KR101792191B1 - Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life - Google Patents

Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life Download PDF

Info

Publication number
KR101792191B1
KR101792191B1 KR1020170047822A KR20170047822A KR101792191B1 KR 101792191 B1 KR101792191 B1 KR 101792191B1 KR 1020170047822 A KR1020170047822 A KR 1020170047822A KR 20170047822 A KR20170047822 A KR 20170047822A KR 101792191 B1 KR101792191 B1 KR 101792191B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
val
pro
lys
ser
Prior art date
Application number
KR1020170047822A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
정상택
고상환
이태규
최소영
이수한
손명호
김수진
박소라
박종식
임명신
Original Assignee
재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
국민대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단, 국민대학교 산학협력단 filed Critical 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
Priority to KR1020170047822A priority Critical patent/KR101792191B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101792191B1 publication Critical patent/KR101792191B1/en
Priority to AU2018249796A priority patent/AU2018249796B2/en
Priority to CA3120566A priority patent/CA3120566C/en
Priority to CA3059199A priority patent/CA3059199C/en
Priority to PCT/KR2018/004104 priority patent/WO2018186717A1/en
Priority to JP2020504084A priority patent/JP7264381B2/en
Priority to EP23211824.0A priority patent/EP4342541A3/en
Priority to US16/603,273 priority patent/US11492415B2/en
Priority to EP18781667.3A priority patent/EP3608339A4/en
Priority to CN201880023946.6A priority patent/CN110691796B/en
Priority to JP2021016775A priority patent/JP7264383B2/en
Priority to US17/881,819 priority patent/US20230061390A1/en
Priority to JP2022125460A priority patent/JP2022159401A/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체(예를 들어, EFc82)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 변이체는 광범위한 항체 및 Fc 융합체 산물에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 치료용, 진단용, 또는 연구용 시약(reagent), 바람직하게는 치료용 시약이다. 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 표적 항원, 예를 들어, 암 세포를 함유하는 표적 세포를 죽이는 데에 사용된다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는, 예를 들어 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대하여 길항 작용하기 위하여, 표적 항원을 블로킹하거나, 길항 작용하거나, 또는 방해하는 데 사용된다.The present invention relates to a polypeptide comprising an Fc variant (for example, EFc82) in which a part of the amino acid sequence of the human antibody Fc domain is replaced with another amino acid sequence, or an antibody comprising the same. The Fc variants of the invention may have utility in a wide variety of antibodies and Fc fusion products. In one aspect, the antibody or Fc fusion of the invention is a therapeutic, diagnostic, or research reagent, preferably a therapeutic reagent. The Fc variants of the present invention can maximize half-life in the body through optimization of some amino acid sequences and can be useful for the treatment of cancer. The antibodies and Fc fusions of the invention are used to kill target cells containing target antigens, e.g., cancer cells. Alternatively, the antibodies and Fc fusions of the invention are used to block, antagonize, or interfere with the target antigen, for example, to antagonize cytokine or cytokine receptors.

Description

연장된 혈중 반감기를 위한 항체 Fc 변이체들{Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life}Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 혈중 반감기가 연장된 신규한 항체 Fc 변이체들 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to novel antibody Fc variants with extended blood half-life and methods for their preparation.

전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포(B Cell)와 골수암 세포(Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.Studies on the structure and function of proteins have been actively conducted according to the development of biotechnology such as genetic recombination and cell culture all over the world. This not only enhances understanding of life phenomena, The role plays a role in the improvement of quality of life by providing effective disease diagnosis and treatment. Particularly, in 1975, a hybridoma technology was developed (Kohler and Milstein, Nature , 256: 495-497, 1988) which produces monoclonal antibodies by fusing B cells and Myeoloma cells, 1975), there has been active research and development on immunotherapy using therapeutic antibodies in clinical fields such as cancer, autoimmune diseases, inflammation, cardiovascular diseases, and infections.

치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴 (Herceptin), 아바스틴 (Avastin), 리툭산 (Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.Therapeutic antibodies are considered to be one of the most effective cancer treatment methods because they exhibit very high specificity to the target, low bio-toxicity and low side effects, as well as excellent blood half-lives of about 3 weeks, compared with conventional low-molecular drugs. In fact, major pharmaceutical companies and laboratories around the world are spurring research and development on therapeutic antibodies that specifically bind to cancer cells, including cancer-causing factors and effectively eliminate them. Roche is a leading company in the development of therapeutic antibody medicines including Roche, Amgen, Johnson & Johnson, Abbott and BMS. Especially Roche has developed Herceptin, Avastin, Rituxan ) Is a representative product. With these three therapeutic antibodies, it generates a huge profit of around US $ 19.5 billion in the global market in 2012, and is leading the global antibody drug market. Johnson & Johnson, who developed Remicade, is also growing rapidly in the global antibody market due to increased sales, and pharmaceutical companies such as Abbott and BMS are also known to have a number of therapeutic antibodies at the developmental stage. As a result, biopharmaceuticals, including therapeutic antibodies specific to disease targets and low side effects, are rapidly replacing the global pharmaceutical market, where low-molecular drugs have taken the initiative.

항체의 Fc 부위는 면역 백혈구 또는 혈청 보체 분자를 소집하여, 암세포 또는 감염된 세포와 같은 손상된 세포들이 제거될 수 있도록 역할을 한다. Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생(neonatal) 수용체 FcRn과의 상호 작용을 매개하며, 그의 결합은 엔도솜(endosome)으로부터 혈류(bloodstream)로 세포내 이입된 항체를 재순환시킨다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). 이 과정은, 전체 길이 분자의 거대한 크기에 기인하여, 신장 여과(kidney filtration)의 저지와 연관되어, 1주 내지 3주 범위의 유리한 항체 혈청 반감기(antibody serum half-life)를 갖는다. 또한, FcRn에 대한 Fc의 결합은 항체 운반에 있어서도 중요한 역할을 담당한다. 따라서, Fc 부위는 세포 내 수송(intracellular trafficking) 및 리사이클 기작을 통하여 항체가 순환되어 연장된 혈청 지속성(prolonged serum persistence)을 유지하는데 필수적인 역할을 한다.The Fc region of the antibody serves to mobilize the immune leukocyte or serum complement molecule to remove damaged cells such as cancer cells or infected cells. The site on the Fc between the C? 2 and C? 3 domains mediates the interaction with the neonatal receptor FcRn and its binding recirculates the intracellularly transferred antibody from the endosome into the bloodstream (Raghavan et al , 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). This process has advantageous antibody serum half-life in the range of one week to three weeks, associated with inhibition of kidney filtration, due to the enormous size of the full length molecule. The binding of Fc to FcRn also plays an important role in antibody delivery. Thus, the Fc region plays an essential role in maintaining circulating prolonged serum persistence by circulating antibodies through intracellular trafficking and recycling mechanisms.

치료제로서 항체 또는 Fc 융합 단백질의 투여는 반감기의 특성을 고려하여, 정해진 빈도의 주사를 필요로 한다. 생체 내에서 더욱 긴 반감기는 더욱 낮은 빈도의 주사 또는 더욱 적은 투여량을 가능하게 하는 명백한 장점이 있다. 이에 따라, 현재 진행되고 있는 많은 임상연구에서 항체의 반감기를 증가시키기 위해 Fc 부위에 돌연변이를 도입하거나 ADCC 효과를 극대화시키기 위해 변이를 도입한 Fc 도메인을 통해 차세대 항암 항체 치료제나 항암 단백질 치료제 개발에 많은 노력을 쏟고 있다 (Modified from Cancer Immunol Res. 2015 / Thomson Reuters).Administration of the antibody or Fc fusion protein as a therapeutic agent requires injection of a predetermined frequency in consideration of the half-life characteristic. A longer half-life in vivo has the obvious advantage of allowing lower frequency injections or lower dosages. Therefore, in many ongoing clinical trials, in order to increase the half-life of antibody, introduction of mutations into the Fc region or introduction of mutations into the Fc domain to maximize the effect of ADCC is required to develop next-generation anticancer antibody therapy or anti-cancer protein therapeutic agent ( Modified from Cancer Immunol Res . 2015 / Thomson Reuters).

하지만, 상기 연구진에서 Fc 도메인에 일부 돌연변이를 도입하여 증가된 FcRn 결합 친화성 및 생체 내 반감기를 갖는 일부 단백질 및 항체를 발굴하기 위해 노력하고 있지만, 아직까지 생체 내 반감기를 크게 향상시키지 못하고 있는 것이 현실이며, 보다 최적화된 돌연변이를 도입한 항체의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.However, the inventors of the present invention have attempted to identify some proteins and antibodies having an increased FcRn binding affinity and in vivo half life by introducing some mutations into the Fc domain, but they have not yet significantly improved the half-life in vivo , And development of antibodies with more optimized mutations is urgently required.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.It should be understood that the foregoing description of the background art is merely for the purpose of promoting an understanding of the background of the present invention and is not to be construed as adhering to the prior art already known to those skilled in the art.

본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써, 단백질 또는 항체 치료제의 활성에는 거의 영향을 주지 않으면서 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made an effort to efficiently increase the half-life of a conventional protein or antibody therapeutic. As a result, the present invention has been accomplished by confirming a method capable of maximizing the half-life without substantially affecting the activity of the protein or antibody therapeutic by optimizing substitution of some amino acid sequences of the wild-type Fc domain with other amino acid sequences.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a polypeptide comprising an Fc variant in which a part of the amino acid sequence of the human antibody Fc domain is replaced with another amino acid sequence.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide an antibody comprising the polypeptide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a nucleic acid molecule encoding the polypeptide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a vector comprising the nucleic acid molecule.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a host cell comprising the vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a composition comprising the polypeptide, antibody, nucleic acid molecule or vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing the polypeptide or antibody.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a screening method of the polypeptide.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a polypeptide comprising an Fc variant in which a part of the amino acid sequence of the human antibody Fc domain is replaced with another amino acid sequence.

본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 방법으로 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환 및 최적화하여 Fc 변이체를 제조함으로써, 이를 포함하는 단백질 또는 항체 치료제의 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 찾고자 하였다.The inventors of the present invention have found that, in order to efficiently increase half-life of a conventional protein or antibody therapeutic, some amino acid sequences of the wild-type Fc domain are replaced with other amino acid sequences and optimized to produce Fc variants, To maximize the half - life.

항체는 특정 항원에 특이적으로 결합을 나타내는 단백질로, 천연 항체는 통상 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로다이머 당단백질이다. An antibody is a protein that specifically binds to a specific antigen, and the natural antibody is a heterodimeric glycoprotein of about 150,000 daltons, usually composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H).

본 발명에서 사용되는 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있으며, 바람직하게는 IgG이다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편과 1개의 Fc 단편을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다(Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).Human antibodies used in the present invention have five main classes of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG. Papain degradation of the antibody forms two Fab fragments and one Fc fragment, and in the human IgG molecule, the Fc region is generated by papain digestion of the N-terminus of Cys 226 (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981) .

항체 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG 항체의 Fc 도메인, 혹은 이들의 변형일 수 있다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 도메인은 IgG 항체의 Fc 도메인(예를 들면 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인)이다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인(예를 들면 항HER2 항체의 Fc 도메인, 바람직하게는 트라스트주맙의 Fc 도메인, 보다 바람직하게는 서열목록 제28서열의 Fc 도메인)일 수 있다. 본 발명의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 일부 또는 전체가 당화되어 있지 않거나 당화되어 있을 수 있다. 또한, 폴리펩타이드에 Fc 도메인에 더해 항체에서 유래하는 하나 이상의 영역이 포함될 수도 있다. 추가적으로, 상기 폴리펩타이드에는 항체 유래의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)이 포함될 수도 있으며, 복수의 폴리펩타이드가 항체 또는 항체형 단백질을 형성할 수도 있다.The antibody Fc domain may be the Fc domain of an IgA, IgM, IgE, IgD, or IgG antibody, or a variant thereof. In one embodiment, the domain is the Fc domain of an IgG antibody (e.g., the Fc domain of an IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, or IgG4 antibody). In one embodiment, the Fc domain may be an IgGl Fc domain (e. G., The Fc domain of an anti-HER2 antibody, preferably the Fc domain of trastuzumab, more preferably the Fc domain of sequence listing 28). The polypeptide comprising the Fc domain of the present invention may be partially or wholly glycosylated or glycosylated. In addition, one or more regions derived from an antibody in addition to the Fc domain may be included in the polypeptide. In addition, the polypeptide may comprise an antigen-binding domain from an antibody, and the plurality of polypeptides may form an antibody or antibody-type protein.

