KR101782656B1 - 시스-사이클로(l-페닐알라닌-l-프롤린) 를 포함하는 항-인플루엔자 a 바이러스(h3n2) 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))를 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물, 농약 조성물 및 항균제 생산방법을 제공한다. 본 발명은 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라에 대하여 우수한 항균 활성을 나타냄에 따라 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 균을 제거 및 예방을 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용될 수 있으며, 특히 적은 양으로도 항균 활성을 나타내기 때문에 이용면에 있어서 경제적인 장점을 가진다. 또한, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 포함하는 항바이러스제 조성물을 제공한다.

Description

시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린) 를 포함하는 항-인플루엔자 A 바이러스(H3N2) 조성물 및 이의 제조 방법{Anti-influenza A viral composition comprising cis―cyclo（L―Phe―Pro）and methods of preparation thereof}

본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 및 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스제 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 젖산 발효 효능은 주로 유기산 축적과 기질 산화에 의존을 받는다.^[1,2,3] 아세트알데히드, 디아세틸 화합물, 과산화수소 및 이산화탄소와 같은 대사산물은 박테리아균, 병원균 및 부패균의 성장을 억제하는데 중요하다.^[1,2,3] 또한, 비-프로테인 기질이 그람 양성균과 곰팡이균 뿐만 아니라 그람 음상균을 억제시키는 것으로 보고되었다.^[4]

최초 저분자량 항생제인 류테리사이클린(Reutericyclin)은 발효빵으로부터 분리된 락토바실러스 류테리 LTH2584(Lactobacillus reuteri LTH2584)로부터 정제되었다. 류테리사이클린은 그람양성균, 그람음성균, 효모균 및 곰팡이와 같은 미생물에 다소 민감하다.^[5] 젖산균 또는 유산균(Lactic acid bacteria: LAB)은 오랜 시간 동안 인류 및 동물에 있어 다양한 식량으로 이용되어 왔으며, 효모처럼 음식 발효, 보관및 저장에 있어서 유용하였다.^[1,2,3]

LAB는 일반적으로 세포외 길항제 화합물을 분비하여 많은 미생물과 대항하며, 내재성 대사 부산물에 의하여 세포외 환경을 변화시킨다.^[6] LAB에 의하여 배설되는 화합물 중에서 다양한 종류의 항균 대사산물은 1000이하의 저분자량 화합물과 1000이하로 평가된 분자량을 가진 박테리오신(bacteriocins)으로 분류될 수 있다.^[7] LAB에 의한 항균활성에 대한 많은 연구들은 박테리오신에 초점을 맞추어졌다. LAB가 생산하는 박테리오신은 활성, 작용 모드, 분자량, 유전적 기원 및 생화학적 특성 측면에서 폭 넓은 스펙트럼에 따라 차이를 나타내는 항균 펩타이드와 단백질의 이종(heterogeneous) 그룹 중 한 종류이며,^[8,9] 이러한 부류의 펩타이드와 단백질은 성숙 펩타이드(peptide) 및 프리펩타이드(prepeptide)의 서열을 기초로 3개로 분류되었다.^{[10,11,12,13]} 페디오신은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)에 의하여 생산된 것으로 알려져 있는 박테리오신의 한 종류이다.^[14] 대부분의 이와 같은 화합물들은 양이온성 분자와 작은 크기의 기질들이 포함된다.^[15] 그리고 이런 화합물들은 일반적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 종(Listeria species) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 그람 양성 몇몇 병원성 균주를 죽일 수 있다.^[16,17,18] 또한, 어떤 박테리오신은 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 속과 같은 식품 병원성 균주들을 죽일 수 있다.^[19] 지금까지는 사이클릭 다이펩타이드인 프롤린-함유 2,5-디케토피페라진(Proline-containing 2,5-diketopiperazine)가 집중적으로 연구 조사되어져 왔다.^{[6,20,22,23,24,25,26,27]} 이러한 많은 사이클릭 또는 사이클로 다이펩타이드들은 많은 생물학적 이벤트와 현상 측면에서 기질로서 작용하는 것으로 여겨져 왔다.^{[22,23,24,25,26]} 특히, 이와 같은 사이클릭 다이펩타이드의 잠재적인 치료 및 예방 효능은 박테리아균, 곰팡이균, 바이러스 및 암에 대하여 다양한 항생 활성들을 가지는 것으로 판명되었다.^{[6,23,26,27,28]} 또한, 이러한 항균성 사이클릭 다이펩타이드들은 효모, 지의류 및 곰팡이 배양에서 확인되었다.^[20,29] 스트렙토마이세스 종으로부터 사이클로(1-류실-1-프로필)과 사이클로(1-페닐알라닐-1-프롤릴)의 분리는 이미 보고되었다.^{[20,24,25,29]} 항균 활성 사이클릭 펩타이드들은 자연계 어디에서나 존재하며 인간을 위한 폭 넓은 다양한 생물학적 타겟에 영향을 미친다.^[22,23,25]

따라서, 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질의 필요성이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 다이펩타이드 중 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))이 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 농약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 항균제 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였으며, 그 결과, 다이펩타이드 중 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))이 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타냄을 규명하였다.

본 발명은 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “항균”은 박테리아의 성장 억제, 증식 억제 및 사멸 작용을 의미하며, 본 명세서에서는 용어 “항박테리아”와 혼용되어 사용된다.

본 발명에서 유효성분으로 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 자연계에 존재하는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 포함하며, 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)에 대한 화학구조식은 본 발명의 명세서에서의 도 21에 나타내었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 류코노스톡 속(Leuconostoc) 균으로부터 분리된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)이다.

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 류코노스톡 속 균으로부터 분리하는 경우, 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), , 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 및 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 류코노스톡 속 균으로부터 분리하는 경우 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.

본 발명의 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 스트렙토코쿠스 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 스트렙토코쿠스 속 균은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes) 및 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 속 균이며, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 파이오제네스 및 스트렙토코쿠스 아갈락티애로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 속 균이고, 가장 바람직하게는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균이다.

또한, 본 발명은 쉬겔라 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 쉬겔라 속 균은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 쉬겔라 속 균이며, 보다 더 바람직하게는 쉬겔라 디센테리애, 쉬겔라 소네이 또는 이의 모두를 포함하고, 가장 바람직하게는 쉬겔라 디센테리애이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 농약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 농약학적 유효량을 포함하는 농약 조성물을 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 농약 조성물은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 농약학적 유효량; 및 (b) 농약학적으로 허용되는 용매, 담체, 유화제 및 분산제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 또는 첨가물을 추가적으로 포함하는 농약 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “농약학적 유효량”은 상술한 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 항균 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 용매를 포함한다. 상기 용매로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌, 파라핀(예를 들어 광유분획물), 알코올(예를 들어 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알코올), 케톤(예를 들어 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈(NMP, NOP), 아세테이트(글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르(원칙적으로, 용매 혼합물을 사용할 수도 있음) 등이 포함된다.

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예컨대, 상기 담체로는 예컨대 분쇄된 천연 광물(예를 들어 카올린, 점토, 활석, 백악) 및 분쇄된 합성 광물(예를 들어 고도로 분산된 실리카, 실리케이트)을 포함한다.

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 유화제를 포함한다. 예컨대, 상기 유화제로는 비이온성 및 음이온성 유화제(예컨대, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)를 포함한다.

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 분산제를 포함한다. 예컨대, 상기 분산제는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로오스를 포함한다.

본 발명은 상기 항균용 조성물에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))유효성분으로 포함하는 농약조성물이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 항균제 생산 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a)에서 젖산균으로 류코노스톡 속 균을 이용하는 경우, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 젖산균을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.

본 발명에서 단계 (a)에서의 젖산균 배양액을 제조하는 단계는 당업계에서 이용할 수 있는 배지 조성 및 첨가물을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명에서 단계 (b)에서의 농축시키는 단계는 배양액으로부터 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 분리 및 정제하여 농축시키는 단계 또는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)이 포함된 배양액을 농축시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 단계 (b)에서 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 분리 및 정제는 공지된 다양한 방법을 통하여 실시된다.

예컨대, 상기 물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻는 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 실시된다.

본 발명에서의 표현 “효과적인 농도로 농축”은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 포함하는 젖산균 배양액이 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 항균 활성을 나타내는 농도로 농축시키는 것을 의미한다.

예컨대, 상기 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 배양액에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)가 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 효과적인 항균 활성을 나타내는 최소 농도는 2.65 mg(37.86 mM)농도를 의미한다.

본 발명은 상기 항균용 조성물에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 포함하는 항균제 생산방법이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.

본 발명의 또다른 형태는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro)) 을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다. 상기 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 이에 제한되는 것은 아니지만 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 균으로부터 분리되어질 수 있다. 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택되어 질 수 있다. 상기 바이러스는 이에 제한되는 것은 아니지만 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 조성물이다.

본 발명의 또다른 형태는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 의약 조성물이다.

