KR101770871B1 - Pharmaceutical Composition Comprising Dryopteris crassirhizoma Extract for the Treatment of Degenerative Brain Diseases - Google Patents
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Abstract
본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 관중 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 천연 식물인 관중에서 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 것으로서, 베타-아밀로이드 응집체의 형성을 억제하는 효과가 있으므로 알츠하이머성 치매 등, 퇴행성 뇌 질환의 예방 및 치료가 가능하다. 뿐만 아니라, 천연물 유래 추출물을 그 유효성분으로 하므로, 부작용이나 세포 독성에 대한 문제가 없는 장점이 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator as an active ingredient. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising the extract of the present invention as an active ingredient contains the extract extracted from a natural plant as an active ingredient and has an effect of inhibiting the formation of beta-amyloid aggregates. Therefore, Can be used for prevention and treatment of degenerative brain diseases. In addition, since the extract derived from a natural product is an effective ingredient thereof, there is no problem about side effects or cytotoxicity.
Description
본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator as an active ingredient.
치매(dementia)는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상이며 그 원인에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구별된다. Dementia is a morbid phenomenon distinguishable from normal aging and is distinguished by the cause of Alzheimer's disease, vascular dementia, other alcoholism, trauma, and dementia resulting from Parkinson's disease do.
이중, 알츠하이머성 치매의 발병기전은 명확히 알려져 있지 않으나, 신경독성단백질인 베타-아밀로이드(β-amyloid protein)의 독성이 가장 중요한 원인으로 제시되고 있다. 이 물질은 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein, 이하 APP)의 잘못된 대사로 인해 생성되는 것으로 알려져 있고, APP의 정상 대사물은 신경세포보호작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 최근 유전공학적 방법을 이용한 연구결과에서는 베타-아밀로이드(β-amyloid)등의 독성 단백질이 세포와 혈관에 쌓여 신경세포에 독성을 미침으로써 결과적으로 뇌기능에 장애가 초래된다는 사실이 밝혀졌다The mechanism of the onset of Alzheimer's dementia is not clearly known, but the toxicity of the neurotoxic protein, β-amyloid protein, is suggested as the most important cause. This substance is known to be produced by the incorrect metabolism of amyloid precursor protein (APP), and the normal metabolite of APP has been reported to have nerve cell protection function. Recent studies using genetic engineering have shown that toxic proteins such as β-amyloid accumulate in cells and blood vessels and become toxic to nerve cells, resulting in impaired brain function
현재까지 치매 치료를 위한 약물치료는 아세틸콜린 전구체를 투여하거나 아세틸콜린의 분해를 저해하는 약물을 투여하여 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여주는 치료방법이 사용되어 왔다. 대표적인 약물로는 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine) 등이 있다.To date, medication for the treatment of dementia has been used to treat acetylcholine precursors or to increase acetylcholine levels in the brain by administering a drug that inhibits acetylcholine degradation. Typical drugs include tacrine, donepezil, rivastigmine, and galantamine.
다만, 기존의 치매 치료제는 주로 아세틸콜린에스터라제 억제 효과만을 가지고 있을 뿐, 베타-아밀로이드의 형성 억제 기능은 없었다. 따라서, 치매의 근원적 치료가 불가능하였다.However, the existing dementia treatment agent mainly has only acetylcholinesterase inhibiting effect, but has no inhibitory effect on the formation of beta-amyloid. Therefore, it was impossible to cure dementia.
뿐만 아니라, 여러 화학 물질들을 포함하는 현존하는 치매 치료제들은 구역, 구토, 어지러움, 설사, 신경계이상 등의 부작용이 빈발하는 문제가 있다.In addition, existing dementia therapies including various chemical substances have a problem that side effects such as nausea, vomiting, dizziness, diarrhea and nervous system disorders frequently occur.
따라서, 베타-아밀로이드 응집체를 억제할 수 있는 효과를 가지면서도 부작용이 적은 천연물 유래 치매 예방 치료제의 개발이 절실한 실정이다.Therefore, there is an urgent need to develop a therapeutic agent for preventing and treating dementia of natural origin, which has an effect of inhibiting beta-amyloid aggregates and has less side effects.
본 발명은 관중 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator.
알츠하이머 병 (Alzheimer's Disease)은 뇌 조직이 기능을 잃으면서 점차 정신기능이 쇠퇴해가는 치매의 한 종류이며 치매유발의 가장 흔한 원인인 질환으로 65세 이상의 노인에게 주로 나타나는 퇴행성 뇌 질환이다. 알츠하이머 병은 점진적으로 기억력이 감퇴되고 인지력이 상실되는 증상을 가진다. 초기에는 학습능력과 최근의 사건을 기억하는 능력이 심각하게 감소하지만 청소년 시절과 같은 오래된 과거에 대한 기억력은 질병이 많이 진행될 때까지 유지된다. 또한 약속을 잊어버리거나 물건을 잘못 두거나 잘 아는 곳에서 길을 잃고 돈 계산을 잘 못하는 등의 중상이 일어난다. 중기의 환자는 점차 말하는 것에서도 어려움을 느끼게 되고 물건을 잘 사용하지 못하게 되는데 치매가 진행됨에 따라 거리를 배회하고 호전적이게 되며 요실금 현상을 나타내기도 한다. 또한 말기에는 먹고,걷고 의사소통 하는 능력을 잃게 된다. 따라서 대부분의 환자는 발병한 후 3-20년 내에 질식 감염 등에 의해 사망하게 된다.Alzheimer's Disease (Alzheimer's Disease) is a type of dementia that gradually declines in mental function due to loss of function of brain tissue. It is the most common cause of dementia, and it is a degenerative brain disease that occurs mainly in elderly people over 65 years old. Alzheimer's disease progressively has symptoms of memory loss and cognitive impairment. Initially, learning ability and ability to remember recent events are severely reduced, but memories of old past like youth are maintained until disease progresses. In addition, there are serious injuries such as forgetting promises, misplaced things, getting lost in a familiar place, and failing to make money. In the mid-term, patients gradually feel difficulty in speaking and become unable to use the product well. As the dementia progresses, they are wandering the streets, becoming belligerent, and exhibiting urinary incontinence. Also, at the end, you lose the ability to eat, walk and communicate. Therefore, most patients die from vaginal infection within 3 to 20 years after the onset.