본 명세서에서 항체 Fc 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른다(Kabat et al., in of Proteins of Immunological Interest5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호). The amino acid residue number of the antibody Fc domain herein refers to the Kabat numbering system conventionally used in the art (Kabat et al., In Proteins of Immunological Interest 5th Ed., US Department of Health and Human Services , NIH Publication No. 91-3242, 1991).

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 하기의 아미노산 치환을 포함한다: a) M428L; 및 b) Q311R 또는 L309G.According to a preferred embodiment of the invention, the substituted Fc variants of the present invention comprise the following amino acid substitutions according to the carbo numbering system: a) M428L; And b) Q311R or L309G.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 P228L의 아미노산 치환을 포함한다.According to a preferred embodiment of the invention, the substituted Fc variants of the present invention comprise an amino acid substitution of P228L according to a cambating system.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 P228L 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 428, 434 및 445번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the Fc variants comprising the P228L amino acid substitutions of the present invention are selected from the group consisting of 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422 , 428, 434, and 445 amino acids.

상기 추가적인 아미노산 치환은 L309R, M428L 및 N434S일 수 있다.The additional amino acid substitutions may be L309R, M428L and N434S.

상기 추가적인 아미노산 치환은 V264M, L368Q, E388D, V422D, M428L 및 P445S일 수 있다.Such additional amino acid substitutions may be V264M, L368Q, E388D, V422D, M428L and P445S.

상기 추가적인 아미노산 치환은 R292L, T359A, S364G 및 M428L일 수 있다.The additional amino acid substitutions may be R292L, T359A, S364G and M428L.

상기 추가적인 아미노산 치환은 L234F, E269D, Q342L, E388D, T394A 및 M428L일 수 있다.The additional amino acid substitutions may be L234F, E269D, Q342L, E388D, T394A and M428L.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 P230 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.According to a preferred embodiment of the invention, the substituted Fc variants of the present invention comprise amino acid substitutions at the P230 position according to the carbo numbering system.

상기 P230 위치에서의 아미노산 치환은 제한되지 않으나, 바람직하게는 P230Q 또는 P230S이다.Amino acid substitution at the P230 position is not limited, but preferably P230Q or P230S.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 P230 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384, 405 및 428번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.According to a preferred embodiment of the invention, the Fc variants comprising an amino acid substitution at said P230 position of the invention are selected from the group consisting of amino acids 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384, 405 and 428 according to the carbo numbering system Lt; RTI ID = 0.0 > amino acid < / RTI >

상기 추가적인 아미노산 치환은 F243Y, K264E, N361S, N384I 및 M428L일 수 있다.The additional amino acid substitutions may be F243Y, K264E, N361S, N384I and M428L.

상기 추가적인 아미노산 치환은 Q295L, K320M, D356E, F405I 및 M428L일 수 있다.The additional amino acid substitutions may be Q295L, K320M, D356E, F405I and M428L.

본 발명은 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 및 해리를 조정하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체에 관한 것이다. 특히, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도(binding affinity)를 나타내고, 높은 pH에서 실질적으로 변화된 결합을 나타내지 않은 Fc 변이체, 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다.The invention relates to Fc variants comprising amino acid substitutions that modulate binding and dissociation to FcRn (neonatal Fc receptor). Particularly Fc variants that exhibit increased binding affinity for FcRn at low pH and do not exhibit substantially altered binding at high pH, or functional variants thereof.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 5.6 내지 6.2(바람직하게는 pH 5.8 내지 6.0)에서 FcRn에 대한 결합 친화도(binding affinity)가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상 증가될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the Fc variant has a binding affinity for FcRn at a pH of 5.6 to 6.2 (preferably at a pH of 5.8 to 6.0) of 10% or more, 20% , At least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 100% More than 5 times, more than 6 times, more than 7 times, more than 8 times, more than 9 times, more than 10 times, more than 20 times, more than 30 times, more than 40 times, more than 50 times, more than 60 times, more than 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times or more.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 7.0 내지 7.8(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6)에서 FcRn(neonatal Fc receptor)으로부터 해리(dissociation)되는 정도가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 동일하거나 실질적으로 변화되지 않을 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the degree of dissociation of Fc variants from FcRn (neonatal Fc receptor) at pH 7.0 to 7.8 (preferably pH 7.2 to 7.6) is the same or substantially . ≪ / RTI >

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형 Fc 또는 기 개발된 타 Fc 변이체와 비교하여 약산성 조건(예를 들어, pH 5.8 내지 6.0)에서는 매우 향상된 결합 친화도를 나타내었으며, 중성 조건(예를 들어, pH 7.0)에서는 동일하거나 실질적으로 동등 또는 그 이상의 수준의 해리 정도를 나타내었다(실시예 4 및 8).According to one embodiment of the present invention, the substituted Fc variants of the present invention exhibit greatly improved binding affinity in the weakly acidic conditions (e.g., pH 5.8 to 6.0) as compared to wild-type Fc or other Fc variants developed , And neutral conditions (e.g., pH 7.0) exhibited the same or substantially the same or higher levels of dissociation (Examples 4 and 8).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 반감기 (Half-life)가 증가된 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the substituted Fc variants of the present invention have an increased half-life as compared to the wild type.

본 발명의 치환된 Fc 변이체의 반감기는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상 또는 10배 이상 증가될 수 있다.The half-life of a substituted Fc variant of the present invention is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% Or more than 100%, or more than 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, or 10 times more than the wild type Fc domain have.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 월등히 향상된 체 내 반감기를 나타내었다(실시예 11, 표 3).According to one embodiment of the present invention, the substituted Fc variants of the present invention exhibited significantly improved somatosensory half-life as compared to the wild-type (Example 11, Table 3).

본 명세서에서, “Fc 감마 수용체”또는 “FcγR” 은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질 계통의 임의의 구성원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 이의 예로서, FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc을 포함하는 FcγRI(CD64); FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 그리고 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하는 FcγRIII(CD16), 그리고 임의의 발견되지 않은 FcγR 또는 FcγR이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. FcγR은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 기타 다른 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다.As used herein, "Fc gamma receptor" or "FcγR" refers to any member of the protein family that binds to the IgG antibody Fc region and is encoded by the FcγR gene. Examples thereof include Fc [gamma] RI (CD64) comprising Fc [gamma] RIa, Fc [gamma] RIb and Fc [gamma] RIc; Fc? RII (CD32) comprising Fc? RIIIa, Fc? RIIb and Fc? RIIc; And Fc? RIII (CD16), including Fc? RIIIa and Fc? RIIIb, and any undiscovered Fc? R or Fc? R. Fc [gamma] R may be derived from humans, mice, rats, rabbits and monkeys, but may be derived from any other organism.

본 명세서에서, “FcRn” 또는 “neonatal Fc receptor”는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 FcRn은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다. 기능적 FcRn 단백질은 경쇄 및 중쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다.As used herein, "FcRn" or "neonatal Fc receptor" refers to a protein that binds to the IgG antibody Fc region and is at least partially encoded by the FcRn gene. The FcRn includes humans, mice, rats, rabbits and monkeys, but may also be derived from any organism. Functional FcRn proteins include two polypeptides, referred to as light and heavy chains. The light chain is beta-2-microglobulin and the heavy chain is encoded by the FcRn gene.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an antibody comprising the polypeptide.

본 명세서에서 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편을 의미한다.As used herein, the term antibody refers to a polyclonal antibody, monoclonal antibody, minibody, domain antibody, bispecific antibody, antibody mimetic, chimeric antibody, antibody conjugate, Means a fragment.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 항체 Fc 영역의 최적화 (M428L 및 Q311R; 또는 M428L 및 L309G)를 통해 Fc 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드의 반감기를 극대화할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention can maximize the half-life of the Fc domain or polypeptides comprising it via optimization of the antibody Fc region (M428L and Q311R; or M428L and L309G).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule encoding the polypeptide, a vector comprising the nucleic acid molecule, or a host cell comprising the vector.

본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다. The nucleic acid molecules of the present invention may be isolated or recombinant, and include DNA and RNA in single and double stranded form as well as corresponding complementary sequences. The isolated nucleic acid is a nucleic acid isolated from a peripheral genetic sequence present in the genome of the isolated nucleic acid, in the case of a nucleic acid isolated from a naturally occurring source. In the case of a nucleic acid that is enzymatically or chemically synthesized from a template, such as a PCR product, a cDNA molecule, or an oligonucleotide, the nucleic acid generated from such a procedure can be understood as an isolated nucleic acid molecule. The isolated nucleic acid molecule represents a nucleic acid molecule as a separate fragment or as a component of a larger nucleic acid construct. A nucleic acid is operably linked when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA of a full-length or secretory leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when expressed as a preprotein in the form before secretion of the polypeptide, and the promoter or enhancer comprises a polypeptide sequence Or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when it is placed to facilitate translation. Generally, operably linked means that the DNA sequences to be linked are located adjacent to each other, and in the case of the secretory leader, it means that the DNA sequences are adjacent to each other in the same reading frame. However, the enhancer need not be located contiguously. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction sites. If such sites are not present, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional methods.

본 명세서에서 용어 벡터는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).As used herein, the term vector refers to a carrier capable of inserting a nucleic acid sequence for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence. The nucleic acid sequence may be exogenous or heterologous. Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (e.g., bacteriophage). Those skilled in the art can establish a vector by standard recombinant techniques (Maniatis, et al, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; and Ausubel et al, In:.. Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994).

본 명세서에서 용어 발현 벡터는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.As used herein, the term expression vector refers to a vector comprising a nucleic acid sequence encoding at least a portion of the gene product to be transcribed. In some cases, the RNA molecules are then translated into proteins, polypeptides, or peptides. The expression vector may contain various regulatory sequences. Vectors and expression vectors may also include nucleic acid sequences that provide another function, as well as regulatory sequences that regulate transcription and translation.

본 명세서에서 용어 숙주세포는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다. As used herein, the term host cell refers to any transformable organism that includes eukaryotes and prokaryotes and is capable of replicating the vector or expressing a gene encoded by the vector. The host cell may be transfected or transformed by the vector, which means that the exogenous nucleic acid molecule is transferred or introduced into the host cell.

본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The host cell of the present invention is preferably a bacterial cell, a CHO cell, a HeLa cell, a HEK293 cell, a BHK-21 cell, a COS7 cell, a COP5 cell, an A549 cell, a NIH3T3 cell, no.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising a human antibody Fc variant comprising the steps of:

a) 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및a) culturing a host cell comprising a vector comprising a nucleic acid molecule encoding said polypeptide; And

b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계. b) recovering the polypeptide expressed by said host cell.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of producing an antibody comprising the steps of:

a) 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및a) culturing a host cell expressing an antibody comprising the polypeptide; And

b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계. b) purifying the antibody expressed from said host cell.

본 발명의 제조방법에 있어서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.In the preparation method of the present invention, the purification of the antibody may include filtration, HPLC, anion exchange or cation exchange, high performance liquid chromatography (HPLC), affinity chromatography, or a combination thereof, preferably Protein Affinity chromatography using A can be used.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a polypeptide comprising an Fc variant comprising the steps of:

a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및a) constructing an Fc variant library comprising a M428L mutation according to a cambator numbering system; And

b) 상기 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.2에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.b) selecting Fc variants with a higher affinity for FcRn than wild type at pH 5.6 to 6.2 among the Fc variants comprising the M428L mutation.

