KR101772440B1 - 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 후각 수용체인 OR10J5가 발현되는 세포 또는 조직, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 심장 대동맥, 관상 동맥 및 내피 세포에서 신생혈관생성을 촉진하는 효과가 있다.

Description

4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물 {Composition for promoting angiogenesis including 4-(4-hydroxy-4-methylpentyl)-3-cyclo-hexene-1-carboxaldehyde}

본 발명은 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

후각 수용체는 G 단백질과 결합하는 수용체로서 일반적으로 후각 감각 뉴런 (olfactory sensory neurons, OSN)에서 발현된다. 냄새를 맡는 첫 번째 과정은 냄새 분자가 수용체에 결합하는 것을 포함한다. 인간 및 마우스에서 후각 수용체를 발현할 것으로 예상되는 기능적 유전자는 각각 350개 및 1,000개가 있고, 후각 수용체는 냄새 분자에 대하여 조합하여 활성화됨으로써 수 천 가지의 냄새 분자를 구분할 수 있게 된다. 냄새 분자가 결합하면 G 단백질과 결합한 수용체가 활성화되어 ACIII (type III adenylyl cyclase)가 자극됨으로써 cAMP 수준이 높아진다. 이에 따라 Ca^{2 +}가 축적되게 되고, 결과적으로 세포막 포텐셜이 변하여 뇌에서 냄새를 인지하게 된다. 또한, 후각 수용체가 후각신경세포에서뿐만 아니라 다른 다양한 조직에서도 발현되는데, 후각 수용체는 정자의 운동, 신장에서 사구체의 여과 속도, 근육 재생성 및 케라틴 생성 세포의 자극에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 흥미롭게도 비-후각신경세포에서 냄새 분자에 의해서 유도된 신호 전달 경로는 후각 뉴런에서 관찰된 것과 동일한 cAMP-Ca²⁺ 신호 연쇄작용에 따라 진행된다.

산소 및 영양분을 새로 성장하는 조직에 전달하기 위하여 신생혈관형성이라고 알려진 모혈관 (parent vessel)으로부터 미세혈관 (microvessels)의 성장이 일어나는데, 이는 혈관 리모델링, 여성 생식 주기 및 상처 치료 등에서 중요한 과정이다. 그러나 비 정상적인 신생혈관형성은 암, 당뇨망막병증 및 류마티스 관절염을 유발한다. 이와 같이 신생혈관형성이 인간의 질병뿐만 아니라 건강을 유지하는 데에 중요한 역할을 하기 때문에, 신생혈관형성을 제어하는 것이 혈관 관련 질환을 효과적으로 치료하고 예방하는 방법일 것이다. 신생혈관형성 과정에서, 내피 세포는 세포의 활성, 이동 및 관 형성에 중요한 역할을 한다. 또한 Ca^{2 +}는 신생혈관형성 동안 인간 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)의 증식 및 침습에 중요한 역할을 한다.

본 발명은 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 후각 수용체 OR10J5를 발현하는 세포 또는 조직의 신생혈관형성을 촉진하고, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 세포 또는 조직은 심장 대동맥, 관상 동맥 및 내피 세포일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 관상동맥질환, 뇌졸증, 심근경색, 궤양, 협심증 및 심근경색을 포함하는 허혈성 심장질환, 당뇨병성 신경병증 및 하지허혈증을 포함하는 허혈성 질환을 치료할 수 있다.

4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드는 리랄이라고도 불리며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

신생혈관형성은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 정상적인 생리작용으로 발생과정과 상처 치유 및 여성의 생식 사이클에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편 신생혈관형성이 불충분한 경우, 관상동맥질환, 뇌졸증, 심근경색, 궤양, 상처 치유의 지연 등이 있을 수 있다 (Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases Nature 407:249-257, 2000.). 따라서 신생혈관형성을 촉진함으로써 상기의 질환 뿐만아니라, 협심증 및 심근경색을 포함하는 허혈성 심장질환, 당뇨병성 신경병증, 하지허혈증과 같은 허혈성 질환을 치료할 수 있는 기전으로 알려졌다 (Hugo H. Marti, Werner Risau. Angiogenesis in Ischemic Disease. Thrombosis and Haemostasis. 82:44-52, 1999; Douglas W. Losordo, Stefanie Dimmeler. Therapeutic Angiogenesis and Vasculogenesis for Ischemic Disease. Circulation 109:2487-2491. 2004; J. Anthony Ware, Michael Simons. Angiogenesis in ischemic heart disease. Nature Medicine 3:158 - 164. 1997).

