KR101779610B1 - 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 항원의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 항원의 검출 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 키트 및 이를 이용한 방법에 의하면, 소량의 표적 항체만으로도 표적 항원을 효율적으로 검출할 수 있으며, 비특이적인 검출 신호를 줄이고, 증폭된 신호를 검출할 수 있다.

Description

면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 항원의 검출 방법{Kit for amplifying detected signal in immunosensor and method for detecting target antigen using the same}
본 발명은 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 항원의 검출 방법에 관한 것이다.
기존의 면역 센서는 보통 캡쳐 항체를 플레이트와 같은 표면 위에 고정하고, 항원을 반응시킨 후, 다시 검출 항체에 분석 가능한 표지를 붙여 사용하였다. 그러나, 종래 기술에 의하면, 첫째, 검출 신호를 증가시키기 위하여 표면에 과량의 캡쳐 항체를 흡착시킬 때 비특이적인 신호가 증가하는 문제가 발생하고, 둘째, 검출 신호를 증가시키기 위하여 과량의 검출 항체를 반응에 첨가시킬 때 비특이적인 신호가 증가하는 문제가 발생하며, 셋째, 표면에 고정된 캡쳐 항체는 1 내지 2개의 검출 항체와 결합할 수 밖에 없기 때문에 검출 신호를 증폭시키는데 한계가 있다는 단점이 있으며, 넷째, 검출 표지가 연결된 검출 항체와 캡쳐 항체 사이의 거리가 너무 짧으면 검출 표지의 성능에 영향을 미칠 수 있다는 문제점도 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트의 필요성이 요구된다.
본 발명의 일 구체예는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트를 이용하여 표적 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 제1 스페이서의 양 말단에 각각 제1 항체 및 검출 가능한 표지가 결합되어 있으며, 상기 제1항체 또는 제1 스페이서의 일부분에 스트랩트아비딘이 연결되어 있는 것인 항원 결합부; 및 제2 스페이서의 양 말단에 각각 비오틴 및 나노 입자가 결합되어 있으며, 상기 나노 입자에는 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있는 것인 신호 증폭부를 포함하는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 면역 분석 방법, 특히, 캡쳐-ELISA 방식에 있어서, 표적 항원의 검출을 위해 사용될 수 있다. 캡처-ELISA는 일반적으로, (i) 포획항체(capturing antibody)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료(예를 들어, 표적이 되는 항원을 포함하는 시료)를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 신호를 발생시키는 검출 가능한 표지가 결합되어 있고, 표적 항원에 특이적으로 반응하는 검출 항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 단계를 거치게 된다. 본 발명은 상기 (ⅲ) 단계에서 검출 가능한 표지가 결합된 검출 항체를 변형시켜 상기 (ⅳ) 단계에서 측정되는 신호를 증폭하기 위하여 상기 항원 결합부 및 신호 증폭부를 사용한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항원 결합부는 제1 스페이서의 양 말단에 각각 제1 항체 및 검출 가능한 표지가 결합되어 있으며, 상기 제1 항체 또는 상기 제1 스페이서의 일부분에 스트랩트아비딘이 연결되어 있을 수 있다.
상기 제1 항체는 상기 캡쳐-ELISA에서 검출 항체를 의미하며, 이는 표적이 되는 항원과 항원-항체 반응을 통해 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 검출 가능한 표지(detectable label)는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미하는 것으로, 상기 검출 가능한 표지는 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색 물질, 형광 물질, 인광 물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 또는 양자점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 표지는 P32 및 S35와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다. 상기 다이는 예를 들어, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 물질은 예를 들어, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 및 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 검출 가능한 표지는 효소일 수 있으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 시토크롬 P450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 제1 항체 및 검출 가능한 표지가 양 말단에 결합하고 있는 제1 스페이서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 화합물로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 캡쳐-ELISA에서 포획 항체가 표면에서 차지하는 수평 방향 길이는 약 15 nm 정도이고, 표면과 접촉하는 포획 항체까지의 수직 방향의 길이는 약 5 nm 정도이므로, 제1 스페이서의 길이는 30 내지 100 옹스트롱일 수 있으며, 50 옹스트롱인 것이 가장 바람직하다. 상기 제1 스페이서는 상기 제1 항체 및 검출 가능한 표지를 연결하는 매개체가 되며, 또한 상기 말단을 제외한 일부분에 스트랩트아비딘이 결합되어 있을 수 있다.
