KR101794750B1 - 인간 중간엽줄기세포의 분화 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 울금 추출물을 유효성분으로 함유하여 인간 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화하는 것을 촉진시킴으로써 지방체 (Lipid droplet)를 생성하여 피부의 볼륨과 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 중간엽줄기세포의 분화 촉진용 조성물{Composition for promoting the differentiation of human mesenchymal stem cell}

본 발명은 인간 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 울금 추출물을 유효성분으로 함유하여 인간 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화하는 것을 촉진시킴으로써 지방체(Lipid droplet)를 생성하여 피부의 볼륨과 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 조성물에 관한 것이다.

진피 아래에 존재하는 피하지방 층은 지방세포(adipocyte)의 소엽으로 구성되어 있는데, 외부의 열에 대해 피부 내부의 기관의 보호 및 충격을 흡수하는 쿠션 역할을 하며 영양성분을 트리글리세라이드(Triglyceride)의 형태로 지방체 (Lipid droplet)라는 세포 소기관에 저장하여 필요 시 에너지원으로 사용하기도 한다. 그러나 나이가 들어감에 따라 자연적인 요인과 각종 외부 자극에 의해 피부는 손상을 입게 되는데, 특히 진피에서 탄력을 담당하는 교원섬유(콜라겐), 탄력섬유(엘라스틴)의 활성 및 발현이 저하되며 탄력이 줄어듦과 동시에, 피하지방에서도 지방생성이 감소함으로써 결국에는 피부 전반적으로 각 구성 세포들의 본래 기능이 제대로 이루어지지 않게 되어 탄력 손실에 따른 주름 생성 등의 피부 노화 현상이 발생하게 된다.

현대 사회에서 특히 여성들에게 피부는 그들의 건강에 대한 주요한 지표가 되고 있으며, 따라서 나이가 들어감에 따라 탄력을 잃는 피부는 여성들에게 민감한 문제로 대두되고 있다. 특히 얼굴 부위의 피부는 다른 피부 부위에 비해서 두께가 얇은 편으로 체중이나 나이 등의 요인으로 인해 처지고 탄력을 잃기 쉽다. 또한 폐경기 여성들에게서 주로 발생하는 호르몬, 혈액, 지방, 뼈 등의 대사 이상으로 인한 얼굴의 탄력 저하 및 지방의 감소는 여성들로 하여금 여성성에 대한 큰 상실감을 느끼게 한다. 이처럼 현대 사회 여성들에게 아주 민감한 문제들에 대해서 지방조직의 볼륨을 증가시키는 것이 하나의 해결책으로 대두되고 있으며, 많은 여성들이 부작용과 경제적인 부담이 따르는 성형수술을 통해서 피부의 탱탱함을 유지 혹은 증가시키고자 한다.

이러한 피부의 탄력 저하를 개선하고자 현재 널리 사용되고 있는 방법이 지방이식수술이다. 지방이식수술은 튜립 니들(tulip needle) 모양의 끝이 날카롭지 않은 바늘을 갖는 주사기를 이용하여 자신의 지방을 채취해 탄력이 떨어져 보이는 피부의 각 부위에 이식하는 수술이다. 이러한 지방 이식은 나이가 들어감에 따라 노화되는 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형과 화상이나 상처로 인해 함몰된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에 적용하여 채워주면서 좋은 성과를 보이고 있다. 하지만 지방이식수술 이후에 이식 부피의 40~60%가 다시 인체 내에 흡수된다는 것이 보고되었고(S Eremia et al., Dermatol . Sur. 2000, 26: 1150-1158; Fulton JE et al., Dermatol . Clin . 2001, 19(3): 523-530), 피부가 얇고 피하지방이 적은 부위에서의 지방이식수술은 세포 덩어리가 만져지는 등의 문제가 제기되며, 실제로 이식한 지방의 생존율과 생존기간이 기대에 미치지 못해 재이식이 필요한 경우가 발생한다. 따라서, 이러한 문제점들이 있는 지방이식수술을 대체하면서 피하지방층을 충분히 증가시킬 수 있는 조성물에 대한 요구가 높아지고 있다.