본 발명의 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.Fc variants comprising the M428L mutant of the invention may comprise additional amino acid substitutions.

상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 넘버링 시스템에 따른 Q311R 또는 L309G 돌연변이를 포함한다.Such additional amino acid substitutions are not particularly limited, and preferably include Q311R or L309G mutations according to the carbach numbering system.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a polypeptide comprising an Fc variant comprising the steps of:

a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 P228L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및a) constructing an Fc variant library comprising a P228L mutation according to a cambator numbering system; And

b) 상기 P228L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.2에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.b) selecting Fc variants with a higher affinity for FcRn than wild type at pH 5.6 to 6.2 among the Fc variants comprising the P228L mutation.

본 발명의 P228L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.Fc variants comprising the P228L mutant of the invention may comprise additional amino acid substitutions.

상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 넘버링 시스템에 따른 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 428, 434 및 445번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산에서 돌연변이를 포함한다.Such additional amino acid substitutions are not particularly limited and preferably include amino acids 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 428, 434 and 445 according to the carbo numbering system And mutations in one or more amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NOs.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a polypeptide comprising an Fc variant comprising the steps of:

a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 P230 위치에 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및a) constructing an Fc variant library comprising a mutation at position P230 according to a cambating system; And

b) 상기 P230 위치에 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.2에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.b) selecting an Fc variant having an affinity for FcRn higher than the wild type at pH 5.6 to 6.2 among the Fc variants comprising a mutation at said P230 position.

본 발명의 P230 위치에 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.Fc variants comprising a mutation at the P230 position of the present invention may comprise additional amino acid substitutions.

상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 넘버링 시스템에 따른 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384, 405 및 428번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산에서 돌연변이를 포함한다.Such additional amino acid substitutions are not particularly limited and preferably include mutations in one or more amino acids selected from the group consisting of amino acids 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384, 405 and 428 according to the carbo numbering system do.

본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리 (FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Sta r Plus, FACScan 및 FACSort 기기 (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.The screening method of the present invention can use fluorescence labeled cell separation (FACS) screening or other automated flow cell analysis techniques. Devices for conducting flow cytometry analyzers are well known to those skilled in the art. Examples of such devices include FACSAria, FACS Sta r Plus, FACScan and FACSort instruments (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C (Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo. -XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, Ind.). Flow cytometry techniques generally involve the separation of cells or other particles in a liquid sample. Typically, the purpose of a flow cytometer is to analyze the discrete particles for one or more of their properties (e.g., the presence of a labeled ligand or other molecule). Particles are passed one by one by the sensor and are classified based on size, refraction, light scattering, opacity, roughness, shape, fluorescence and the like.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 상기 항체, 상기 핵산분자 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a polypeptide comprising an Fc variant comprising the amino acid substitution, the antibody, the nucleic acid molecule or a composition comprising the vector.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 대조군(예를 들어, 트라스트주맙) 대비 동등 또는 그 이상의 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 활성을 나타내어, 상기 현저한 반감기 증가와 더불어 높은 항암활성을 갖는다(실시예 13, 도 18).According to one embodiment of the present invention, the Fc variants of the present invention exhibit the same or higher antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity as compared to the control (e.g., trastuzumab) and have a high antitumor activity (Example 13, Fig. 18).

본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 항체, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises (a) a polypeptide comprising the polypeptide, an antibody, a nucleic acid molecule encoding the polypeptide, or a vector comprising the nucleic acid molecule; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method of preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition.

본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.The types of cancer to be prevented or treated according to the present invention are not limited and include leukemias and acute lymphocytic leukemia, acute nonlymphocytic leukemias, chronic lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Lymphomas such as chronic myelogenous leukemia, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphomas and multiple myeloma, brain tumors, neuroblastoma, Childhood solid tumors such as retinoblastoma, Wilms Tumor, bone tumors and soft-tissue sarcomas, lung cancer, breast cancer, cancer cancers, prostate cancer, urinary cancers, uterine cancers, oral cancers, pancreatic cancer, melanoma and other skin cancers. cancer, stomach cancer, ovarian cancer, brain tumors, liver cancer, laryngeal cancer, thyroid cancer, esophageal cancer and testicular cancer. ), ≪ / RTI > and the like.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and can be administered, for example, by intravenous injection, local injection, and intraperitoneal injection.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient, Usually, a skilled physician can readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg / kg.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used alone, but may be used in combination with other conventional chemotherapy or radiotherapy, and cancer therapy can be more effectively performed when such concurrent therapy is carried out. Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention include, but are not limited to, cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, But are not limited to, ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, , Bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-fluorouracil, vincristin, vinblastin and methotrexate, and the like. Radiation therapies that can be used with the compositions of the present invention include X-ray irradiation and gamma-ray irradiation.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체를 제공한다.(I) The present invention provides a polypeptide comprising an Fc variant in which a part of the amino acid sequence of the human antibody Fc domain is replaced with another amino acid sequence, or an antibody comprising the same.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공한다.(Ii) In addition, the present invention provides a method for producing said polypeptide or antibody.

(ⅲ) 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.(Iii) The Fc variant of the present invention can maximize half-life in the body through optimization of some amino acid sequences and can be useful for the treatment of cancer.

도 1은 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 위한 발현용 vector 및 정제 후 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸다.
도 2는 M252 및 M428에 18가지의 아미노산이 들어 갈 수 있도록 제작하기 위한 라이브러리 모식도를 나타낸다.
도 3은 2M 라이브러리 탐색 과정 및 선별된 M428L 변이체를 나타낸다.
도 4는 M428L을 기본으로 하여 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리의 모식도를 나타낸다.
도 5는 Error 라이브러리(도 5a) 및 point 라이브러리(도 5b)에서 발굴한 변이체들의 FACS 형광세기 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 동물세포 내에서 발현하기 위한 플라스미드를 나타낸다.
도 7은 야생형 트라스트주맙의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 8은 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다(A: CE-cIEF, B: SEC).
도 9는 N-Glycan profiling에 의한 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다.
도 10은 10종의 트라스트주맙 Fc 변이체 발현 및 정제 결과를 나타낸다(A: Affinity Chromatography, B: SDS-PAGE Analysis, C: List of Final Yield).
도 11은 트라스트주맙 Fc 변이체의 SEC 특성분석 결과를 나타낸다.
도 12는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 BiaCore에 의한 pH 6.0과 7.4에서의 트라스트주맙 Fc변이체와 hFcRn과의 결합력 측정결과를 나타낸다(A: pH 6.0(capture method) B: pH 7.4(Avid Format)에서의 결합력 측정).
도 14는 일반 마우스(C57BL/6J (B6))와 인간 FcRn Tg 마우스에서의 상업용 및 연구실 제작 트라스트주맙의 약동학 비교 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 FcRn Tg 마우스에서 Fc 변이체의 약동학 분석결과를 나타낸다(정맥주사로 각 변이체 5 mg/kg 주사, n=5).
도 16은 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정결과를 나타낸다.
도 17은 Normal IgG 와 대조군(트라스트주맙) 대비 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function 비교결과를 나타낸다(ADCC assay).
도 18은 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function(ADCC) 비교 결과를 나타낸다.
도 19는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정결과를 나타낸다.
Figure 1 shows a vector for expression and SDS-PAGE gel after purification for expression and purification of terameric FcRn and dimeric FcRn.
FIG. 2 shows a schematic diagram of a library for producing 18 amino acids into M252 and M428.
Figure 3 shows the 2M library search process and screened M428L variants.
FIG. 4 shows a schematic diagram of an error library and a point library prepared based on M428L.
FIG. 5 shows FACS fluorescence intensity measurement results of the mutants excavated from the Error library (FIG. 5A) and the point library (FIG. 5B).
Figure 6 shows plasmids for expressing trastuzumab heavy and light chains in animal cells.
Figure 7 shows the expression and purification results of wild type trastuzumab.
8 is a cross- (A: CE-cIEF, B: SEC). The results are shown in Fig.
FIG. 9 shows a comparison of physical properties of commercial trastuzumab by N-Glycan profiling and trastuzumab prepared by the laboratory.
FIG. 10 shows the expression and purification results of 10 strains of trastuzumab Fc variants (A: Affinity Chromatography, B: SDS-PAGE Analysis, C: List of Final Yield).
Fig. 11 shows the results of analysis of SEC characteristics of Trastuzumab Fc variants.
Figure 12 shows the results of FcRn binding assay of Trastuzumab Fc variants using ELISA.
Fig. 13 shows the results of measurement of the binding force between the trastuzumab Fc variant and hFcRn at pH 6.0 and 7.4 by BiaCore (A: measurement of binding force at pH 6.0 (capture method) B: pH 7.4 (Avid Format)).
Figure 14 shows pharmacokinetic comparison results of commercial and laboratory made trastuzumab in normal mice (C57BL / 6J (B6)) and human FcRn Tg mice.
Figure 15 shows the pharmacokinetic analysis of Fc variants in human FcRn Tg mice (5 mg / kg of each variant by intravenous injection, n = 5).
16 shows the result of measurement of Fc? Rs binding capacity of Trastuzumab Fc variants using ELISA.
FIG. 17 shows the results of an effector function comparison of Trastuzumab Fc variants versus normal IgG and control (trastuzumab) (ADCC assay).
Fig. 18 shows the results of an Effector Function (ADCC) comparison of Trastuzumab Fc variants.
Fig. 19 shows the results of measurement of Clq binding capacity of Trastuzumab Fc variants using ELISA.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1. Fc 변이체 라이브러리 탐색을 하기 위한 FcRn(neonatal Fc receptor) 발현 및 정제Example 1. FcRn (neonatal Fc receptor) expression and purification for Fc variant library search

FcRn에 pH-의존적 결합력이 향상된 Fc 변이체를 탐색하기 위하여 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 수행하기 위하여 발현용 벡터를 준비하였다(도 1). Tetrameric FcRn을 얻기 위해서 pMAZ-β2microglobulin-GSlinker-FcRnα-chain-streptavidin-His의 DNA 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Ni-NTA resin(Qiagen)을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한 레진을 흘려 주고 50 ml wash-1 buffer(PBS), 25 ml wash-2 buffer(PBS + 10 mM imidazole), 25 ml wash-3 buffer(PBS + 20 mM imidazole), 200 μl wash-4 buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn을 얻었다. 그리고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units(Merck Millipore)을 사용하였다. Dimeric FcRn을 얻기 위해서 Oslo 대학교에서 받은 pcDNA-FcRnα-chain-GST-β2 microglobulin 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Glutathione agarose 4B(incospharm) 레진을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한레진을 흘려 주고 10 ml wash buffer(PBS)를 흘려주어 dFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(50 mM Tris-HCl + 10 mM GSH pH 8.0)를 흘려주고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units 3K(Merck Millipore)을 사용하였다. 정제 후 SDS-PAGE 겔을 이용하여 크기를 확인 하였다(도 1). 정제된 terameric FcRn과 dimeric FcRn에 형광 신호를 낼 수 있도록 Alexa 488를 이용하여 형광 표지를 하였다.Expression vectors were prepared for expression and purification of terameric FcRn and dimeric FcRn in order to search for Fc variants with enhanced pH-dependent binding ability in FcRn (FIG. 1). In order to obtain Tetrameric FcRn, a DNA plasmid of pMAZ-β2microglobulin-GSlinker-FcRnα-chain-streptavidin-His was obtained. This DNA was co-transfected into HEK 293F cells and transiently expressed at a size of 300 ml. The cultured medium was removed by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was taken and equilibrated using 25x PBS. and filtered with a 0.2 μm filter (Merck Millipore) using a bottle top filter. After equilibrating with PBS, Ni-NTA resin (Qiagen) was added and FcRn and resin were bound at 4 ° C for 16 hours. The resin bound to FcRn was flowed through the column and washed with 50 ml wash-1 buffer (PBS), 25 ml wash-2 buffer (PBS + 10 mM imidazole), 25 ml wash-3 buffer (PBS + 20 mM imidazole) -4 buffer (PBS + 250 mM imidazole) to remove proteins other than tFcRn. Then, 2.5 ml of elution buffer (PBS + 250 mM imidazole) was poured to obtain tFcRn. And centrifugal filter units (Merck Millipore) were used to change the buffer. To obtain Dimeric FcRn, we obtained the pcDNA-FcRnα-chain-GST-β2 microglobulin plasmid from Oslo University. This DNA was co-transfected into HEK 293F cells and transiently expressed at a size of 300 ml. The cultured medium was removed by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was taken and equilibrated using 25x PBS. and filtered with a 0.2 μm filter (Merck Millipore) using a bottle top filter. After equilibrating with PBS, Glutathione agarose 4B (incospharm) resin was added to bind FcRn and resin at 4 ° C for 16 hours. The resin bound to FcRn was flown through the column, and 10 ml of wash buffer (PBS) was added thereto to remove proteins other than dFcRn. Then, 2.5 ml of elution buffer (50 mM Tris-HCl + 10 mM GSH pH 8.0) was added and centrifugal filter units 3K (Merck Millipore) was used to change the buffer. After purification, the size was confirmed using SDS-PAGE gel (Fig. 1). Fluorescent labeling was performed using Alexa 488 to generate fluorescent signals on purified terameric FcRn and dimeric FcRn.