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 리랄을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 리랄에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 계면활성제의 예로는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE·POP (폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE·POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다. 음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다. 양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급암모늄염 등을 들 수 있다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.2 내지 200 ㎎/kg으로, 바람직하게는 2 내지 100 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 본 발명의 리랄을 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명은 상기의 수단을 통하여 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드를 포함하는 신생혈관형성 촉진용 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 후각 수용체 OR10J5의 리랄의 농도에 따른 Ca^{2 +} 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, siRNA로 형질 주입된 HUVEC 세포에서의 OR10J5의 발현 양을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과 (도 2A) 및 리랄 및 siRNA를 처리한 경우의 Ca²⁺의 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프(도 2B) 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, OR10J5가 녹다운된 HUVEC 세포에서는 리랄에 의해 유도된 이동이 저해됨을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, OR10J5가 녹다운된 HUVEC 세포에서 리랄에 의해 유도되는 AKT의 Ca²⁺ 의존적 인산화가 저해됨을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, in vivo에서 리랄이 신생혈관형성을 촉진함을 마트리젤을 이용하여 확인한 사진 (도 5A) 및 그래프 (도 5B)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 재료 및 방법

1.1. 재료

리랄 및 이오노마이신 (ionomycin)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드 (4-(4-hydroxy-4-methylpentyl)-3-cyclo-hexene-1-carboxaldehyde; lyral; 이하 리랄이라 한다) 는 10% fetal bovine serum을 포함한 DMEM 세포배양액 (WelGene Gyengsan-si, Geyngsandbuk-do, Republic of Korea)에서 Branson 5800 초음파 기기 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA)로 30분 처리하여 준비하였다. Ca^{2 +} 어세이 (assay) 키트는 Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입하였고, 세포 이동 (cell migration) 어세이 키트는 Biolabs, Inc. (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 마트리젤 (Matrigel)은 Millipore Inc. (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 인간 OR10J5에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서, 인산-AKT 및 인산-ERK 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서, β-액틴 항체는 Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX, USA)에서 구입하였다. OR10J5-특이적 siRNA (small interfering RNAs) 및 비-표적 (non-targeting) siRNA 대조군은 Thermo Scientific, Inc. (Waltham, MA, USA)에서 구입하였고, 이들의 형질 주입에 사용한 시약 Dharmafect4는 Dharmacon GE, Inc. (Lafayette, CO, USA)에서 구입하였다.

1.2. 세포 배양

HUVEC 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% FBS (fetal bovine serum) 및 1% 항생제 (Welgene, Daegu, South Korea)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37 ℃로 5% CO₂ 인큐베이터를 이용하여 배양하였다.

1.3. OR10J5 siRNA 형질 주입

OR10J5에 대한 4개의 siRNA (각각 12.5 nM, 총 50 nM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; cat: Scientific LQ-022371-02-0002) 또는 대조군으로 이용된 비-표적 siRNA (50 nM, Thermo Fisher Scientific; cat: D001810-02-20)는 HUVEC 세포에 정해진 절차에 따라 Thermo Scientific Dharmafect4 형질 주입 시약을 이용하여 형질 주입 되었다. 형질 주입으로부터 2일 후, HUVEC 세포를 분석하였다.

1.4. 냄새 분자 자극 및 Ca ²⁺ 유입 어세이

HUVEC 세포를 96-웰 마이크로플레이트 (96- well microplate)에 분주하고 밤새도록 배양하였다. 로딩 완충액 (Ca^{2 +} 어세이 시약, 1X Hank's Balanced Salt solution, 20 mM HEPES 완충액, pH 7.4) 을 세포에 주입하고 30분 동안 실온에서 배양한 후 37 ℃에서 15분 동안 배양하였다. 어세이 플레이트를 FlexStation (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)으로 옮기고 리랄 및 양성 대조군인 아이오마이신을 첨가하여 자극하였다. 세포 내 Ca^{2 +} 유입 수준을 정해진 절차에 따라 측정하였고 SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용해 분석하였다.

1.5. 세포 이동 어세이

HUVEC 세포의 이동 특성은 24-웰 플레이트 CytoSelect™ 세포 이동 어세이 키트를 이용하여 측정하였다. 리랄 (0.625 mM, 1.25 mM 및 2.5 mM)이 첨가된 1% FBS 또는 양성 대조군으로 이용된 리랄이 첨가되지 않은 5% FBS 배양액을 이동 플레이트 (migration plate) 의 아래쪽 웰에 분주하였다. 밤새 1% FBS 에서 굶주리도록 배양한 HUVEC 세포를 위쪽 웰에 1.0 X 10⁶ 개씩 분주하였다. 24시간 후, 바닥의 폴리카보네이트 막에 이동한 세포를 추출하여 염색하고 560 nm에서 정량하였다.