알츠하이머 병의 병리학적 특정으로는 신경 세포의 핵 주위에서 신경섬유들이 엉켜 만들어진 신경섬유다발(neurofibrillary tangles)과 신경세포의 외부에 축적되는 노인성 반점(senile plaques)을 들 수 있다. 신경섬유다발 (neurofibrillary tangles)은 신경세포의 골격구조인 미세소관 관련 단백질을 안정화하는 단백질인 타우(tau) 단백질이 과인산화 되어 생성된 응집체이다. 이로 인해 정상 미세소관의 구조가 파괴되고 축산 수송이 이루어지지 못하게 되며,신경세포 내에 신경섬유다발이 생성되면서 점차 많은 수의 신경 세포가 기능 장애,나아가 사멸하게 된다. 노인성 반점 (senile plaques)은 응집된 베타-아밀로이드 (Aβ)의 주위에 신경교세포, 미세아교세포 및 성상세포 동 염증세포들이 모여 있는 것으로 주성분인 베타-아밀로이드는 신경세포 퇴행을 유도하는 독성을 갖는 원인물질로 알려져 있다. The pathological specifics of Alzheimer's disease include neurofibrillary tangles in which nerve fibers are entangled around the nucleus of nerve cells and senile plaques accumulated outside of nerve cells. Neurofibrillary tangles are aggregates produced by over-phosphorylation of tau protein, a protein that stabilizes microtubule-related proteins, the skeletal structure of nerve cells. As a result, the structure of normal microtubules is destroyed and livestock transport can not be performed. As a bundle of nerve fibers is generated in nerve cells, an increasing number of nerve cells become dysfunctional, and furthermore, die. Senile plaques are characterized by aggregation of glial cells, microglia, and astrocytic inflammatory cells around aggregated beta-amyloid (Aβ), the main component of which is beta-amyloid, which causes neurodegenerative toxicities It is known as a substance.
베타-아밀로이드 (Aβ)는 APP(amyloid precusor protein) 라는 type 1 integral membrane glycoprotein에서 유래된 단백질이 분해효소에 의해 각각 N-, C-terminal이 잘려 생성되는 대사산물로서 extracellular domain과 membrane domain으로 이루어져 있는 36-43개의 펩타이드이다. 베타-아밀로이드 생성에 관여하는 효소로는 β-site APP-cleaving enzyme (BACE1)이라 명명된 β-secretase와 최소 네 개의 단백질 복합체 (presenilin 1 or 2, presenilin enhancer 2, anterior pharynx, nicastrin)로 이루어진 γ-secretase가 있으며 이 같은 단백질 분해 효소에 의해 베타 아밀로이드가 생성되는 대사과정을 amyloidogenic pathway라고 한다. β-secretase (BACE1)에 의해 잘려진 APP는 90 kDa 내외의 sAPPβ라 불리는 N-terminal domain과 CTFβ(C99)라 불리는 cytoplasmic domain으로 나눠지는데 이렇게 생성된 sAPPβ는 세포 밖으로 분비되며 C99는 다시 y-secretase에 의해 잘려 4 kDa의 베타-아밀로이드가 생성된다. 이와는 반대로 non-amyloidogenic pathway는 APP의 α-site를 자르는 α-secretase에 의해 일어나며 16/17번째 아미노산 사이를 잘라 베타 아밀로이드가 형성되지 않게 하는 대사과정이다. α-secretase는 disintegrin domain과 metalloproteinase domain을 갖는 α-disintegrin metalloproteinase domain (ADAM) family에 속하는 단백질 분해 효소로 ADAM-9, ADAM-10, ADAM-17 이 그 구성원으로 생각되고 있다. α-secretase (ADAM10 or 1 7)가 APP를 자르게 되면 sAPPα라 불리는 N-terminal domain과 CTFα(C83) 라 불리는 cytoplasmic domain으로 잘리게 되는데 C83은 다시 γ-secretase에 의해 잘려져서 p3라고 불리는 3 kDa의 조각을 만들어 내게 된다.Beta-amyloid (Aβ) is a metabolite produced by cleavage of N-terminal and C-terminal by a protease from a
베타-아밀로이드에 의해 신경세포사멸이 유도되는 단계를 간단히 살펴보면 먼저 APP로부터 amyloidogenic pathway에 의해 단계적으로 베타-아밀로이드가 생성되고 이렇게 생성된 monomer 형태의 베타-아밀로이드는 서로 응집하여 oligomer를 형성하게 되는데 이렇게 응집된 형태의 베타-아밀로이드가 결국 신경세포사멸을 유도하게 된다는 것이 최근 일반적으로 받아들여지고 있는 가설이다. 따라서 베타-아밀로이드에 의한 신경세포사멸을 억제하여 신경세포를 보호할 AD 치료제는 베타-아밀로이드의 생성 억제, 베타-아밀로이드 응집 억제,또는 베타-아밀로이드 독성으로부터 보호하는 기능을 가져야 할 것이다. 따라서 발명의 발명자들은 퇴행성 뇌 질환, 특히 알츠하이머의 치료 및 예방 소재를 개발하기 위하여 베타-아밀로이드의 생성을 억제하는 기능을 가진 천연 추출물을 찾는 연구를 진행하였다In summary, the step of inducing neuronal apoptosis by beta-amyloid is firstly beta-amyloid is generated stepwise by amyloidogenic pathway from APP, and the resulting monomer-form of beta-amyloid coagulates to form an oligomer, It has recently been accepted that beta-amyloid in the form of beta-amyloid induces neuronal apoptosis. Therefore, the AD therapeutic agent that protects nerve cells by inhibiting beta-amyloid-induced neuronal cell death should have a function of inhibiting beta-amyloid production, inhibiting beta-amyloid aggregation, or beta-amyloid toxicity. Accordingly, the inventors of the present invention have conducted studies to find a natural extract having a function of inhibiting the production of beta-amyloid in order to develop a therapeutic and preventive material for degenerative brain diseases, particularly Alzheimer's
따라서, 본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator as an active ingredient.