본 발명의 또다른 형태는 (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 항바이러스제 생산 방법이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))를 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물, 농약 조성물 및 항균제 생산방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라에 대하여 우수한 항균 활성을 나타냄에 따라 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 균을 제거 또는 예방을 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용될 수 있으며, 특히 적은 양으로도 항균 활성을 나타내기 때문에 이용면에 있어서 경제적인 장점을 가진다.

(ⅲ) 또한, 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 포함하는 항바이러스제 조성물로서 다양한 바이러스의 치료에 사용가능하다.

(iv) 또한, 본 발명은 다이펩타이드를 이용하는 농약업계 및 의약업계에 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 농약 및 의약으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

도 1은 식물 추출물에서의 항균 활성을 비교한 결과이다. 배양액이 포함된 디스크를 다음과 같이 준비하였다. 1번 디스크는 웨이셀라 시바리아(W. cibaria) LBP-B06 배양액이 포함된 디스크이며, 2번 디스크는 락토바실러스 사케이(L. sakei) LBP-S02 배양액이 포함된 디스크이고, 3번 디스크는 락토바실러스 김치아이(L. kimchii) LBP-B02 배양액이 포함된 디스크이며, 4번 디스크는 락토바실러스 플란타룸(Lb. plantarum) LBP-K10 배양액이 포함된 디스크이고, 5번 디스크는 락토바실러스 시트레움 LBP-K11(L. citreum LBP-K11) 배양액이 포함된 디스크이며, 6번 디스크는 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(L. mesenteroides LBP-K06) 배양이 포함된 디스크이다. 왼쪽 패널은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 지표 균주를 이용한 결과이며, 오른쪽 패널이 대장균(Escherichia coli) 지표 균주를 이용한 결과이다. 모든 실험은 독립적으로 세 번 실행되었다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상적인 생장을 600 nm에서의 흡광도와 pH 변화를 나타낸 그래프이다. 28 시간 후, pH(closed circle)와 OD₆₀₀(open circle)를 2주 동안 유지시켰으며, pH를 pH 3.8 정도로 계속 유지시켰다(왼쪽 패널). 또한, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상 생장 중 항균 활성의 변화를 디스크 확산법(disk diffusion assay)으로 수행하여 관찰하였으며(오른쪽 패널), 하루 동안 배양시킨 후 pH(closed circle)와 항균 활성(open circle)을 일주일 동안 유지시켰다.
도 3은 병원성균들의 생장 저지능력에 대한 결과이다. 배양액을 이용하여 그람 양성균(B. subtilis, L. monocytogens 및 S. aureus), 그람 음성균(S. typhimurium, S. sonnei 및 E. coli)과 기회성 진균으로 병원성을 가진 칸디다 알비칸스(C. albicans)를 한천 플레이트에서 저지환을 관찰하였다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액에서 유도된 비단백성 항균 물질의 열 안정성에 대한 결과이다. 그람 양성균(B. subtilis)과 그람 음성균(E. coli)에서 비단백성 물질의 항균 활성은 여러 조건의 열처리한 배양액과 비교해 볼 때 대조군에 비해 큰 차이가 없이 유사하였고, 이를 디스크 확산법을 통한 생육저지환의 직경을 통해 관찰하였다.
도 5는 단백분해 효소를 처리했을 때 비단백성 항균 물질의 효과를 가지는 배양액의 특징을 나타낸 것이다. 여러 가지 다양한 단백분해 효소를 처리하여 항균 활성을 관찰하였다. 프로테이나아제 K와 키모트립신을 배양액에 처리하였고, 이때 배양액은 분자량 1,000을 기준으로 하기 실시예에서 설명한 바와 같이 YM-1 컷-오프(YM1C)와 YM-1 상청액(YM1S), 그리고 대조군으로 나누어 실험하였다.
도 6은 CH₂Cl₂를 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 배양액을 추출한 결과이다. a는 CH₂Cl₂(methylene chloride)을 이용하여 추출한 후의 상청액의 항균활성을 나타낸 것이며, b는 CH₂Cl₂없는 배양 상청액의 항균활성을 나타낸 것이고, c는 CH₂Cl₂(methylene chloride)을 이용하여 추출한 하층액의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 ZORBAX C18 옥타데도실 실리카 하이드로포빅 레진을 이용한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석을 나타낸 결과이다. 각 분획은 액체-액체 추출법에 의해 수집하였다. 이러한 분석 내용은 자외선 파장 210, 260 그리고 280 nm에서 각각 기록하였다. 모든 분획된 물질은 10여개로 각각 나눌 수 있었다. 이렇게 모인 10개의 분획 물질을 하기 실시예에서 기술한 대로 수집하고 농축하였다.
도 8은 최소농도배지법을 활용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스(P. pentosaceus)로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다. 모든 배양액은 CH₂Cl₂를 이용하여 추출하였고 각 시료는 6-웰 플레이트에 희석법을 이용하여 지표 균주를 놓은 후에 로딩하였다. 최소농도배지법을 수행한 결과 일부 유의적인 항균 활성이 그람 양성균과 그람 음성균에서 동시에 관찰되었다. 최소농도배지법의 수행과정을 위해 분리되지 않은 배양액의 CH₂Cl₂ 하층액을 대조군으로 사용하였다. 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로부터 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 분획된 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 8번 및 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 8번 및 10번에서 각각 1.45 mg (20.71 mM), 1.37 mg (19.6 mM) 그리고 2.35 mg (33.57 mM)이었다.
도 9는 최소농도배지법을 활용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10으로부터 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)는 6-웰당 각각 3.0 x 10⁶ CFU (colony forming unit) 을 분주하여 분획된 물질에 대해 테스트하였다. 분획된 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 8번 및 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 8번 및 10번에서 각각 1.30 mg (20.62 mM), 1.25 mg (17.86 mM) 그리고 2.35 mg (33.57 mM) 이었다.
도 10은 최소농도배지법을 활용하여 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다.류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06에서 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 분획된 3, 4, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 10번에서 각각 1.43 mg (20.43 mM) 그리고 5.50 mg (78.6 mM)이었다.
도 11은 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 및 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06 균주에서 분획된 물질들의 크로마토그램에 대한 결과이다. 모든 균주는 CH₂Cl₂ 추출법을 이용하여 분획하였다.
도 12는 분리하여 동정한 여러 유산균에 대한 크로마토그램에 대한 결과이다. CH₂Cl₂ 추출 방법을 이용하여 동정된 다양한 유산균 균주들의 세미-프렙 HPLC 크로마토그램을 관찰하였다. 이 실험에서는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP(Pediococcus pentosaceus MCPP), 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(Leuconostoc mesenteroides LBP-K06), 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10(Lactobacillus plantarum LBP-K10), 웨이셀라 시바리아 LBP-K15(Weissella cibaria LBP-K15), 웨이셀라 콘푸사 LBP-K16(Weissella confusa LBP-K16), 락토바실러스 사케이 LBP-S01(L. sakei LBP-S01), 락토바실러스 플란타룸/펜토스 LBP-S02(Lactobacillus plantarum/pentos LBP-S02), 락토코쿠스 락티스 LBP-S03(Lactococcus lactis LBP-S03), 락토코쿠스 락티스 LBP-S06(Lactococcus lactis LBP-S06) 및 스타필로코쿠스 시우리 LBP-S07 (Staphylococcus sciuri LBP-S07) 균주들을 이용하였다.
도 13은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 전자충격이온화법(electron ionization, EI)을 이용한 분석 결과이다.
도 14는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 화학이온화법(chemical ionization, CI)을 이용한 분석 결과이다.
도 15는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 ¹H-핵자기공명(500 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 16은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 ¹H-핵자기공명(500 MHz, 10% D₂O가 함유된 DMSO)에 대한 결과이다.
도 17은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 ¹³C-핵자기공명(500 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 18은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 ¹³C-핵자기공명(500 MHz, 10% D₂O가 함유된 DMSO)에 대한 결과이다.
도 19는 X-선 회절법을 이용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 예상 구조식을 나타낸 것이다.
도 20은 X-선 회절법을 이용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 구조식을 나타낸 것이다.
도 21은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 구조를 최종적으로 나타낸 것이다. 분리된 항균 물질은 C₁₁H₁₈O₂N₂ 분자식을 가진 시스-사이클로(L-Leu-L-Pro)(cis-cyclo (L-Leu-L-Pro)로 확인되었다.
도 22은 분획된 화합물의 항바이러스 효과를 보인다. 항바이러스 활성의 경우 성견 코카스파니엘의 신장(Madin-Darby, canine kidney)에서 수립한 상피유사세포를 이용하였으며 이를 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 3일간 감염시켰다. 실험에 사용된 락토바실러스 플랜타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석에서 나온 각각의 분획물을 0.7% 완전 최소 필수배지(complete minimal essential medium, MEM agarose)에 섞어 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 감염시킨 성견 상피세포(MDCK)에 적용하였다. 모든 항바이러스 활성 실험군은 플라크(plaque) 분석을 사용하였다. (A) 대조구; (B) 바이러스 대조구; (C) 8번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (D) 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (E) 10번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린); (F) 10번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)
도 23은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 전자충격이온화법(electron ionization, EI)을 이용한 분석 결과이다.
도 24는 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 화학이온화법(chemical ionization, CI)을 이용한 분석 결과이다.
도 25는 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 ¹H-핵자기공명(600 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 26은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 2D HSQC from ¹H/¹³C NMR (600MHz, in 100 % MeOD) 에 대한 결과이다.
도 27은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 2D COSY from ¹H/¹H NMR (600MHz, in 100 % DMSO (왼쪽) 및 10 % D₂O contained DMSO (오른쪽)) 스펙트라에 대한 결과이다.
도 28는 X-선 회절법을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 예상 구조식을 나타낸 것이다.
도 29은 X-선 회절법을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 구조식을 나타낸 것이다.
도 30은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 구조를 최종적으로 나타낸 것이다. 분리된 항균 물질은 C₁₄H₁₆O₂N₂, 의 분자식을 가진 시스-사이클로(L-Phe-L-Pro)로 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