실시예 2. Fc 변이체 2M 라이브러리(library) 제작Example 2. Fabrication of 2M library of Fc variants

트라스트주맙(Trastzumab)에 있는 Fc 부분의 유전자(서열목록 제29서열)를 SfiI 제한효소를 이용하여 pMopac12-NlpA-Fc-FLAG를 제작하였다. 제작된 벡터를 기반으로 Fc 내에 두 개의 Met부분을 cys과 Met을 제외한 나머지 18가지의 다른 아미노산으로 치환될 수 있도록 pMopac12-seq-Fw, Fc-M252-1-Rv, Fc-M252-2-Rv, Fc-M252-3-Rv, Fc-M428-Fw, Fc-M428-1-Rv, Fc-M428-2-Rv, Fc-M428-3-Rv, Fc-M428-frg3-Fw, pMopac12-seq-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리 insert를 제작하였다(표 1, 도 2). 제작된 insert를 SfiI 제한효소 처리하여 같은 SfiI으로 처리된 벡터와 라이게이션하였다. 그 후 대장균 Jude1((F'[Tn10(Tetr )proAB+ lacI qΔ(lacZ)M15] mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)에 형질전환하여 거대 Fc 변이체 2M 라이브러리(라이브러리 크기: 1x109)를 구축하였다.Trast the gene (SEQ ID No. 29 sequence) of the Fc part in jumap (Trastzumab) using the Sfi I restriction enzyme was prepared pMopac12-NlpA-Fc-FLAG. Fc-M252-1-Rv, Fc-M252-2-Rv, Fc-M252-2-Rv and Fc-M252-2-Rv so that two Met portions in Fc can be substituted with the other 18 amino acids except cys and Met Fc-M428-3-Rv, Fc-M428-Fw, Fc-M428-1-Rv, Fc-M428-2-Rv, Fc-M428-3-Rv, -Rv primer was used to prepare a library insert (Table 1, Fig. 2). The prepared insert was ligated with the same Sfi I-treated vector by Sfi I restriction enzyme treatment. Then Escherichia coli Jude1 ((F '[Tn 10 (Tet r) proAB + lacI q Δ (lacZ) M15] mcrA Δ (mrr - hsdRMS - mcrBC) φ80d lac ZΔM15 Δ lacX74 deoR recA1 araD139 ? ( intermediate leu ) 7697 galU galKrpsLendA1nupG ) to construct a large Fc variant 2M library (library size: 1x10 9 ).

[표 1] 클로닝에 사용된 프라이머들(서열목록 제1서열 내지 제27서열) [Table 1] Primers used for cloning (Sequence Listing Nos. 1 to 27)

Figure 112017036058475-pat00001
Figure 112017036058475-pat00001

실시예Example 3. 박테리아배양 및  3. Bacterial culture and 유세포Flow cell 분리기(flow  Separator cytometrycytometry )를 이용한 ) FcFc 변이체Mutant 2M 라이브러리 탐색 Exploring the 2M Library

구축된 2M Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위하여 대장균 Jude1 세포에 형질전환되어 있는 Fc 변이체 라이브러리 세포 1 ml을 37℃ 250 rpm shaking 조건으로 2%(w/v) 글루코오스에 항생제는 클로람페니콜(40 μg/mL)이 포함된 Terrific Broth(TB) 배지에 넣어 주고 4시간 배양을 하였다. 진탕배양된 라이브러리 세포를 TB 배지에 1:100으로 접종한 후 37℃ 250 rpm shaking으로 OD600가 0.5에 도달할 때 까지 배양하였다. 그 후 cooling을 위해 20분 동안 25℃에서 배양한 후 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)를 넣어 발현유도를 하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하여 OD600 normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 재현탁(resuspension)하고 1분간 원심분리하는 세척과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M 수크로오스, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA(pH 8.0)]로 재현탁하여 37℃, 30분간 회전시켜 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M 수크로오스, 20 mM MgCl2, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 재현탁과 원심분리를 하였다. 1 ml의 SolutionA와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 재현탁한 뒤 37℃, 15분 간 회전시켜 펩티도글라이칸 층을 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 재현탁한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 형광 표지된 tetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flour 프로브를 함께 넣고 상온에서 회전시켜 spheroplast에 형광 프로브를 라벨링하였다. 라벨링후 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 유세포 분리기(Flow cytometry: S3 sortor (Bio-rad))를 이용하여 높은 형광을 보이는 상위 3% 세포들을 회수하기 위해 선별(sorting) 작업을 진행 하였고 형광이 높은 세포들의 순도를 높이기 위해서 선별된 세포들을 다시 재선별 (resorting)하였다. 재선별된 샘플을 pMopac12-seq-Fw와 pMopac12-seq-Rv 프라이머로 Taq 폴리머레이즈(Biosesang)를 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리, 라이게이션, 형질전환 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 증폭된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 2라운드에 걸쳐 반복한 후, 40여개의 개별 클론들을 각각 분석하여 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 FcRn과 높은 친화도를 보이는 M428L 변이체를 선별하였다(도 3).To investigate the constructed 2M Fc mutant library, 1 ml of Fc mutant library cells transformed into Escherichia coli Jude1 cells was added to 2% (w / v) glucose at 37 ° C and 250 rpm shaking condition and chloramphenicol (40 μg / (TB) medium and cultured for 4 hours. Shake cultured library cells were inoculated 1: 100 in TB medium and cultured at 37 ° C at 250 rpm shaking until OD 600 reached 0.5. After that, the cells were incubated at 25 ° C for 20 minutes for cooling, and the expression was induced by adding 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG). Cells were harvested by centrifugation at 14,000 rpm for 1 min, followed by OD600 normalization. The cells were resuspended with 1 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and centrifuged for 1 min. The washing procedure was repeated twice. Suspended in 1 ml of STE [0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)], and the extracellular membrane was removed by rotating at 37 ° C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 1 ml of Solution A [0.5 M sucrose, 20 mM MgCl 2 , 10 mM MOPS pH 6.8] was added and resuspended and centrifuged. 1 ml of Solution A and 20 μl of 50 mg / ml lysozyme solution was added to 1 ml of the solution, and the solution was incubated at 37 ° C for 15 minutes to remove the peptidoglycan layer. After centrifugation, the supernatant was removed and resuspended in 1 ml of PBS. Then, 300 μl was taken and labeled with fluorescence probe in spheroplast by adding 700 μl of PBS and fluorescently labeled tetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flour probe together and rotating at room temperature. After labeling, the cells were washed once with 1 ml of PBS and sorted using a flow cytometer (S3 sortor (Bio-rad)) to recover the upper 3% cells with high fluorescence. In order to increase the purity of these high cells, the selected cells were again re-selected. Of the amplified genes by PCR using the Taq polymerase to the re-selected samples to pMopac12-seq-Fw and pMopac12-seq-Rv primer raised (Biosesang) and sorting through the Sfi I restriction enzyme digestion, ligation, transformation procedure cells A sub-library in which genes were amplified was constructed. This process was repeated over a total of 2 rounds and 40 individual clones were analyzed respectively to select M428L variants with high affinity for FcRn at pH 5.8 than for wild-type Fc (FIG. 3).

실시예 3. Fc 변이체 error 라이브러리 및 point 라이브러리 제작Example 3. Fabrication of Fc variant error library and point library

발굴된 M428L을 주형으로 하여 추가로 두 가지 라이브러리를 제작하였다. 첫 번째 라이브러리는 error prone PCR 기법을 이용하여 Fc에 변이를 도입하여 error 라이브러리를 제작하였다. Error rate은 Fc(680 bp)에 0.3% error(2.04 bp)가 들어 갈 수 있도록 ep-Fc-Fw, ep-Fc-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리(라이브러리 크기: 2x108)를 제조하였다. 두 번째 라이브러리는 M428L을 주형으로 하고 Fc와 FcRn결합 부위를 선정하여 해당 부위에 무작위적으로 돌연변이가 도입되도록 pMopac12-seq-Fw, pMopac12-seq-Rv, Fc-Sub#0-Rv, Fc-Sub#1-1-Fw, Fc-Sub#1-2-Fw, Fc-Sub#1-3-Fw, Fc-Sub#1-4-Fw, Fc-Sub#1-5-Fw, Fc-Sub#1-Rv, Fc-Sub#2-1-Fw, Fc-Sub#2-2-Fw, Fc-Sub#2-3-Fw, Fc-Sub#2-Rv, Fc-Sub#3-1-Fw, Fc-Sub#3-2-Fw, Fc-Sub#3-3-Fw, Fc-Sub#3-4-Fw 프라이머를 이용하여 point 라이브러리를 제작하였다(도 4). 그 후 위와 같은 방법으로 Jude1에 형질전환하여 Fc 변이체 라이브러리를 구축하였다.Two additional libraries were constructed using the excavated M428L as a template. The first library used the error prone PCR technique to construct the error library by introducing mutations in Fc. The library (library size: 2x10 8 ) was prepared using ep-Fc-Fw and ep-Fc-Rv primers so that the error rate could be 0.3% error (2.04 bp) in Fc (680 bp). The second library uses M428L as the template and selects the Fc and FcRn binding sites and inserts pMopac12-seq-Fw, pMopac12-seq-Rv, Fc-Sub # 0-Rv, Fc-Sub # 1-1-Fw, Fc-Sub # 1-2-Fw, Fc-Sub # 1-3-Fw, Fc-Sub # 1-4-Fw, # 1-Rv, Fc-Sub # 2-1-Fw, Fc-Sub # 2-2-Fw, Fc-Sub # 2-3-Fw, Fc- The point library was constructed using the Fc-Sub # 3-2-Fw, Fc-Sub # 3-3-Fw and Fc-Sub # 3-4-Fw primers (FIG. Then, Jude1 was transformed into the Fc variant library by the above method.

