KR101788611B1 - 인간성장호르몬의 지속방출을 위한 약물전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간성장호르몬(hGH)이 탑재되어 있는 약물전달체에 관한 것으로, 본 발명의 약물전달체는, 산성조건에서 인간성장호르몬이 정전기적 인력으로 탑재(loading)되고, 인체 내 생리학적 조건에서 (pH 7.4, 37℃) 인간성장호르몬이 약물전달체와의 정전기적 인력을 상실하여 약물전달체로부터 탈착되는데, 탈착된 인간성장호르몬이 곧바로 방출되어 나오는 것이 아니라, 체온(37℃)으로 인해서 응축된 열 감응성 고분자 층을 통하여 서서히 지속 방출되어 나오는 특징이 있다.

Description

인간성장호르몬의 지속방출을 위한 약물전달체 {Drug delivery carrier for sustained release of human growth hormone}
본 발명은 인간성장호르몬(hGH)이 탑재되어 있는 약물전달체에 관한 것이다. 본 발명의 약물전달체는, 산성조건에서 인간성장호르몬이 정전기적 인력으로 탑재(loading)되고, 인체 내 생리학적 조건에서 (pH7.4, 37℃) 인간성장호르몬이 약물전달체와의 정전기적 인력을 상실하여 약물전달체로부터 탈착되는 특징이 있다. 또한, 본 발명의 약물전달체는, 탈착된 인간성장호르몬이 곧바로 방출되어 나오는 것이 아니라, 체온(37℃)으로 인해서 응축된 열 감응성 고분자 층을 통하여 인간성장호르몬이 서서히 확산되어 나오기 때문에, 수일에 걸쳐서 지속 방출되어 나오는 특징이 있다.
인간성장호르몬은 이것의 부족으로 인하여 발생하는 성장지연, 터너증후군, 성 염색체의 비정상, 만성신장부전에 대한 치료제로 사용된다 [Vance, M. L., Mauras, N. N. Engl . J. Med . 1999, 341, 1206-1216].
인간성장호르몬은 혈장으로부터 매우 빨리 소멸되기 때문에, 피하지방 주사를 통하여 매일 주사해야 한다. 하지만, 매일 주사함으로써 발생하는 환자의 낮은 순응도를 피하고, 의료비를 절감하기 위해서는, 인간성장호르몬이 지속적으로 꾸준히 방출되게 하고, 오랜 시간 동안 효능을 유지하게 하는 것이 필요하다.
이와 같은 필요를 충족시키기 위해 여러 가지 제형들이 개발되었는데, poly(lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA) 마이크로시피어, 히아룰로네이트 마이크로파티클 (hyaluronate microparticle), 수화겔이 지속형 방출 제형(sustained-release formulation) 등이 있었다 [Peschke, B., Zundel, M., Baka, S., Clausenb, T. R., Blumec, N., Pedersend, A., Zaragoza, F., Madsena, K. Bioorg . Med . Chem . 2007, 15, 4382-4395].
이중 처음으로 상용화된 지속형 제제는 인간성장호르몬이 탑재된 poly(lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA) 마이크로시피어 (상품명 Nutropin depot®)이었다 [Myler, H. A., McVav, S., Kratzsch, J. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2010, 61, 92-97.]. 다만, PLGA 마이크로스피어는, 인간성장호르몬이 초기에 많은 양 방출되고, 변성된다고도 알려져 있으며, 가격이 너무 높아, 더 이상 판매되고 있지 않다.
한편, 인간성장호르몬이 탑재된 히아룰로네이트 마이크로파티클 (hyaluronate microparticle)은 1주일에 한 번 주사하는 지속형 방출 제형으로 개발되었는데, 현재 유일하게 판매되고 있는 지속 방출형 제제이다 [Capan, Y., Jiang, G., Giovagnoli, S., Na, Y. H., Deluca, P. P. AAPS PHARMSCITECH . 2003, 4, 147-156]. 히아룰로네이트 마이크로파티클이 PLGA 마이크로스피어보다 더 많은 약을 탑재하고, 더 많은 생체이용률을 나타낸다고 보고되었으나, 히아룰로네이트 마이크로파티클은 시노몰거스 몽키 (cynomolgus monkey)에서 성장호르몬의 혈중농도를 단지 30시간 동안만 유지하였다고 보고된 바가 있었다 [Kim, H. K., Park, T. G. Int . J. Pharm . 2001, 229, 107-116]. 따라서, 인간성장호르몬을 실질적으로 오랜 시간 동안 서서히 방출할 수 있는 약물전달체를 새롭게 개발할 필요가 있는 것이다.
대한민국 특허공개번호 제10-2005-0023875호 (공개일자 2005.03.10)에는, 인간성장호르몬 (human growth hormone, hGH)의 안정화된 액상 제제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 1 내지 10 ㎎/㎖의 인간성장호르몬, 5 내지 100 mM의 완충제, 5 내지 100 ㎎/㎖의 등장제 및 0.001 내지 20 ㎎/㎖의 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)을 유효성분으로 함유하는 인간성장호르몬의 안정화된 액상 제제용 조성물이 기재되어 있다.