<실시예 1> 식물 물질로부터 LAB(lactic acid bacteria)의 분리 및 동정

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

재료 및 방법

실험 균주 및 유산균 분리

갓 김치와 돌나물 김치 및 배추 김치로부터 다양한 유산균들을 분리하였다. 준비된 각각의 재료를 믹서기로 갈아서, 갓 김치와 돌나물 김치의 경우에는 5% NaCl을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 나누었고, 각각 4℃, 22℃ 및 30℃에서 보관하였다. 모든 식물 실험군은 1달 동안 24시간 간격으로 시료를 검체하였고, 각 실험군의 농도를 멸균한 증류수에 적당하게 희석하여 유산균 분리 배지인 MRS(de Mann Rogosa Sharpe) 고체 배지에 도말한 후, 30℃에서 2-3일 정도 배양하였다. 배양 후 잘 분리된 균체를 선별하여 16s rDNA 염기서열법을 수행하였으며, 유전체 정보와 비교하기 위해 액체 MRS 배지에 재배양하였다.

분리된 유산균의 동정

본 실험에서는 발효된 식물에서 분리된 유산균을 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 결정법을 통해 유산균들을 동정하였다. PCR(중합효소연쇄반응)을 위한 프라이머로는 일반적인 진정세균을 대상으로 하는 프라이머로서 27F(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’(서열번호 1))와 1492R(5’-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’(서열번호 2))을 이용하였다. PCR반응은 94℃에서 5분간 프리-디네이쳐레이션(pre-denaturation) 과정을 거친 후, 94℃에서 1분간 디네이쳐레이션(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 익스텐션(extention) 과정을 30회 거쳐 최종적으로 72℃에서 7분간 엑스트라-익스텐션(extra-extention)을 해주었으며, 4℃에서 보관하였다. 중합효소연쇄반응 후 0.7% 아가로오스 젤 전기영동으로 증폭된 16S rDNA를 확인하고 DNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 선별된 균주의 16S rDNA 염기서열의 상동관계는 NCBI의 뉴클레오타이드 BLAST 프로그램을 이용하여 비교하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

항균 활성 시험 및 배양 조건을 위한 표준 세균 균주, 다제내성 그람-양성 및 그람-음성 세균 균주

분리된 젖산균 균주들중에서, Lb. plantarum LBP-K10을 본 발명에서 주로 사용하였다. Lb. plantarum LBP-K10를 포함하는 모든 분리된 젖산균 균주는 변형된 MRS(mMRS) 브로스 또는 1.7% 고형 아가 배지(Difco laboratory, Detroit, MI)를 사용하였다. 본 발명에서는 LAB에 의해 생성되는 항균 물질을 찾아내기 위해 한국의 전통적인 발효 식물 물질로부터의 Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum 및 Leuconostoc mesenteroides 같은 분리된 젖산균주를 사용하였다. 그리고 항균 활성을 관찰하기 위해 그람 양성 세균 대조 균주로서 B. subtilis, S. areus, L. innocua, S. pneumoniae 및 그람 음성 대조 균주로서 E. coli, S. typhimurium, S. sonnei를 항균 지표 균주로 사용하였다. 더욱이 한국의 국립보건원의 인간의 시로타입 19A의 뇌척수액으로부터 분리되고, 페니실린, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 클린다마이신에서 저항성을 보이는 Streptococcus pneumonia 14596, 대한민국 국립보건원의 인간 시로타입 B의 대변으로부터 분리되고, ACSSuT, H1: 1 및 H2:1.2에 저항성을 보이는 Salmonella typhimurium 12219 및 옥사실린 (MEC A+)에 저항성을 보이는 메티실린-저항성 Staphylococcus aureus(methicillin-resistant Staphylococcus aureus ; MRSA) 11471, 이들 모든 세 개의 다제내성 세균을 분리된 항세균 화합물의 최소 저해 농도(MIC)에 사용하였다. 리스테리아 속(Listeria spp.)을 제외한 대부분의 병원성 균주들을 루리아-베르타니(Luria-Bertani: LB) 브로스(1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl)에서 배양하였고, 리스테리아속은 브레인 하트 인퓨젼(Brain Heart infusion) 배양액(Difco, Laboratories, Detroit, MI)에서 따로 배양하였다. 그리고 모든 세균 세포를 MRS에서 배양하였다. 약 0.1 ~ 0.2%의 시딩 이노큘럼(seeding inoculum)을 교반 또는 흔들어줌이 없이 3일 동안 30 ℃에서 배양하였다. 생장된 세포를 두번 15분 동안 8000 rpm에서 원심분리하여 수확하였다. 배양 상등물(Culture supernatant; CS)는 항균활성 분석을 위해 사용되었고, 추가로 정제하였다.

항균 활성 평가

항균 활성을 알아보기 위하여 배지희석법(broth microdilution test), 디스크 확산법(disk diffusion assay) 및 길항작용법(antagonism test)을 실시하였다.

각각의 실험 방법은 다음과 같다.

배지희석법은 농축된 배양상등액을 연속 희석하여 수행하였고, 미생물 지표 균주에 활성이 있는지를 살펴 보았다. 항균 활성을 관찰하기 위해 길항작용법의 경우에는 24 시간 배양된 LAB 세포가 OD₆₀₀ = 1.0 으로 최적화 하였고 1 ㎕로 MRS 아가 플레이트에 점적 되었고 30℃에서 24시간 동안 배양되었다. 그 이후 3 ~5시간 미리 배양해 둔 지표 균주를 MRS 아가 플레이트가 점적된 LAB위에 올려졌다. 30℃에서 1일 배양한 후 성장제한영역은 지름(mm)으로 계산하였다.

디스크 확산법은 배양상등액(CS)이나 항균물질이 사용되었고 6 ㎜의 종이 디스크(Toyo Roshi kaisha, ltd)에 점적시키고, 3-5시간 배양시킨 지표 균주가 1%의 적절한 몰튼 아가에 접종하였다. 아가 플레이트를 굳힌 후, 스팟팅한 디스크 페이퍼(disk paper)를 아가 플레이트 상에 놓았고 적절한 온도에서 24시간 동안 배양했다. 항균활성은 지름(mm)으로 생육 저지환을 측정하였다.

LAB 생장에 따른 pH와 항균 활성의 변화

밤사이에 배양해 놓은 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10를 변형 MRS 브로스에 1.0%로 접종하여 30℃에서 정치 배양하였다. 접종 후 휴지기(stationary phase)로 진입할 때까지 4시간 마다 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 원심분리 후 상층액을 얻어 pH와 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 상기 설명한 배지희석법(broth microdilution test), 디스크 확산법(disk diffusion assay) 및 길항작용법(antagonism test)을 사용하여 접종 후 일주일 동안 24시간마다 수행하였다.

단백질 분해 효소의 효과에 대한 분석

세포외 단백질성 및 비-단백질성 물질이 병원성 미생물에 활성이 있는지 없는지, CS(아세테이트 막 YM-1을 이용하여 여과됨, 분자량 1,000 미만 및 1,000 초과)의 단백질 분해효소에 대한 민감도를 프로테이나아제 K(proteinase K, Sigma-Aldrich, Inc., USA), 키모트립신(chymotrypsin, Boehringer Mannheim GmbH., Germany) 및 트립신(trypsin, Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한 프로테이나아제 K를 제외한 나머지는 실온(25℃)에서 최종 농도 1 ㎎/㎖로 맞추어 처리하여 관찰하였다. 적절한 시간을 항온반응한뒤 혼합물을 변성시키고 이들 단백질 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분 동안 95℃에서 열처하였다. 그리고 항균 활성은 상기 설명한 바와 같이 디스크 확산법을 사용하여 결정하였다.