1.6. 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석

인간의 심장 대동맥 및 심장 관상동맥 조직 추출물은 Proteus Biosciences, Inc. (Ramona, CA, USA)에서 구입하였다. OR10J5가 HUVEC 세포 및 혈관 조직에서 발현되는지를 확인하기 위하여, 세포 내 총 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 단백질의 발현 정도는 특이적 항체를 이용하여 확인하였다. HUVEC 세포를 리랄로 7분간 자극하고 단백질 분해효소 저해제 및 인산화효소 저해제 (Roche, Basel, Switzerland)가 포함된 RIPA (Radioimmunoprecipitation assay) 완충액 (Biosesang, Seongnam, South Korea)에서 용해시켰다. 추출된 단백질은 웨스턴 블랏을 이용하여 리랄이 신생혈관형성의 신호 전달에 미치는 영향을 확인하였다.

1.7. 동물 실험

6주령된 수컷 C57BL/6J 마우스를 Nara biotech (Seoul, Korea)에서 구입하고 24 ± 1 ℃ 및 50% 상대 습도로 유지되는 항온·항습실에서 광주기와 암주기를 각각 12시간씩으로 하여 사육하였다.

1.8. 마트리젤 플러그 어세이 (Matrigel plug assay)

in vivo 에서 리랄의 신생혈관형성 활성은 마트리젤 플러그 어세이를 이용하여 확인하였다 (A. Passaniti, R.M. Taylor, R. Pili, Y. Guo, P.V. Long, J.A. Haney, R.R. Pauly, D.S. Grant, G.R. Martin, A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor, Lab. Invest. 67 (1992) 519e528.). 최종적으로는 리랄을 처리한 군과 처리하지 않은 군에 0.6 ml 의 마트리젤을 6주령된 수컷 C57BL/6J 마우스의 등 피부조직 아래로 주입하였다. 2주 후, 상기 마우스를 마비시키고 마트리젤 플러그를 제거한 후 입체경 (stereoscope, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하고 사진을 촬영하였다. 마트리젤 플러그에 형성된 혈관의 길이는 Image-Pro Plus V 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD)를 이용하여 측정하였다.

실시예 2. 결과

2.1. 비-후각신경 조직 및 비-후각신경 세포에서 인간 후각 수용체 10J5의 발현

OR10J5 발현을 인간 조직 및 세포에서 확인한 결과, OR10J5는 내피 세포 (endothelial cell), 평활근 (smooth muscle) 및 결합 조직 (connective tissue)으로 구성된 인간 대동맥 및 관상동맥에서 모두 발현되었으며 (도 1A), HUVEC 세포에서도 높은 발현 양을 보였다. 또한 OR10J5의 발현이 기능적인지 확인하기 위하여 리랄로 자극한 후에 Ca^{2 +} 수준을 관찰하였다. 리랄이 Ca^{2 +} 수준을 투여량에 의존적으로 증가시켰다 (도 1B). 이를 통해 볼 때 OR10J5는 HUVEC 세포에서 리랄에 기능적으로 반응하는 후각 수용체 중 하나임을 알 수 있다.

2.2. HUVEC 세포에서 리랄에 의한 Ca ²⁺ 의 증가

여러 후각 수용체는 동일한 냄새 분자에 대해서도 상이한 정도로 활성화 되기 때문에 (B. Malnic, J. Hirono, T. Sato, L. Buck, Combinatorial receptor codes for odors, Cell 96 (1999) 713-723.; P. Mombaerts, Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors, Nat. Rev. Neurosci. 5 (2004) 263-279.), 리랄에 의해서 Ca^{2 +} 수준이 증가한 것이 OR10J5의 활성화에 의한 것인지 4가지 siRNA 를 이용하여 확인하였다. OR10J5에 대한 siRNA가 HUVEC 세포에서 OR10J5의 발현을 90%정도 까지 효과적으로 억제한 반면 비특이적 siRNA는 OR10J5의 발현을 거의 억제하지 못하였다 (도 2A). OR10J5의 Ca^{2 +} 수준의 변화에 미치는 영향을 측정하기 위하여, HUVEC 세포에 siRNA 형질 유입을 시키고 리랄로 자극한 후 Ca^{2 +} 유입 어세이를 수행하였다. OR10J5이 넉다운된 군의 경우 리랄에 의해 유도되는 Ca^{2 +} 증가의 정도가 현저히 감소하였다 (도 2B). 또한, siRNA를 25 nM, 50 nM, 및 100 nM로 처리하였을 때 Ca^{2 +} 수준은 각각 20 %, 42 %, 및 50 %만큼 감소되어 Ca^{2 +} 의 감소는 투여량에 의존적인 것으로 나타났다. 이를 통해 볼 때 OR10J5는 HUVEC 세포에서 Ca^{2 +} 수준을 높이는 데에 중요한 역할을 하는 수용체 중 하나인 것을 알 수 있었다.