본 발명은 인간성장호르몬을 쉽게 탑재할 수 있고, 인체 내에서 실질적으로 오랜 시간 동안 서서히 방출할 수 있는, 약물전달체를 새롭게 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 제1형태로, 알지네이트-신남산(Al-Ci) 결합체 및 플루로닉 F127-신남산(Pl-Ci) 결합체가 신남산을 매개로 하여 상호 결합되어 있는 약물전달체의 내부에 인간성장호르몬이 탑재되어 있는 것을 특징으로 하는 인간성장호르몬 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 제2형태로, 알지네이트-신남산(Al-Ci) 결합체, 플루로닉 F127-신남산(Pl-Ci) 결합체 및, 폴리에틸렌글리콜-신남산(PEG-Ci) 결합체가 신남산을 매개로 하여 상호 결합되어 있는 약물전달체의 내부에 인간성장호르몬이 탑재되어 있는 것을 특징으로 하는 인간성장호르몬 약물전달체를 제공한다.
한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 신남산을 매개로 하는 결합은, 바람직하게 신남산의 이량화(dimerization)에 의해 발생하는 것일 수 있다. 이때, 상기 이량화는, 일 예로, 자외선에 의해 수행된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 인간성장호르몬 약물전달체는, 바람직하게 탑재된 인간성장호르몬을 생체 내에서 외부로 방출할 수 있다. 이때, 상기 약물전달체는 바람직하게 탑재된 단백질을 서방형으로 방출할 수 있다.
한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 알지네이트-신남산(Al-Ci) 결합체는, 바람직하게 신남산의 카르복실기와 알지네이트의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 플루로닉 F127-신남산(Pl-Ci) 결합체는, 바람직하게 신남산의 카르복실기와 플루로닉(pluronic) F127의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜-신남산(PEG-Ci) 결합체는, 바람직하게 신남산의 카르복실기와 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것일 수 있다.
본 발명의 인간성장호르몬의 지속 방출을 위한 약물전달체는, 산성조건에서 정정기적 인력을 이용하여 인간성장호르몬을 능동적으로 탑재시키고, 인체 내 조건에서(pH 7.4, 37 ℃) 인간성장호르몬을 서방형으로 지속 방출시키는 효과를 발휘한다.
도 1은 플루로닉 F127(A), CinPlu (B), 폴리에틸렌 글리콜 (C), CinPEG (D), 알지네이트(E), CinAlg(F)의 DSC 곡선이다.
도 2는 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) (●), CinAlPlPe NG(1/1/1) (○), CinAlPlPe NG(1/2/1) (▼), CinAlPlPe NG(1/3/1) (△) 약물 전달체에 포함된 신남산(CA) 잔기의 광이량화 정도이다.
도 3은 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) (A), CinAlPlPe NG(1/1/1) (B), CinAlPlPe NG(1/2/1) (C), CinAlPlPe NG(1/3/1) (D) 약물 전달체의 TEM 사진이다.
도 4는 37 ℃에서 48시간 동안 혈장에 보관한 후 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1)약물전달체 (A)와 자외선을 조사한 CinAlPlPe NG (1/1/1)약물전달체 (B)의 TEM 사진이다.
도 5는 37 ℃에서 48시간 동안 DOC 수용액(1mM)에 보관 후 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체 (A)와 자외선을 조사한 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체(B)의 TEM 사진이다.
도 6은 자외선으로 처리한 약물전달체 (CinAlPlPe NG(1/0.5/1) (△), CinAlPlPe NG(1/1/1) (▼), CinAlPlPe NG(1/2/1) (○), CinAlPlPe NG(1/3/1) (●))의 제타포텐셜을 pH 3~9 범위에서 측정한 결과이고 (도 6에서 A), pH 3~9 범위에서 측정한 hGH의 제타 포텐셜이다 (도 6에서 B).
도 7은 37 ℃로, pH 3.0 (●), pH 5.0 (○), pH 7.4 (▼), pH 9.0 (△)에서 170시간 동안 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) (panel A), CinAlPlPe NG(1/1/1) (panel B), CinAlPlPe NG(1/2/1) (panel C), CinAlPlPe NG(1/3/1) (panel D) 약물전달체로부터 방출되어 나오는 인간성장호르몬의 방출 프로필이다.
본 발명에서는 인간성장호르몬을 탑재하고자, 알지네이트(alginate), 플루로닉(Pluronic) F127, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)로 구성된 약물전달체를 개발하였다.
신남산(cinnamic acid, CA)은 광 이량화(photo-dimerization)가 가능한 소수성 화합물이다. 신남산의 카르복실기와 상기 각각의 고분자 수산기 사이의 축합반응으로, 신남산을 각각의 고분자에 공유결합시켜, 시나모일 알지네이트 (cinnamoyl alginate, CinAlg), 시나모일 플루로닉 F127 (cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu), 시나모일 폴리에틸렌글리콜 (cinnamoyl polyethylene glycol, CinPEG)을 합성하였다.
신남산을 수용성 고분자와 컨쥬게이션(conjugation)시키면, 신남산의 페닐 그룹 때문에, 양친매성 고분자(amphiphilic polymer)를 제조할 수 있다. 이와 같이 제조된 CinAlg, CinPEG, CinPlu가 수상에 함께 분산되면, 신남산 잔기들의 소수성 상호작용으로 인해, 고분자들은 입자형태의 약물전달체를 형성한다. 이후, UV를 조사하면, 신남산 잔기는 이량화(dimerization)되고, 약물전달체를 구성하는 고분자 사슬들은 화학적으로 결합된다.