현재 판매되고 있는 피부 탄력 증진 효능을 가진 화장품의 대부분은 피부의 주름 제거 또는 진피 강화 등의 일반적인 효능을 가진 성분을 사용한 것이다. 피부 탄력의 저하는 노화나 자외선 등에 의해 유발되는 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 생성 저하 또는 파괴에 기인한다. 이러한 탄력 감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있다. 그 중 대표적으로 사용되고 있는 것이 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드이다. 레티노이드는 탁월한 탄력개선 효과를 나타내지만(Dermatology therapy 1998, 16, 357-364), 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가진다. 따라서 최근 들어 이러한 원료들의 피부 자극 문제를 해소하기 위해 보다 안전하고 피부에 자극이 없는 천연 식물성 원료를 이용한 화장품 개발에 대한 요구가 높아지고 있다.

한편, 피부의 기본적인 구조가 피하지방조직에 의해서 유지되고, 이러한 피하지방조직은 피부의 볼륨과 강도를 좌우하는 역할을 하므로, 상기 설명한 바와 같이 기존에 사용되고 있던 피부 외곽층의 진피나 표피에 탄력을 부여하는 방법보다 지방조직의 부피를 증가시키는 것이 피부의 볼륨감 유지 및 주름 개선에 좋은 해결책이 될 수 있으며, 이와 관련되어 최근 논문들이 발표되었다 (Kim WS et al., J. Dermatol. Sci. 2009, 53(2): 96-102 ; Trottier V et al ., Stem Cells. 2008 26(10):2713-23 ; Park BS et al., Dermatol . Surg . 　2008, 34(10):1323-1326).

지방세포를 이용한 연구는 다양한 분야에서 활발하게 진행되고 있다. 일반적으로 사용되는 지방전구세포(preadipocyte)는 인슐린과 같은 분화 유도 물질에 의해 지방세포로 분화되는 특성을 가지고 있기 때문에, 널리 사용되는 세포이다. 이러한 지방세포를 이용한 연구에 있어서 최근 주목을 받고 있는 것이 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방 유래 줄기세포 (adipocyte derived stem cell)이다. 이들 줄기세포는 일반적으로 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 데 사용되는 방법과 유사한 방법을 이용하여 분화시킬 수 있기 때문에(Xu Y et al., Exp. Cell Res. 2006, 312, 1856-1864), 지방세포 분화 연구에 널리 이용되고 있다 (Pittenger MF et al., Science 1999, 284, 143-146).

이에 본 발명자들은 지방조직을 이루는 지방세포의 분화를 촉진시키는 생약 추출물을 찾고자 노력한 결과, 울금 추출물을 중간엽줄기세포에 처리할 경우 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 과정을 효과적으로 촉진함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진시키는 생약 추출물을 함유하여 피부 볼륨감 및 탄력을 증가시키고 주름을 개선시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 울금 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 촉진용 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 조성물은 울금 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것을 촉진시킴으로써 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가에 유용하며, 따라서 피부 볼륨 및 탄력을 증가시키고 피부 주름을 개선시키는 도움이 된다.

도 1은 IDXT 조건 하에서 울금 추출물을 처리 후, 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 후에 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 사진이다.
도 2는 울금 추출물을 처리한 후 중간엽줄기세포의 IDXT 대비 상대적 지방분화 수치를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 울금 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 용어 “지방세포 분화”는 동물, 바람직하게는 포유동물의 지방전구세포 또는 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것이고, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포가, 가장 바람직하게는 인간의 골수로부터 유래한 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것이다.

본 발명에서 사용하는 생약 추출물은 하기와 같다.