본 발명의 관중 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 천연 식물인 관중에서 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 것으로서, 베타-아밀로이드 응집체의 형성을 억제하는 효과가 있으므로 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌 질환의 예방 및 치료가 가능하다. 뿐만 아니라, 천연물 유래 추출물을 그 유효성분으로 하므로, 부작용이나 세포 독성에 대한 문제가 없는 장점이 있다. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising the extract of the present invention as an active ingredient contains the extract extracted from a natural plant as an active ingredient and has an effect of inhibiting the formation of beta-amyloid aggregates. Therefore, And the like can be prevented and treated. In addition, since the extract derived from a natural product is an effective ingredient thereof, there is no problem about side effects or cytotoxicity.
도 1은 본 발명에 따른 관중 추출물의 추출 및 분획 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 아밀로이드-베타 단백질을 과발현하는 세포주를 면역형광법 및 웨스턴 블랏법으로 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 관중의 메탄올 추출물의 세포 독성을 측정한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 관중의 분획 추출물의 세포 독성을 측정한 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 관중의 메탄올 추출물의 베타-아밀로이드 응집 형성 억제 효과를 ELISA 법으로 측정한 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 관중의 분획 추출물의 베타-아밀로이드 응집 형성 억제 효과를 ELISA 법으로 측정한 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 관중의 부탄올 분획 추출물의 sAPPβ 및 BACE1(β-secretase)에 대한 효과를 측정한 웨스턴블랏법에 의해 측정한 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 관중의 부탄올 분획 추출물의 sAPPβ에 대한 효과를 측정한 웨스턴블랏법에 의해 측정한 결과를 도식화한 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 관중의 부탄올 분획 추출물의 BACE1(β-secretase)에 대한 효과를 측정한 웨스턴블랏법에 의해 측정한 결과를 도식화한 도이다. FIG. 1 is a view showing extraction and fractionation processes of an extract of a spectator according to the present invention. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing cell lines overexpressing amyloid-beta protein by immunofluorescence and Western blotting.
FIG. 3 is a chart for measuring cytotoxicity of a methanol extract of a crowd according to the present invention. FIG.
FIG. 4 is a chart for measuring cytotoxicity of a fraction extract of a crowd according to the present invention. FIG.
FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect of the methanol extract of a crowd according to the present invention on the formation of beta-amyloid aggregation by ELISA.
FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of the fraction extract of a crowd according to the present invention on the formation of beta-amyloid aggregation by ELISA.
FIG. 7 is a graph showing the effect of the butanol fraction extract of the present invention on the sAPPβ and BACE1 (β-secretase) measured by Western blotting.
FIG. 8 is a diagram showing the result of measurement by Western blotting method in which the effect of the butanol fraction extract of the present invention on the sAPPβ of the present invention was measured.
FIG. 9 is a graphical representation of the result of measurement by Western blotting, in which the effect of the butanol fraction extract of the present invention on the BACE1 (β-secretase) of the present invention was measured.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator as an active ingredient.
관중(Crassirhizomae Rhizoma)은 연마과(Aspidiaceae)의 여러해살이 풀인 관중 (Dryopteris crassirhizoma Nakai)의 뿌리줄기와 잎자루의 잔기를 건조한 생약을 말한다. 어린 잎을 식용으로 사용하고, 한방에서는 뿌리줄기를 약재로 사용한다. 전국의 그늘진 산지에서 자라며 그 밖에 일본,사할린 쿠릴열도 만주 등에도 분포하고 있다. 관중은 약간 휘고 끝이 가는 원추형이며 길이가 7-10cm, 지름은 3-6cm이다. 주변에 엽기가 밀생하여 뿌리줄기를 감싸는데 엽기는 여러 개의 모가 나는 기둥 모양으로 모가 지고 휘어져 있다. 표면은 암갈색으로 갈색 비늘잎이 붙어 있고 뿌리줄기의 횡단면은 다각형,기본 조직은 해면상의 다공성으로 녹색이다. 관중은 구충작용, 해열, 해독작용, 감기바이러스 억제작용, 항균·항암작용을 나타내며, 관중을 달인 물은 피부 진균에 대해 억제작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 관중은 자궁흥분작용, 지혈작용, 진통작용, 소염작용을 나타낸다는 것이 보고되었다. 그러나, 관중의 최근까지의 연구에도 불구하고 퇴행성 뇌 질환의 예방 및 치료에 관한 어떠한 연구결과도 보고된 바가 없었다.
