KR101767253B1 - 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 심근세포로의 유전자 전달용 복합체 - Google Patents

유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 심근세포로의 유전자 전달용 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산; 및 친수성 고분자;로 구성된 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체를 포함하는 약학적 조성물은 2종의 유전자 동시 전달을 통해 허혈성 심장질환 부위에 대한 신생혈관의 형성 및 심근세포의 사멸을 감소시킴으로써, 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 심근세포로의 유전자 전달용 복합체{Pharmaceutical compositions for prevention or treatment of ischemic heart diseases comprising composite for gene delivery and complex for genes delivery to cardiomyocytes}
본 발명은 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 심근세포로의 유전자 전달용 복합체에 관한 것이다.
허혈(ischemia)은 혈관의 수축 또는 폐색에 의해 유발되는 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈액공급의 감소 상태를 말한다. 허혈 후에는 혈액의 재관류(repurfusion)가 일어나더라도 신경세포가 손상되어 여러 가지 후유증이 야기된다. 이러한 허혈은 종종 관상동맥 질환, 심장혈관 질환, 협심증, 두통 또는 기타의 혈관 증상들과 관련되며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다.
이러한 허혈/재관류시의 세포 손상과 기능 저하에 의해 발생하는 심근 경색, 부정맥, 부전증 등의 허혈성 질환은 유병률 및 사망률이 높고 완치가 어려워 지난 50년 동안 집중적인 기초 연구 및 임상 연구가 진행되어 왔다(Wang, Q. D. et al., Cardiovasc. Res. 55:25-37, 2002). 허혈/재관류 손상은 대사, 면역반응 및 이온항상성의 변화, 산소유리기 등 다양한 생리학적 기전이 관여되므로 면역조절 물질, 세포사멸 관련물질, 이온통로 조절물질 등 다양한 분야에서 연구가 이루어지고 있다(Hearse, D. J. et al., Mol. Cell. Biochem. 186:177-184, 1998). 현재까지 기전연구와 함께 새로운 작용점에 의한 치료제의 개발 및 외과적 시술의 개발 등이 활발히 이루어졌으나, 허혈/재관류로부터 심근세포를 보호할 수 있는 기술이 아직 임상적으로 상용화되지 못하였다. 따라서, 허혈에 의한 심근세포 손상의 진행을 늦추고 재관류 손상을 완화시킬 수 있는 허혈성 심장질환의 예방 및 치료제, 또는 심장 보호제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 심근세포에 선택적으로 유전자를 전달할 수 있는 심근세포로의 유전자 전달용 복합체를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산; SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산; 및 친수성 고분자;로 구성된 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 저산소환경에서만 VEGF의 발현을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 pDNA, gDNA, cDNA, mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 개열지도 1의 구성을 가지는 pDNA일 수 있다.
[개열지도 1]
Figure 112015092920899-pat00001
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA, pDNA, 안티센스 올리고뉴클리오타이드(antisense oligonucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA일 수 있다.
[서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
[서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌이민 또는 그 유도체, 폴리라이신 및 그 유도체, 폴리아스파르트산 및 그 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그 유도체, 키토산 및 그 유도체, 글라이콜키토산 및 그 유도체, 덱스트란 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 친수성 고분자는 담즙산(deoxycholic acid, DA)과 폴리에틸렌이민의 접합체로서 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
Figure 112015092920899-pat00002
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 유전자 전달용 복합체는 허혈성 심장질환 부위의 신생혈관형성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 유전자 전달용 복합체는 허혈성 심장질환 부위의 세포사멸을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 허혈성 심장질환은 협심증, 심근비대증, 심근경색증, 허혈성 급성 심부전증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8일 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해, 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 하기 [화학식 1]로 표시되는 친수성 고분자;로 구성된 심근세포로의 유전자 전달용 복합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00003
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8일 수 있다.
상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA일 수 있다.
[서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
[서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 하기 개열지도 1의 구성을 가지는 pDNA일 수 있다.
[개열지도 1]
Figure 112015092920899-pat00004
상기 유전자 전달용 복합체는 구형의 나노입자이고, 상기 나노입자의 평균 직경은 60 내지 200 nm일 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체를 포함하는 약학 조성물은 2종의 유전자 동시 전달을 통해 허혈성 심장질환 부위에 대한 신생혈관의 형성 및 심근세포의 사멸을 감소시킴으로써, 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는 세포 흡수능이 우수하고 심근 세포에 대해 선택성이 높아, 심근세포로 유전자를 효율적으로 전달할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 및 비교예 1로부터 제조된 유전자 전달용 복합체의 형성 확인을 위한 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체의 광산란입자분석(DLS)으로 분석한 결과 그래프와 원자힘 현미경(AFM)으로 측정한 도면이다.
도 4는 아무것도 첨가하지 않은 대조군(control), 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1), 비교예 3의 siSHP-1(naked siSHP-1) 및 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF(siRNA 50 nM))의 세포 내 전달여부를 확인하기 위하여, 각각에 대한 FACS를 이용한 유세포 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF), 비교예 4의 복합체(PEI1.8/siSHP-1/pVEGF), 및 비교예 5의 복합체(PEI25/siSHP-1/pVEGF)의 세포 독성을 평가하기 위하여, 각각에 대한 MTT 어세이(assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 세포(H9C2)와 배양하였을 때, 세포 내로 전달 된 후, 세포 내 SHP-1 발현 정도를 분석한 웨스턴 블랏 결과 및 정량 그래프이다.
도 7은 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 H9C2 세포를 처리한 후, 정상 산소(normoxia) 및 저산소(hypoxia) 환경 하에서 8 일 동안 배양된 상기 세포의 VEGF 유전자 발현 정도를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay; 효소 결합 면역 흡착 분석) 기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 DA-PEI/siSHP-1/pVEGF의 생체 내 항세포사멸 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Nor), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 TUNEL assay로 측정된 결과를 촬영한 이미지와 사멸된 세포를 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 혈관 신생에 대한 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 미세 혈관 형성 확인용 면역 조직화학적 염색 결과를 촬영한 이미지와 이미지별 미세 혈관 수를 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 심근경색증에 대한 치료 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 4일 후 TTC 염색을 통하여 경색 크기를 촬영한 이미지와 이를 수치화한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
종래 허혈성 심장질환의 약물 치료의 한계를 극복하기 위한 방안으로서, 유전자 치료가 큰 관심을 받고 있다. 그러나, 종래 허혈성 심장질환의 약물은 심근 세포에 대한 표적특이성이 약하고, 이로 인해 심근 세포로 약물이 효율적으로 전달되지 못하고, 다른 세포에 전달되어 약효가 떨어지거나 부작용이 발생하는 등의 문제가 있어, 상용화에 어려움이 있었다.