한편, 인간성장호르몬을 상기에서 제조한 약물전달체에 탑재시킬 때, 성장호르몬과 CinAlg 사이의 정전기적 인력을 이용하여 탑재되는 양을 최대화하였다. 이를 위하여 약물전달체가 현탁되어 있는 수상 미디엄의 pH 값은 성장호르몬의 pI값보다 낮게 유지하였다. 그리고, 약물전달체가 현탁되어 있는 수상 미디엄의 온도는 플루로닉 F127의 겔화 온도(gelation temperature)보다 낮게 유지하여, 온도 감응성 고분자 사슬들이 팽창된 형태를 취하도록 하였다. 이렇게 함으로써, 인간성장호르몬이 약물전달체의 CinAlg에 쉽게 접근할 수 있도록 하였다.
상기와 같이 제조된 약물전달체를 인체에 주사하면, 인체의 pH 조건에서 (약 pH 7.4), 인간성장호르몬은 음전하를 띠게 되고, CinAlg 사슬로부터 탈착된다. 동시에, 플루로닉 F127 사슬들은 체온으로 인하여 열적으로 수축되어 응축된 층을 형성함으로써, 탈착된 성장호르몬의 방출을 지연시킨다. 결과적으로, 열적으로 응축된 고분자층은 성장호르몬을 지속적으로 방출시키는 역할을 하는 것이다.
한편, 폴리에틸렌 글리콜은 혈장 단백질들이 본 발명의 약물 전달체에 흡착하는 것을 방지하여 약물 전달체가 장기간 동안 혈액 내를 순환하는 것을 도와 준다. 하기 참고도 1은 약물전달체로부터 인간성장호르몬이 방출되는 원리이다.
[참고도 1]
Figure 112015099329811-pat00001
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 알지네이트 -CA 결합체 ( CinAlg ) 제조]
DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 용해되어 있는 술폰산 (sulfonic acid) 용액(2.86% w/v) 35 ml을 둥근 플라스크(250 ml, 2-neck)에 넣고 여기에 알지네이트 2 g을 용해시켰다. 혼합용액을 55 ℃로 맞춰진 실리콘 오일 유조 (silicone bath)에서 가열시켰다.
한편, 20 ml 유리병에서 1 ml의 피리딘을 5 ml의 DMSO와 혼합시킨 후 3.6 g의 시나모일 클로라이드 (cinnamoyl chloride)를 혼합용매에 용해시켰다. 시나모일 클로라이드 용액을 주사기를 이용하여 알지네이트 용액에 적하(dropping)시키고, 시나모일 클로라이드와 알지네이트의 결합 반응을 72 시간 동안 85 ℃에서 교반하고 환류시키면서 진행시켰다.
생성물(CinAlg)을 에탄올에서 침전시켰고, 정제하기 위하여 용해시킨 후 재 침전시켰다. 여과하여 침전물을 수거하였고 침전물을 40 ℃로 맞추어진 오븐에서 건조하였다.
CinAlg를 D2O에 용해시킨 후 CinAlg의 1H NMR 스펙트럼을 'Bruker Avance 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany, l℃ated in the Central Laboratory of Kangwon National University)'에서 얻었다.
CinAlg의 1H NMR 스펙트럼에서, 피라노스 프로톤((pyranose proton) 신호는 3.6 ppm - 4.2 ppm에서 관찰되었고, 시나모일 프로톤 (cinnamoyl proton) 신호는 6.4 ppm과 7.6 ppm에서 관찰되었다.
피라노스 프로톤 신호의 면적과 시나모일 프로톤 신호의 면적을 이용하여 계산한 결과에 의하면, 'pyranose unit / cinnamoyl residue'의 몰비는 1:0.09이었고, 이것은 피라노스 11.1개당 하나의 시나모일 그룹이 결합되어 있는 것에 해당한다.
[ 실시예 2: 플루로닉 F127-CA 결합체 ( CinPlu ) 제조]
5 g의 플루로닉 F127 (0.4 mmol)과 0.14 ml의 트리에틸아민 (1.0 mmol)을 200 ml 둥근 바닥 플라스크에 담겨져 있는 100 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 후 이를 얼음 수조에 담궜다. 0.27 g의 시나모일 클로라이드 (cinnamoyl chloride, 1.6 mmol)를 상기 혼합용액에 첨가한 다음, 얼음 수조에서 12시간 동안 교반하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응이 종결된 후, 혼합물을 2L의 디에틸에테르에 부어서 생성물(cinnamoyl Pluronic, Cin-Plu)을 침전시켰다. 여과하여 침전물을 수거하였고, 40 ℃로 유지되고 있는 오븐에서 건조하였다.
디메틸설폭사이드를 용매로 사용하여 건조된 Cin-Plu를 용해시키고, 1H NMR 스펙트럼을 'Bruker Avance 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany)'에서 얻었다.