항세균 물질에 대한 열처리

항균성 물질의 활성에 대한 온도의 영향을 연구하기 위해서, CS를 100℃ 워터 배스(water bath)에서 60분, 120분, 그리고 121℃에서 오토클레이브(autoclave)를 사용하여 15분 동안 열처리에 노출시켰다. 샘플을 활성 분석을 수행하기 전에는 상온에 두었다. CS를 대조군으로 이용했다. 고온으로 처리후 남아있는 항균 활성을 디스크 확산 분석법을 이용하여 측정했다.

항세균 물질의 분리 준비

분리된 Lb. plantarum LBP-K10로부터, 항균성 화합물을 변형된 MRS(mCS)를 이용하여 CS로부터 정제하고 특성을 규명하기 위해서 지정했다. mMRS는 하기와 같은 구성요소를 포함했다:

1 리터 당 10g의 펩톤, 2g의 암모늄 시트레이트, 5g의 나트륨 아세테이트, 0.1g의 마그네슘 설페이트, 0.05g의 망간 설페이트, 2g의 다이포타슘 포스페이트, 5g의 이스트 추출물 및 20g의 포도당.

D-포도당을 기타 공급원과 혼합 전에 각각 멸균했다. CS를 3일 동안 mMRS에서 배양된 Lb . plantarum LBPK-10로부터 수득하고(P. pentosaceus 및 Lc.Mesenteroides에도 동일) 상술한 바와 같이 8000rpm에서 30분 동안 원심분리를 하였다. Lb.plantarum LBPK-10 균주를 10배로 농축한 후 동결건조(freeze-drying)하였고 메틸렌 클로라이드(CH₂Cl₂)로 액체-액체 추출법에 의해 분별 깔때기(separating funnel)를 이용하여 약 1일 동안 추출하고 55℃에서 증발기로 탈수했다. 획득된 분리 유기상(organic phase)을 수득하고 유기 용매를 증기로 제거했다. 또한, 수성상(aqueous phase)만을 그것의 활성을 유기상 및 CS와 비교하기 위해서 수득했다. 이 용리제(eluent)를 C18 SPE 카트리지(Waters Sep-pak C18 plus cartridge, Millipore Corp., Marlborou, MA)를 통과시켰다. 용출된 샘플을 SPE 카트리지 상에 로딩했고, 100% 메탄올의 등용매(isocratic flow)를 이용함으로써 운용했다. SPE 상에 샘플을 로딩하기 전에, 카트리지를 활성화했고 15ml MeOH 및 연속되는 15ml의 물 100%로 세척했다. 그 후, 샘플 로딩을 수행했고 100% 물로 세척했다. 최종 용출을 SPE 카트리지를 통해 100% MeOH에 의해 수행했다. 용출된 샘플을 수집하고 남아있는 유기용매를 제거하기 위해서 증발시켰다. 각각의 농축된 샘플을 하기의 HPLC 단계를 위해 적절한 양의 멸균된 TDW로 용해했다.

고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통한 항균 물질의 분리

추출된 물질을 적절한 양의 증류수로 용해시키고 0.22μm 아세테이트 셀룰로오스 막으로 여과했다. 여과된 샘플을 ODS C-18 칼럼(octadedosyl-C18 hydrophobic semi-preparative column)(9.4 × 250mm, Agilent, USA)을 이용한 HPLC(High Performance Liquid Chromatography(semi-prep HPLC system, Agilent 1200 series, USA)) 시스템에 의해 분석하고 분리했다. 칼럼 온도를 40℃로 고정하고, 이동상은 35분 동안 67% 물, 3% 아세토나이트릴(ACN) 및 30% 메탄올이었다. 유속은 1.5ml/분이고 파장은 210nm, 260nm 및 280nm에서 UV 다중파장 감지 시스템(UV multi-wavelength detector system)을 이용하여 각각 관찰하였다. 각각의 분말 샘플을 수득하기 위해서, 분리된 각각의 피크 프랙션(fraction)을 증발 및 동결건조에 의해 수집하고, 농축했다.

최소배지농도법(MIC)을 이용한 항균 활성의 측정

분획 물질(fractionation)들을 HPLC를 이용하여 각각 수집한 후, 각각의 획득되어진 샘플을 최소 억제적 농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험에 의해서 그 활성을 인용문헌에서처럼[Mathur et al., 2005; Messens et al., 2002] 체크했다. 이렇게 분획된 샘플들 중에서, 최고의 활성을 갖는 적절한 피크의 분획(fraction)을 동일 절차에 의해 추가 정제하고 이후 단일 화합물을 수득했다. 이것은 GC/MS, 원소 분석(elemental analysis), NMR 분광법 및 X-선 결정법(X-ray crystallography)등의 다양한 분석법에 의해 추가 분석될 수 있었다.

세포 배양 및 바이러스 균주, 배지 및 배양 조건

DMEM(v/v)의 완전 조성은 다음과 같다. 76.5% DMEM(높은 포도당, Hyclone Laboratories, USA), 1.0% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES 완충용액, 둘베코의 인산-완충된 생리식염수(7.5% DPBS)내의 우혈청으로부터의 멸균된, BioXtra, 세포배양에 적합한 2.5% 알부민 용액(Sigma, USA) 및 10.0% 우태아 혈청 (FBS) (NOVA, USA).

또한 VIM은 94.0% DMEM(높은 포도당)(Hyclone Laboratories, USA), 1.0% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES 완충용액(Gibco, USA), 둘베코의 인산-완충된 생리식염수(7.5% DPBS)내의 우혈청으로부터의 멸균된, BioXtra, 세포배양에 적합한 2.5% 알부민 용액(Sigma, USA) 및 10.0% 우태아 혈청 (FBS) (NOVA, USA) 및 0.1% 토실 페닐알라닌 클로로메틸 케톤-처리된 트립신( tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin (TPCK-treated trypsin) (2㎍/ml). VIM 아가로스는 플라크 분석을 위해 2X VIM에 부가하여 1.4% 아가로스SEG(TNT research, Korea)로부터 최종 0.7% VIM 아가로스로 사용하였다.

항바이러스 활성 테스트-플라크 분석 방법

a. MDCK 세포 배양 조건

항바이러스 테스트를 이전 연구와 같이 플라크(plaque)을 계수하여 수행했다[Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009]. 항바이러스 활성을 관찰하기 위하여, 개의 신장의 마딘 다비 케인 신장(Madin Darby canine kidney; MDCK)의 상피세포를 본 발명의 실시예에서 항바이러스 지표로 이용했다. 플라크-정제된 야생형 인플루엔자 바이러스 세포당 5 pfu의 세미콘플루언트 모노레이어의 5 x 10⁵ 세포내의 MDCK 세포을 이용했다[Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009]. MDCK 세포를 상기 기술한 완전 DMEM에서 배양하였다. 처음에는 MDCK 세포 스톡을 천천히 37℃의 수조에서 녹였고, 세포 스톡내에 포함된 디메틸설폭사이드(DMSO)를 제거하기 위해 10배 이상의 완전 DMEM으로 부드럽게 혼합하였고, 3분동안 12,000 rpm에서 원심분리하였고, MDCK 세포가 부유되지 않도록 하며 상등액을 버렸고, 이를 연속하여 세번 반복하였다. DMEM 배지로 MDCK 세포를 세척한 후 MDCK 세포를 10ml 완전 DMEM 배지에 현탁하였고, 세포 배양 접시에 퍼지도록 여러번 부드럽게 흔들어주면서 100 Π 세포 배양 접시로 옮겨주었다. 옮겨준 MDCK 세포를 72시간동안 5% CO₂ 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다. 잘 자란 MDCK 세포(세포 배양 접시의 90 ~ 95%)의 생산을 계속하였다. 성장된 MDCK 세포(2 x 10⁵)를 DMEM 배지를 버린 후에 1.5ml TPCK-처리 트립신으로 처리했고, 10-15분 동안 5% CO₂ 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다. 떨어져나온 MDCK 세포를 10배의 DMEM 배지로 혼합하였고, 성장된 세포가 남아 있지 않도록 멸균된 50ml 콘니칼 튜브로 옮겼고, 3분 동안 원심분리를 하고, 인산 완충 생리식염수(PBS)로 세번 세척하였다. PBS로 세척 단계를 완료한 후 10 ml 완전 DMEM 배지를 첨가하고, 현탁한 후 추가의 30ml 완전 DMEM 배지를 추가했다. 각 10ml의 MDCK 세포를 100 Π 세포 배양 접시로 놓고, 48시간 동안 5% CO₂ 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다.

b. 항바이러스 활성을 위한 플라크 분석 방법

플라크 분석을 상기에 설명한 바와 같이(Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009) 준비하였다. 세포 배양 접시의 90 ~ 95%까지 잘 자란 MDCK 세포의 6-웰 세포 접시로 이동하였다. 세포 배양 접시의 80%로 덮혀진 성장된 MDCK 세포을 준비하여 PBS로 2번 세척하였다. 200㎕ 바이러스 감염 배지(virus infection media; VIM)을 포함하는 분리 정제된 여러 종류의 단일 화합물을 자란 MDCK 세포에 처리하였다.90분 동안 34 ℃에서의 추가의 항온배양 동안에 바이러스 감염 6-웰 접시를 매 15분마다 부드럽게 흔들어 주었다. 그 이후 바이러스 감염 배지를 제거하고 0.7 % DMEM 아가로스(1:1)을 플라크 생성을 관찰하기 위하여 72시간 동안 5% CO₂ 인큐베이터, 34 ℃에서 각각의 웰(well)에 놓여졌다.