따라서, 상술한 문제점을 해결하고자, 본 발명자들은 허혈성 심장질환의 치료를 위해 다양한 치료 물질들을 연구한 결과, 유전자 전달을 통하여 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)의 발현을 증가시킴으로써 경색 부위에 신생혈관의 형성을 유도함과 동시에 심근경색 부위에서 과발현되는 세포사멸관련 인자인 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소 (Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제함으로써 경색부위의 심근세포 사멸을 감소시키는 것, 즉 2종의 유전자 동시 전달을 통한 신생혈관 형성 유도 및 심근세포 사멸 감소가 허혈성 심장질환의 치료에 매우 효과적일 뿐만 아니라, 상기 2종의 유전자에 의하여 복합체의 안정성 및 흡수능이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 이의 제조과정 및 구조는 하기 도 1에 구체적으로 나타내었다.
이에, 본 발명은 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산; SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산; 및 친수성 고분자;로 구성된 유전자 전달용 복합체를 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 VEGF의 발현을 유도할 수 있는 핵산이라면 그 발현 환경이 제한되는 것이 아니지만, 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 저산소 환경에서만 VEGF의 발현을 유도하는 것이 더욱 바람직하다. 이때, 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현을 유도할 수 있는 핵산이라면 그 형태가 제한되는 것은 아니지만, pDNA, gDNA, cDNA, mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하며, 하기 개열지도 1의 구성을 가진 pDNA(본 발명의 명세서에는 pVEGF로 표시)핵산인 것이 더욱 바람직하다.
[개열지도 1]
Figure 112015092920899-pat00005
상기 개열지도 1의 구성을 가지는 pDNA 핵산은 구체적으로, 유전자 서열의 발현을 조절하기 위한 SV40 프로모터, 허혈 조직을 인지함으로써 저산소 선택적 발현을 유도하기 위한 Epo 인핸서(enhancer)(서열번호 3); 및 혈관내피성장인자(VEGF)의 유전자 서열인 VEGF cDNA(서열번호 4);를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산이라면 그 형태가 제한되는 것은 아니지만, siRNA, shRNA, miRNA, pDNA, 안티센스 올리고뉴타이드(antisense oligonucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하며, 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA(본 발명의 명세서에는 siSHP-1으로 표시)인 것이 더욱 바람직하다.
[서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
[서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
상기 서열번호 1, 2의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에는 1 내지 5 개의 뉴클레오타이드의 돌출부(overhang)를 포함할 수 있고, 상기 돌출부 뉴클레오타이드는 2 개의 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘)일 수 있다.
또한 상기 친수성 고분자는 상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산 및 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산과 전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성할 수 있는 고분자라면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌이민 또는 그 유도체, 폴리라이신 및 그 유도체, 폴리아스파르트산 및 그 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그 유도체, 키토산 및 그 유도체, 글라이콜키토산 및 그 유도체, 덱스트란 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다. 또한, 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 친수성 고분자는 담즙산(deoxycholic acid, DA)과 폴리에틸렌이민의 접합체(본 발명의 명세서에는 DA-PEI로 표시)로서 하기 화학식 1로 표시되는 것이 가장 바람직하다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00006
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 하기 실시예에서 후술하는 바와 같이, 하기 개열지도 1의 구성을 가진 pDNA(본 발명의 명세서에는 pVEGF로 표시),
하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA(본 발명의 명세서에는 siSHP-1으로 표시) 및
담즙산(deoxycholic acid, DA)과 폴리에틸렌이민의 접합체(본 발명의 명세서에는 DA-PEI로 표시)인, 하기 화학식 1로 표시되는 친수성 고분자;를 포함하는 것이 가장 바람직하다.
[개열지도 1]
Figure 112015092920899-pat00007
[서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
[서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
상기 서열번호 1, 2의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에는 1 내지 5 개의 뉴클레오타이드의 돌출부(overhang)를 포함할 수 있고, 상기 돌출부 뉴클레오타이드는 2 개의 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘)일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00008
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
상술한 구조를 갖는 유전자 전달용 복합체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 경우, 양전하를 띄는 상기 친수성 고분자와 음전하를 띄는 상기 siRNA가 서로 전기적 상호작용에 의하여 구형 나노입자를 형성하는데 구체적으로 상기 친수성 고분자 내에 상기 siRNA가 봉입되는 형태이다. 이후 첨가되는 pDNA 역시 음전하를 띄어, 상기 친수성 고분자와 전기적 상호작용으로 결합되며, 상기 siRNA와 함께 친수성 고분자 내에 봉입된다. 다만, pDNA의 첨가로 인하여 상기 친수성 고분자가 더욱 단단히 결합되어 구형의 유전자 전달용 복합체 평균 직경이 평균 직경이 150 내지 350 nm에서 60 내지 200 nm로 줄어들게 된다.
또한 상술한 구조를 갖는 유전자 전달용 복합체는 외부 물질에 대해 안정적이며, 내부 결합이 단단할 뿐만 아니라, 심근세포에 대한 선택성도 우수하다. 게다가 이러한 복합적 구성 요소들로 인하여 세포 흡수 능력이 우수하기 때문에, 종래 약물 전달체나 DA-PEI/siSHP-1로만 이루어진 복합체에 비하여 약 2 배이상의 현저히 우수한 약물 효과를 나타냄을 후술하는 실험예를 통해 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체를 포함하는 약학 조성물은 상술한 구조 및 이에 의한 효과로 인하여, 허혈성 심장질환 부위의 경색부위에서만 신생혈관형성을 증가시키는 것과 동시에, 경색부위의 심근세포 사멸을 감소시키는 효과가 있는바, 협심증, 심근비대증, 심근경색증, 허혈성 급성 심부전증 등의 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 작용한다.
본 발명에 따른 상기 유전자 전달용 복합체를 포함하는 조성물은, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8인 것이 바람직하다. 상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비가 1 : 1 : 2 미만인 경우에는 단단한 결합을 갖는 60 내지 200 nm의 평균직경을 갖는 구형 나노입자로 형성되지 못하고, 내부에 봉입되어야 할 상기 두 핵산이 모두 외부에 방출되거나 입자를 형성하지 못하고 외부 용액에 노출되어 존재하게 되는 문제가 있고(도2), 중량비가 1 : 1 : 8을 초과할 경우, 유전자 전달용 복합체의 고분자량이 과도하여 세포 독성이 야기되는 문제가 발생한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등과 함께 제제화할 수 있다. 약학으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 심근에 국부적으로 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 1일 혹은 1회 투여량은 예컨대 0.00001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 하기 [화학식 1]로 표시되는 친수성 고분자;로 구성된 심근세포 전달용 복합체에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00009
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
상기 심근세포로의 유전자를 전달하기위한 심근세포의 유전자 전달용 복합체는 혈관내피성장인자의 발현을 증가시키는 핵산과 심근경색 부위에서 과발현되는 세포사멸관련 인자인 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소의 발현을 억제하는 핵산 및 이들을 외부 환경에 노출되지 않도록 보호함과 동시에 표적 세포인 심근세포에 정확히 전달되도록 하는 심근세포에 대한 선택성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 친수성 고분자를 포함하는 구성을 갖는다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00010
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 하기 개열지도 1의 구성을 가진 pDNA(본 발명의 명세서에는 pVEGF로 표시)일 수 있고,
[개열지도 1]
Figure 112015092920899-pat00011
상기 개열지도 1의 구성을 가지는 pDNA 핵산은 구체적으로, 유전자 서열의 발현을 조절하기 위한 SV40 프로모터, 허혈 조직을 인지함으로써 저산소 선택적 발현을 유도하기 위한 Epo 인핸서(enhancer)(서열번호 3); 및 혈관내피성장인자(VEGF)의 유전자 서열인 VEGF cDNA(서열번호 4);를 포함하는 것일 수 있다.