The crowd (Crassirhizomae Rhizoma) refers to the dry root of the rootstock and petiole of Dryopteris crassirhizoma Nakai, a perennial herb of the Aspidiaceae. The young leaves are used for edible purposes, and the roots are used as medicines in one room. It grows in shady mountains all over the country, and is distributed in Japan, Sakhalin, Kuril and Manchuria. The crowns are slightly bent and conical in shape with a length of 7-10cm and a diameter of 3-6cm. Around the roots are covered with roots, and the roots are gathered and bent in the shape of several pillar-shaped pillars. The surface is dark brown with brownish scaly leaves, the cross section of the rootstock is polygonal, and the base tissue is green with porous nature of the sea surface. The crowd shows antiparasitic, antipyretic, detoxifying, cold virus inhibiting, antibacterial and anticancer activities, and the water that is crowded is known to suppress the skin fungus. It has also been reported that the crowd exhibits uterine stimulation, hemostatic, analgesic, and anti-inflammatory effects. However, despite the recent research by the crowd, no studies on the prevention and treatment of degenerative brain diseases have been reported.
본 발명에서 의미하는 퇴행성 뇌 질환은 노화로 인해 야기되는 뇌(brain)의 병증에 관한 것을 모두 포함하고, 바람직하게는 알츠하이머병 또는 치매를 의미한다.
The degenerative brain disease as referred to in the present invention includes all those related to brain diseases caused by aging, preferably means Alzheimer's disease or dementia.
본 발명에 따른 관중 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
The tube extract according to the present invention may be one prepared by a conventional method for producing a plant extract. Specifically, it may be a cold extraction method, a warm extraction method, a heat extraction method, an ultrasonic extraction method, Can be used.
본 발명에 따른 관중 추출물을 추출하기 위한 추출 용매는 물 및 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. (도 1 참조)The extraction solvent for extracting the spectral extract according to the present invention may be at least one selected from the group consisting of water and an organic solvent. (See Fig. 1)
상기 유기용매는 탄소 수 1 내지 5의 알코올, 또는 그의 희석수, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 또는 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 메탄올 희석수, 더 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 메탄올이 좋다. The organic solvent may be an alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a dilute aqueous solution thereof, a polar solvent such as ethyl acetate or acetone, or a nonpolar solvent such as ether, chloroform, benzene, hexane or dichloromethane or a mixture thereof Methanol, more preferably 50% (v / v) to 99% (v / v) methanol.
상기, 알코올의 희석수는 알코올을 1 내지 99%(v/v)로 물에 희석한 것을 의미한다.
The diluted water of the above-mentioned alcohol means that 1 to 99% (v / v) of alcohol is diluted in water.
상기 추출물의 추출온도는, 4℃ 내지 120℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 상온에서 추출하는 것이 좋다. 또한, 상기 추출시간은 12시간 내지 120시간일 수 있다. 상기 추출온도가 4℃ 보다 낮은 경우 추출 효율이 감소할 수 있으며, 120℃를 넘는 경우 추출물이 변성될 수 있다. 상기 추출시간이 12시간 보다 낮은 경우 유효성분이 일부 추출되지 않을 수 있으며, 120시간을 넘길 경우 유효성분 이외의 불순물 성분이 함께 추출될 수 있으므로 바람직하지 않다.
The extraction temperature of the extract may be performed at 4 ° C to 120 ° C, preferably at room temperature. The extraction time may be from 12 hours to 120 hours. If the extraction temperature is lower than 4 ° C, the extraction efficiency may decrease. If the extraction temperature is higher than 120 ° C, the extract may be denatured. If the extraction time is less than 12 hours, the effective component may not be extracted partially, and if the extraction time exceeds 120 hours, impurities other than the active component may be extracted together.
상기 관중 추출물은 추출 용매로 추출 후, 관중 찌꺼기를 제거하고, 필터 페이퍼로 여과한 후 여액을 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.
The tubular extract can be extracted with an extraction solvent, and then filtered to remove filter residue. The filtrate can be concentrated using a vacuum rotary evaporator or a vacuum dryer, and then stored at room temperature.
본 발명의 한 실시예에서 관중의 메탄올 추출물에 대한 베타-아밀로이드 응집 억제능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 베타-아밀로이드 응집을 억제하는 것을 알 수 있었다. (도 5 참조) 따라서 본 발명의 관중 추출물을 포함하는 약제학적 조성물은 뇌 조직 내에 베타-아밀로이드의 형성(응집)으로 인해 야기되는 퇴행성 뇌 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도로서 사용될 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the inhibition of beta-amyloid aggregation on the methanol extract of the crowd was measured, and it was found that beta-amyloid aggregation was inhibited in a concentration-dependent manner. (See FIG. 5) Accordingly, the pharmaceutical composition comprising the spectral extract of the present invention can be used as an agent for preventing or treating a degenerative brain disease caused by the formation (aggregation) of beta-amyloid in brain tissue.