시나모일 프로톤 (cinnamoyl proton)의 신호는 6.65-7.73 ppm 범위에서 관찰되었고, 신남산 잔기의 =CH-CO-의 신호는 6.65 ppm에서 관찰되었다. 신남산 잔기의 아로마틱 프로톤의 신호는 7.44 ppm과 7.73 ppm에서 관찰되었고, 신남산 잔기의 -C-CH= 신호는 7.65 ppm에서 관찰되었다.
한편, 폴리(폴리프로필렌 옥사이드) 블록 {poly(propylene oxide) block}의 메틸 프로톤의 신호는 1.05 ppm에서 관찰되었다. 시나모일 프로톤 면적과 메틸 프로톤 신호의 면적을 이용하여 계산한 결과, 프루로닉 F-127 (Pluronic F-127):시나모일 그룹 (cinnamoyl group)의 몰비가 1:1.4로 계산되었다.
[ 실시예 3: PEG- CA결합체 ( CinPEG ) 제조]
PEG (5 g, 0.6 mmol)과 트리에틸아민(triethylamine, 0.14 g, 1.0 mmol)을 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 담겨져 있는 100 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 그리고, 시나모일 클로라이드 (cinnamoyl chloride, 0.3 g, 1.8 mmol)를 상기 PEG 용액에 첨가하였다.
공유결합반응을 위해서 반응 혼합물을 12시간 동안 얼음 배스에서 교반시키고, 상온에서 12시간 동안 교반시켰다. PEG-CA 컨쥬게이트 (CinPEG)를 침전시키기 위하여, 반응 혼합물을 1000 ml 비이커에 담겨져 있는 디메틸 에스테르(700 ml)에 부었다.
침전물을 여과지(Whatman, No. 2)로 걸러서, 55 ℃로 온도가 맞추어진 오븐에서 건조시켰다. 건조된 CinPEG를 CDCl3에 용해시키고, 1H NMR 스펙트럼을 'Bruker Avance 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany, installed in the Central Laboratory of Kangwon National University)'에서 얻었다.
CA의 프로톤 신호는 6.4 ppm - 7.9 ppm에서 발견되었고, PEG의 에틸렌 프로톤 신호는 3.7 ppm에서 발견되었다. 신호의 면적을 이용하여 CA잔기에 대한 PEG사슬의 몰비가 1:0.68로 계산되었다.
[ 실시예 4: CinAlg , CinPlu , CinPEG의 시차주사열량분석 연구]
알지네이트, CinAlg, 플루로닉 F127, CinPlu, 폴릭(에틸렌 글리콜), CinPEG를 40℃로 맞춰진 진공오븐에서 건조시켰다. 건조 시료들 각각을 알루미늄 팬에 넣고 프레스 (Tzero, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 이용하여 알루미늄 팬을 밀봉하였다. 시료를 담고 있는 팬을 시처주사열량분석기(differential scanning calorimeter, DSC Q2000, TA Instruments, New Castle, DE, USA)에 장착시키고, 20-80 ℃ 범위에서 2 ℃/min 속도로 가열하여 DSC 곡선을 얻었다.
도 1은 플루로닉 F127, CinPlu, poly(ethylene glycol), CinPEG, 알지네이트, CinAlg의 DSC 곡선이다.
플루로닉 F127는 54 ℃ 근처에서 흡열 피크를 나타내었는데, 이것은 플루로닉 F127의 용융에 의한 피크이다. CinPlu는 43 ℃ 근방에서 흡열 피크를 나타내었고, 이것은 플루로닉 F127의 피크의 위치보다 약 10 ℃ 정도 더 낮았다. CA 잔기들은 소수성 상호작용으로 미세 영역 (microdomains)을 형성하고, 이것이 폴리(프로필렌 옥사이드) 소수성 블록의 결정구조를 방해하여 CinPlu 융점이 Plu융점보다 낮은 것이다.
PEG는 61.5 ℃ 부근에서 흡열 피크를 나타내었고, 이것은 PEG의 용융에 의한 피크이다. CinPEG는 61 ℃ 부근에서 흡열피크를 나타내었고, PEG의 피크위치와 거의 같았다. CA잔기는 소수성 인력으로 미세영역을 형성하지만, 소수성 미세영역은 친수성 PEG사슬과 거의 상호작용하지 않는다. 이와 같은 이유 때문에 CA 잔기는 PEG의 용융점에 영향을 끼치지 않는다.
한편, 알지네이트와 CinAlg는 시험온도 범위에서(20-80 ℃) 피크를 나타내지 않았는데, 알지네이트의 융점은 300 ℃보다 높기 때문이다.
[ 실시예 5: CinAlg / CinPlu / CinPEG로 구성된 약물전달체 제조]
50 mg의 CinAlg, 변하는 양의 CinPlu, 그리고 50 mg의 CinPEG를 10 ml 바이알(vial)에 담겨져 있는 4ml의 글리신 버퍼 용액 (glycine buffer solution, 30 mM, pH 3.0)에 함께 용해시켜서 CinAlg/CinPlu/CinPEG의 질량비가 1/0.5/1, 1/1/1, 1/2/1, 그리고 1/3/1이 되게 하였다.