스트랩트아비딘은 비오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질로서, 4개의 동일 분자로 구성되어 있다. 따라서, 스트랩트아비딘 한 분자당 1 내지 4분자의 비오틴과 결합할 수 있다는 특징을 갖는다. 즉, 스트랩트아비딘을 포함하는 항원 결합부에는 비오틴을 포함하는 신호 증폭부가 4분자까지 결합할 수 있다는 것을 의미하며, 이는 본 발명의 신호 증폭에 있어서 특징적인 요소가 된다. 신호 증폭에 대해서는 추후 설명하도록 한다.
일 구체예에 따르면, 상기 신호 증폭부는 제2 스페이서의 양 말단에 각각 비오틴 및 나노 입자가 결합되어 있으며, 상기 나노 입자에는 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있을 수 있다.
용어 "나노 입자(nanoparticle)"는 직경 1 내지 1000 nm 크기의 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 바람직하게는, 10 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 입자일 수 있다. 상기 나노 입자를 이루는 성분은 예를 들어, 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐 및 백금 등과 같은 금속, CdSe, CdS, InAs, InP 등의 반도체 물질, 폴리스틸렌, 라텍스, 아크릴레이트 계열, 폴리펩티드 등의 중합 물질과 같은 불활성 물질일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 나노 입자에는 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있을 수 있으며, 검출 가능한 표지가 결합할 수 있는 개수는 상기 나노 입자의 크기에 따라 결정될 수 있다. 검출 가능한 표지에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
상기 비오틴 및 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있는 나노 입자가 양 말단에 결합하고 있는 제2 스페이서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 화합물로 이루어질 수 있으며, 일 구체예에 따르면, 상기 제2 스페이서의 길이는 30 내지 100 옹스트롱, 가잘 바람직하게는 50 옹스트롱일 수 있다. 상기 제2 스페이서는 비오틴 및 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있는 나노 입자를 연결하는 매개체가 된다.
상기 신호 증폭부는 상기 캡쳐-ELISA의 (ⅳ) 단계에서 측정되는 신호를 증폭하는 역할을 한다. 상기 신호의 증폭은 상기 설명한 바와 같이 스트랩트아비딘-비오틴의 특이적 결합으로 인하여 항원 결합부에 4개까지의 신호 증폭부가 결합할 수 있으며, 상기 신호 증폭부에 포함되어 있는 나노 입자에는 복수 개의 검출 가능한 표지가 결합되어 있으므로, 하나의 표적 항원에 대해서 한 분자의 검출 가능한 표지에 의해 발생하는 신호에 비해 훨씬 신호의 세기가 강하게 된다.
본 발명의 다른 양상은 표적 항체, 표적 항원 및 상기 항원 결합부를 접촉시키는 단계; 상기 결과물에 상기 어느 한 항의 신호 증폭부를 접촉시키는 단계; 및 상기 항원 결합부 및 신호 증폭부의 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적 항원의 검출 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 표적 항체는 플레이트 위에 고정되어 있는 것일 수 있으며, 상기 플레이트는 폴리스티렌, 금, 탄소, 인듐 틴 옥시드와 같은 물질로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 표적 항원의 검출 방법은 상기 (ⅲ) 단계에서, 검출 항체 대신에 항원 결합부 및 신호 증폭부를 접촉시키는 것을 제외하고는 일반적인 캡쳐-ELISA의 방법을 사용하는 것이며, 이는 상기 설명한 바와 같다.
상기 방법에서 항원 결합부, 신호 증폭부를 접촉시킨 후에는 상기 접촉에 의해 특이적으로 결합하지 않은 항원 결합부, 신호 증폭부를 제거하기 위한 세척 과정을 더 포함할 수 있다. 상기 과정을 거침으로서, 비특이적으로 발생하는 신호를 줄일 수 있으며, 더욱 민감하게 신호를 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 키트 및 이를 이용한 방법에 의하면, 소량의 표적 항체만으로도 표적 항원을 효율적으로 검출할 수 있으며, 비특이적인 검출 신호를 줄이고, 증폭된 신호를 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 항원 결합부의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 신호 증폭부의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 본 발명의 키트를 이용하여 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하여 표적 항원을 검출하는 방법을 나타낸다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 본 발명의 키트를 이용하여 표적 항원의 검출을 위한 샌드위치 ELISA 결과 및 전극실험 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 본 발명의 키트에서 항원 결합부를 나타내는 모식도이고, 도 2는 일 구체예에 따른 본 발명의 키트에서 신호 증폭부를 나타내는 모식도이다. 도 3은 일 구체예에 따른 본 발명의 키트를 이용하여 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하여 표적 항원을 검출하는 방법을 나타낸 것이다.
이하 도 1 내지 도 3을 참조하여, 본 발명의 키트를 이용하여 표적 항원을 검출하는 방법의 일 구체예를 설명하도록 한다.