추가적으로, 상기 관중의 메탄올 추출물은, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여, 동시 또는 순차적으로 분획과정을 더 실시할 수 있다. (도 1 참조)
In addition, the methanol extract of the above-mentioned spectra can be subjected to simultaneous or sequential fractionation using one or more solvents selected from the group consisting of hexane, chloroform, ethyl acetate, and butanol. (See Fig. 1)
상기 분획 온도는 4℃ 내지 120℃에서 수행될 수 있다.
The fractionation temperature may be performed at 4 캜 to 120 캜.
상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획추출물은 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.
The fraction extract obtained by performing the fractionation process can be concentrated using a vacuum rotary condenser or a vacuum dryer, and then stored at room temperature.
본 발명의 한 실시예에서 관중 추출물에 대한 베타-아밀로이드 생성 억제능을 측정한 결과, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올의 용매로 순차적으로 분획한 부탄올 분획 추출물(CRE-BuOH)이 가장 효과적으로 베타-아밀로이드 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다. (도 6 참조)
In one embodiment of the present invention, the inhibitory activity on beta-amyloid production of the extracts of the spectra was measured. As a result, the butanol fraction extract (CRE-BuOH), which was sequentially fractionated with a solvent of hexane, chloroform, ethyl acetate and butanol, Indicating that amyloid production is inhibited. (See Fig. 6)
본 발명에 따른 관중 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 인간을 포함한 동물에 적용될 수 있다.
The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising the extract of the present invention as an active ingredient according to the present invention can be applied to animals including humans.
상기 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The dosage of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases can be determined in consideration of the administration method, the age and sex of the recipient, the severity of the patient, the state, the degree of absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate, , 0.1 mg / kg (body weight) to 500 mg / kg (body weight), 0.1 mg / kg (body weight) to 400 mg / kg (body weight) or 1 mg / 300 mg / kg (body weight), and may be administered once or several times in divided doses, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 관중 추출물은 상기 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. The spectral extract according to the present invention may be used alone in the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
이 경우, 상기 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물 내 관중 추출물의 함량은 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.In this case, the content of the tubular extract in the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases may be 0.001% by weight to 99.9% by weight, 0.1% by weight to 99% by weight or 1% by weight to 50% And the content of the compound may be suitably adjusted depending on the intended use of the composition and the method of use.
상기 약학적으로 허용되는 담체의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 약학적으로 허용 가능한 담체라면 모두 사용 가능하다.
Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, dextrin, calcium But are not limited to, one or more selected from the group consisting of water, carbon dioxide, propylene glycol, liquid paraffin, and physiological saline. Any conventional pharmaceutically acceptable carrier may be used.
또한, 관중 추출물을 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
In addition, the composition for preventing or treating dementia including a spectral extract may be prepared by using a conventional filler, an extender, a binder, a disintegrant, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a pH adjuster, a nutrient, a vitamin, an electrolyte, A salt thereof, a protective colloid, a glycerin, a flavoring, an emulsifying agent or an antiseptic, and the like.
또한, 본 발명의 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 치매 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 알려진 물질, 일 예로 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine)등의 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
In addition, the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases of the present invention may contain substances known to those skilled in the art, such as tacrine, donepezil, Rivastigmine, galantamine, and the like may be additionally included.
본 발명에 따른 관중 추출물을 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구를 모두 포함한다. 또한, 상기 퇴행성 뇌 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
When the spectral extract according to the present invention is used as a medicine, the administration method includes both oral and parenteral administration. In addition, the formulation of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases may be varied depending on the method of use, and may be varied depending on the technique of the present invention to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal Lt; / RTI > may be formulated using methods well known in the art.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 비경구투여를 위한 형태는 크림, 로션제, 연고제, 경고제, 액제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 패취제 또는 주사제 등의 형태일 수 있다.
Solid formulations for oral administration include tablets, soft or hard capsules, pills, powders, suspensions, syrups, injections and granules, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, Lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Forms for parenteral administration may be in the form of creams, lotions, ointments, alerts, liquids, aerosols, fluid extracts, elixirs, infusions, sachets, patches or injections.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예Example 1. 관중 메탄올 추출물 및 분획추출물의 제조 1. Preparation of spectral methanol extract and fraction extract
1.관중 메탄올 추출물의 제조1. Preparation of spectral methanol extract
건조된 관중 1.2 kg을 상온에서 90% 메탄올로 3일 동안 추출하여 filter paper (Nalgene, New York, NY, USA)로 여과한 후 여액을 진공회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하였다. 이 과정을 3번 반복 하고, 농축액은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 관중의 메탄올은 추출한 갈색의 결정성 가루형태로, 추출물은 총 65g 수득하였다. (도 1 참조)
1.2 kg of the dried blood was extracted with 90% methanol at room temperature for 3 days, filtered through filter paper (Nalgene, New York, NY, USA), and the filtrate was concentrated using a vacuum rotary evaporator (EYELA, Tokyo, Japan) . This procedure was repeated 3 times and the concentrate was stored at 4 ° C until use. The methanol in the spectra was in the form of an extracted brown crystalline powder, and a total of 65 g of the extract was obtained. (See Fig. 1)
2. 관중 부탄올 분획 추출물의 제조2. Preparation of extracts of butanol fraction from crowd
관중 추출물을 극성의 차이를 이용하여 섞이지 않는 두 가지 용매로 각각 분획 하였다. 상기 1.에서 얻은 관중 메탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 층으로 분획하여 농축하였고, 이 과정을 3번 반복 하였다. 농축액은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 각 층의 가루형태 분획 추출물은 각각 헥산 층 3.2 g, 클로로포름 층 0.6 g, 에틸 아세테이트 층 10.8 g, 부탄올 층은 14 g, 물 층은 28 g 수득하였다. (도 1 참조)
The spectral extracts were fractionated with two solvents that did not mix with polarity differences. The methanol extracts obtained in the
실험예Experimental Example 1. 관중 추출물의 세포독성 평가 1. Assessment of cytotoxicity of spectral extracts
1. 아밀로이드베타 전구체 단백질(amyloid-β precursor protein, APP)을 과발현하는 형질주입 세포주 제작1. Production of transfected cell lines overexpressing amyloid-beta precursor protein (APP)
실험에 사용한 CHO(chinese hamster ovary) 세포는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Korea)에서 구입하였다. 10% FBS가 함유된 RPMI 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 배지는 3일마다 교환해 주었다. The CHO (chinese hamster ovary) cells used in the experiments were purchased from the Korean Cell Line Bank (KCLB; Korea). The cells were cultured in RPMI medium containing 10% FBS at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. The medium was changed every 3 days.