실시예Example 4. 박테리아배양 및  4. Bacterial culture and 유세포Flow cell 분리기(flow  Separator cytometrycytometry )를 이용한 ) FcFc 변이체Mutant error 및 point 라이브러리 탐색과 PFc3, PFc29, PFc41, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 등의 변이체 선별 error and point library search and selection of mutants such as PFc3, PFc29, PFc41, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88

앞서 발굴된 M428L을 기본으로 하여 추가적으로 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리를 위와 같은 방법으로 선별 및 재선별 작업을 진행하였다. error 라이브러리는 5 라운드에 거쳐 반복하였고, point 라이브러리는 1회에 거쳐 선별을 진행한 후 두 가지 라이브러리에서 나온 그룹에서 각각 100여개의 개별 클론들을 분석하여 pH 5.8에서 FcRn에 높은 친화도를 보이고 pH 7.4에서는 낮은 친화도를 보이는 Fc 변이체들을 선별하였다. FACS를 이용하여 각각을 분석한 결과 error 라이브러리에서 발굴된 EFc6, EFc29, EFc41, EFc46, EFc70, EFc90 EFc82, EFc88은 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 높은 형광세기를 보였지만 선행연구에서 발굴된 메디이뮨(Medimmune)의 YTE (Gabriel J. Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother. 2013 Dec; 57(12): 61476153)나 젠코(Xencor)의 LS(미국 특허등록번호 제8,324,351호) 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 나타내었으며, pH 7.4에서 LS보다 낮은 형광을 나타내는 변이체는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 이라는 것을 확인하였다. 또한 point 라이브러리에서 발굴된 변이체 PFc3, PFc29, PFc41는 YTE나 LS 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 보였지만 PFc30은 낮은 형광세기를 보였다. 그리고 PFc29, PFc41은 pH 7.4에서 LS 보다 낮은 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 최종적으로 혈중 반감기를 향상 시킬 것으로 예상되는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88, PFc3, PFc29, PFc41을 선정하였다(표 2, 도 5).Based on the previously discovered M428L, additional error library and point library were selected and redesigned as above. The error library was repeated over 5 rounds and the point library was screened one time and analyzed over 100 individual clones from each of the two libraries to show high affinity to FcRn at pH 5.8 and pH 7.4 Fc variants with low affinity were selected. The fluorescence intensities of EFc6, EFc29, EFc41, EFc46, EFc70, EFc90 EFc82 and EFc88 were higher than those of wild type Fc at pH 5.8. However, (Fluorescence intensity at pH 5.8) higher than that of YTE (Gabriel J. Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother . 2013 Dec; 57 (12): 61476153) or Xencor LS (US Patent No. 8,324,351) And the mutants exhibiting fluorescence lower than LS at pH 7.4 were found to be EFc6, EFc29, EFc41, EFc82 and EFc88. In addition, mutants PFc3, PFc29, and PFc41, which were found in the point library, showed higher fluorescence intensity at pH 5.8 than YTE or LS, but PFc30 showed lower fluorescence intensity. It was confirmed that PFc29 and PFc41 exhibited fluorescence lower than LS at pH 7.4. EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88, PFc3, PFc29 and PFc41, which are expected to improve the half-life of the blood, are finally selected (Table 2, Fig. 5).

[표 2] 발굴한 변이체의 점 돌연변이 [Table 2] Point mutations of mutants excavated

Figure 112017036058475-pat00002
Figure 112017036058475-pat00002

돌연변이위치는 Kabat EU 넘버링시스템(Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호에 따름.The mutation positions were identified using the EU index numbering scheme as in the Kabat EU numbering system (Kabat et al., In "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, According to.

실시예 5. Fc 변이체 도입을 위한 대조군 트라스트주맙 생산 및 정제Example 5. Control for the introduction of Fc variants Trastuzumab production and purification

본 발명에서는 IgG1 치료용 항체 중 대표적인 트라스트주맙(trastuzumab, Herceptin)을 선정하여, 발굴된 Fc 변이체를 도입하고 향후 대조군으로 사용하고자 하였다. In the present invention, a representative trastuzumab (Herceptin ) among IgG1 therapeutic antibodies was selected, and the excised Fc variant was introduced and used as a control group in the future.

야생형 트라스트주맙 유전자는 Drug Bank(http://www.drugbank.ca/)의 아미노산 서열로부터 back-translation과 동시에 mammalian codon optimization을 통해 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 각각을 합성(Genscript) 하였다. 합성된 트라스트주맙 중쇄 유전자는 pOptiVEC-Fc 벡터에 트라스트주맙 경쇄 유전자는 pDNA3.3 벡터에 각각 서브클로닝하였다(도 6). 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 코딩하고 있는 동물세포 발현용 플라스미드들을 각각 제조하여 HEK293세포에서 발현 및 정제하였다. The wild-type Trastuzumab gene was synthesized (Genscript) from the amino acid sequence of Drug Bank (http://www.drugbank.ca/) by back-translation and mammalian codon optimization at the same time, respectively. The synthesized trastuzumab heavy chain gene was subcloned into the pOptiVEC-Fc vector and the trasturmate light chain gene was subcloned into the pDNA3.3 vector, respectively (FIG. 6). Plasmids expressing animal cells encoding trastuzumab heavy chain and light chain were prepared and expressed in HEK293 cells, respectively.

HEK 293F에서 배양 후 Protein A 친화도 크로마토크래피(AKTA prime plus, cat # 11001313)와 젤여과 크로마토그래피(HiTrap MabselectSure, GE, cat #11-0034-95)를 이용하여 야생형 트라스트주맙을 정제하였고, 300 ml 배양액으로부터 7.7 mg의 고순도 야생형 트라스트주맙을 확보하였다(도 7).After cultivation in HEK 293F, wild type trastuzumab was purified using Protein A affinity chromatography (AKTA prime plus, cat # 11001313) and gel filtration chromatography (HiTrap MabselectSure, GE, cat # 11-0034-95) From the 300 ml culture, 7.7 mg of high-purity wild-type tasturzum was obtained (Fig. 7).

실시예 6. 연구실 제작(Example 6. Preparation of a laboratory ( in-housein-house ) 및 상업용() And commercial ( commercialcommercial )) 트라스트주맙 물성 비교 분석 Comparison of properties of trastuzumine

CHO suspension 배양으로 생산된 상업용(commercial) 트라스트주맙과 달리 연구실에서 제작(in-house)한 in-house 트라스트주맙은 HEK293에서 생산하였기 때문에 선별된 Fc-변이체를 도입하여 그 기능을 분석 하기 전 두 가지 형태의 기본 특성 분석을 하였다. CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 분석은 pH 3-10의 구배를 형성하는 Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes(GE Healthcare, 17-0456-01)를 사용하여 시료의 pI값 및 Charge variants를 분석하였다. 분석 결과 SEC(Size Exclusion Chromatography :Tskgel G3000swxl, Tosoh)에 의한 impurity는 없었으며, CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 charge variant에 의한 pI값은 상업용의 경우 8.27-8.74이고 main peak의 PI가 8.62이며, 자체 생산한 트라스트주맙의 PI는 8.29-8.78, main peak은 8.65로 둘 다 거의 유사하였다(도 8). 그러나 cIEF 분석 결과 연구실에서 제작한 트라스트주맙에서 main peak외 나머지 peak에서의 약간의 함량차이가 관찰되었고 이것은 상업용의 경우 CHO에서 생산되나, 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 생산 세포주가 HEK293으로 Glycan pattern이 달라 sialic acid등으로 인한 oxdation일 가능성도 있어 Glycan 분석도 진행 하였다(도 9). In -house in-house trastuzumab was produced in HEK293, unlike commercial trastuzumab produced in CHO suspension cultures. Therefore, before analyzing its function by introducing the selected Fc-mutants, two The basic characteristics of the shape were analyzed. Analysis by CE (Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter) was carried out using Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes (GE Healthcare, 17-0456-01) forming a gradient of pH 3-10 and the pI value of the sample and Charge variants Respectively. As a result, there was no impurity caused by SEC (Size Exclusion Chromatography: Tskgel G3000swxl, Tosoh), and the pI value due to charge variant by CE (Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter) was 8.27-8.74 for commercial use and the main peak PI was 8.62, and the self-produced trastuzumab PI was 8.29-8.78, and the main peak was 8.65 (Fig. 8). However, in the cIEF analysis, there was a slight difference in the content of the remaining peaks in the other main peaks in the trastuzumab prepared in the laboratory. It was produced in the CHO in the commercial use, but the production of the trastuzumab in the laboratory was different from the HEK293 in the Glycan pattern sialic acid and the like, so that Glycan analysis proceeded (FIG. 9).

Glycan 분석은 단백질에서 PNGase F(NEB, 186007990-1)를 이용하여 N-glycan을 떼어낸 후 RapiFluor-MS reagent(Waters, 186007989-1)를 이용하여 라벨링 후 UPLC 시스템(Acquity UPLC I class, Waters, FLR detector)을 이용하여 분석 실시하였다. Glycan 분석 결과 당 패턴은 유사하나 각 조성 당의 함량 차이만 보여 이는 sialic acid에 의한 oxidation이 원인은 아닌 것으로 보이며, 생산 세포주 차이에 의해 나타나는 것으로 보였고, 결합력 분석 및 약동학 분석에는 큰 영향이 없음을 확인하여(Data not shown) 선별된 Fc 변이체들을 도입하여 생산하였다.Glycan analysis was performed by labeling the protein with a RapiFluor-MS reagent (Waters, 186007989-1) after removing N-glycan using PNGase F (NEB, 186007990-1) FLR detector). Glycan analysis showed similar pattern but the difference in contents per composition showed that it was not due to oxidation by sialic acid. It appeared to be due to the difference of the cell lines and it was confirmed that there was no significant effect on the binding assay and pharmacokinetic analysis (Data not shown) by introducing selected Fc variants.

실시예 7. Fc 변이체 생산, 정제 및 물성 분석Example 7. Production, purification and physical property analysis of Fc variants

상업용과 연구실에서 제작한 야생형 외에 LS(XenCor), YTE(MedImmune), 428L등의 대조군 변이체 5종과 PFc29, PFc41, EFc29, EFc41 및 EFc82 등 5종의 선별된 변이체를 HEK 293F 동물세포에 형질주입하였다. 형질주입 하루 전날 HEK293F cell을 1x106 cells/ml의 밀도로 300 ml 계대배양하고 다음날 Polyethylenimine(PEI, Polyscience, 23966)을 이용하여 형질주입하였다. Freestyle 293 expression 배양액(Gibco, 12338-018) 30 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 2:1의 비율로 먼저 섞고, 다음으로 PEI : 변이체유전자 = 1:2 비율로 섞어 상온에서 20분간 두었다가 전날 계대배양 해 놓은 세포에 섞고 shaking CO2 인큐베이터에서 37℃, 125 rpm, 8 % CO2 조건으로 6일간 배양한 후 원심 분리하여 상등액만 취하였다. In addition to the commercial and laboratory wild-type strains, five selected variants of control variants such as LS (XenCor), YTE (MedImmune) and 428L and PFc29, PFc41, EFc29, EFc41 and EFc82 were transfected into HEK 293F animal cells Respectively. The day before transfection, HEK293F cells were cultured in 300 ml subculture at a density of 1x10 6 cells / ml and transfected with polyethylenimine (PEI, Polyscience, 23966) the following day. The heavy chain and light chain genes of the mutants were first mixed at a ratio of 2: 1 in 30 ml of Freestyle 293 expression culture medium (Gibco, 12338-018), and then mixed with PEI: mutant gene = 1: 2 ratio for 20 minutes at room temperature. Cells were incubated in shaking CO 2 incubator at 37 ° C, 125 rpm, 8% CO 2 for 6 days and centrifuged to remove the supernatant.

상등액으로부터의 단백질 정제는 HiTrap MabselectSure 칼럼을 장착한 AKTA prime plus를 이용하여 친화 크로마토그래피로 수행하였다. 상등액 300 ml을 분당 3 ml의 속도로 흘려주고, 100 ml의 1xPBS로 씻어준 후 IgG Elution buffer(Thermo scientific , 21009)를 분당 5 ml의 속도로 5 ml 씩 6개의 절편(fraction)을 수집하고 1M Tris (pH9.0) 500 ul를 섞어 중화시켜준 후, 각 절편을 Bradford (BioRad, 5000001) 용액으로 단백질을 확인하여 새 튜브에 취하였다. 30K Amicon ultra centrifugal filter(UFC903096)를 이용하여 정제된 변이체들을 농축한 다음 물성 분석하였다(도 10 및 11). Protein purification from the supernatant was performed by affinity chromatography using AKTA prime plus equipped with HiTrap MabselectSure column. The supernatant (300 ml) was flowed at a rate of 3 ml / min, washed with 100 ml of 1 × PBS, and 6 fractions were collected in 5 ml of IgG Elution buffer (Thermo scientific, 21009) After neutralizing with 500 μl of Tris (pH 9.0), each fragment was identified in a Bradford (BioRad, 5000001) solution and placed in a new tube. Purified mutants were concentrated using a 30K Amicon ultra centrifugal filter (UFC903096) and then analyzed for physical properties (FIGS. 10 and 11).