상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA(본 발명의 명세서에는 siSHP-1으로 표시)인 것이 바람직한데 왜냐하면 상술한 심근세포에 선택성을 갖는 친수성 고분자와 강한 전기적 상호작용을 형성함과 동시에 심근세포의 허혈성 심장질환에 서로 시너지 효과를 갖도록 하는 두 핵산이기 때문이다.
[서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
[서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
상기 서열번호 1, 2의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에는 1 내지 5 개의 뉴클레오타이드의 돌출부(overhang)를 포함할 수 있고, 상기 돌출부 뉴클레오타이드는 2 개의 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘)일 수 있다.
상기 두 핵산은 상기 친수성 고분자와 결합되어 친수성 고분자 내에 포획되어 있는데, 구체적으로 구형 나노입자를 형성한다.
상기 나노입자의 평균 직경은 60 내지 200 nm일 수 있다. 허나, 상기 나노입자의 평균 직경이 100 nm 미만일 경우에는 외부 환경에 노출되는 상기 나노입자의 표면적이 넓어지기 때문에, 핵산의 안정성이 낮아지며, 내부에 봉입할 수 있는 핵산의 양 또한 낮아지기 때문에, 과량의 친수성 고분자를 투여해야하는 문제가 발생할 수 있고, 140 nm를 초과하게 되면 상기 두 핵산을 포획하고 있는 친수성 고분자 간의 공간이 넓어지게 되어, 이 역시 안정성이 낮아지는 문제가 발생하므로, 상기 나노입자의 평균 직경이 100 내지 140 nm인 것이 바람직하다.
상술한 구성을 갖는 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)의 발현을 증가시킴으로써 경색 부위에 신생혈관의 형성을 유도함과 동시에 심근경색 부위에서 과발현되는 세포사멸관련 인자인 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소 (Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제함으로써 경색부위의 심근세포 사멸을 감소시킬 뿐만 아니라, 심근세포에 대한 선택성이 우수하여 상술한 효과를 갖는 두 핵산을 정확히 심근세포에 전달할 수 있다. 아울러, 심근세포로의 흡수능도 우수하여 두 핵산을 심근세포 내로 전달하는 능력도 종래 전달체보다 2 배 이상 탁월하다.
상술한 구조를 갖는 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는 양전하를 띄는 상기 친수성 고분자와 음전하를 띄는 상기 siRNA가 서로 전기적 상호작용에 의하여 결합을 형성하여 구형 나노입자를 형성하는데 구제적으로 상기 친수성 고분자 내에 상기 siRNA가 봉입되는 형태이다. 이후 첨가되는 pDNA 역시 양전하를 띄어, 상기 친수성 고분자와 전기적 상호작용으로 결합되며, 상기 siRNA와 함께 친수성 고분자 내에 봉입되는 코어에 위치한다. 다만, pDNA의 첨가로 인하여 상기 친수성 고분자가 더욱 단단히 결합되어 상술한 바와 같이, 평균 직경이 150 내지 350 nm에서 60 내지 200 nm로 줄어들게 된다.
또한 상술한 구조를 갖는 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는 외부 물질에 대해 안정적이며, 내부 결합이 단단할 뿐만 아니라, 심근세포에 대한 선택성도 우수하다. 게다가 이러한 복합적 구성 요소들로 인하여 세포 흡수 능력이 우수하기 때문에, 종래 하나의 유전자 또는 하나의 유전자와 지지체(일예로 DA-PEI/siSHP-1)로 이루어진 복합체에 비하여 약 2 배이상의 현저히 우수한 심근세포로 유전자를 전달하는 효과를 나타냄을 후술하는 실험예를 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는 심근세포의 세포 내 세포질 영역으로 선택적으로 전달되고, 상기 친수성 고분자는 심근세포에만 존재하는 효소에 의하여 분해됨에 따라, 심근세포로의 유전자 전달용 복합체 내부에 단단히 봉입되어 있던 서로 다른 효과를 갖는 두 핵산(siSHP-1 및 pVEGF)이 효과적으로 방출되는 효과를 나타낸다,
이때, 상기 pDNA는 유전자 전달용 복합체를 형성하는데 있어 음이온 첨가제로서의 역할을 수행한다.
본 발명에 따른 상기 심근세포로의 유전자 전달용 복합체는, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 같이, 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8인 것이 바람직하다. 상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 친수성 고분자의 중량비가 1 : 1 : 2 미만인 경우에는 단단한 결합을 갖는 100 내지 140 nm의 평균직경을 갖는 구형 나노입자로 형성되지 못하고, 내부에 봉입되어야 할 상기 두 핵산이 모두 외부에 방출되거나 입자를 형성하지 못하고 외부 용액에 노출되어 존재하게 되는 문제가 있고(도 2), 중량비가 1 : 1 : 8을 초과할 경우, 심근세포로의 유전자 전달용 복합체의 고분자량이 과도하게 높아져 세포 독성이 야기되는 문제가 발생한다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
원료 및 시약
저 분자량 폴리에틸렌이민(PEI1.8)을 Pierce사(Rockford, IL)에서 구입 하였다. 고 분자량 PEI (PEI25), 담즙산(deoxycholic acid, DA), dicyclohexylcarbodiimide(DCC) 및 N-hydroxysuccinimide(NHS)는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다.
제조예 1. siSHP -1 및 pVEGF 의 제조.
쥐의 SHP-1 siRNA(센스: 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'(서열번호 1), 안티센스: 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'(서열번호 2))는 Bioneer(대전, 한국)로부터 제공받았다. 이때, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 3' 말단에는 dTdT 돌출부 뉴클레오티드가 더 포함되어 있었다. 문헌(Kim SH, Moon H-H, Kim HA, Hwang K-C, Lee M, Choi D. Hypoxia-inducible vascular endothelial growth factor-engineered mesenchymal stem cells prevent myocardial ischemic injury. Mol Ther. 2011;19:741-50.)에 보고된 방법에 따라 pEPO-SV-VEGF 벡터를 제작하였다.