APP plasmid에서 APP 부분만을 amplication 하기 위해 5'-ctg gcc tgc tgg ctg aac ccc-3' (forward, 서열번호 1), 5'-gtc cac gta tct ttg ggt ctt-3' (reverse, 서열번호 2) primer를 이용하여 APP 부분만을 증폭시키고 이것을 pcDNA 3.1 벡터에 삽입하여 제작된 APP-pcDNA 3.1 벡터를 상기 배양한 CHO 세포에 형질주입 하였다. 형질주입을 위해서 Lipofectamine®2000 Transfection Reagent protocol에 따라 60mm dish에 CHO cell 1.2 X 106 /5ml의 세포를 seeding 한 다음, 24시간 후 APP-pcDNA3.1 320ng/ Lipofectamine 0.8 μl를 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 형질주입 된 CHO 세포 주에서 형질주입 된 세포(APPwt-CHO)들만 선별하기 위해 geneticin 2.5 mg/ml을 포함한 배지로 3-4일에 한번씩 배지 교환을 하여 배양하였다.
(Reverse, SEQ ID NO: 2) to 5'-ctg gcc tgc tgg ctg aac ccc-3 '(forward, SEQ ID NO: 1), 5'-gtc cac gta tct ttg ggt ctt- primer was used to amplify only the APP portion, inserted into the pcDNA 3.1 vector, and the prepared APP-pcDNA 3.1 vector was transfected into the cultured CHO cells. For the transfection injection according to Lipofectamine®2000 Transfection Reagent protocol in 60mm dish CHO cell 1.2 X 10 6 / 5ml one of seeding the cells, then after 24 hours into the APP-pcDNA3.1 320ng / Lipofectamine 0.8 μl 24 hours at 37 ℃ Lt; / RTI > To select only the transfected cells (APP wt -CHO) in the transfected CHO cells, the cells were cultured in medium containing 2.5 mg / ml of geneticin once every 3-4 days.
2. 면역형광법을 이용한 APPwt-CHO 세포주 선정2. Selection of APP wt -CHO cell line by immunofluorescence
24 well plate에 각 well 마다 cover glass를 넣은 다음 그 위에 형질주입 된 APPwt-CHO 세포를 2 X 105 개씩 seeding하고 24시간 배양 시킨 후 4% paraformaldehyde를 200 μl/well 넣어 30분간 실온에서 고정하였다. 5% BSA(in PBS)로 1시간 blocking한 후 1차 항체인 APP/β-amyloid (NAB228) Mouse mAb(Cell signaling)를 3% BSA(in PBS)로 희석(1:50)하여 20μl씩 넣고 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후 fluorochrome -conjugated secondary antibody를 (Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG(H+L)-Invitrogen) 3% BSA로 dilution(1:50)하여 20μl씩 넣고 실온에서 1시간 배양하였다. DAPI로 핵을 염색한 후 형광현미경을 통해 형질주입 된 정도를 관찰하였다.
A cover glass was inserted into each well of a 24-well plate, and 2 × 10 5 APP wt -CHO cells were seeded on the cover glass. After incubation for 24 hours, 4% paraformaldehyde was added to 200 μl / well for 30 minutes at room temperature . After blocking with 5% BSA (in PBS) for 1 hour, the primary antibody, APP / β-amyloid (NAB228) Mouse mAb (Cell signaling) was diluted (1:50) with 3% BSA And reacted at 4 DEG C for 12 hours. After washing with PBS, 20 μl of a fluorochrome-conjugated secondary antibody was diluted (1:50) with Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG (H + L) -invitrogen 3% BSA and incubated at room temperature for 1 hour. The nuclei were stained with DAPI and the degree of transfection was observed through a fluorescence microscope.
3. 관중 추출물의 세포독성 평가3. Evaluation of cytotoxicity of spectral extracts
APPwt-CHO 세포에 대한 관중 추출물의 세포독성을 검사하기 위하여 MTT-based cytotoxicity assay를 시행 하였다. 약물이 처리된 세포를 24시간 배양한 후, 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 넣고 3시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO를 넣어 30분간 용해시킨 후 Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.MTT-based cytotoxicity assay was performed to examine the cytotoxicity of the extracts of the spectra of APP wt -CHO cells. The cells treated with the drug were cultured for 24 hours, and then MTT solution was added at a concentration of 5 mg / ml for 3 hours. After removing the medium and dissolving in DMSO for 30 minutes, the absorbance was measured at 540 nm using an Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA).
