧 Method for generating adult stem cells into spheroid cell populations

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