2.3. 리랄에 의해서 유도된 HUVEC 세포의 이동

내피 세포 이동은 신생혈관형성의 중요한 특징이기 때문에, 세포의 이동을 폴리카보네이트 막이 담겨있는 트랜스-웰에서 확인하였다. 리랄은 HUVEC 세포의 이동을 투여량 의존적으로 촉진시켰다 (도 3). 그러나 OR10J5이 넉다운된 군의 경우 리랄에 의해 유도되는 이동은 완전히 저해되었다. 이를 통해 볼 때 HUVEC 세포의 이동은 OR10J5과 리랄의 상호작용에 의해 주로 매개됨을 알 수 있다.

2.4. HUVEC 세포에서 리랄에 의해 유도된 AKT 및 ERK의 인산화

리랄의 신생혈관형성 신호 전달 경로 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 신생혈관형성과정 중 세포 이동에 중요한 신호 물질인 AKT 및 ERK의 인산화 정도를 확인하였다. HUVEC 세포에서 AKT 및 ERK의 인산화는 리랄로 자극한 경우 증가하였지만, OR10J5이 넉다운된 군의 경우에는 리랄에 의해 유도된 인산화는 저해되었다 (도 4A). HUVEC 세포에서 AKT의 인산화가 Ca^{2 +}-의존적인지 확인하기 위하여 이온 투과담체 (ionophore)로 알려진 이오노마이신을 처리한 후 AKT의 인산화를 측정하였으며, 그 결과 HUVEC 세포에서 AKT의 인산화는 Ca^{2 +}에 의존적임을 확인하였다. 따라서 리랄에 의해 유도된 HUVEC 세포의 이동은 Ca^{2 +}-의존적 AKT 신호 기전에 의해 조절된다고 할 수 있다. 결과적으로, OR10J5는 신생혈관형성 동안 중요한 신호 물질의 인산화 및 세포의 이동을 조절하는 주요한 수용체임을 알 수 있다.

2.5. in vivo 에서 리랄의 신생혈관형성을 증진 효과

in vivo에서 리랄이 신생혈관형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마트리젤 플러그 어세이를 이용하여 신생혈관형성 활성을 확인하였다. PBS (phosphate buffer saline) 또는 5mM 리랄을 포함하는 마트리젤을 각각 동일한 수컷 마우스의 왼쪽 등과 오른쪽 등의 피하에 주입하였다. 그로부터 2주 후 상기 마트리젤을 촬영하고 정량하였다. 리랄을 처리한 마트리젤에서 새로 형성된 추가적인 혈관이 분명하게 형성되었다 (도 5A). 30마리의 마우스 중 2마리의 주입 위치에 염증반응이 발생했고, 2마리에서는 용혈이 관찰되었으며, 4마리에서는 혈관이 발견되지 않았지만, 나머지 22마리의 리랄을 포함하는 마트리젤이 대부분 더 진한 노란색을 띄었다. 새로운 혈관의 수나 길이는 각각의 마우스마다 상이했기 때문에 PBS 마트리젤에 대한 리랄을 처리한 마트리젤의 증가 배수로 측정하였다. 리랄을 포함하는 마트리젤에서 혈관의 총 길이는 대조군에 비하여 5배가량 크게 증가하였다 (n = 22, p < 0.05). 리랄을 처리한 군 중 12마리의 마우스에서 혈관의 길이가 9배가 증가하였다. 결론적으로 in vivo에서도 리랄이 신생혈관형성에 중요한 인자임을 확인할 수 있었다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는 데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

1. 유효성분인 하기 화학식 1로 표현되는 4-(4-하이드록시-4-메틸펜틸)-3-사이클로-헥센-1-카복스알데하이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 후각 수용체 OR10J5를 발현하는 세포 또는 조직의 신생혈관형성을 촉진하여, 관상동맥질환, 뇌졸증, 심근경색, 허혈성 심장질환 및 하지 허혈증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
   [화학식 1]
   

   

   .
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 세포 또는 조직은 심장 대동맥, 관상 동맥 또는 내피 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 삭제

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