도 1은 일 구체예에 따른 항원 결합부의 모식도를 나타낸 것으로, 제1 항체(100), 제1 스페이서(110), 스트랩트아비딘(120) 및 검출 가능한 표지(130)가 도시되어 있다. 제1 항체(100)는 표적 항원과 결합하는 항체로서, 제1 스페이서(110)를 통해 검출 가능한 표지(130)와 연결되어 있다. 또한, 스트랩티아비딘(120)은 상기 제1 항체(100) 또는 제1 스페이서(120)의 일부분에 결합되어 있다. 스트랩트아비딘(120)은 4개의 동일 분자로 구성된 물질로 1 분자당 1 내지 4 분자의 비오틴과 결합할 수 있다는 특징이 있다.
도 2는 일 구체예에 따른 신호 증폭부의 모식도를 나타낸 것으로, 비오틴(140), 제2 스페이서(150), 나노 입자(160) 및 검출 가능한 표지(130)가 도시되어 있다. 비오틴(140)은 상기 항원 결합부의 스트랩트아비딘(120)과 특이적인 결합을 할 수 있는 분자로서, 제2 스페이서(150)을 통해 나노 입자(160) 또는 검출 가능한 표지(130)와 결합되어 있다. 또한, 상기 나노 입자(160)에는 복수개의 검출 가능한 표지(130)가 결합되어 있어서 하나의 검출 가능한 표지가 결합되어 있는 경우에 비하여 더욱 증폭된 신호를 방출할 수 있다.
도 3은 상기 항원 결합부 및 신호 증폭부를 이용하여 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하여 표적 항원을 검출하는 방법의 일 구체예를 나타낸 것이다.
표면에 고정된 표적 항체(170)는 표적 항원(180)과 항원-항체 반응에 의해서 복합체를 형성하게 되고, 여기에 항원 결합부를 접촉시키면, 표적 항원(180)에 상기 항원 결합부의 제1 항체(100)와 항원-항체 반응을 나타내게 된다. 제1 항체(100)와 제1 스페이서(110)로 결합된 검출 가능한 표지(130)는 항원 결합부만 존재하는 경우라면 이로부터 발생하는 신호가 크지 않지만, 신호 증폭부에 의해 발생하는 신호를 증폭시킬 수 있다. 항원 결합부에는 스트랩트아비딘(120)이 결합되어 있고, 이는 신호 증폭부의 비오틴(140)과 특이적으로 결합이 가능하며, 비오틴(140)과 제2 스페이서(150)를 통해 연결되어 있는 나노 입자(160)에 다수의 검출 가능한 표지(130)가 결합되어 있어, 한 분자의 항원 결합부의 결합만으로도 민감도가 높은 신호의 검출이 가능하다.
실시예 1: 항원 결합부 및 신호 증폭부의 제조 방법
항원 결합부의 제조 방법은 다음과 같다. 먼저, 폴리에틸렌 글리콜의 한쪽에는 아민기와 결합 가능한 갖는 N-히드로숙신이미드 에스테르 그룹을 결합시키고, 다른 한쪽에는 술피드릴기와 결합 가능한 말레이미드 그룹을 결합시킨 다음, 알칼라인 포스파타아제는 에틸말레이미드와 반응시켜 자체적인 폴리머 형성을 억제 시켜놓고, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드로숙신이미드 그룹에 알칼라인 포스파타아제를 공유 결합시키고, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말레이미드 그룹에는 환원된 헤파티티스 B 항체(제조사: 아리스타)를 공유 결합시켰다. 그리고 N-히드로숙신이미드 그룹과 연결된 술피드릴기를 환원된 헤파티티스 B 항체의 아민기에 추가로 공유 결합시켰다. 스트랩트아비딘은 상기 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드로숙신이미드 그룹에 결합시키고, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말레이미드 그룹에는 추가로 부착된 환원된 헤파티티스 B 항체의 술피드릴기와 공유결합 시켰다.
신호 증폭부의 제조 방법은 다음과 같다. 먼저, 카르복실기를 붙착시킨 직경 약 130 nm의 폴리스티렌 비드를 이디씨/술포엔에에스치 (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)/ Sulfo N-hydroxysulfosuccinimide(Sulfo-NHS))를 첨가하여 N-히드로숙신이미드 그룹을 비드에 결합시킨 다음, 과량의 알칼라인 포스파타아제를 비드의 N-히드로숙신이미드 그룹에 반응시켜 복수개의 알칼라인 포스파타아제가 결합된 폴리스티렌 비드를 제작하였다. 이후, 알칼라인 포스파타아제가 결합된 폴리스티렌 비드에 N-히드로숙신이미드 그룹을 가지는 비오틴을 공유 결합시켰다.