연구실 제작 야생형 트라스트주맙 외 각 Fc 변이체들을 protein A로 정제 후 SDS-PAGE에 의해 순도 90% 이상 순도 및 분자량을 확인하였고, 효능평가 및 순도 분석에 요구되는 고순도 단백질 시료 확보(순도 97% 이상)를 위해 SEC-HPLC(도 11A) 실험을 진행하였다. isocratic condition(이동상 1X PBS pH 7.0, 1 ml/min 유속)에서 분석한 결과, Fc 변이체 모두 main peak에 대한 retention time이 동일하며 분자량 예측 결과 예상 분자량으로 확인 하였다(도 11B).After purification of each Fc variant by the protein A, the purity and molecular weight were confirmed to be more than 90% by SDS-PAGE and the high purity protein sample (purity more than 97%) required for efficacy evaluation and purity analysis was obtained (FIG. 11A) for SEC-HPLC. As a result of analysis by isocratic condition (mobile phase 1X PBS pH 7.0, flow rate of 1 ml / min), retention times for the main peaks of all the Fc variants were the same and the molecular weights were predicted as the expected molecular weight (FIG. 11B).

실시예 8. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정Example 8. Measurement of FcRn Binding Capacity of Fc Variants by ELISA

앞서 준비된 변이체들의 FcRn pH-의존적 결합력과 effect function을 나타낼 수 있도록 하는 FcγRs, C1q와의 결합력을 측정해 보기 위하여 ELISA 측정을 진행하였다. 먼저 FcRn에 pH-의존적 결합력을 보기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)로 상온에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST (pH 5.8/pH 7.4) 180 μl로 4회 씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)으로 serially dilution된 FcRn를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-GST-HRP conjugate(GE Healthcare) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl 씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 발굴한 변이체는 FcRn에 대해서 pH 5.8에서는 LS 변이체와 비슷한 결합력을 가지고 pH 7.4에서는 LS 보다 더 잘 해리가 되는 것을 볼 수 있었다(도 12).ELISA measurements were performed to determine the binding capacity of FcγRs and C1q to allow for the FcRn pH-dependent binding force and effect function of the previously prepared mutants. In order to determine the pH-dependent binding force of FcRn, 50 μl of IgG Fc mutant diluted to 4 μg / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 was added to the flat bottom polystyrene high-bind 96-well microplate (Costar) And then blocked with 100 μl of 4% skim milk (in 0.05% PBST pH 5.8 / pH 7.4) for 2 hours at room temperature. After washing four times with 180 μl of 0.05% PBST (pH 5.8 / pH 7.4), 50 μl of serially diluted FcRn in 1% skim milk (in 0.05% PBST pH 5.8 / pH 7.4) was added to each well The reaction was allowed to proceed at room temperature for 1 hour. After washing, 50 μl of anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) was reacted at room temperature for 1 hour and washed. After adding 50 μl of 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific), color development was performed and 50 μl of 2 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction. The reaction was then analyzed using an Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek). The mutant digested with FcRn had a similar binding affinity to LS mutant at pH 5.8 and was more dissociated at pH 7.4 than LS (Fig. 12).

실시예 9. pH 6.0과 pH 7.4에서 트라스트주맙 Fc 변이체들과 monomeric hFcRn과의 결합력 측정 비교 분석 Example 9. Comparison of measurement of binding force between trastuzumab Fc variants and monomeric hFcRn at pH 6.0 and pH 7.4

이와 같이, 물성 분석으로 확인된 상업용과 연구실 제작 트라스트주맙 외 선별된 Fc 변이체들의 pH에 따른 인간 FcRn과의 결합력 차이를 비교하기 위해 Biacore T200(GE Healthcare) 장비를 이용하여 KD값을 측정 비교하였다. pH 6.0 조건에서는 문헌(Yeung YA. et al., J. Immunol,2009)에 따라 antigen-mediated antibody capture 방식으로 인간 FcRn을 analyte로 사용하였다. HER2 ECD domain이 ∼3,000 response units(RU) 수준으로 고정된 CM5 chip 표면에 Fc 변이체를 리간드로 running buffer(50 mM Phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0)에 희석하여 ~300 RU 수준으로 주입하여 capture하였다. Analyte인 monomeric FcRn(Sinobiological inc., CT009-H08H)은 125 nM에서부터 FcRn running buffer에 순차적으로 희석하여 30 ul/min 유속으로 2분 동안 injection하고, 2분 동안 dissociation하여 결합력을 측정하였다. 각 cycle 마다 10 mM Glycine(pH1.5) 30 ml/min의 유속으로 30초간 regeneration을 수행하였다. Sensogram은 BIAevaluation software(Biacore)에서 1:1 binding model을 적용하여 분석하였다. 그 결과, Fc 변이체가 대조군으로 사용된 상업용 트라스트주맙(15 nM) 및 연구실 제작 트라스트주맙(16.9 nM)과 backbone으로 사용된 428L(9 nM)보다는 결합력이 좋아졌지만(PFc 3: 5.6 nM, PFc29 : 6.8 nM, PFc 41: 5.9 nM 등), 세계 최고로 알려진 YTE(5.7 nM)와 LS(4.1 nM)보다는 결합력이 다소 낮았으나 그 값의 차이가 거의 오차범위내로 비슷함을 확인하였다. pH 7.0 조건에서는 리간드와 analytes가 잘 결합하지 않으므로 monomeric hFcRn을 direct immobilization 한 다음 Fc 변이체들을 농도별로 주입하는 avid format(Zalevsky J et al. Nat. Biotechnol,2010)으로 측정하였다. 인간 FcRn ECD doamin(Sino Biological)을 CM5 chip 표면에 ∼1,500 RU 수준으로 고정화하였다. FcRn이 고정된 chip 표면에 Fc 변이체들을 3000 nM에서부터 HBS-EP(pH 7.4)에 순차적으로 희석하여 5 ml/min의 유속으로 2분간 injection하였다. 결합한 Fc 변이체들은 2분 동안 해리시켰으며, 각 cycle이 끝나면 chip 표면을 100 mM Tris(pH 9.0)로 regeneration 하였다(conatat time 30초; 유속 30 ul/min). 이중, Fc 변이체들 2종 (PFc29, PFc41)이 pH 6.0 조건에서 높은 결합력을 유지하면서 pH 7.4 조건에서는 YTE와 LS보다 빠르게 해리되는 것 (ELISA 결과와 일치)으로 보아 반감기 증가 효과를 기대할 수 있음을 예상하였고(도 13), 실제 인간 FcRn Tg 마우스에서 체내 약동학실험을 진행하였다. In this way, the K D values were measured and compared using Biacore T200 (GE Healthcare) equipment to compare the difference of binding force between human and FcRn according to the pH of commercial and laboratory-produced Fc variants identified by physical property analysis . At pH 6.0, human FcRn was used as an analyte by antigen-mediated antibody capture according to the literature (Yeung YA et al. , J. Immunol, 2009). The Fc variants were diluted in running buffer (50 mM phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0) on CM5 chip surface fixed to HER2 ECD domain at ~ 3,000 response units (RU) 300 RU. The analyte, monomeric FcRn (Sinobiological Inc., CT009-H08H), was serially diluted from 125 nM to FcRn running buffer, injected at a flow rate of 30 μL / min for 2 min and dissociated for 2 min to measure binding. Regeneration was performed for 30 seconds at a flow rate of 30 ml / min of 10 mM Glycine (pH 1.5) per cycle. Sensograms were analyzed using a 1: 1 binding model in BIAevaluation software (Biacore). As a result, the Fc variants showed better binding (PFc 3: 5.6 nM, PFc 29: 9 nM) than the commercial trastuzumab (15 nM) and laboratory produced trastuzumab (16.9 nM) 6.8 nM, and PFc 41: 5.9 nM), but the binding force was slightly lower than that of the world's best known YTE (5.7 nM) and LS (4.1 nM). Since the ligand and the analytes do not bind well at pH 7.0, they were measured by avid format (Zalevsky J et al ., Nat Biotechnol, 2010) in which the monomeric hFcRn was directly immobilized and then the Fc variants were injected at different concentrations. Human FcRn ECD doamin (Sino Biological) was immobilized on CM5 chip surface at ~1,500 RU level. Fc variants were sequentially diluted from 3000 nM to HBS-EP (pH 7.4) on the surface of the FcRn-immobilized chip and injected at a flow rate of 5 ml / min for 2 minutes. The bound Fc variants were dissociated for 2 min. At the end of each cycle, the chip surface was regenerated with 100 mM Tris (pH 9.0) (conatate time 30 sec; flow rate 30 ul / min). Two of the Fc variants (PFc29 and PFc41) were expected to dissociate faster than YTE and LS (consistent with the ELISA results) at pH 7.4, while maintaining high binding at pH 6.0. (Fig. 13), and an in vivo pharmacokinetic experiment was conducted in real human FcRn Tg mice.

실시예Example 10. 일반 B6 마우스와  10. With a regular B6 mouse hFcRnhFcRn TgTg 마우스에서 상업용 및 연구실 제작  Commercial and laboratory production from mouse 트라스트주맙Trastuzumab 생체 내( In vivo in vivoin vivo )) PK 실험비교 분석 Comparison of PK experiment

인간 FcRn Tg 마우스와 유전적 background가 동일한 B6 일반 마우스(중앙실험동물센터, C57BL/6J(B6))에서의 PK분석 결과, 논문에서 보고된 것과 같이 일반 마우스 FcRn과 인간 항체의 Fc와의 친화력이 인간 FcRn과 인간항체 Fc보다 높게 나옴을 확인하였다. 그러나, 일반 마우스에서의 PK값은 연구실 제작 및 상업용 항체간의 variation이 보였고 연구실 제작 항체가 unstable해 보였으나, Tg 마우스(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg(Jackson lab, CAGFCGRT)276Dcr/DcrJ)에선 일반 마우스보다는 AUC가 다소 낮으나 연구실 제작 및 상업용 항체간의 약동학 경향은 비슷하게 측정됨이 확인되었다. 따라서, Tg 마우스에서의 실제 체내 약동학 분석에 HEK293에서 생산한 연구실 제작 유래 Fc 변이체들의 실험 측정에 문제가 없음을 확인하였다(도 14). PK analysis of B6 mice (C57BL / 6J (B6)) with the same genetic background as human FcRn Tg mice revealed that the affinity between normal mouse FcRn and Fc of a human antibody FcRn and human antibody Fc. However, the PK values in normal mice showed variations between the laboratory and commercial antibodies and the lab-produced antibodies were unstable. However, Tg mice (B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg (Jackson lab, CAGFCGRT) 276Dcr / DcrJ) , But the pharmacokinetic trends between lab-produced and commercial antibodies were found to be similar. Thus, it was confirmed that there was no problem in the experimental measurement of the laboratory-produced Fc variants produced in HEK293 in the actual pharmacokinetic analysis of Tg mice (Fig. 14).