FBS(fetal bovine serum), DMEM(Dulbeco’s modified Eagle’s medium) 및 DPBS(Dulbeco’s phosphate buffered saline)를 비롯한 모든 세포 배양 물질은 Invitrogen사(Calsbad, CA)에서 제공받았다.
제조예 2. 담즙산(deoxycholic acid, DA)과 폴리에틸렌이민 ( PEI )의 접합체(DA- PEI )의 제조
종래 문헌(Chae SY, Kim HJ, Lee MS, Jang YL, Lee Y, Lee SH, et al. Energy-independent intracellular gene delivery mediated by polymeric biomimetics of cell-penetrating peptides. Macromol Biosci. 2011;11:1169-74.)에 보고된 방법에 따라, DA의 C-24 위치의 측쇄 카르복실기와 PEI1.8 아민 말단을 접합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 DA-PEI 접합체를 합성하였다. 이때, 합성된 DA-PEI 접합체는 하기 화학식 1에서 n과 m이 각각 1 내지 10이였다.
[화학식 1]
Figure 112015092920899-pat00012

실시예 . 유전자전달용 복합체(DA- PEI / siSHP -1/ pVEGF )의 제조 및 특성화
본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 상기 제조예 2로부터 제조된 DA-PEI에 상기 제조예 1로부터 제조된 siSHP-1 및 pVEGF를 순차적으로 혼합하여 유전자전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)을 제조하였다.
구체적으로 DA-PEI와 siSHP-1을 2-8 : 1의 중량비로 혼합하고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 이후, siSHP-1과 동량의 pVEGF를 혼합한 후, 상온에서 30 분 동안 추가로 인큐베이션 하여 유전자전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)을 제조하였다.
비교예 1. 유전자전달용 복합체(DA- PEI / siSHP -1/ pVEGF , 0-1 : 1)의 제조.
제조예 2로부터 제조된 DA-PEI와 제조예 1로부터 제조된 siSHP-1을 0-1 : 1의 중량비로 혼합하고, 상기 siSHP-1과 동량의 pVEGF를 혼합한 것을 제외하고 상기 실시예와 모두 동일하게 유전자전달용 복합체를 제조하였다.
비교예 2. 복합체(DA- PEI / siSHP -1)의 제조.
본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)와의 비교를 위한 비교예로,
제조예 2로부터 제조된 DA-PEI와 제조예 1로부터 제조된 siSHP-1만을 4:1 중량비로 혼합하면서, pVEGF를 사용하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예과 모두 동일하게 하여 복합체(DA-PEI/siSHP-1)를 제조하였다.
비교예 3. siSHP -1(naked siHSP -1)의 제조.
상기 제조예 1로부터 제조된 siSHP-1을 그대로 사용하였다.
비교예 4. 유전자전달용 복합체( PEI1 .8/ siSHP -1/ pVEGF , 8 : 1 : 1)의 제조.
시그마 알드리치 社로부터 구입한 PEI1.8 (분자량 1,800)을 이용한 것을 제외하고 상기 실시예와 모두 동일하게 유전자전달용 복합체를 제조하였다.
비교예 5. 유전자전달용 복합체( PEI25 / siSHP -1/ pVEGF , 1 : 1 : 1)의 제조.
시그마 알드리치 社로부터 구입한 PEI25 (분자량 25,000)을 이용하고, PEI25와 siSHP-1의 혼합 질량비를 2 : 1로 한 것을 제외하고 상기 실시예와 모두 동일하게 유전자전달용 복합체를 제조하였다.
실험예 1.
상기 실시예 및 비교예 1로부터 제조된 복합체들의 형성여부를 확인하기 위하여, 겔 지연 분석법(gel retardation assay)으로 측정하였다.
상기 실시예 또는 비교예 1의 복합체가 용해된 시료를 2% 아가로스겔에 로딩하고, 이때, 상기 시료는 로딩 전에 GelRed(Biotium Inc., Hayward, CA)로 예비 염색하였다. 다음 TAE 버퍼에서 15 분 동안 100 V로 전기영동하였다. 상기 겔 내에 형성된 siRNA의 밴드는 GelDoc gel documentation system (Syngene, Cambridge, UK)로 시각화하여 확인하였다.
상기 실시예 및 비교예 1로부터 제조된 복합체들의 직경(hydrodynamic diameter), 표면 전하(surface charge)를 동적광산란형 입도 분석기(DLS; Zeta-plus, Brookhaven, New York)로 분석하였고, 입자의 형태(morphology)는 원자힘 현미경(AFM)으로 관찰하였다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 및 비교예 1로부터 제조된 유전자 전달용 복합체의 형성 확인을 위한 전기영동 결과를 나타낸 도면으로,
도 2에 도시된 바와 같이, siSHP-1 및 pVEGF가 DA-PEI에 첨가 시, 핵산의 완전한 결합은 모두 유전자에 대한 고분자의 중량비가 1 이상인 실시예의 유전자 전달용 복합체에서만 이루어지고 있음을 확인하였다.
비교예 1로부터 제조된 유전자 전달용 복합체와 같이 siSHP-1 및 pVEGF의 존재 하에서 고분자의 중량비가 낮은 경우를 살펴보면, 유전자 전달용 복합체로 형성되지 못하고 겔 상에 로딩된 siSHP-1 및 pVEGF의 밴드가 명확히 나타나는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 유전자 전달용 복합체는 DA-PEI(친수성 고분자) : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 2:1:1 이상이면 유전자 전달용 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있고, 가장 바람직하게는 2-8 : 1 : 1일 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체의 광산란입자분석(DLS)으로 분석한 결과 그래프와 원자힘 현미경(AFM)으로 측정한 도면이다. 이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였다.
도 3에 도시된 바와 같이. 광산란입자분석에서는 실시예(DA-PEI:siSHP-1:pVEGF, 8:1:1) 유전자 전달용 복합체가 평균 직경이 125 ㎚인 것으로 확인되었으나, 원자힘 현미경에서는 평균 직경이 140 ㎚의 구형인 것으로 확인되었다. 상기 두 결과는 서로 유사성을 가지고 있으므로 이로부터 본 발명의 유전자 전달용 복합체의 평균 직경은 60 내지 200 ㎚임을 알 수 있다.
실험예 2. 세포 배양 및 인 비트로 트랜스펙션( transfection )
쥐 심장 근원 세포(H9C2 cells, 한국 세포주 은행, 서울, 한국)를 5 % CO2의 습한 대기 중에서, 37 ℃, 10 % FBS가 공급된 DMEM에서 배양하였다. 인 비트로 트랜스펙션(transfection)을 위해, 세포들을 소정의 세포 밀도로 접종하고, 24 시간 동안 배양 하였다. 신선한 무혈청 배지(serum-free medium)로 배지를 변경 한 후, 본 발명에 따른 유전자전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 37 ℃에서 4 시간 동안 처리 하였다. 이후 세포 배양액을 신선한 10 % 혈청 함유 배지로 교체하였다. 상기 세포는 종래의 인 비트로 분석으로 37 ℃에서 정상 산소 상태 및 저산소 상태에서 배양 하였다.