GS - MS 를 이용한 전자충격이온화법( electron ionization : EI )과 화학이온화법( chemical ionization : CI )에 의한 분석

Lb.plantarum에서 정제된 물질의 전자 이온화 및 화합물 이온화 연구를 위해서, 본 발명에서는 7679 시리즈 자동 액체 샘플러를 갖춘 Agilent 6890 시리즈 GC(AgilentTechnologies, Waldron, Germany)로 구성되어 있는 크로마토그래피 시스템을 이용했다. 질량 분석법을 고해상도 질량분석기(JEOLJMS-700, Tokyo, Japan)을 이용하여 수행했다. 가스 크로마토그래피 시스템 및 고해상도 질량분석기를 JMS-700 M Station software(JEOLJMS-700, Tokyo, Japan)[T, 2006; Ahietal., 2008]을 사용하여 모두 조절했다.

¹ H, ¹³ C, HSQC 과 2D-COSY 핵자기공명 분석

Lb.plantarum에서 D₂O 및 DMSO에서 정제된 샘플(1.0mg)을 NMR 분광법을 사용하여 수소 이온 및 탄소 배치, 결합 및 서열의 결정을 위해 이용했다. NMR 스펙트럼을 300K에서 XWIN-NMR 3.5 소프트웨어[Reynoldsetal.,2002; Luetal., 2004; Baranovskiietal., 2007] CryoProbe16을 갖는 Bruker AVANCE-500 분광기로 기록했다. 모든 2-D NMR 실험을 Bruker에 의해 제공된 표준 펄스 시퀀스(standard pulse sequence)를 이용하여 수행했다. NMR 데이터를 PC(Windows Professional 2000, Microsoft) 상에서 XWIN-NMR 3.5 software packages(Karlsruhe, Germany)를 이용하여 처리했다. ¹H 및 ¹³C에 대한 NMR 스펙트럼을 AVANCE 500 분광기(Bruker-Biospin) 상에서 사용 주파수 500.13 및 125.77MHz를 이용하여 기록했고, Z축 기울기(Z gradient)를 갖는 인버스 감지기(broadband inverse detector; BBI)를 이용했다. 스펙트럼을 D₂O 및 D₂O가 포함된 DMSO 용액에서[Pateletal.,2010] 293K의 샘플 온도에 대해서 기록했다.

분리돤 단일 화합물의 원소 분석(Elemental analysis; EA)

Lt, plantarum LBp-K10 내의 분리된 물질의 원소 성분을 결정하기 위하여, 원소분석기를 사용하였다. C, H, N 및 O에 대한 원소분석을 원소분석기에서 수행했다(CE Instruments EA1110, EA1112) [Yu et al., 2008; Okada et al., 2009]. 산소 밸러스(Oxygen balance; OB)를 폭발물의 평가에 일반적으로 사용했다. C/H/O/N의 원소 비율을 이용하여 OB를 계산하였다.

X선 회절을 이용한 분리된 물질의 구조 결정

Lt. plantarum LBP-K10으로 부터 분리된 단일 화합물의 구조를 결정하기 위하여 X-선 결정 구조 분석을 이용하였다. 단일화합물의 결정은 35% 에탄올 및 65% 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂) 혼탁액 혼합물에서 성장시켰고, 1.6Å(Angstrom) 데이터 세트(data set)를 Pohang Light Source(Kim et al.,2005)에서 빔라인(beamline) 6B에서 Bruker Proteum 300 CCD를 이용하여 얻었다.

실험 결과

식물에서의 유산균 동정

다양한 한국의 식물 재료인 갓김치, 돌나물 김치 및 배추 김치로부터 많은 종류의 유산균을 분리하였다. 이 3가지 식물 공급원으로부터, 400개 이상의 LAB을 분리하여, 길항작용 시험을 이용하여 대부분 항균 활성의 원인이 되는 200개의 LAB을 선별했다. 선별된 LAB을 PCR 증폭 및 비교를 통한 16s DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 동정했다. 결과적으로, 본 발명에서는 Leuconostoc spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp. 및 Weisella spp.를 동정했다(표 1). 3가지 식물물질 모두에서, Leuconostoc spp. 및 Lactobacillus spp.를 주로 분리했다. 또한, 특히 돌나물 김치의 Lactococcus lactis를 분리하고 동정했다. 이러한 발효 식물 물질의 배양을 위해서, 배양 시간에 따라 Leuconostoc spp.를 초기 발효 단계(1 내지 2일)에서 자주 관찰했고, Lactobacillus spp.가 배양 후기(2 내지 3일)에서 주요한 박테리아 균주이었다.

균주	식물 재료에서의 균주 수
	갓 김치	돌나물 김치	배추 김치
류코노스톡 속 (Leuconostoc spp.)	93	10	28
락토바실러스 속 (Lactobacillus spp.)	14	8	17
락토코쿠스 속 (Lactococcus spp.)	-	1	-
웨이젤라 속 (Weisella spp.)	2	14	18

분리 및 동정된 유산균의 항균 활성 비교

LAB의 일반적인 성장 동안, 세포들은 그들 스스로의 필요에 따라 많은 2차 대사물질을 생산한다. 따라서, LAB 및 항균성 작용에 대한 추가 연구 목적을 위해서, 분리 및 동정된 LAB의 항균 활성을 길항작용 시험 및 브로스 마이크로딜루션 방법을 계속적으로 이용해서 광범위하게 관찰하고 비교했다. 분리된 균주의 항균 활성을 표 2에서 나타냈다. 또한, 이러한 젖산 박테리아 균주 중에서, 다른 분리된 LAB과 비교해서 강한 항균 활성을 갖는 W.cibaria LBP-B06, L.sakei LBP-S01, L.kimchii LBP-B02, Lb.plantarum LBP-K10, L.citreum LBP-K11 및 L.mesenteroides LBP-K06를 디스크 확산법을 사용함으로써 관찰했다. 본 발명에서는 지표 균주(indicator)로서 B. subtilis(그람 양성) 및 E.coli(그람 음성)를 이용했다. 도 1에서 나타낸 것처럼, 시험된 LAB 중에서 Lb. plantarum LBP-K10의 항균 활성이 다른 다수의 박테리아 균주보다 의미있게 더 높다는 것을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 본 발명에서는 식물물질로부터의 항균성 물질은 이 균주 Lb.plantarum LBP-K10에 초점을 맞췄다.

식물 재료	균주	길항 작용 테스트a	MICb,c	염기서열로 확인한 균체 분류군
갓 김치	LBP-B01	++	+++	Lb. sakei
	LBP-B02	++	++	L. kimchii
	LBP-B03	++	++	L. mesenteroides
	LBP-B04	++	++	L. mesenteroides
	LBP-B05	+++	++	L. paramesenteroides
	LBP-B06	+++	++	W. cibaria
돌나물 김치	LBP-S01	++	+++	Lb. sakei
	LBP-S02	+++	+++	Lb. plantarum
	LBP-S03	++	++	Lc. lactis
	LBP-S04	++	++	L. citreum
	LBP-S05	++	++	L. citreum
	LBP-S06	+	++	L. lactis
	LBP-S08	++	++	W. hellenica
배추 김치	LBP-K01	++	+++	Lb. plantarum
	LBP-K03	++	++	L. citreum
	LBP-K04	++	-	L. citreum
	LBP-K05	++	++	L. holzapfelii
	LBP-K06	+++	++	L. mesenteroides
	LBP-K07	++	++	L. pseudomesenteroides
	LBP-K08	++	+	L. mesenteroides
	LBP-K09	++	++	Lb. brevis
	LBP-K10	+++	+++	Lb. plantarum
	LBP-K11	++	++	L. citreum
	LBP-K12	+++	++	L. mesenteroides
	LBP-K13	++	++	L. mesenteroides
	LBP-K14	++	++	L. pseudomesenteroides
	LBP-K15	+++	++	W. cibaria
	LBP-K16	++	++	W. confusa

a는 항균 활성 범위를 나타내는 지름을 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스). +는 지름이 ＜ 15 ㎜를 의미하고, ++는 지름이 ＜ 22 ㎜를 의미하며, +++는 지름이 ≥ 22 ㎜를 의미한다.

b는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration: MIC)를 의미한다.

c는 최소억제농도의 배율을 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스).