CinAlg/CinPlu/CinPEG의 질량비가 1/0.5/1, 1/1/1, 1/2/1, 그리고 1/3/1인 약물 전달체를 편의상 각각 CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), 그리고 CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체라고 명명하였다.
CinAlPlPe 약물전달체에 함유되어있는 CA잔기를 광이량화(photo-dimerization)하기 위해서, 약물전달체 현탁액에 UV(365nm, 400W)를 1시간 동안 조사시켜 주었다. CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체 현탁액을 증류수로 희석하여 CA잔기의 농도가 0.05 % (w/v)가 되게 하였다. UV (365 nm, 400 W)를 10 ml 바이알에 담겨져 있는 5ml 약물전달체 현탁액에 조사하였다. 이량화(dimerization)의 정도는 다음 식으로 계산되었다.
[수학식 1]
Dimerization (%) = (1 - At/A0) × 100 %
상기 수학식 1에서 A0는 약물전달체 현탁액을 자외선으로 조사하기 전에 275nm에서 측정한 흡광도이고, At는 약물전달체 현탁액을 주어진 기간 동안 자외선을 조사한 후에 275nm에서 측정한 흡광도이다. 이후의 실시예들에서 사용한 약물전달체들은 60분 동안 UV를 조사하여 처리한 약물전달체이다.
도 2은 CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물 전달체에 포함된 CA잔기의 광이량화 정도이다. 이량화 정도는 초기 5분 동안의 자외선조사 기간 동안 빠르게 증가하였고, 그 다음 조사 나머지 기간 동안 천천히 증가하였다. CA는 자외선 조사에 의해서 광 가교되고, 형성된 이량체(dimer)는 자외선 조사에 의해서 광 분해(photo-clevage)되기도 한다.
자외선 조사 초기 단계에서는 CA잔기 단량체가 이량체보다 비교적 많이 존재하기 때문에 초기단계에서는 이량화가 지배적이고 이량화 정도가 빠르게 증가한다. 자외선 조사가 계속 진행될수록, 이량체의 양은 증가하여 광분해 속도가 광이량화 속도와 동일해지는 평형상태에 도달한다. 이러한 이유 때문에, 도 2에서와 같이 광이량화 정도가 자외선 조사 시간에 따라서 포화적으로 증가하는 것이다.
약물전달체의 TEM 사진들을 네가티브 스테이닝 기술 (negative staining technique)을 이용하여 촬영하였다. 약물전달체 현탁액을 포스포텅스텐산 (phosphotungstic acid) 용액 (2% (w/v))과 동일한 부피로 혼합하여 상온에서 2시간 동안 약물전달체를 염색하였다. 그리고 나서, 염색된 약물전달체 현탁액을 포름바/쿠퍼 코팅 그리드 (formvar/copper-coated grid, 200 mesh)에 침적시킨 후, 48시간 동안 상온에서 자연 건조하였다. 염색된 약물전달체의 TEM 사진을 'tansmission electron microscope (LEO 912AB OMEGA, Germany, installed in Korea Basic Science Institute, Chuncheon, Republic of Korea)'을 이용하여 촬영하였다.
도 3는 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물 전달체의 TEM 사진이다. 거의 구형에 가까운 입자가 관찰되었고, 직경은 50-150 nm이었다.
CA는 소수성 화합물이고, 친수성 고분자와 결합하면 양친매성 분자(amphiphiles)가 형성된다. CA와 친수성 고분자의 결합체인 CinAlg, CinPlu, CinPEG 가 수상에 분산되면, CA잔기들 사이의 소수성 상호작용으로 회합체(약물전달체)가 형성된다.
본 발명에서 사용된 알지네이트는 고 분자량이고(MW 10,000-600,000), 평균 분자량이 300,000이라고 가정할 때, 하나의 알지네이트 분자는 153개의 CA잔기들을 가지고 있어, CinAlg는 약물전달체의 골격(backbone)이 될 수 있다.
이와 같은 상황에서, CA잔기들 사이의 소수성 상호작용으로 인하여 CinPEG와 CinPlu는 CinAlg의 골격을 따라 CinAlg와 회합할 수 있다. 자외선을 조사한 약물전달체의 모양과 크기는 자외선을 조사하지 않은 약물전달체의 모양과 크기와 크게 다르지 않았는데, 약물 전달체의 CA 잔기들은 자외선을 조사하면 용이하게 이량화되었다(도 2).
광 이량화되면 CA잔기들 사이에서 사이클로부탄 다리(cyclobutane bridge)가 형성된다. 소수성 상호인력으로 이미 접촉하고 있는 두 개의 CA잔기들 사이에서 사이클로 부탄 다리가 형성되기 때문에, 자외선 조사는 약물전달체의 크기와 모양에는 거의 영향을 미치지 못하는 것이다.
CinAlg에서 알지네이트에 대한 CA의 몰비는 1:153이었고, CinPlu에서 플루로닉 F127에 대한 CA의 몰비는 1:1.4이었으며, CinPEG에서 PEG에 대한 CA의 몰비는 1:0.68이었다.