실험예 2-1. 세포 흡수(cellular uptake)
인 비트로 세포 흡수 실험에는 Cy5.5-표지된 siSHP-1를 사용하였다. 세포 흡수는 형광 현미경으로 조사하였다. H9C2 셀은 5.0×104 cells/35 mm의 밀도로 배양접시에 접종하고, 4 시간 동안 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF(siRNA 50 nM))를 처리하였다.
이후 세포를 차가운 PBS로 세척하고 4% 파라포름 알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 고정하였다. Cy5.5-표지된 siSHP-1의 세포 내에서의 위치는 공 초점 레이저 주사 현미경 (Leica TCS SP8 confocal laser scanning microscope, Leica, Germany)에 의해 시각화하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 4.0×105 cells/60 mm 의 밀도로 배양접시에 도말하고, 실시예인 DA-PEI/ siSHP-1/pVEGF(siRNA를 50 nM)를 처리하였다. 4 시간 후, 세포를 트립신 처리 및 차가운 PBS로 세척하고, FACS를 이용한 유세포 분석기(Guava east Cyte Flow Cytometers, EMD Millipore, Germany)로 분석하였다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였다. 다만, siSHP-1의 최종 농도가 50 nM이 되도록 제조하였다.
또한, 본 발명의 유전자 전달용 복합체의 효과를 비교하고자, 실시예인 DA-PEI/ siSHP-1/pVEGF(siRNA를 50 nM) 대신에 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1), 비교예 3의 siSHP-1(naked siSHP-1) 및 아무것도 처리하지 않은 대조군(control)으로 각각 처리하여 상술한 바와 동일한 조건으로 실험한 후, FACS를 이용한 유세포 분석기(Guava east Cyte Flow Cytometers, EMD Millipore, Germany)로 분석하였다.
도 4는 아무것도 첨가하지 않은 대조군(control), 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1), 비교예 3의 siSHP-1(naked siSHP-1) 및 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF(siRNA 50 nM))의 세포 내 전달여부를 확인하기 위하여, 각각에 대한 FACS를 이용한 유세포 분석결과를 나타낸 그래프이다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였다. 다만, siSHP-1의 최종 농도가 50 nM이 되도록 제조하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 H9C2 세포 내로 제대로 전달되었음을 확인하였다.
즉, 유세포 분석기를 통한 정량적 분석에 따르면, 세포집단(cell population)은 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 또는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 배양한 경우에 한해서, 높은 형광 강도를 나타내었다. 즉, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 또는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 세포를 처리할 경우, 세포의 평균 형광강도는 아무것도 처리하지 않은 대조군(control)보다 각각 8.4 배, 12.3 배 증가한 것을 확인하였다.
한편 비교예 3의 siSHP-1(naked siSHP-1)으로 처리한 경우, 세포 흡수를 무시할 수 있는 정도로 형광강도의 차이가 미미하게 관찰되었다.
상술한 결과를 통해, 본 발명에서 복합체들의 높은 세포 내 전달 성능은 엔토시토시스(endocytosis), 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs)와 같은 에너지 독립적인 경로(energy-independent)를 매개하는 친수성 고분자인 DA-PEI로부터 기인한다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 보다 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)가 세포 흡수가 더 높았던 이유는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 평균 직경이 더 작고, 양의 표면 전하를 가지며, 음이온성 고분자에 대해 높은 안정성을 가지는 등의 물리 화학적 성질이 우수하기 때문이다.
즉 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)와 달리 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 pVEGF의 첨가로 인하여 평균 직경이 더욱 작아짐과 동시에 물리화학적 성질이 우수해지는 역할을 수행함을 알 수 있다. 결국, 본 발명의 유전자 전달용 복합체는 서로 간의 긴밀한 상호작용으로 인하여 어느 하나라도 제외될 경우 세포 흡수능이 현저히 낮아짐을 알 수 있다.
실험예 2-2. 세포독성 분석( cytotoxicity assay)
세포 독성을 평가하기 위해, H9C2 세포를 1.0×105 cells/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 배양 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교환 하였다. 세포에 polymer/siSHP-1/pVEGF 복합체를 처리하였는데, 이때 실시예, 비교예 4, 비교예 5로부터 제조한 복합체를 처리하였다. 4시간 후, 배지를 신선한 혈청 함유 배지로 변경하고, 24 시간 동안 배양 하였다. 세포 생존율은 30 분 동안 MTT 용액 (0.5 ㎎ / ㎖)와 함께 항온 배양하는 단계; DMSO로 침전물을 용해하는 단계; 540 nm에서 흡광도를 측정하는 단계;로 구성된 MTT 분석법에 의해 측정하여 도 5에 나타내었다.
이때, 도 5 그래프 내에서 실시예는 DA-PEI으로, 비교예 4는 PEI1.8로, 비교예 5는 PEI25로 표기하였다.
다만, 상기 실시예, 비교예 4 및 비교예 5의 복합체에서 친수성 고분자(polymer)가 세포 독성에 나타내는 영향을 측정하기 위하여, 친수성 고분자의 조성을 0.0 mM에서 1.5 mM로 달리하여 이들 각각에 대하여 세포 독성을 측정하여 도 5에 도시하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 친수성 고분자의 조성이 0.0에서 1.5 mM로 증가하는데 따라 본원 발명과 비교예 4의 복합체 경우에는 친수성 고분자의 조성이 1.5 mM까지 증가되어도 세포 생존율이 80% 미만으로 감소되지 않았으나 비교예 5 복합체에 사용된 친수성 고분자(PEI25)는 0.3 mM 이상부터 80% 미만으로 감소되기 시작하고, 1.4 mM 사용될 경우에는 세포 생존율이 20% 까지 떨어지게 되는 것을 확인할 수 있다.
즉, PEI25는 세포 독성이 매우 높으나, 본원 발명에 사용된 친수성 고분자는 세포에 미치는 영향이 미미한 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 인 비트로 SHP -1 유전자 사일런싱 ( 웨스턴 블롯 분석)
H9C2 세포를 5.0×105 cells/100 mm의 밀도로 배양접시에 접종한 후, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 4 시간 동안 각각 처리하였다. 세포를 추가로 정상산소(20% O2, 5% CO2 및 75% N2)하에서 24 시간 동안 배양하고, 뒤이어 저산소(1% O2, 5% CO2, 94% N2)하에서 4 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 헹구고, 1×Cell Lysis Buffer(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)로 용해시켰다. 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay(Thermo Scientific Rockford, IL)를 사용하여 측정하였다. 상층액(supernatants)을 SDS-PAGE에 분류하고(fractionated), 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, Richmond, CA)에 도말하였다. 막을 1 시간 동안 1 % 트윈 20을 함유 한 TBS에서 4% 탈지 우유로 차단시켰다. 막을 1차 항체(mouse anti-SHP-1 및 rabbit anti-β-actin, Abcam)와 함께 4 ℃에서 하루 동안 배양한 후, HRP-conjugated 2차 항체(anti-rabbit 및 anti-mouse IgG, ABCAM)와 배양하였다.