실시예 11. LS, YTE 외 두 종 변이체(PFc29 및 PFc41)등 4종에 대한 hFcRn Tg 마우스 약동학Example 11. hFcRn Tg mouse pharmacokinetics on four species including LS, YTE and two species mutants (PFc29 and PFc41)

ELISA 와 BiaCore장비로 pH 6.0 및 pH 7.4에서 측정했던 결합력 결과가 일관성 있게 나와 이를 토대로 pH 6.0 acidic 조건에서 LS 만큼 결합력이 좋고 pH 7.4에서 해리력이 LS보다 더 좋았던, PFc29와 PFc41의 2 종류를 선별하였다. 이와 동시에, 현 세계 최고라고 알려진 XenCor의 LS mutant와 MedImmune의 YTE를 대조군으로 총 4종의 트라스트주맙 Fc 변이체를 인간 FcRn Tg 마우스 20마리(각 군당 5마리씩 5 mg/kg을 I.V (미정맥)로 주사 후 facial vein에서 채혈(총 12회 → 0, 30min, 1, 6, 24hr, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50day))에서 얻어진 혈액을 이용하여 ELISA로 농도분석한 후 WinNonlin으로 non-compartmental analysis (NCA) 실시하였다. ELISA와 BiaCore 분석 결과에서 예상했던 대로, Fc 변이체 2종 (PFc29 및 PFc41) 모두 체내 반감기 증가 효과를 보여주었으며, 특히 PFc29의 경우 선행연구에서 발굴된 LS보다 높은 반감기 효과를 보였다(도 15, 표 3).The results of the binding strength measured at pH 6.0 and pH 7.4 with ELISA and BiaCore instrument were consistently selected, and two types of PFc29 and PFc41 were selected, which had good binding force at pH 6.0 acidic condition and LS at dissolution pH at pH 7.4 Respectively. At the same time, a total of 4 kinds of Trastuzumab Fc mutants were administered to 20 human FcRn Tg mice (5 mice per group of 5 mg / kg IV (control group)) using XenCor LS mutant and MedImmune YTE, After the injection, blood was collected from the facial vein (12 times in total → 0, 30 min, 1, 6, 24 hr, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50 days) Non-compartmental analysis (NCA) was performed with WinNonlin. As expected from the ELISA and BiaCore analysis, both of the Fc variants (PFc29 and PFc41) showed an increase in half-life in the body, and PFc29 showed a half-life effect higher than that of the LS found in the previous studies (FIG. 15, Table 3 ).

[표 3] 마우스 정맥 투여 (5 mg/kg) 후 트라스트주맙 Fc 변이체의 비구획적 약동학 파라미터 분석(Data are expressed as mean ±SD (n = 5)) [Table 3] Analysis of non-compartmental pharmacokinetic parameters of trastuzumab Fc variants after intravenous administration of mouse (5 mg / kg) (Data are expressed as mean ± SD (n = 5))

Figure 112017036058475-pat00003
Figure 112017036058475-pat00003

t1/2, terminal half-life; Tmax, time at maximal concentration; C0, extrapolated zero time concentration; Cmax, maximal concentration; AUClast, area under the curve from administration to the last measured concentration; AUCinf, area under the curve from administration to infinity; AUC%Extrap, percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve;Vz, volume of distribution; CL, clearance.t 1/2 , terminal half-life; T max , time at maximal concentration; C 0 , extrapolated zero time concentration; C max , maximal concentration; AUC last , area under the curve from administration to the last measured concentration; AUC inf , area under the curve from administration to infinity; AUC % Extrap , percentage of the extrapolated area under the curve, V z , volume of distribution; CL, clearance.

실시예 12. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정Example 12 Measurement of Fc? Rs Binding Capacity of Fc Variants by ELISA

FcγRs와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk (GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 FcγRs를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 FcRs는 anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1 시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 각각의 FcγRs[FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(V), FcγRIIIa(F))에 대한 결합력을 확인할 수 있었다(도 16). In order to measure the binding force with FcγRs, 50 μl of IgG Fc mutant diluted to 4 μg / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 was immobilized in a flat bottom polystyrene high-bind 96-well microplate (Costar) at 4 ° C for 16 hours And then blocked with 100 μl of 4% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) for 2 hours at room temperature. After washing four times with 180 μl of 0.05% PBST (pH 7.4), 50 μl of serially diluted FcγRs with 1% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour . After washing, FcRs were reacted with 50 μl of anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) for 1 hour at room temperature and washed. After adding 50 μl of 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific), color development was performed and 50 μl of 2 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction. The reaction was then analyzed using an Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek). Each experiment was carried out in duplicate and ELISA confirmed the binding ability to each of FcγRs [FcγRI, FcγRIIa (H), FcγRIIa (R), FcγRIIb, FcγRIIIa (V), FcγRIIIa (F)).

실시예Example 13.  13. FcFc 변이체의Mutant 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 ( Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ( ADCCADCC )에 의한 )On by 작동체Operator 기능 ( function ( EffectorEffector Function) 측정  Function measurement

트라스트주맙 Fc 변이체의 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성은 ADCC 리포터 바이오어세이 키트(reporter bioassay kit, Promega, G7010)을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 표적 세포(Target cells)로 사용되는 SKBR-3을 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 5X103 cells/100 ㎕ 씩 분주한 후 37℃ CO2 배양기에서 20시간동안 배양하였다. 20시간 경과 후 멀티 피펫을 이용하여 플레이트의 각 웰에서 95 ㎕의 배양 배지를 제거하고 ADCC 리포터 바이오어세이 키트 에서 제공된 ADCC assay buffer 25 ㎕를 각 웰에 분주하였다. Normal IgG, 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체는 ADCC assay buffer에 농도 별로 희석하여 준비한 후, 세포가 있는 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰당 25 ㎕씩 분주하고 효과기 세포 (effector cells)를 첨가할 때까지 상온에 두었다. 키트에서 제공하는 효과기 세포는 37℃ 항온수조에서 2-3분간 녹인 후 630 ㎕를 취하여 ADCC assay buffer 3.6 mL과 혼합하였다. 표적 세포와 항체 희석물을 포함하는 플레이트에 준비된 효과기 세포를 웰당 25 ㎕씩 분주한 후 37 ℃ CO2 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다. 시간이 경과되면 플레이트를 꺼내 15분간 상온에 둔 후, Bio-GloTMLuciferase assay reagent를 웰 당 75 ㎕ 씩 첨가하고 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 루미노미터(luminometer, Enspire multimode plate reader)를 이용하여 각 웰의 루미네센스(luminescence)를 측정하였다. 각 시험 항체들의 ADCC 활성도는 실험한 결과의 평균값을 Fold induction으로 표시하였고, 다음 식을 사용하여 결정되었다: Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity was assessed using an ADCC reporter bioassay kit (Promega, G7010). Specifically, SKBR-3, used as target cells, was added to each well of a 96-well tissue culture plate with 5X10 < 3 > cells / 100 μl each, and then cultured in a 37 ° C CO 2 incubator for 20 hours. After 20 hours, 95 [mu] l of the culture medium was removed from each well of the plate using a multipipette, and 25 [mu] l of the ADCC assay buffer provided in the ADCC Reporter Bioassay Kit was dispensed into each well. Normal IgG, trastuzumab, and trastuzumab Fc variants were diluted in ADCC assay buffer by concentration, and then 25 쨉 l per well of a 96-well tissue culture plate with cells was added until effector cells were added Lt; / RTI > The effector cells provided in the kit were dissolved in a constant temperature water bath at 37 ° C for 2-3 minutes and then 630 μl was mixed with 3.6 ml of ADCC assay buffer. The effector cells prepared on the plate containing the target cells and the antibody dilution were dispensed in a volume of 25 μl per well and reacted in a 37 ° C CO 2 incubator for 6 hours. After the time had elapsed, the plate was taken out and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Then, 75 μl of Bio-Glo Luciferase assay reagent was added per well and reacted at room temperature for 5 minutes. After the reaction, the luminescence of each well was measured using a luminometer (Enspire multimode plate reader). The ADCC activity of each test antibody was determined by the fold induction average of the experimental results and was determined using the following equation:

Fold induction =Fold induction =

RLU(induced1-background2)/RLU(noantibodycontrol3-background)RLU (induced 1-background 2 ) / RLU (noantibodycontrol 3 -background)

1.induced: 표적세포, 시험 항체 그리고 효과기 세포가 혼합된 시료로부터 획득된 RLU 값 1.induced: RLU values obtained from samples mixed with target cells, test antibodies and effector cells

2. background: ADCC assay buffer에서 획득한 RLU 값 2. background: RLU value obtained from ADCC assay buffer

3. no antibody control: 표적세포와 효과기 세포만 혼합된 시료에서 획득한 RLU 값. 3. no antibody control: The RLU value obtained from a mixture of only target cells and effector cells.

SKBR-3에 대한 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체(LS, YTE, PFC29 및 PFC41)의 ADCC 활성을 상호 비교하였다(도 17). 그 결과, 가장 높은 농도에서의 최대 활성값을 기준으로 각 시험물질의 ADCC 활성은 양성 대조물질인 트라스트주맙에 비해 LS는 약 1.5배, PFc29는 1.18배 그리고 PFc41은 1.27배 높았으나, YTE는 4.2배 낮은 활성을 보였다. 결과적으로, 트라스트주맙 Fc 변이체 2종(PFc29 및 PFc41)과 대조 변이체 LS는 기존 대조약 (Trastuzumab) 대비 1.18-1.5배 향상된 ADCC 활성을 보였다. 그러나, 다음 그림에서 보는 바와 같이 측정된 변이체 각각의 EC50 값을 보았을 때, 대조군 LS (EC50=0.05575 ug/mL) 보다 본 발명에서 찾은 Fc 변이체 PFc29 (EC50=0.04543 ug/mL)와 PFc41 (EC50=0.05405 ug/mL)가 더 안정된 효능을 보임을 확인하였다(도 18). The ADCC activities of trastuzumab and trastuzumab Fc variants (LS, YTE, PFC29 and PFC41) against SKBR-3 were compared (FIG. 17). As a result, ADCC activity of each test substance was found to be about 1.5 times higher in LS, 1.18 times in PFc29 and 1.27 times in PFc41 compared to the positive control substance, based on the maximum activity value at the highest concentration, but YTE was 4.2 Fold lower activity. As a result, two strains of trastuzumab Fc variants (PFc29 and PFc41) and the control mutant LS showed ADCC activity 1.18-1.5 times higher than that of the existing control (Trastuzumab). However, as shown in the following figure, when the EC50 values of the respective mutants were examined, the Fc variants PFc29 (EC50 = 0.04543 ug / mL) and PFc41 (EC50 = 0.05405 ug / mL) showed more stable efficacy (Fig. 18).

실시예 14. ELISA를 통한 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정Example 14 Measurement of C1q Binding Capacity of Fc Variants by ELISA