따라서, CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물 전달체를 구성하고 있는 CinAlg/CinPlu/CinPEG에 함유되어 있는 CA 잔기의 몰비는 각각 4.7:0.55:1.23, 4.7:1.10:1.23, 4.7:2.20:1.23, 그리고 4.7:3.30:1.23로 계산되었다. 약물전달체를 제조할 때 사용한 CinAlg/CinPlu/CinPEG 무게비가 무엇이든 상관없이, CinAlg에 함유된 CA잔기의 수는 CinPlu에 함유된 CA잔기 수와 CinPEG에 함유된 CA잔기의 수의 합보다 더 컸다.
따라서, CinAlg에 함유된 CA잔기가 CinPlu에 함유된 CA잔기와 CinPEG에 함유된 CA잔기와 1:1몰비로 상호작용한다면, CinAlg 분자들은 CinPlu 분자들과 CinPEG 분자들 모두를 수용할 수 있다. 그리고, 알지네이트를 플루로닉 F127와 PEG와 회합시키는 모든 CA잔기들은 광 이량화에 참여한다. 하지만, 같은 종류의 두 분자 사이에서 발생하는 이량화, CinPlu와 CinPEG 사이에서 발생하는 이량화, 각각의 결합체(CinAlg, CinPlu, CinPEG)의 한 분자 내부에서 발생하는 이량화도 발생할 수 있다.
요약하자면, CA잔기들이 광 이량화가 되든지 또는 되지 않든지에 상관없이 그리고 광 이량화가 분자 내부에서 발생하든지 분자들 사이에서 발생하든지 상관없이, CinAlg, CinPlu, 그리고 CinPEG는 CA잔기의 소수성 상호작용을 통하여 서로 함께 화합하여 약물전달체를 형성할 수 있는 것이다.
[ 실시예 6: 혈장과 담즙산 염 용액에서 약물 전달체의 안정성]
자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물 전달체 현탁액(1 %) 0.1 ml 과 자외선을 조사하여 처리한 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물 전달체 현탁액(1 %) 0.1 ml 각각을 10 ml 유리병에 담겨져 있는 2.9 ml 혈장에 첨가하였다.
한편, 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물 전달체 현탁액(1 %) 0.1 ml 과 자외선을 조사하여 처리한 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물 전달체 현탁액(1 %) 0.1 ml 각각을 10 ml 유리병에 담겨져 있는 2.9 ml 데옥시콜레이트(deoxycholate, DOC) 수용액 (1 mM과 10 mM)에 첨가하였다.
유리병을 37 ℃에서 48 h시간 동안 'roller mixer (205RM, Hwashin Technology Co., Seoul, Korea)'에서 롤링한 다음, CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체의 온전성(integrity)을 TEM에서 관찰하였다.
도 4는 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체와 자외선을 조사한 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체를 37 ℃에서 48 시간 동안 혈장에 보관한 후의 TEM 사진이다.
약물 전달체는 자외선 조사 여부와 관계없이 안정하게 자신의 구조를 유지하였다. 혈장 단백질은 약물전달체에 흡착되어 약물 전달체의 구조를 파괴할 수 있다. 하지만, 약물전달체에 함유되어 있는 PEG 사슬이 혈장단백질의 흡착을 방지하여 약물전달체를 안정화시킨다. PEG는 유연하고 스프링역할을 하여 혈장단백질 흡작을 방지할 수 있다.
도 5는 자외선을 조사하지 않은 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체와 자외선을 조사한 CinAlPlPe NG (1/1/1) 약물전달체를 37 ℃에서 48 시간 동안 데옥시콜레이트 (DOC) 수용액(1mM)에 보관 후의 TEM사진이다.
약물전달체가 자외선으로 처리되지 않았을 때는 작고 온전성이 저해된 입자들이 관찰되었다. 약물전달체는 고분자 컨쥬게이트(CinAlg, CinPlu, CinPEG)의 CA잔기들 사이에서 발생하는 소수성 상호작용으로 인하여 생성된다. DOC는 담즙에 포함된 생체 계면활성제의 일종이고, 따라서 CA잔기들 상이의 소수성 상호작용을 방해한다. 그 결과로 인하여, 약물전달체는 고분자 컨쥬게이트와 DOC 분자로 구성된 혼합미셀(mixed micelle)로 변성된다.
한편, 약물전달체가 자외선 조사로 처리되었을 때는 크기와 구조의 온전성이 유지되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 약물전달체의 AC 잔기들은 자외선 조사로 인하여 쉽게 광이량화 될 수 있다. 따라서, 약물전달체를 구성하고 있는 고분자 컨쥬게이트(CinAlg, CinPlu, CinPEG)는 화학적으로 서로 결합될 것이다. 이와 같은 상황에서, 자외선을 조사한 약물전달체는 담즙에 포함된 생체 계면활성제인 DOC에 의해서 파괴되기 어렵다. 자외선으로 처리한 약물전달체는 심지어 10 mM이라는 고 농도의 DOC 용액에 보관되었더라도, 크기와 구조의 온전성을 유지하였지만, 자외선으로 전처리하지 않은 약물전달체는 DOC 용액에서 해체되었다.