<실시예 3> Lb.plantarum LBP-K10의 항균 활성의 특성 분석

Lb.plantarum LBP-K10의 16S rDNA 서열을 NCBI의 뉴클레오타이드 BLAST 프로그램과 비교했고 Lb.plantarum 균주IMAU10173과 100% 동일한 상동성을 나타냈다. 동정된 Lb.plantarum LBP-K10을 실시예에서 설명된 것처럼 배양했다. 600nm에서의 흡광도 및 배양된 세포 사이에서의 이에 상응하는 pH 프로파일 및 Lb.plantarum의 정상 성장 동안의 pH의 주목할만한 변화가 28 시간 동안 각각 관찰되었다(도 2A,왼쪽패널). LAB 세포의 성장 및 이에 상응하는 CS의 pH 분석 결과를 보면 흡광도 및 pH가 정확히 서로 반비례 관계에 있고, 8 시간으로부터 지수성장기(logarithmic phase)에 진입하고, 28시간 후 정체기에 도달했다는 것을 보인다. 정체기인 28 시간 후에는 흡광도 및 pH는 거의 고정되었고 변화되지 않았다(도 2A, 왼쪽 패널). 시간에 따른 항균 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 하루 단위씩 3일간 배양액을 채취하여 실험을 하였다. 그 결과, 1일째부터는 활성이 나타나기 시작하였고, 2일째도 계속 증가하다가 3일째의 항균 활성이 가장 높은 것으로 관찰되었으며, 약 2주간 이 활성이 유지되었다(도 2의 오른쪽 패널). pH의 경우는 정상적인 생장 동안에는 계속 감소하다가 생장이 정체기 전후에 pH 4.1 정도로 나타나며 이후 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 또한, 항균 활성은 2일 배양 후 증가했고, 3일 째에 최고치에 도달했다는 것을 나타냈다(도 2A, 오른쪽). 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10이 병원성균에 대한 항균 활성이 있는지를 살펴보기 위하여 여러 균주에 대하여 위에서 설명한 방법대로 디스크 확산법을 통해 항균 활성을 확인해 보았다(도 2B). 여기서 수행한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 총 3회의 독립적인 디스크 확산법을 수행하여 각 균주에 대한 활성을 생장 저지환(mm)을 계산하여 측정하였다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia)와 같은 그람 양성균 뿐만 아니라 살모넬라 티피무루이움(Salmonella typhimuruium) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)와 같은 그람 음성균, 그리고 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 기회 감염 병원성 진균류에서도 항균활성이 관찰되었다(도 2B).

또한, 항균 물질이 열에 안정한지 확인하기 위해 다양한 조건하에 열을 가한 후 배양액에 대한 항균 활성 시험을 하였다(도 2C). 열처리한 배양액은 항균 활성이 변하지 않았다. 지표 균주로 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스와 그람 음성균인 살모넬라 티피무루이움을 사용하여 배양액의 활성을 관찰한 결과, 열을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 열을 가한 조건에 관계없이 실험군 모두 대조군과 비슷한 양상을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 항균 활성은 15분간 멸균기에서 121℃로 열을 가해도 그대로 유지되었다. 이 결과로 보아 항균 활성을 가지는 물질이 열에 의해 변성되지 않고 안정함을 확인하였다(도 2C).

단백질 분해효소(proteinase)의 효과는 CS에 대한 억제 물질을 특성 규명하기 위해 지정된 것이고 다양한 효소를 시험했다(프로테인카이네이즈 K,키모트립신 및 트립신)(도 2D). 본 발명의 실험 절차를 위해서, CS를 사용하여 72시간 동안 배양했고, CS 용액을 분자량 1000의 위 아래로 차단하기 위해서 YM-1 아세테이트 막(Amicon,USA)을 이용함으로써 단백질성(proteinous) 및 비단백질성 프랙션의 2 부분으로 나누었다. 대조군으로서 YM1S(분자량 1000 초과의 CS 용액) 및 YM1C(분자량 1000 미만의 CS 용액)의 CS를 제조했고 단백질 분해 효소를 1mg/ml의 농도로 처리했다[Pangsomboon,2009]. 이 단백질 분해 효소를 처리한 경우, 성장 억제 지역의 원인이 되는 B.subtilis 및 E.coli에 대한 항균 활성은 CS 및 YM1S의 두 실험 샘플 용액에서 감소되었다(도 2D). B.subtilis의 경우, 트립신은 대조군 CS에서 10.5%로 감소되었고 키모트립신은 6.5%로 감소되었다. 그러나, 프로테이네이즈 K 활성은 거의 남아있었다. B.subtilis와 비교해서, E.coli는 프로테이네이즈 K 및 트립신에 있어서 7.0% 감소를 나타냈다(도 2D). 아세테이트 막을 분자량 1,000을 기준으로 3부분으로 나누었기 때문에, 항균 활성의 효과는 CS 및 YM1S의 단백질성 물질에 의존적일 수 있다. 분자량 1000 미만에서 항균 활성을 변화시키지 못한 YM1C와 비교한, CS 및 YM1S의 전반적인 항균적 특성이 약간 감소했지만, 항균 활성의 대부분은 남아있었다. 이러한 결과로부터, 항균 활성이 열 및 단백질 분해 안정성에 따르면 비단백질성 물질일거라 판단된다. 그러므로, 배양 사층액으로부터의 항박테리아 활성의 대부분은 Lb.plantarum LBP-K10에서 비단백질성 물질이라는 결론을 내렸다(도 2C, 2D).

항균 또는 항바이러스 물질의 분리 및 특성

락토바실러스 플란타룸의 항균 물질의 순수 분리는 앞서 여러 가지 실험 결과를 토대로 3일간 배양한 상층 배양액을 가지고 실시하였다. 분리 과정은 CH₂Cl₂를 이용하여 액체-액체 추출법에 의해 배양액으로부터 항균 물질을 분리한 후 세미-프렙(semi-prep)용 HPLC를 이용하여 분획하고, 수집하였고 분획한 결과는 HPLC 크로마토그램으로 확인하였다(도 6 및 도 7). 이러한 실험을 실시하기 위하여 본 실험에서는 항균 물질의 순수 분리 과정에서 일부 불필요한 산성 불순물인 D-젖산이나 아세트산등을 제거하기 위해 CH₂Cl₂를 이용하여 추출한 하층 배양액, CH₂Cl₂로 추출한 상층 배양액과 CH₂Cl₂로 추출하지 않은 배양액의 항균 활성을 액체-액체 추출법으로 비교해 보았고 이후의 실험에 적용하였다(도 6).

이 실험을 통해 배양액의 모든 항균 물질은 CH₂Cl₂ 추출 후 하층액을 가지고 이후의 실험을 수행하였다(도 6). 즉, 앞서 설명한 방법으로 배양액의 CH₂Cl₂ 추출 상층액과 하층액, 그리고 CH₂Cl₂ 추출을 하지 않은 농축 배양액을 가지고 항균 활성 실험을 확인한 결과, CH₂Cl₂ 추출 상층액과 CH₂Cl₂ 추출을 하지 않은 농축 배양액의 항균 활성이 비슷하게 나타났으며 하층액의 경우 다른 두 가지 실험군보다 훨씬 더 높은 항균 활성을 가짐을 관찰하였다(도 6). 따라서 항균 물질의 분리는 CH₂Cl₂ 추출의 하층액을 가지고 실험하는 것이 더욱 효율적임을 알 수 있었다(도 6).

또한, 이러한 전처리 과정을 통해 준비된 실험군은 세미-프렙 HPLC 크로마토그램에서 분획된 물질을 적당한 양으로 농축한 후 항균 활성 실험을 실시하였고 락토바실러스 플란타룸의 크로마토그램에서 10여 개의 분획된 물질이 확인되었으며, 시간대 별로 나오는 피크를 분획화하여 수집하여 각각의 분획에 대한 항균 활성을 확인해 보았다(도 7 및 표 3). 그 결과, 2, 7, 8 및 10번의 분획에서의 항균 활성을 최소배지농도법(MIC)을 통해 관찰하였다(도 8 내지 도 10). 이상과 같은 실험을 통해 이 중에서도 8번째 분획 물질의 항균 활성이 분리된 물질들 가운데 가장 높음을 확인하였다(도 8 내지 도 10).

지표 균주	MICa	분획	염기서열로 확인된 균체 분류군
바실러스 서브틸리스	+++	M8	Lc. mesenteroides LBP-K06
	+++	N8	Lb. plantarum LBP-K10
	+++	P8	P. pentosaceus MCPP
에스케리치아 콜리	++	M8	Lc. mesenteroides
스타필로코쿠스 아우레우스	++	M8	Lc. mesenteroides
스트렙토코쿠스 뉴모니애	++	M8	Lc. mesenteroides
쉬겔라 디센테리애	++	M8	Lc.mesenteroides

a는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration:MIC)를 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다.