실험결과 관중의 메탄올 추출물(CRE-MeOH)은 2, 10, 50, 100 μg/ml에서 독성이 없었으며 극성에 따라 5개 용매로 분획한 층의 세포독성은 각각 헥산 층은 10, 50 μg/ml, 클로로포름 층은 10 μg/ml, 에틸 아세테이트 층은 10, 50 μg/ml, 부탄올 층은 10, 50 μg/ml, 물층은 10, 50 μg/ml에서 독성이 없는 것을 확인하였다. (도 3 및 4 참조)
The cytotoxicity of the five methanol extracts (CRE-MeOH) from 2, 10, 50, and 100 μg / ml was not toxic, ml, 10 μg / ml in the chloroform layer, 10 μg / ml in the ethyl acetate layer, 10 μg / ml in the butanol layer, and 10 μg / ml in the water layer. (See Figures 3 and 4)
실험예Experimental Example 2. 2. ELISAELISA 를 이용한 관중 추출물의 베타-아밀로이드 생성에 미치는 효능 평가Evaluation of Efficacy on the Generation of Beta-Amyloid by the Spectral Extract
상기 실험예 1의 1.의 과정으로 구축된 APPwt-CHO 세포를 96 well plate에 (6 x 104 cells/well) 4시간 배양한 후 관중 메탄올 추출물 (2, 10, 50, 100ug/ml) 및 50 ug/ml의 헥산/에틸아세테이트/부탄올/물 분획 추출물을 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 그 상등액을 취하여 EP 튜브에 옮기고 3000 x g에서 5분간 원심 분리하여 세포 파편들을 제거하였다. 상등액에 들어 있는 베타-아밀로이드의 양을 Human Aβ40 ELISA kit (Invitrogen KHB3482)를 사용하여 측정하였다. 간단히 각 well에 샘플 상등액 10 μl, dilution solution 40 μl, Human Aβ40 Detection antibody solution 50 μl, AEBSF (1mM)을 넣고 3시간 실온에서 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후 washing solution 100 μl를 넣어 4번 세척하고 각 well에 anti-Rabbit IgG HRP working solution 100 μl를 넣고 30분간 실온에서 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후 washing solution 100 μl를 넣고 5번 세척한 후, 각 well에 Stabilized Chromogen (TMB solution) 100 μl를 넣어 암실에서 30분간 반응시켰다. 그 후 각 well에 stop solution 100 μl씩을 넣고 microtiter plate reader를 사용하여 450nm의 파장에서 측정하여 베타-아밀로이드 양을 측정하였다. The APP wt -CHO cells constructed in
실험결과 관중의 메탄올 추출물(CRE-MeOH) 50 μg/ml는 대조군의 74%, 100 μg/ml는 27% 수준으로 베타-아밀로이드의 양이 감소하였으며 극성에 따라 5개 용매로 분획한 층 중 독성을 나타내지 않은 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 층에서는 부탄올 층이 대조군의 60% 수준으로, 물 층은 58% 수준으로 베타-아밀로이드의 생성량이 감소되었다. (도 5 및 6 참조)
As a result, the amount of beta-amyloid decreased to 74% of the control group and 27% of 100 μg / ml of the methanol extract of CRE-MeOH (CRE-MeOH) Butanol and water layer showed 60% level of the butanol layer and 58% level of water layer, respectively, in the hexane, ethyl acetate, butanol, and water layers. (See Figures 5 and 6)
실험예Experimental Example 3. 3. WesternWestern blotblot analysis분석 를 이용한 관중 추출물의 Of spectral extracts sAPPsAPP β 및 beta and BACE1BACE1 levellevel 변화에 미치는 효능 평가 Evaluation of efficacy on change
60mm dish에 배양한 세포들에 관중 추출물을 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 24시간 처리한 후 PBS로 세척하고 trypsin을 넣어 3분간 배양한 다음 떼어내어 EP튜브로 옮겼다. 1000 x g에서 원심분리를 통해 cell pellet을 만든 후 상등액을 제거하고 Lysis buffer 50μl를 넣었다. 30분 동안 -20℃에서 용해시켜 단백질을 추출한 후 SMART™ BCA kit(Intron, Korea)를 이용하여 정량하였다. 추출한 단백질에 sample loading buffer를 넣고 100℃ 끓는 물에 10분 동안 끓인 후 사용할 때까지 -20℃에 보관 했다. 7.5% gel 또는 15% Acrylamide gel로 전기영동을 통해 단백질을 분리한 후 PVDF membrane으로 옮겼다. PVDF membrane의 항체에 대한 비특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% skin milk in PBS) 용액에서 1시간 동안 반응 시킨 후 Tween 20을 함유한 PBS 용액 (0.1% PBST)으로 15분간 3번 세척 후 각 검증 단백질에 대한 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 APP/β-amyloid Mouse antibody (1:1000, Cell signaling Technology, MA, USA)), BACE1 antibody (1:1000, Abcam), APP c-terminal antibody (1:1000, Sigma A8717), sAPPβ antibody (1:1000, IBL 18957), beta-actin antibody (1:1000, BD biosciences, CA, USA) 이다. PBST 용액으로 15분간 3번 세척한 다음 2차 항체 (5% skin milk in PBS)로 1시간 반응시켰다. 이어서 ECL-spray (Advanta, CA, USA)로 반응시킨 후 G:Box iChemiXT Imager (Syngene, Cambridge, UK) 상에서 단백질을 확인하였다. The cells were incubated with 10, 50, and 100 μg / ml of the extracts in a 60-mm dish for 24 hours, washed with PBS, incubated with trypsin for 3 minutes, removed, and transferred to an EP tube. Cell pellet was prepared by centrifugation at 1000 x g, supernatant was removed, and 50 μl of lysis buffer was added. Proteins were extracted by dissolving at -20 ° C for 30 min and quantitated using SMART ™ BCA kit (Intron, Korea). Sample loading buffer was added to the extracted protein, boiled in boiling water at 100 ° C for 10 minutes, and stored at -20 ° C until use. Proteins were separated by electrophoresis with 7.5% gel or 15% acrylamide gel and transferred to PVDF membrane. In order to prevent nonspecific binding of the PVDF membrane to the antibody, the cells were incubated in blocking buffer (5% skin milk in PBS) for 1 hour, washed with PBS solution (0.1% PBST) The primary antibody to the test protein was added and reacted at 4 ° C for 12 hours. BACE1 antibody (1: 1000, Abcam), APP c-terminal antibody (1: 1000, Sigma A8717) was used for the primary antibody used. , sAPPβ antibody (1: 1000, IBL 18957) and beta-actin antibody (1: 1000, BD biosciences, CA, USA). PBST solution for 15 minutes, and reacted with a secondary antibody (5% skin milk in PBS) for 1 hour. Proteins were then identified on the G: Box iChemiXT Imager (Syngene, Cambridge, UK) after ECL-spray (Advanta, CA, USA).