울금(Curcumae longae Rhizoma)은 가을울금이라고도 하는(Curcuma longa Linne)의 덩이뿌리를 말한다. 강황과 유사한 외형을 하고 있으나 잎의 양면이 모두 매끈한 특징을 갖는다.　중국 남부와 인도, 오키나와를 비롯한 동남아시아지역에서 자생, 재배되며 우리나라의 중남부지역에서도 재배된다. 술과 함께 섞으면 누렇게 금처럼 되어 붙여진 이름이며 모양이 아술(莪述)과 비슷하고 말의 질병을 치료하므로 마술(馬述)이라 하기도 하였다. 이 약은 특이한 냄새가 있고 씹으면 침을 누렇게 물들이며 자극성이 있다. 맛은 맵고 쓰며 성질은 서늘하다. 울금은 기를 소통시키고 혈액순환을 도와 생리통, 생리불순, 옆구리통증을 치료하고 토혈, 코피, 피오줌을 치료하고, 정신을 맑게 하며 흉복부가 그득한 것을 없애주고 담즙분비 촉진과 담낭결석을 치료한다. 약리작용은 담즙분비, 배설 촉진, 관상동맥안의 반괴형성을 감소시킨다고 보고되었다.(출처, 네이버 백과사전)

본 발명에서 사용하는 울금 추출물은 물 또는 에탄올과 같은 유기용매를 사용하여 당업계에 잘 알려진 통상적인 추출 방법에 의해 추출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)의 분화를 촉진함으로써, 피하지방층을 구성하거나 지방세포를 제공하여 피부에 대하여 볼륨과 탄력을 부여하고 주름을 개선시키는 효능을 제공하며, 피부 외용제 조성물 또는 약학 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명에 의한 조성물이 피부 외용제 조성물로 사용될 경우에 신체 부위에 따라, 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양 크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 울금 추출물을 유효성분으로 피부 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~ 30중량%의 양으로 함유한다.

또한 각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 울금 추출물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신) 및 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 생약 추출물의 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 일반적으로 생약 추출물의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다.

본 발명에 의한 중간엽줄기세포의 분화를 촉진시키는 미용 또는 성형용 조성물의 적용 부위는 신체의 모든 지방 조직을 포함하며, 특정 부위에 한정하지는 않지만, 예를 들면, 지방층이 많은 여성의 가슴, 엉덩이 부위를 포함할 수 있다. 또한 상기 지방조직의 증가 효과로는 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가 효과가 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 생약 추출물의 제조

용뇌, 우슬, 울금을 각각 30g을 에탄올(95.0~95.5v/v%), 200ml에 넣은 다음 ASE300 ACCELERATED SOLVENT EXTRACOR(DIONEX Corporation) 기기를 이용하여 50℃에서 1500psi 압력하에 20분간 분쇄하였다. 또한 초음파 세척기(BRANSON Ultrasonics corporation) 소니케이터 기기를 이용하여 50℃에서 3일 정도 추가 분쇄하였다. 이렇게 분쇄된 각 추출물을 모듈 스핀 40(Modul spin 40; Biotron corporation) 기기를 이용하여 40℃에서 24시간 동안 건조하여 각 추출물 시료를 제조하였다.

[시험예 1] 인간의 골수 유래 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화 촉진 효능 및 정량적 측정

인간의 골수 유래 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 지방세포 분화는 인도메타신(indomethacin) 대신 트로글리타존(Troglitazone)을 사용하여 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 점을 제외하고 론자사에서 권장하는 방법을 사용하여 달성하였다. 구체적으로, 중간엽줄기세포의 배양액에 인슐린 1 μg/ml, 덱사메타손 (Dexamethasone, DEXA) 1 μM, 이소부틸메틸크산틴(isobutyl methyl xanthine, IBMX) 0.5 mM 을 넣고 배양하여 줄기세포를 지방세포로 분화시켰으며, 지방세포 분화 유도 시에 IDXT 조건하에서 울금 추출물을 각각 10 ppm씩 배지에 첨가하였다. 또한, 비교를 위하여 용뇌, 우슬 추출물을 10 ppm씩 배지에 첨가하였다. 양성 대조군으로는 트로글리타존(Troglitazone; TRO) 2?M을 사용하여, IDX 배지와 같이 처치하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 시작한 지 14일 후, 세포 배양액을 제거하고, 10 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 10% 포르말린/PBS 용액 0.2 ml/cm²을 사용하여 세포를 10분간 고정시켰다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올 용액 0.5 ml/cm²로 1회 세척하고, 오일레드오(Oil Red O)를 60% 이소프로판올에 녹인 염색액 0.2 ml/cm²로 10분간 지방세포 내의 지질체를 염색하였다. 이어서, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 재염색을 행하여 세포핵을 쉽게 구분되도록 한 후 현미경으로 관찰하였고, 울금 추출물을 처리한 경우의 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 보면, 용뇌, 우슬 추출물을 처리한 경우는 IDXT 조건 하에서 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 정도와 차이가 크지 않았으나, 반면 IDXT 조건하에서 울금 추출물을 첨가한 다음 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 경우에는 IDXT 조건 하에서 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 경우보다 지방세포의 분화가 더 효과적으로 일어남을 확인할 수 있다.