최소배지농도법의 결과, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 모든 분획된 물질에서 공통된 크로마토그램의 각 균주에 해당하는 분획 물질인 P8, N8 및 M8에서 항균 활성이 가장 높은 것으로 나타났다(도 8, 도 9, 도 10 및 표 3). 각 분획된 물질들의 pH는 크로마토그램 앞부분의 분획하여 확인한 산성 물질을 제외하고 모두 중성 pH에 가까웠으며(표 4), 이러한 결과는 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 모두 비슷한 경향성을 보였다(도 8, 도 9 및 도 10).

분획 수
구분	P1	P2	P3	P4	P5	P6a	P6b	P7a	P7b	P8	P9	P10
g/ℓ	-	5.88	-	-	-	14.5	2.0	5.0	7.3	2.2	4.2	10.7
pH	-	3.8	7.6	7.9	9.6	9.2	8.9	8.8	8.6	8.5	8.2	8.1
- : 활성 없음.

또한, 최소저해농도법의 결과를 토대로 본 실험에서 동정한 여러 가지 유산균을 가지고 HPLC로 크로마토그램을 비교 분석한 결과, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 분획 물질의 분포가 비슷하다는 사실을 발견하였다(도 11). 다른 유산균 균주들에서의 크로마토그램도 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스와 유사한 분획 경향성이 보였다(도 12). 이러한 결과를 통해 유산균이 생장을 거치며 항균 물질을 생성하고 생성된 대사산물이 서로 비슷하다는 것을 알 수 있었다(도 11 및 12).

항바이러스 활성분석

항바이러스 활성의 경우 성견 코카스파니엘의 신장(Madin-Darby, canine kidney)에서 수립한 상피유사세포를 이용하였으며 이를 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 3일간 감염시켰다. 실험에 사용된 락토바실러스 플랜타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석에서 나온 각각의 분획물을 0.7% 완전 최소 필수배지(complete minimal essential medium, MEM agarose)에 섞어 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 감염시킨 성견 상피세포(MDCK)에 적용하였다. 모든 항바이러스 활성 실험군은 플라크(plaque) 분석을 사용하였다. 도 22에서 (A) 대조구; (B) 바이러스 대조구; (C) 8번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (D) 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (E) 10번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린); (F) 10번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)이다. 도 22에서 보여주듯이 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)과 10번째 분획물, 10.0mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)이 플라크 분석에서 항바이러스 활성을 보였다. 특히 10번째 분획물인 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 경우 매우 높은 항바이러스 활성을 보였다.

항균 및 항바이러스 물질의 구조 분석

항균 및 항바이러스 물질의 구조를 분석하기 위해 HPLC로 분리한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 8번째 및 10번째 분획물을 동결 건조기로 분말 형태로 만들어 준비하였다. 실험 재료 및 방법에서 기술한 대로 분자량은 다이렉트 인서션 프로브(DIP, Direct Insertion Probe; DIP)로 크로마토그래피 질량분석기(Agilent 6890 series GC, Agilent Technologies, Waldron, Germany; high-resolution mass spectrometer, JEOL JMS-700, Tokyo, Japan)(GC-MS)를 이용하여 분석하였다(도 13,도 14, 도 23 및 도 24). 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 하였고 참고치와의 연관성을 파악하였다. 8번째 및 10번째 분획물의 분자량의 참고치는 각각 분자량 210 및 244으로 조사되었고, 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석 결과 페디오코쿠스 펜토사세우스 및 락토바실러스 플란타룸 8번째 분획물은 모두 210으로 나타났고, 10번째 분획물은 모두 244로 나타났다(도 13 및 도 14).

보다 정확한 분자 구조를 파악하고 선행 실험인 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 비교하기 위해 500 MHz 자기공명법을 이용하여 8번째 분획물과 10번째 분획물의 구조를 관찰하였다(도 15). 100 % DMSO 가 처리된 P8과 10% 중수(D₂O)가 DMSO와 혼합된 8번째 및 10번째 분획물을 ¹H 핵자기공명법과 ¹³C 핵자기공명법으로 분석하였다(도 15 내지 18, 도 25 내지 도 27). 100% DMSO로 처리한 P8은 8.0 ppm에서 전형적인 질소-수소 피크를 나타내지만(도 15), 10% D₂O가 함유된 P8의 경우 질소-수소 피크에서 중수로 치환되어 8.0 ppm의 피크가 사라지는 것을 확인하였다(도 16). 8번째 및 10번째 분획물의 ¹³C 핵자기공명법을 통한 화학적 이동(Chemical shift)은 DMSO와 10% 중수를 함유한 DMSO 시료에서 8번째 분획물은 모두 11개의 탄소를 가지고, 10번째 분획물은 모두 14개의 탄소를 가진 물질로 나타났다(도 17, 18, 도 25 내지 도 27).

또한 X선 회절을 이용한 결정 구조 분석 결과와 여러 구조 분석 결과를 통해 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 메센테로이데스 LBP-K06 및 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 8번째 분획물은 C₁₁H₁₈O₂N₂의 구조를 가지는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo L-Leu-L-Pro)임을 확인하였고(도 21). 이의 최종 구조는 도 21에 제시하였다.

ESI-CID mass spectrum m/z 211 [MH]⁺ base peak, 195[MH-O]⁺, 154[MH-C₄H₉]⁺

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 0.83 및 0.85 (6H at C-12 and C-13, d, J = 6.49 Hz and 6.45 Hz), 1.34 - 1.36 (1H at C-5, m), 1.73 -1.76 (1H at C-5, m), 1.80 1.87 (3H at C-4 and C-10, m), 2.10 -2.13 (1H at C-10, m), 3.31 - 3.34 (2H at C-3, m), 3.98 - 4.02 (1H at C-6, m), 4.16 - 4.19 (1H at C-9, m), 8.02 (1H at N-8, s).

¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 170.8 (C-1), 167.0 (C-7), 58.8 (C-9), 52.9 (C-6), 45.2 (C-3), 37.9 (C-5), 27.7 (C-10), 24.4 (C-4), 23.0 (C-11), 22.7 및 22.2 (C-12 and C-13).

또한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 메센테로이데스 LBP-K06 및 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 10번째 분획물은 C₁₄H₁₆O₂N₂, 의 구조를 가지고 시스-사이클로 (L-페닐알라닌-L-프롤린)으로 확인되었다(도 28 내지 도 30).

ESI-CID mass spectrum m/z 245 [MH]⁺ base peak, 153 [MH-C₇H₈]⁺, 125 [MH-C₇H₈-CO]⁺

¹H NMR (DMSO-d₆) 1.41 - 1.45 (1H at C-5, m), 1.69 - 1.74 (2H at C-4, m), 1.98 - 2.03 (1H at C-5, m), 3.01 - 3.08 (2H at C-10, m), 3.24 - 3.42 (2H at C-3, m), 4.05 - 4.08 (1H at C-6, m), 4.33 - 4.35 (1H at C-9, m), 7.17 - 7.27 (5H at phenyl group, m) 7.98 (1H at N-8, s).

참고 문헌

[1] Schillinger, U., and W. H. Holzapfel. 1996. Guidelines for manuscripts on bacteriocins of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol. 33:iii-v.

[2] Bottazzi, V. 1988. An introduction to rod-shaped lactic-acid bacteria. Biochimie. 70:303-315.

[3] Atrih, A., N. Rekhif., A. J. Moir., A. Lebrihi, and G. Lefebvre. 2001. Mode of action, purification and amino acid sequence of plantaricin C19, an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19. Int J Food Microbiol. 68:93-104.

[4] Ocana, V. S., A. A. Pesce De Ruiz Holgado., and M. E. Nader-Macias. 1999. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by a vaginal Lactobacillus salivarius strain. Appl Environ Microbiol. 65:5631-5635.

[5] Ganzle, M. G., A. Holtzel., J. Walter., G. Jung, and W. P. Hammes, 2000.Characterization of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584. Appl Environ Microbiol. 66:4325-4333.

[6] Lindgren, S. E., and W. J. Dobrogosz. 1990. Antagonistic activities of lactic-acid bacteria in food and feed fermentations. FEMS Microbiol. Rev. 87:149-163.

[7] Niku-Paavola, M. L., A. Laitila, T. Mattila-Sandholm, and A. Haikara. 1999. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J Appl Microbiol. 86:29-35.

[8] Abee, T., L., Krockel., and C, Hill. 1995. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. Int J Food Microbiol. 28:169-185.

[9] De Vuyst, L., and F. Leroy.2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. J Mol Microbiol Biotechnol. 13:194-199.

[10] Nes, I. F., and H. Holo. 2000. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. Biopolymers. 55:50-61.

[11] Nes, I. F., D. B. Diep., L. S. Havarstein., M. B. Brurberg, V. Eijsink, and H. Holo.1996. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 70:113-128.

[12] Nes, I. F., and J. R. Tagg. 1996. Novel lantibiotics and their pre-peptides. Antonie Van Leeuwenhoek. 69:89-97.