이를 화학 발광(chemiluminescence)은 화학 발광 검출 시스템(ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 사용하여 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)가 세포 내 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(SHP-1)의 발현정도와 β-actin의 발현에 미치는 영향을 측정하여 비교하였다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였고, 다만 siSHP-1의 최종 농도가 10 nM와 20 nM인 두 용액을 제조하여 사용하였다.
또한, 상기 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)도 DA-PEI : siSHP-1의 혼합 중량비가 4:1인 것을 사용하였으나, 다만 siSHP-1의 최종 농도가 10 nM와 20 nM인 두 용액을 제조하여 사용하였다.
도 6는 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 세포(H9C2)와 배양하였을 때, 세포 내로 전달 된 후, 세포 내 SHP-1 발현 정도를 분석한 웨스턴 블랏 결과 및 이를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6에 도시된 바와 같이, siRNA를 이용한 SHP-1의 유전자 사일런싱(silencing) 효과를 알아보기 위해, 저산소 환경에서 H9C2 세포에 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 각각 처리하여 이를 측정하였다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였고, 다만 siSHP-1의 최종 농도가 10 nM와 20 nM인 두 용액을 제조하여 사용하였다.
또한, 상기 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)도 DA-PEI : siSHP-1의 혼합 중량비가 4:1인 것을 사용하였으나, 다만 siSHP-1의 최종 농도가 10 nM와 20 nM인 두 용액을 제조하여 사용하였다.
그 결과, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)와 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF) 모두 SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(SHP-1) 유전자 발현은 억제하지만, 본 발명에 따른 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 효능이 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)보다 높은 것을 확인할 수 있다.
구체적으로 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)는 siSHP-1의 최종농도가 10, 20 nM일 때, 유전자 사일런싱 효과가 각각 14.6 %와 33.6 %로 측정되었다.
한편 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 siSHP-1의 최종농도가 10, 20 nM일 때, 유전자 사일런싱 효과가 각각 36.9 및 63.9%로 동일한 siSHP-1에서 약 2 배의 유전자 사일런싱 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
이는 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체가 동일한 siSHP-1 농도를 포함하는 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP)보다 2 배 이상의 현저히 우수한 발현 억제 효과를 갖는데, 이는 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체의 구조에 기인한 우수한 세포 흡수 특성에 의한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체는 단순히 친수성 고분자와 siSHP의 복합체에 pVEGF를 첨가함으로써 허혈성 심장질환에 대한 시너지 효과를 가질뿐만 아니라, 이 두 핵산의 첨가로 인하여 유전자 전달용 복합체의 구조가 재배열되면서 물리화학적 성질이 개선되었을 뿐만 아니라, 세포 전달능 또한 개선되었음을 확인할 수 있다.
실험예 4. 인 비트로 VGEF 발현(ELISA)
H9C2 세포를 2.0×105 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 24 시간 동안 배양하였다. 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)으로 처리한 후, 4 시간 후, 세포를 추가로 8일 동안 배양하였다. 조정 배지(conditioned medium)는 소정의 시간 간격으로 수집 하였다. VEGF의 발현 수준은 제조업체의 지시에 따라 human VEGF EKISA KIT(R & D System, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. VEGF 발현에 제시된 모든 데이터는 Pierce BCA Protein 분석법으로 산출된 단백질 농도와 함께 정규화 하였다.
상기 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에서, DA-PEI:siSHP-1:pVEGF의 혼합 중량비는 8 : 1 : 1이고, 상기 pVEGF 와 siRNA의 최종농도는 0.7 ㎍/well이 되도록 제조한 것을 사용하였다.
도 7은 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 H9C2 세포를 처리한 후, 정상 산소(normoxia) 및 저산소(hypoxia) 환경 하에서 8일 동안 배양된 상기 세포의 VEGF 유전자 발현 정도를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay; 효소 결합 면역 흡착 분석) 기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
상기 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에서, DA-PEI:siSHP-1:pVEGF의 혼합 중량비는 8 : 1 : 1이고, 상기 pVEGF 와 siRNA의 최종농도는 0.7 ㎍/well이 되도록 제조한 것을 사용하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 세포가 저산소 조건에 노출되었을 때 VEGF의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 7100 pg/ml까지 증가하는데 반해, 정상 산소 하에서는 VEFG의 발현이 증가되지 않고 정상 수준에 머물고 있음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 DA-PEI/siSHP-1/pVEGF 복합체가 세포 내로 siRNA와 pDNA를 효과적으로 전달하고 있으며, 이러한 전달을 통해서 세포 내 존재하는 특정 유전자의 발현을 성공적으로 억제 및 향상시키고 있음을 확인할 수 있다.
아울러, 상기 본 발명에 따른 DA-PEI/siSHP-1/pVEGF 복합체 중에서 어느 하나라도 제외될 경우에는 물리화학적 성질뿐만 아니라 세포 내 전달성이 2 배 이상 감소되어, 세포 내 존재하는 특정 유전자의 발현을 향상 및 억제하는 효과가 2 배 이상 감소된다는 것을 알 수 있다.
실험예 5.
5-1) 쥐 심근 경색 수술 모델의 준비
모든 동물 실험 프로토콜은 연세대학교 의과 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인되었다. 심근 경색(Myocardial infarction)은 8 주령의 수컷 Sparague-Dawley 쥐(240 ± 10g)로부터 유도하였다. 마취[ketamin hydrochloride(90 mg/ kg) 및 xylazine hydrochloride(5 ㎎/㎏) 사용] 후, Harvard ventilator(Harvard Apparatus, Milis, MA)를 사용하여 환기하였고, 쥐의 심장은 왼쪽 측면 늑골 부분을 2 cm 절개하여 노출시켰다. 좌전하행 관상동맥을 6-0 실크 봉합사(Ethicon Inc, Somerville, NJ)를 사용하여 결찰하고, 1 시간 후 재관류시켰다. 허혈(Ischemia)은 흡장(occlusion) 구역의 심근 말단에서 육안 검사에 의해 확인되었다. 가성 조작 동물(sham-operated animals)은 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 과정을 제외한 과정을 동일하게 수행함으로써 제작하였다. PBS 버퍼용액으로 처리한 대조군(Nor), 살린(saline), 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 외과적 혈관 폐쇄(occlusion) 1 시간 이후, 경색영역의 전방 및 측방향으로 심근 내 3회 주사 방식을 통하여 전달되었다 (siRNA 1 nmol in a total volume of 100 μL). 소정의 기간(세포사멸 분석 7일, 미세혈관형성 분석 7일, 경색크기 분석 4일) 경과 후, 동물을 다시 마취시켰다. 심장을 10% 포름알데히드 용액을 이용한 관류-고정(perfusion-fixation) 및 파라핀 포매 과정을 거쳐 5 μm 파라핀 절편으로 제작하였다. 모든 세 번째 섹션은 추가 분석을 위해 수집 하였으며, 모든 측정은 조직학적 맹검 방식으로 수행하였다.