실시예 2: 샌드위치 ELISA 를 이용한 헤파티티스 B 항원의 검출 및 신호의 증폭 확인
폴리스티렌의 표면에 헤파티티스 B 항체를 고정시키고, 여기에 헤파티티스 B 항원을 100uL(1ng/mL)첨가하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후, 상기 실시예 1에서 제조한 항원 결합부를 100uL(1ug/mL) 첨가하여 상기 헤파티티스 B 항원과 반응시킨 다음, 트리스 완충용액으로 세척하여 반응하지 않은 항원 결합부를 제거하였다. 여기에 실시예 1에서 제조한 신호 증폭부를 100uL(1ug/mL) 첨가하여 항원 결합부의 스트랩트아비딘과 신호 증폭부의 비오틴이 충분히 결합할 수 있도록 하였다. 결합하지 않은 신호 증폭부를 트리스 완충용액으로 세척하여 제거한 다음, 기질용액을 첨가하여 스페트로포토미터(제조사: Bio-rad)로 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(실험 2). 대조군으로는 상기 항원 결합부 대신 알칼라인 포스파타아제가 결합된 헤파티티스 항체를 100uL(1ug/mL) 첨가하였고, 비교 실험으로는, 상기 항원 결합부만을 첨가한 다음, 신호 결합부를 첨가하지 않고 흡광도를 측정하였다(실험 1). 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 항체 결합부와 신호 증폭부를 모두 반응시킨 실험군(실험 2)에서 가장 높은 흡광도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
신호의 증폭 여부를 전기 화학적으로 측정하기 위해, 금 전극 표면에 헤파티티스 B 항체를 고정시키고, 여기에 마이크로 채널을 만든 다음 헤파티티스 B 항원 7uL(1ng/mL)첨가하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후, 상기 실시예 1에서 제조한 항원 결합부를 채널에 7uL(1ug/mL) 주입하여 상기 헤파티티스 B 항원과 반응시키고, 반응하지 않은 항원 결합부를 트리스 완충용액으로 제거하였다. 여기에 실시예 1에서 제조한 신호 증폭부를 채널에 7uL(1ug/mL) 주입하여 항원 결합부의 스트랩트아비딘과 신호 증폭부의 비오틴이 충분히 결합할 수 있도록 하였다. 결합하지 않은 신호 증폭부를 트리스 완충용액으로 세척하여 제거한 다음, 기질용액(10mM의 아미노페닐인산염)을 채널에 주입하고 potentiostat(제조사: princeton)을 이용해 전극으로부터 전기신호를 측정하였다(실험 2). 대조군으로는 상기 항원 결합부 대신 알칼라인 포스파타아제가 결합된 헤파티티스 항체를 첨가하였고, 비교 실험으로는, 상기 항원 결합부만을 첨가한 다음, 신호 결합부를 첨가하지 않고 전기신호를 측정하였다(실험 1). 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 항체 결합부와 신호 증폭부를 모두 반응시킨 실험군(실험 2)에서 가장 높은 전류 흐름이 나타남을 확인할 수 있었다.
100: 제1 항체
110: 제1 스페이서
120: 스트랩트아비딘
130: 검출 가능한 표지
140: 비오틴
150: 제2 스페이서
160: 나노 입자
170: 표적 항체
180: 표적 항원

Claims (6)

  1. 제1 스페이서의 양 말단에 각각 제1 항체 및 검출 가능한 표지가 결합되어 있으며, 상기 제1 항체의 일부분에 스트랩트아비딘과 결합된 제1 스페이서가 연결되어 있고, 상기 스트랩트아비딘은 제1 스페이서의 N-히드로숙신이미드 에스테르 그룹과 결합되어 있는 것인 항원 결합부; 및
    제2 스페이서의 양 말단에 각각 비오틴 및 나노 입자가 결합되어 있으며, 상기 나노 입자에는 하나 이상의 검출 가능한 표지가 결합되어 있는 것인 신호 증폭부를 포함하고,
    상기 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 30 내지 100 옹스트롱의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 발색 물질, 형광 물질, 인광 물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노 입자는 10 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 센서에서 검출 신호를 증폭하기 위한 키트.
  5. 표적 항체, 표적 항원 및 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 항원 결합부를 접촉시키는 단계;
    상기 결과물에 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 신호 증폭부를 접촉시키는 단계; 및
    상기 항원 결합부 및 신호 증폭부의 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적항원의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표적 항체는 플레이트에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 항원의 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2003322654A (ja) * 2002-02-27 2003-11-14 Hitachi Software Eng Co Ltd 生体高分子の検出方法
WO2006116742A2 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Ventana Medical Systems, Inc. Fluorescent nanoparticles conjugated to antibodies via a peg linker

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