이후 염색된 오일레드오를 100% 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이 때, 각 데이터 값은 인슐린 대조군으로 보정하였다. 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다. 또한 울금 추출물을 각각 처리한 경우 중간엽줄기세포의 IDXT 대비 지방분화 촉진 증가율은 하기 표 1에 나타내었다.

생약명	학명	IDXT 대비(증가율)
용뇌	Borneolum	8% 증가
우슬	Achuranthis Radix	9.7% 증가
울금	Curcumae longae Rhizoma	51% 증가

표 1 및 도 2의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 울금 추출물은 각각 중간엽줄기세포의 세포 사멸을 유도하지 않으면서 지방세포의 분화를 촉진하며, 용뇌, 우슬 추출물을 각각 처리한 경우와 비교하여 훨씬 효과적으로 지방세포의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 피부 볼륨감 증진 효과 측정

본 발명의 울금 추출물의 사용시 인체 피부의 볼륨감 증진 및 주름 개선 효과를 알아보기 위하여 20명의 임상시험 참가자를 대상으로 설문조사를 실시하였다.

구체적으로 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 울금 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 2.0중량%의 양으로 함유한 영양크림을 매일 1회씩 8주간 목 부위의 피부에 도포를 하도록 하였으며, 그 후에 볼륨감 증진 및 주름 개선 효과에 대하여 설문조사를 하였다. 효과가 좋은 경우는 ○, 보통인 경우는 △, 효과가 없는 경우는 X로 표시하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

배합성분	함량(중량%)
정제수	To 100
울금 추출물	2.0
식물성 경화유	1.5
스테아린산	0.6
글리세롤 스테아레이트	1.0
세테아닐 알콜	2.0
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 & 소디움 스테아로일 락틸에이트	1.0
아라키딜 베헤닐알콜	1.0
세틸아릴알콜&세테아릴글루코사이드	2.0
PEG-100 스테아레이트&글리세롤올레이트&프로필렌글리콜	1.5
카프릴릭/카르릭 트리글리세라이드	11.0
사이클로메디콘	6.0
방부제, 향	적량
트리에탄올 아민	0.1

생약명	볼륨감 증진 효과(명)
	○	△	X
용뇌	2	2	16
우슬	3	2	15
울금	14	4	2

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 용뇌, 우슬을 각각 사용한 경우에는 피부 볼륨감 및 주름 개선 효과가 좋지 않지만, 반면 본 발명의 울금 추출물을 함유한 조성물을 사용할 경우에는 대부분의 시험 참가자들에 대하여 피부 볼륨감 증진 및 주름 개선 효과가 좋은 것을 확인할 수 있다.

상기 실험결과로부터 울금 추출물을 함유한 조성물을 각각 얼굴 피부에 도포, 피부에 침습 또는 복용하면 상기 추출물의 유효성분이 지방조직의 부피를 증가시키게 되고, 따라서 피부의 볼륨감 및 탄력을 증가시키며 피부 주름을 개선시키는 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

[제제예 1] 정제

본 발명에 따른 울금 중에서 1종의 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제제예 2] 캡슐제

본 발명에 따른 울금 중에서 1종의 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 울금 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 사용하여 시험관내(in vitro) 조건에서 중간엽줄기세포를 지방 세포로 분화시키는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포가 인간의 중간엽줄기세포임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 인간의 중간엽줄기세포가 인간 골수의 중간엽줄기세포임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 울금 추출물은 물, 에탄올, 또는 물과 에탄올 혼합용매를 추출용매로 추출하여 수득한 추출물임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 물과 에탄올 혼합용매에서 에탄올의 농도는 95% 이상임을 특징으로 하는 방법.

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