이때, 상기 실시예로부터 제조된 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 실시예 중에서 DA-PEI : siSHP-1 : pVEGF의 혼합 중량비가 8 : 1 : 1인 것을 사용하였다. 다만, 상기 실시예의 유전자 전달용 복합체 총 100 μL를 기준으로 siSHP-1의 최종농도가 10 nM이 되도록 제조하였다.
상기 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)는 DA-PEI : siSHP-1의 혼합 중량비가 4 : 1인 것을 사용하였다. 다만, 이 역시 비교예 2의 복합체 총 100 μL를 기준으로 siSHP-1의 최종농도가 10 nM이 되도록 제조하였다.
5-2) TUNEL assay
파라핀-포매 조직 절편을 탈 파라핀화 하고 PBS로 세정 하였다. TUNEL 분석은 ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit(Chemicon International, Temecula, CA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 세포사멸 핵(Apoptotic nuclei)은 세포사멸 핵을 어두운 갈색으로 염색할 수 있는 3,3-diaminobenxidine(DAB, Vector Lavoratories, UK)를 사용하여 시각화 하였다. 세포사멸된 세포는 광학현미경으로 계수하였다. 시험편은 슬라이스 당 총 5 고출력 필드(HPF)에서 시험하였다. 각 시험편에 할당된 값이 다섯 측정치의 평균이다.
5-3) 면역조직화학적 분석( immunohistochemistry )
미세 혈관 심장을 조사하기 위해, 심장 조직에서 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin, ASMA)의 발현 수준을 분석하였다. 파라핀 포매 조직 절편은 크실렌(xylene)과 알코올로 탈파라핀화 및 재수화하고, PBS로 세정하였다. 샘플은 5 % 소혈청알부민(BSA)으로 차단한 후, anti-ASMA 1차 항체(primary antibody)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양 하였고, 뒤이어 비오틴화(biotinylated)된 anti-mouse IgG 2차 항체(secondary antibody)와 함께 배양하였다. 절편들은 DAB 염색 후, Vectastain Universal Quick Kit(Vector Lavoratories, UK)에서 스트렙타비딘(streptavidin)/퍼옥시다제 (peroxidase)의 복합 시약으로 처리하였다. 핵들은 헤타톡실린(hematoxylin)으로 대비 염색 (counterstain) 하였다. 미세 혈관 형성은 광학 현미경으로 관찰하고, HPF 당 ASMA-positive 영역의 개수는 200× 배율에서 전체 섹션을 계수하여 결정하였다. 표본들은 슬라이드 당 5 HPF로 시험하였다.
도 8은 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 DA-PEI/siSHP-1/pVEGF의 생체 내 항세포사멸 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 상기 TUNEL assay로 측정된 결과를 촬영한 이미지와 사멸된 세포를 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 생체 내에서 SHP-1 유전자 발현의 하향 조절을 유도하는 유전자가 전달이 된다면, 세포사멸 수준 또한 감소될 것이다.
결과를 비교하자면, PBS 버퍼 처리된 대조군(Saline)의 경우보다, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)로 처리된 경우, 세포사멸 수준을 52.3%로 감소되었음을 확인하였다.
한편, 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 처리한 경우에는 세포사멸 수준을 22.4%로 더욱 크게 감소한 것을 확인하였다. 즉, 비교예 1의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)에 비해 약 2 배 이상 현저히 우수한 실시예 의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 항세포사멸 효과는 VEGF 발현의 상향 조절에 의해 발생되는 것에 의해 기인하는 것이다.
즉, siRNA에 의한 siSHP-1 유전자 사일런싱 및 pDNA에 의한 VEGF 발현과 같이 2 종의 유전자를 동시에 전달하는 것은 심근 세포의 저산소증에 의한 세포 사멸을 방지하는 종래 복합체 또는 살린(saline)보다 현저히 우수한 효과를 갖는데, 이러한 효과는 본 발명에 따른 새로운 구조 및 구성요소의 제한된 중량비에 따라 제조된 유전자 전달용 복합체가 물리화학적 특성이 현저히 개선됨과 동시에 선택적으로 심근 세포로 전달되며, 심근 세포 내로 상기 siRNA 및 pDNA의 전달능이 현저히 향상되었기 때문이다.
도 9은 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 혈관 신생에 대한 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 미세 혈관 형성 확인용 면역 조직화학적 염색 결과를 촬영한 이미지와 이미지 별 미세 혈관 수를 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9에 도시된 바와 같이, PBS 버퍼가 처리된 대조군(Saline)의 경우 혈관 신생 지수가 3.8 small vessels/visible region인 반면 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)를 처리한 심근의 경우의 혈관 신생 지수가 16.5 small vessels/visible region으로 크게 증가하였다. 이는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 허혈성 지역에 선택적으로 전달되어, 신생 혈관을 자극함으로써 VEGF 발현을 유도하기 때문이다.
따라서, 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 저산소환경하에서 혈관 신생 유전자 치료가 수행된다는 것을 알 수 있다.
흥미롭게도, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)로 처리한 경우에도 혈관 신생 지수가 8.1 small vessels/visible region으로 조금 향상되었음이 관찰되었는데, 이는 세포 내에 존재하는 SHP-1는 VEGF 수용체(receptor)-2(KDR / FLK-1)와 TNF-α의 불활성화를 매개하고, SHP-1 유전자 사일런싱은 KDR/FLK-1의 티로신 탈인산화를 완화시켜 결과적으로, 허혈 영역에서의 혈관 신생의 속도를 증가시키기 때문으로, 즉, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1)에서와 같이 siSHP-1의 단독처리로도 혈관 형성을 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.
허나 본 발명에 따른 siSHP-1과 pVEGF의 동시 전달하게 되면, 단독으로 처리하는 경우에 비해 심근 경색 모델에서 2 배 이상의 혈관 신생 효과를 가짐을 알 수 있으므로, 단독으로 사용하는 경우보다 현저히 우수한 시너지 효과가 발생하는 것을 확인하였다.
결과적으로 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 VEGF의 발현을 증가시킴으로써 경색 부위에 신생혈관의 형성을 유도함과 동시에 심근경색 부위에서 과발현되는 세포사멸관련 인자인 SHP-1의 발현을 억제함으로써 경색부위의 심근세포 사멸을 감소에 상승효과를 발생시킬 수 있다.