[13] Parente, E., and A. Ricciardi. 1999. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 52:628-638.

[14] Tominaga, T., and Y. Hatakeyama. 2007. Development of innovative pediocin PA-1 by DNA shuffling among class IIa bacteriocins. Appl Environ Microbiol. 73: 5292-5299.

[15] Klaenhammer, T. R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev. 12:39-85.

[16] Joerger, M. C., and T. R. Klaenhammer. 1990. Cloning, expression, and nucleotide sequence of the Lactobacillus helveticus 481 gene encoding the bacteriocin helveticin. J Bacteriol. 172:6339-6347.

[17] Wu, C. W., L. J. Yin, and S. T. Jiang. 2004. Purification and characterization of bacteriocin from Pediococcus pentosaceus ACCEL. J Agric Food Chem. 52:1146-1151.

[18] Nardi, R. M., M. M. Santoro., J. S. Oliveira., A. M. Pimenta., V. P. Ferraz., L. C. Benchetrit, and J. R. Nicoli.2005. Purification and molecular characterization of antibacterial compounds produced by Lactobacillus murinus strain L1. J Appl Microbiol. 99:649-656.

[19] Stevens, K. A., B. W. Sheldon., N. A. Klapes, and T. R. Klaenhammer. 1991. Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 57: 3613-3615.

[20] Graz, M., A, Hunt., H. Jamie., G. Grant, and P. Milne. 1999. Antimicrobial activity of selected cyclic dipeptides. Pharmazie. 54:772-775.

[21] Strom, K., S., S. Jorgen., B, Anders, and S. John. 2002. Lactobacillus plantarium Mi-LAB 393 produce the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid. Appl Environ Microbiol. 68:4322-4327.

[22] O'Neill, J. C., and H. E. Blackwell.2007. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10:857-876.

[23] Prasad, C. 1995. Bioactive cyclic dipeptides. Peptides. 16:151-164.

[24] Rhee, K. H., K. H. Choi., C. J. Kim., and C. H. Kim. 2001. Identification of Streptomyces sp. AMLK-335 producing antibiotic substance inhibitory to VRE (vancomycin-resistant enterococci). J Micribiol Biotechnol. 11:469-474.

[25] Rhee KH. 2002. Isolation and characterization of Streptomyces sp. KH-614 producing anti-VRE (vancomycin-resistant enterococci) antibiotics. J Gen Appl Microbiol. 48:321-327.

[26] Stark, T., and T. Hofmann. 2005. Structures, sensory activity, and dose/response functions of 2,5-diketopiperazines in roasted cocoa nibs (Theobroma cacao). J Agric Food Chem. 53:7222-7231.

[27] Strom, K., J. Sjogren., A. Broberg, and J. Schnurer. 2002. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid. Appl Environ Microbiol. 68:4322-4327.

[28] Trabocchi, A., D. Scarpi., and A. Guarna. 2008. Structural diversity of bicyclic amino acids. Amino Acids. 34:1-24.

[29] Ottenheijm, H. C. J, J. D. M. Herscheid., G. P. C. Kerkhoff, and T. F. Spende. 1976. Preparation of episulfide DKPS from ZN²⁺ catalysed cyclization procedure. J Org Chem. 41:3433-3438.

[30] Woo, P. C., S. K. Lau., J. L. Teng., H. Tse, and K. Y. Yuen. 2008. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 14:908-934.

[31] Holzapfel, W. H., P. Haberer., R. Geisen., J. Bjorkroth, and U. Schillinger.2001. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am J Clin Nutr. 73:365S-373S.

[32] Huys, G., K. D'Haene, and J. Swings. 2002. Influence of the culture medium on antibiotic susceptibility testing of food-associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc diffusion method. Lett Appl Microbiol. 34:402-406.

[33] Mathur, S., and R. Singh. 2005. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review. Int J Food Microbiol. 105:281-295.

[34] Messens, W., and V. L. De. 2002. Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from sourdoughs-a review. Int J Food Microbiol. 72:31-43.

[35] Tolgyessy, P., and J. Hrivnak. 2006. Analysis of volatiles in water using headspace solid-phase microcolumn extraction. J Chromatogr A. 1127: 295-297.

[36] Ahi, S., I. M. Reddy., A. Beotra., R. Lal., S. Jain, and T. Kaur. 2008. Sample purification procedure for confirmation of 3'-hydroxy stanozolol by gas chromatography/high resolution mass spectrometry. Indian J Pharmacol. 40:164-169.

[37] Reynolds, W. F., and R. G. Enriquez. 2002. Choosing the best pulse sequences, acquisition parameters, postacquisition processing strategies, and probes for natural product structure elucidation by NMR spectroscopy. Review. J Nat Prod. 65:221-244.

[38] Lu, T. L., C. S. Chen., F. L. Yang., J. M. Fung., M. Y. Chen., S. S. Tsay., J. Li., W. Zou, and S. H. Wu. 2004. Structure of a major glycolipid from Thermus oshimai NTU-063. Carbohydr Res. 339:2593-2598.

[39] Baranovskii, A. V., R. P. Litvinovskaya., M. A. Aver’kova., N. B. Khripach, and V. A. Khripach. 2007. NMR spectra of androstane analogs of brassinosteroids. Appl Spectros. 74:642-650.

[40] Patel, S., N. Kasoju., U. Bora, and A. Goyal. 2010. Structural analysis and biomedical applications of dextran produced by a new isolate Pediococcus pentosaceus screened from biodiversity hot spot Assam. Bioresour Technol. 101:6852-6855.

[41] Lonvaud-Funel, A., and Joyeux, A. 1993. Antagonism between lactic acid bacteria of wines: inhibition of Leuconostoc oenos by Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus. Food Microbiology.10: 411-419.

[42] Olasupo, N. A. 1996. Bacteriocins of Lactobacillus plantarum strains from fermented foods. Folia Microbiol (Praha). 41:130-136.

[43] Molin, G. 2001. Probiotics in foods not containing milk or milk constituents, with special reference to Lactobacillus plantarum 299v. Am J Clin Nutr. 73:380S-385S.

[44] Jamuna, M., and K. Jeevaratnam. 2004. Isolation and partial characterization of bacteriocins from Pediococcus species. Appl Microbiol Biotechnol.65:433-439.

[45] Gourama, H., and L. B. Bullerman. 1995. Inhibition of growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus species. Journal of Food Protection. 58: 1249-1256.

[46] Kim, J., J. Chun., and H. U. Han. 2000. Leuconostoc kimchii sp. nov., a new species from kimchi. Int J Syst Evol Microbiol. 50:1915-1919.

[47] Skytta, E., A. Haikara, and T. Mattila-Sandholm. 1993. Production and characterization of antibacterial compounds produced by Pediococcus damnosus and Pediococcus pentosaceus.J Appl Bacteriol. 74:134-142.

[48] Aguilar, C., C. Vanegas, and B. Klotz. 2010. Antagonistic effect of Lactobacillus strains against Escherichia coli and Listeria monocytogenes in milk. J Dairy Res. 3:1-8.

[49] Ganzle, M. G.2004. Reutericyclin: biological activity, mode of action, and potential applications. Appl Microbiol Biotechnol. 64:326-332.

[50] Bernbom, N., T. R. Licht., P. Saadbye., F. K. Vogensen, and B. Nørrung. 2006. Lactobacillus plantarum inhibits growth of Listeria monocytogenesin an in vitro continuous flow gut model, but promotes invasion of L. monocytogenes in the gut of gnotobiotic rats. Int J Food Microbiol. 108:10-14.

[51] Loessner, M., S. Guenther., S. Steffan, and S. Scherer S. A pediocin-producing Lactobacillus plantarum strain inhibits Listeria monocytogenesin a multispecies cheese surface microbial ripening consortium. Appl Environ Microbiol. 69:1854-1857.

[52] Van Reenen, C. A., M. L. Chikindas., W. H. Van Zyl, and L. M. Dicks. 2003. Characterization and heterologous expression of a class IIa bacteriocin, plantaricin 423 from Lactobacillus plantarum 423, in Saccharomyces cerevisiae. Int J Food Microbiol. 81:29-40.

[53] van Reenen, C. A, L. M. Dicks, and M. L. Chikindas. 1998. Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. J Appl Microbiol. 84:1131-1137.

[54] Ennahar, S., O. Assobhel, and C. Hasselmann. 1998. Inhibition of Listeria monocytogenes in a smear-surface soft cheese by Lactobacillus plantarum WHE 92, a pediocin AcH producer. J Food Prot. 61:186-191.

[55] Pangsomboon, K., S. Bansal., G. P. Martin., P. Suntinanalert, S. Kaewnopparat, and T. Srichana. 2009. Further characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus paracasei HL32. J Appl Microbiol. 106:1928-1940.

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12. 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 항바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 조성물.
13. 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 특이적인 항바이러스활성을 가지는 의약 조성물.
14. (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 항바이러스제 생산 방법.
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