[ 실시예 7. 약물전달체의 크기와 표면전하 측정]
약물 전달체의 표면전하를 상온에서 pH 3.0-9.0 범위에서 'dynamic light scattering equipment (ZetaPlus 90, Brookhaven Instrument Co, NY, USA)'를 이용하여 측정하였다. 미디움의 pH 값이 pH 3.0, pH 4.0, pH 9.0일 때는 글리신 버퍼를 사용하였고, pH 값이 pH 5.0, pH 6.0일 때는, MES 버퍼를 사용하였다. pH 값이 pH 7.0, pH 8.0일 때는 PBS 버퍼를 사용하였다.
도 6의 (A)는 자외선으로 처리한 약물전달체 (CinAlPlPe NG(1/0.5/1), CinAlPlPe NG(1/1/1), CinAlPlPe NG(1/2/1), CinAlPlPe NG(1/3/1))의 제타포텐셜을 pH 3-9 범위에서 측정한 결과이다. 제타 포텐셜은 측정한 pH 값 범위에서 모두 음의 값이었는데, 이것은 알지네이트의 카르복실레이트가 영구적인 마이너스 전하를 가지기 때문이다.
제타 포텐셜의 절대값은 pH 값이 증가할수록 증가하였는데, 알지네이트의 카르복실산은 pH 값이 증가하면 탈 양성자화(deprotonation)하기 때문이다.
비 이온성 고분자 사슬인 플루로닉 F127 사슬과 PEG 사슬은, 알지네이트 사슬의 음전하를 차폐할 수 있고, 차폐효과(shielding effect)는 비 이온성 고분자의 함량이 높을수록 높을 것이다.
도 6의 (B)는 pH 3-9 범위에서 측정한 hGH의 제타 포텐셜이다. pH 값이 pH 3.0에서 pH 9.0으로 증가할 때, 제타 포텐셜은 + 30 mV 에서 -55 mV까지 감소하였다. 등전점은 pH 5.0 부근에서 관찰되었다.
[ 실시예 8: 약물전달체에 인간성장호르몬 탑재]
인간성장호르몬 5 mg을 1 ml의 글리신 버퍼 용액(30 mM, pH 3.0)에 용해시켰다. 이 인간성장호르몬 용액 1ml을 약물전달체 현탁액(3 %, w/v) 4 ml에 첨가하였다. 인간성장호르몬과 약물전달체를 상호작용시키기 위하여, 인간성장호르몬과 약물전달체의 혼합물을 4 ℃에서 24 시간 동안 교반시켰다.
탑재되지 않은 인간성장호르몬을 제거하기 위하여, 약물전달체 현탁액 5 ml을 투석 주머니 (MWCO 100,000)에 집어넣고, 투석주머니를 다시 글리신 버퍼 용액 (30 mM, pH 3.0) 500 ml에 집어넣은 후 인간성장호르몬이 투석 주머니 밖으로 더 이상 빠져나오지 않을 때까지 투석하였다. 투석기간 동안 투석액을 새로운 완충용액으로 두 번 교체하였다.
CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/1/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/2/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체에서 인간성장호르몬의 비 탑재율 (specific loading, 약물전달체 무게에 대하여 탑재된 인간성장호르몬 무게의 백분율)은 각각 3.83 %, 3.10 %, 2.4 %, 1.8 % 이었다.
CinPlu의 함량이 증가할수록 인간성장호르몬의 비 탑재량은 감소하였다. 인간성장호르몬이 약물전달체에 탑재된 조건인 pH 3.0에서 약물전달체의 제타포텐셜은 약물전달체의 조성에 따라서 -17 mV - -24 mV 이었고 (도 6의 A), 인간성장호르몬의 제타포텐셜은 + 30 mV이었다 (도 6의 B). 따라서, 인간성장호르몬은 정전기적 인력으로 약물전달체에 탑재되는 것을 확인할 수 있었다.
약물전달체의 음의 제타포텐셜 절대값은 CinPlu의 함량이 높을수록 낮았다. (도 6의 A). 예를 들면, pH 3에서 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/1/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/2/1) 약물전달체, CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체의 제타 포텐셜은 각각 -24 mV, -22.5 mV, -20 mV, -17 mV 이었다.
따라서, CinPlu의 함량이 높을수록 인간성장호르몬과 약물전달체 사이의 정전기적인력은 더욱 불리해진다. 이러한 이유 때문에 비 탑재량이 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체 > CinAlPlPe NG(1/1/1) 약물전달체 > CinAlPlPe NG(1/2/1) 약물전달체 > CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체 순서로 크게 나타났다.
[ 실시예 9: 약물전달체로부터 인간성장호르몬의 방출]
인간성장호르몬이 탑재된 약물전달체 현탁액 (3 %, w/v, glycine buffer (pH 3.0)) 1 ml을 투석주머니(MWCO 100,000)에 넣고, 투석주머니를 50 ml 코니칼 튜브 (conical tube)에 담겨져 있는 40 ml 완충용액(pH 3.0, pH 5.0, pH 7.4, pH 9.0)에 넣은 후 투석하였다.
투석용액을 37 ℃에서 7일 동안 교반하였고, 특정시간에서 일정량의 투석액(0.2 ml)을 취하여 투석막을 빠져나온 인간성장호르몬 양을 정량하였다. 인간성장호르몬의 양은 인간성장호르몬 정량용 kit(R&D System Elisa)를 사용하여 측정하였다.