실험예 6. 경색(infarct) 크기 분석
상기 실험예 5-1에서의 심근 경색 모델을 이용한다. 상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여, 4 일 후 심근 경색 크기를 분석하기 위해, 심장을 절단하고, 1% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC; Sigma-Aldrich) 용액에서 37 ℃, 20 분 동안 배양하였다. 절단된 조직은 4 ℃에서 하루 동안 파라-포름알데히드(para-formaldehyde) 용액으로 고정시켰다. 샘플들을 디지털 카메라로 촬영하였다. 생존 심근(viable myocardium)(TTC stained)은 빨간색으로 식별되며, 경색 영역(infarcted area)(unstained by TTC)은 노랑-흰색(yellow-white)으로 나타났다. Image J 소프트웨어를 사용하여 정상 및 좌심실 경색 심근 영역의 면적을 측정하였다. 좌심실의 경색 부분은 전체 좌심실 면적 비율(%)에 대한 누적 경색 부분으로 산출하였다.
도 10는 심근경색 모델에서 본 발명에 따른 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)의 심근경색증에 대한 치료 효과를 평가하기 위해, 가성 조작 쥐 모델(Nor), 좌전하행 관상동맥 결찰 및 재관류 수술에 의해 제작된 쥐 모델의 허혈성 심근에 PBS 버퍼를 처리한 대조군(Saline), 비교예 2의 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1) 및 실시예의 유전자 전달용 복합체를 처리한 군(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)에 대하여 4일 후 TTC 염색을 통하여 경색 크기를 촬영한 이미지와 이를 수치화한 그래프이다.
도 10에 도시된 바와 같이, 심근 경색 모델에서 경색 지역은 담황색으로 관찰된다. 그러나, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 또는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 처리한 후에는 담황색 부분 즉 경색 지역이 눈에 띄게 감소하였음을 확인할 수 있었다.
정량적 분석 결과(도 9의 그래프)에 따르면, 비교예 2의 복합체(DA-PEI/siSHP-1) 또는 실시예의 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)로 처리한 후, 좌심실의 10.3%, 1.8%에만 경색이 나타난 반면, 살린(saline)을 처리한 경우에는 좌심실의 33.7%에 경색이 나타났다.
상술한 바와 같이, 이러한 결과는 siSHP-1 처리에 의한 감소된 세포 사멸 및 pVEGF의 도입을 통한 혈관 확장으로부터 기인하는 것이다.
상술한 결과들을 모두 종합하여 보면, 본 발명에 따른 유전자 전달용 복합체(DA-PEI/siSHP-1/pVEGF)는 2종의 유전자 동시 전달을 통한 상승작용을 통해 허혈성 심장질환의 치료에 매우 효과적으로 적용될 수 있음을 알 수 있다.
<110> KIST <120> Pharmaceutical compositions for prevention or treatment of ischemic heart diseases comprising composite for gene delivery and complex for genes delivery to cardiomyocytes <130> 5934 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> misc_RNA <400> 1 ggacauuucu ugugcguga 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> misc_RNA <400> 2 ucacgcacaa gaaaugucc 19 <210> 3 <211> 106 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> enhancer <400> 3 gccctacgtg ctgtctcaca cagcctgtct gacctctcga cctaccggcg tctagacgcc 60 ggtaggtcga gaggtcagac aggctgtgtg agacagcacg tagggc 106 <210> 4 <211> 588 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene <400> 4 aagcttatga actttctgct gtcttgggtg cattggagcc ttgccttgct gctctacctc 60 caccatgcca agtggtccca ggctgcaccc atggcagaag gaggggggca gaatcatcac 120 gaagtggtga agttcatgga tgtctatcag cgcagctact gccatccaat cgagaccctg 180 gtggacatct tccaggagta ccctgatgag atcgagtaca tcttcaagcc atcctgtgtg 240 cccctgatgc gatgcggggg ctgctgcaat gacgagggcc tggagtgtgt gcccactgag 300 gagtccaaca tcaccatgca gattatgcgg atcaaacctc accaaggcca gcacatagga 360 gagatgagct tcctacagca caacaaatgt gaatgcagac caaagaaaga tagagcaaga 420 caagaaaatc cctgtgggcc ttgctcagag cggagaaagc atttgtttgt acaagatccg 480 cagacgtgta aatgttcctg caaaaacaca gactcgcgtt gcaaggcgag gcagcttgag 540 ttaaacgaac gtacttgcag atgtgacaag ccgaggcggt gatctaga 588

Claims (17)

  1. 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산;
    SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산; 및
    담즙산(deoxycholic acid, DA)과 폴리에틸렌이민의 접합체로서 하기 화학식 1로 표시되는 친수성 고분자;로 이루어진 유전자 전달용 복합체를 유효성분으로 하고,
    상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 하기 개열지도 1의 구성을 갖는 pDNA이고, 상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA이며,
    상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 상기 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8이며,
    상기 유전자 전달용 복합체는 평균 직경은 100 내지 140 nm인 구형의 나노입자인 것을 특징으로 하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [개열지도 1]
    Figure 112017027220263-pat00027

    [서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
    [서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
    [화학식 1]
    Figure 112017027220263-pat00028

    상기 화학식 1에서,
    n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 저산소환경에서만 VEGF의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 전달용 복합체는 허혈성 심장질환 부위의 신생혈관형성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 전달용 복합체는 허혈성 심장질환 부위의 세포사멸을 감소시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 허혈성 심장질환은 협심증, 심근비대증, 심근경색증, 허혈성 급성 심부전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산;
    SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산; 및
    하기 [화학식 1]로 표시되는 친수성 고분자;로 이루어지고,
    상기 VEGF의 발현을 유도하는 핵산은 하기 개열지도 1의 구성을 갖는 pDNA이고, 상기 SHP-1의 발현을 억제하는 핵산은 하기 서열번호 1의 센스 서열 및 서열번호 2의 안티센스 서열을 갖는 siRNA이며,
    상기 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하는 핵산, SH2 도메인 티로신 탈인산화효소(Src homology region 2 domain-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1)의 발현을 억제하는 핵산, 및 상기 친수성 고분자의 중량비는 1 : 1 : 2-8이며,
    평균 직경은 100 내지 140 nm인 구형의 나노입자인 것을 특징으로 하는 심근세포로의 유전자 전달용 복합체.
    [개열지도 1]
    Figure 112017027220263-pat00029

    [서열번호 1] 5'-GGACAUUUCUUGUGCGUGA-3'
    [서열번호 2] 5'-UCACGCACAAGAAAUGUCC-3'
    [화학식 1]
    Figure 112017027220263-pat00015

    상기 화학식 1에서,
    n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이다.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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