실험결과 sAPPβ의 발현량을 대조군과 비교하였을 때 10 μg/ml는 크게 변화가 없었지만, 50 μg/ml는 대조군의 20%, 100 μg/ml는 8%로 감소하였으며 β-secretase 또한 10, 50, 100 μg/ml에서 각각 대조군의 50%, 30%, 8%로 감소하였다. (도 7 내지 9 참조)
As a result, there was no significant change in the expression level of sAPPβ compared to the control group. However, 50 μg / ml was decreased to 20% in the control group and 8 μg / ml in 100 μg / ml, 100, and 50%, 30%, and 8% of the control, respectively. (See Figs. 7 to 9)
하기에 기재된 제조예는 단순 참조용일 뿐 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다. 하기 제조예에 기재된 구성성분의 함유량은 염증강도, 목적 및 상황에 따라 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 약학적 조성물의 제조방법에 따라 변형하여 제조할 수 있다.
The preparation examples described below are for the purpose of simple reference only and do not limit the scope of the present invention. The content of the constituent components described in the following Preparation Examples may be varied according to the intensity of inflammation, the purpose and the circumstances, and may be modified according to a conventional method for producing a pharmaceutical composition.
제조예Manufacturing example 1. One. 산제의Sanje 제조 Produce
하기 표 1에 기재된 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.The components listed in Table 1 below were mixed and packed in airtight bags to prepare powders.
제조예Manufacturing example 2. 정제의 제조 2. Preparation of tablets
하기 표 2에 기재된 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.The ingredients listed in Table 2 were mixed and tableted according to a conventional tablet preparation method.
제조예Manufacturing example 3. 캡슐제의 제조 3. Preparation of capsules
하기 표 3에 기재된 성분들을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하였다.The ingredients listed in Table 3 below were mixed and filled into gelatin capsules.
제조예Manufacturing example 4. 주사제의 제조 4. Preparation of injections
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 하기 표 4에 기재된 성분 함량으로 제조하였다.
(2 ml) per 1 ampoule in accordance with the usual injection preparation method.
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical Composition Comprising Dryopteris crassirhizoma Extract for the Treatment of Degenerative Brain Diseases <130> HY131227 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctggcctgct ggctgaaccc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtccacgtat ctttgggtct t 21 <110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical Composition Comprising Dryopteris crassirhizoma Extract for the Treatment of Degenerative Brain Diseases <130> HY131227 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctggcctgct ggctgaaccc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtccacgtat ctttgggtct t 21
Claims (7)
상기 관중 추출물은 관중을 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 메탄올로 추출한 후,
헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어진 부탄올 분획 추출물인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for prevention and treatment of degenerative brain diseases comprising an extract of a spectator as an active ingredient,
The above-mentioned spectral extract was obtained by extracting the spectra from 50% (v / v) to 99% (v / v) methanol,
Wherein the extract is a butanol fraction extract obtained by successively fractionating with hexane, chloroform, ethyl acetate, and butanol.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 또는 치매인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the degenerative brain disease is Alzheimer's disease or dementia.
상기 약제학적 조성물은 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제로 이루어지는 군중에서 선택된 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the pharmaceutical composition is formulated into a formulation selected from the group consisting of tablets, soft or hard capsules, pills, powders, suspensions, syrups, injections and granules.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여를 위한 것인 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the pharmaceutical composition is for oral or parenteral administration.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020130160352A KR101770871B1 (en) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Pharmaceutical Composition Comprising Dryopteris crassirhizoma Extract for the Treatment of Degenerative Brain Diseases |
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KR1020130160352A KR101770871B1 (en) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Pharmaceutical Composition Comprising Dryopteris crassirhizoma Extract for the Treatment of Degenerative Brain Diseases |
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---|---|---|---|---|
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