도 7 (A)는 37 ℃에서 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.4, pH 9.0에서 170시간 동안 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체로부터 방출되어 나오는 인간성장호르몬의 방출 프로필이다.
방출 미디움의 pH 값이 3.0 과 5.0일 때, 방출속도는 아주 느려서 방출정도는 170시간 동안 10%보다 적었다. 방출 미디움의 pH값이 7.4일 때, 방출속도는 초기 24시간 동안 높았고, 그 이후 방출속도는 비교적 낮았다. 그리고 170시간 동안 방출 정도는 약 45%이었는데, 이 값은 산성조건에서 (pH 3.0과 pH 5.0) 관찰된 방출 %보다 훨씬 높은 것이다. pH 9.0에서 비슷한 방출 프로필이 관찰되었고, 방출 정도는 낮은 pH 값들에서 더 높았다.
산성조건에서(pH 3.0과 pH 5.0), 인간성장호르몬은 양전하를 가질 것이고 (왜냐하면, 인간성장호르몬의 등전점은 pH 5.0이기 때문이다), 따라서 인간성장호르몬은 음전하를 띠는 알지네이트와 정전기적 인력으로 상호작용할 것이다.
한편, pH 값이 7.4와 9일 때, 인간성장호르몬은 음전하를 띨 것이고, 따라서 음전하를 띠는 알지네이트와 상호작용하지 않을 것이다. 이러한 이유 때문에 pH 7.4와 pH 9에서의 방출 정도가 산성에서의 방출 정도보다 훨씬 높은 것이다.
CinAlPlPe NG(1/1/1)약물전달체, CinAlPlPe NG(1/2/1)약물전달체, CinAlPlPe NG(1/3/1)약물전달체의 pH 의존성 인간성장호르몬 방출프로필 패턴은 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체의 패턴과 유사하였다 (도 7 (B), 도 7 (C), 도 7 (D)).
그러나, 초기 방출 정도는 CinPlu 함량이 증가할수록 억제되었다. 다시 말하면, 약물전달체의 CinPlu 함량이 낮을 때 (즉, CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체를 사용할 때), 방출은 1차 방출 (1st order release)과 유사하였고, CinPlu함량이 증가할수록 방출은 0차 방출(zero order rekease)에 근접하였다. 실제로, pH 7.4와 pH 9에서 CinAlPlPe NG(1/3/1) 약물전달체의 방출곡선의 초기 기울기는 동일한 pH값들에서 CinAlPlPe NG(1/0.5/1) 약물전달체의 초기 기울기보다 훨씬 적었다.
방출 프로필(release profile)들은 37 ℃에서 관찰하여 얻어졌고, 37 ℃에서 플루로닉 F127 사슬들은 열적 탈수화(thermal dehydration)와 수축(collapse)으로 응축된 층(condensed layer)을 형성한다. 이와 같은 상황에서, 인간성장호르몬은 응축된 층에 의해서 갇힐 수 있다. CinPlu의 함량이 증가할수록, 응축된 층이 더 많이 형성되고 초기 방출 정도는 더 많이 억제된다. 게다가, 인간성장호르몬의 소수성 영역은 열적으로 소수화된(thermally hydrophobicized) 플루로닉 F127 사슬들과 상호작용하고, 그 소수성 상호작용은 플루로닉 F127의 함량이 증가할수록 강해진다. 이러한 이유들 때문에 초기 방출 정도가 CinPlu 함량이 증가할수록 억제되는 것이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 알지네이트-신남산(Al-Ci) 결합체, 플루로닉 F127-신남산(Pl-Ci) 결합체 및 폴리에틸렌 글리콜-신남산(PEG-Ci) 결합체를 1 : 0.5 : 1 의 질량비로 수상에 분산시킴으로써, 신남산 잔기들 사이의 소수성 상호 작용으로 회합체를 형성시키는 단계 (A);
    단계 (A)후, 회합체에 자외선을 조사하여 신남산 잔기를 광이량화시킴으로써, 신남산을 매개로 상호결합된 약물전달체를 제조하는 단계 (B); 및
    단계 (B)후, pH 3.0, 4℃의 조건에서 상기 약물전달체에 인간성장호르몬을 탑재시키는 단계 (C);를 포함하며,
    상기 탑재된 인간성장호르몬은 생체 내에서 서방형으로 방출되는 것을 특징으로 하는 서방형 인간성장호르몬 약물전달체의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서,
    상기 인간성장호르몬은,
    등전점이 pH 5.0인 것을 특징으로 하는 서방형 인간성장호르몬 약물전달체의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제2항에 있어서,
    상기 알지네이트-신남산(Al-Ci) 결합체는,
    신남산의 카르복실기와 알지네이트의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것을 특징으로 하는 서방형 인간성장호르몬 약물전달체의 제조방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 플루로닉 F127-신남산(Pl-Ci) 결합체는,
    신남산의 카르복실기와 플루로닉(pluronic) F127의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것을 특징으로 하는 서방형 인간성장호르몬 약물전달체의 제조방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜-신남산(PEG-Ci) 결합체는,
    신남산의 카르복실기와 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)의 수산기가 축합 반응되어 합성된 것을 특징으로 하는 서방형 인간성장호르몬 약물전달체의 제조방법.
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