C1q와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 Complement C1q Human (Millipore)를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-C1qHRP conjugate(Invitrogen) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 분석 결과 C1q 결합력이 선행연구에서 발굴된 LS와 YTE 보다 본 연구에서 발굴한 PFc29이 높은 결합력을 보였다(도 19). In order to measure the binding force with C1q, 50 μl of IgG Fc mutant diluted to 4 μg / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 was immobilized in a flat bottom polystyrene high-bind 96-well microplate (Costar) at 4 ° C for 16 hours And then blocked with 100 μl of 4% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) for 2 hours at room temperature. After washing four times with 180 μl of 0.05% PBST (pH 7.4), 50 μl of serially diluted Complement C1q Human (Millipore) in 1% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) was added to each well. And reacted for 1 hour. After washing, 50 μl of anti-C1qHRP conjugate (Invitrogen) was reacted at room temperature for 1 hour and washed. After adding 50 μl of 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific), color development was performed and 50 μl of 2 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction. The reaction was then analyzed using an Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek). As a result, the binding force of C1q was higher than that of LS and YTE, which were found in previous studies (PFc29).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation Osong Hi-Tech Medical Industry Promotion Foundation <120> Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life <130> HP7180 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMopac12-seq-Fw <400> 1 ccaggcttta cactttatgc 20 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-1-Rv <400> 2 cctcaggggt ccgggagatg wagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-2-Rv <400> 3 cctcaggggt ccgggagatk nbgagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-3-Rv <400> 4 cctcaggggt ccgggagatc cagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-Fw <400> 5 atctcccgga cccctgagg 19 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-1-Rv <400> 6 gtagtggttg tgcagagcct catggwacac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-2-Rv <400> 7 gtagtggttg tgcagagcct catgknbcac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-3-Rv <400> 8 gtagtggttg tgcagagcct catgccacac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-frg3-Fw <400> 9 catgaggctc tgcacaacca ctac 24 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMopac12-seq-Rv <400> 10 ctgcccatgt tgacgattg 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#0-Rv <400> 11 gtccttgggt tttgggggga ag 22 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-1-Fw <400> 12 cttcccccca aaacccaagg acnnkctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 13 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-2-Fw <400> 13 cttcccccca aaacccaagg acaccnnkat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-3-Fw <400> 14 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gnnktcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 15 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-4-Fw <400> 15 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatcnnkcgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-5-Fw <400> 16 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctccnnk acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#1-Rv <400> 17 gacggtgagg acgctgacc 19 <210> 18 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#2-1-Fw <400> 18 ggtcagcgtc ctcaccgtcn nkcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#2-2-Fw <400> 19 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcacnnkga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 20 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#2-3-Fw <400> 20 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggnnkaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#2-Rv <400> 21 cacggagcat gagaagacgt tcc 23 <210> 22 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#3-1-Fw <400> 22 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatn nkgctctgca caaccactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 23 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#3-2-Fw <400> 23 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctnnkca caaccactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 24 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#3-3-Fw <400> 24 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctctgca cnnkcactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 25 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub#3-4-Fw <400> 25 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctctgca caaccacnnk acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ep-Fc-Fw <400> 26 ccagccggcc atggcg 16 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ep-Fc-Rv <400> 27 gaattcggcc cccgaggccc c 21 <210> 28 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 29 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 30 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 3 <400> 30 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Arg His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 31 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 29 <400> 31 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 32 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 41 <400> 32 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Gly His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 33 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 6 <400> 33 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Met Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Gln Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Asp Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Asp Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Ser Gly Lys 225 <210> 34 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 29 <400> 34 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Leu Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Gly 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 35 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 41 <400> 35 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Leu Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Asp Asn Asn Tyr Lys Thr Ala Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 36 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 82 <400> 36 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Tyr Pro Pro Glu Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Ser Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Ile Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 37 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 88 <400> 37 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Leu Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Met Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ile Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation          Osong Hi-Tech Medical Industry Promotion Foundation <120> Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life <130> HP7180 <160> 37 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMopac12-seq-Fw <400> 1 ccaggcttta cactttatgc 20 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-1-Rv <400> 2 cctcaggggt ccgggagatg wagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-2-Rv <400> 3 cctcaggggt ccgggagatk nbgagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-3-Rv <400> 4 cctcaggggt ccgggagatc cagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-Fw <400> 5 atctcccgga cccctgagg 19 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-1-Rv <400> 6 gtagtggttg tgcagagcct catggwacac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-2-Rv <400> 7 gtagtggttg tgcagagcct catgknbcac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-3-Rv <400> 8 gtagtggttg tgcagagcct catgccacac ggagcatgag aagacgttcc 50 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-frg3-Fw <400> 9 catgaggctc tgcacaacca ctac 24 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMopac12-seq-Rv <400> 10 ctgcccatgt tgacgattg 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 0-Rv <400> 11 gtccttgggt tttgggggga ag 22 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-1-Fw <400> 12 cttcccccca aaacccaagg acnnkctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 13 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-2-Fw <400> 13 cttcccccca aaacccaagg acaccnnkat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-3-Fw <400> 14 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gnnktcccgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 15 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-4-Fw <400> 15 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatcnnkcgg acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-5-Fw <400> 16 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctccnnk acccctgagg tcacatgcg 59 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 1-Rv <400> 17 gacggtgagg acgctgacc 19 <210> 18 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 2-1-Fw <400> 18 ggtcagcgtc ctcaccgtcn nkcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 2-2-Fw <400> 19 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcacnnkga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 20 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 2-3-Fw <400> 20 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggnnkaat ggcaaggagt acaagtgcaa 60 gg 62 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 2-Rv <400> 21 cacggagcat gagaagacgt tcc 23 <210> 22 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > Fc-Sub # 3-1-Fw <400> 22 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatn nkgctctgca caaccactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 23 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 3-2-Fw <400> 23 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctnnkca caaccactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 24 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 3-3-Fw <400> 24 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctctgca cnnkcactac acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 25 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Sub # 3-4-Fw <400> 25 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctctgca caaccacnnk acgcagaaga 60 gcctctccct g 71 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ep-Fc-Fw <400> 26 ccagccggcc atggcg 16 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ep-Fc-Rv <400> 27 gaattcggcc cccgaggccc c 21 <210> 28 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 29 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 30 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 3 <400> 30 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Arg His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 31 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 29 <400> 31 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 32 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc 41 <400> 32 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Gly His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 33 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 6 <400> 33 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Met Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Gln Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Asp Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Asp Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Ser Gly Lys 225 <210> 34 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 29 <400> 34 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Leu Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Gly     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 35 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 41 <400> 35 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Leu Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Asp Asn Asn Tyr Lys Thr Ala Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 36 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 82 <400> 36 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Tyr Pro Pro Glu Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Ser Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Ile Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 37 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EFc 88 <400> 37 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly   1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met              20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His          35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val      50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Leu Tyr Asn Ser Thr Tyr  65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly                  85 90 95 Lys Glu Tyr Met Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile             100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val         115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser     130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro                 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ile Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val             180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu         195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser     210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims (17)

인간 IgG 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 Fc 변이체는 야생형(wild type) 인간 IgG 항체 Fc 도메인에서 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른 P230Q 또는 P230S 아미노산 치환을 포함하며, 추가적으로 F243Y, K264E, N361S, N384I 및 M428L의 아미노산 치환 또는 Q295L, K320M, D356E, F405I 및 M428L의 아미노산 치환을 포함하여, 야생형과 비교하여 반감기(Half-life)가 증가된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
Wherein said Fc variant comprises a P230Q or P230S amino acid substitution according to the Kabat numbering system in a wild type human IgG antibody Fc domain and additionally comprises F243Y, K264E , The amino acid substitutions of N361S, N384I and M428L, or the amino acid substitutions of Q295L, K320M, D356E, F405I and M428L, as compared to the wild-type.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
An antibody comprising the polypeptide of claim 1.
제 7 항에 있어서 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
The method of claim 7, wherein the antibody is selected from the group consisting of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a minibody, a domain antibody, a bispecific antibody, an antibody mimetic, a chimeric antibody, an antibody conjugate, &Lt; / RTI &gt; or a fragment thereof.
제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
A nucleic acid molecule encoding the polypeptide of claim 1.
제 9 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
12. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 9.
제 10 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
11. A host cell comprising the vector of claim 10.
삭제delete 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
A method for producing a polypeptide comprising a human antibody Fc variant with increased half-life compared to a wild-type comprising the steps of:
a) culturing a host cell comprising a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the polypeptide of claim 1; And
b) recovering the polypeptide expressed by said host cell.
하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 항체의 제조방법:
a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
A method for producing an antibody having increased half-life as compared to a wild type comprising the steps of:
a) culturing a host cell expressing an antibody comprising the polypeptide of claim 1; And
b) purifying the antibody expressed from said host cell.
하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법:
a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 P230Q 또는 P230S의 아미노산 치환을 포함하며, 추가적으로 F243Y, K264E, N361S, N384I 및 M428L의 아미노산 치환 또는 Q295L, K320M, D356E, F405I 및 M428L의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.2에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.
A screening method for a polypeptide comprising an Fc variant with increased half-life compared to a wild-type comprising the steps of:
a) an Fc variant library comprising the amino acid substitutions of P230Q or P230S according to the cambator numbering system and additionally including amino acid substitutions of F243Y, K264E, N361S, N384I and M428L or amino acid substitutions of Q295L, K320M, D356E, F405I and M428L Building; And
b) selecting an Fc variant having a higher affinity for FcRn than the wild type at pH 5.6 to 6.2 among the Fc variants comprising said amino acid substitution.
삭제delete 삭제delete
KR1020170047822A 2017-04-07 2017-04-13 Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life KR101792191B1 (en)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170047822A KR101792191B1 (en) 2017-04-13 2017-04-13 Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life
CN201880023946.6A CN110691796B (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody FC variants for increasing blood half-life
JP2020504084A JP7264381B2 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody Fc variants for improved serum half-life
CA3120566A CA3120566C (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody fc variants for increased blood half-life
CA3059199A CA3059199C (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody fc variants for increased blood half-life
PCT/KR2018/004104 WO2018186717A1 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody fc variants for improving blood half-life
AU2018249796A AU2018249796B2 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody Fc variants for improving blood half-life
EP23211824.0A EP4342541A3 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody fc variants for increased blood half-life
US16/603,273 US11492415B2 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody Fc variants for increased blood half-life
EP18781667.3A EP3608339A4 (en) 2017-04-07 2018-04-06 Antibody fc variants for improving blood half-life
JP2021016775A JP7264383B2 (en) 2017-04-07 2021-02-04 Antibody Fc variants for improved serum half-life
US17/881,819 US20230061390A1 (en) 2017-04-07 2022-08-05 Antibody fc variants for increased blood half-life
JP2022125460A JP2022159401A (en) 2017-04-07 2022-08-05 Antibody fc variants for improving half-life in blood

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170047822A KR101792191B1 (en) 2017-04-13 2017-04-13 Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101792191B1 true KR101792191B1 (en) 2017-10-31

Family

ID=60301638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170047822A KR101792191B1 (en) 2017-04-07 2017-04-13 Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101792191B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11492415B2 (en) 2017-04-07 2022-11-08 Kookmin University Industry Academy Antibody Fc variants for increased blood half-life

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Frontiers in Immunology, Vol.6, article 39, pages 1-14 (2015)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11492415B2 (en) 2017-04-07 2022-11-08 Kookmin University Industry Academy Antibody Fc variants for increased blood half-life

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102207261B1 (en) Bispecific protein and methods of preparation thereof
WO2020088164A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
KR20200003845A (en) Bispecific Recombinant Protein and Its Application
JP7264383B2 (en) Antibody Fc variants for improved serum half-life
CN107484416A (en) Can be with reference to CD19 and CD3 bispecific unit price double antibody and application thereof
KR20190026684A (en) Compositions and methods for genetically engineered Fc constructs
EP4273167A1 (en) Anti-cldn18.2 antibody, and preparation method therefor and use thereof
KR101924485B1 (en) Antibody Fc variants for Prolonged Serum Half-Life
KR101957431B1 (en) Antibody Fc variants for Prolonged Serum Half-Life
KR101913743B1 (en) Antibody Fc variants for Prolonged Serum Half-Life
KR20210044218A (en) Compositions and methods related to CD38 targeting engineered Fc-antigen binding domain constructs
KR101900384B1 (en) Aglycosylated Antibody Fc Region Exhibiting Enhanced Binding Specificity to an Fcγ Receptor
KR101883886B1 (en) Aglycosylated Antibody Fc Region for Treating Cancer
KR101792205B1 (en) Antibody Fc variants for Prolonged Serum Persistence
KR101792191B1 (en) Antibody Fc variants for Extended Serum Half-life
KR101985863B1 (en) An Antibody Fc Variant for Enhancing ADCC Activity
GB2571036A (en) Aglycosylated antibody fc region for treating cancer
KR101872455B1 (en) Antibody Fc Region Comprising a New Mutation
KR20210042324A (en) Compositions and methods related to CCR4 targeting engineered Fc-antigen binding domain constructs
KR20210044783A (en) Compositions and methods related to CTLA-4 targeting engineered Fc-antigen binding domain constructs
WO2023208014A1 (en) Antibodies binding bcma and cd3 and uses thereof
WO2024094159A1 (en) Single domain antibody targeting human ror1
WO2024074145A1 (en) Bispecific antibody binding to baffr and cd3 and use thereof
KR20230041219A (en) Glycosylated Fc variants with improved binding selectivity to Fc gamma receptor IIIa
KR20230041218A (en) Glycosylated Fc variants with enhanced binding to Fc gamma receptor IIIa

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant