KR101762695B1

KR101762695B1 - 탄저병 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법

Info

Publication number: KR101762695B1
Application number: KR1020160070458A
Authority: KR
Inventors: 조혜은; 신영기; 최준석; 이훈석; 김지천
Original assignee: 국방과학연구소
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2017-07-28

Abstract

본 발명은 탄저병의 진단 및 치료 효과 모니터링을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 제1폴리펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 제2폴리펩티드 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오마커 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 탄저균 감염 여부를 단시간 내에 진단할 수 있게 되고, 치료 효과를 주기적으로 모니터링할 수 있게 된다.

Description

탄저병 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법{BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING ANTHRAX AND METHOD FOR DIAGNOSING USING THE SAME}

본 발명은 탄저병의 진단 및 치료 효과 모니터링을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.

탄저병(anthrax)은 그람 양성(gram positive), 간균형(rod)인 탄저균 (Bacillus anthracis)에 의해 일어나는 감염성 질병이다. 탄저병은 인수공통 전염병으로 감염된 가축과의 접촉, 감염된 고기나 가공품의 섭취, 또는 탄저균 포자의 흡입에 의해 사람에게 감염된다(비특허문헌 0001, 비특허문헌 0002).

탄저병은 감염 경로에 따라 피부 탄저, 호흡기 탄저, 소화기 탄저로 분류된다. 피부 탄저는 사람에게 감염되는 탄저병의 95%를 차지하며 탄저균에 감염된 가축으로 만들어진 울, 가죽, 털제품 등을 다룰 때 박테리아가 피부의 상처를 통해 침입하면서 발생하고, 치료를 받지 못하면 20% 정도가 사망하게 된다. 호흡기 탄저는 탄저균에 오염된 공기를 사람이 흡입함으로써 발생하며 치료를 받지 않으면 90% 이상의 사망률을 보인다. 증상은 감염 후 7일 내지 10일 정도 지나서 나타나기 시작하며 초기에는 열이 오르고 기침이 나는 등 감기와 비슷한 증상을 보이면서 심한 호흡곤란·청색증·심혈관 허탈 등의 중증이 나타난 뒤 2~3일 안에 사망한다. 소화기 탄저는 감염된 고기를 섭취하여 이뤄지며 장내의 염증이 생기면서 시작된다. 처음에는 구역질을 느끼고 식욕이 떨어지면서 구토와 열이 나고 더 진행되면 복통이 심해지고 피가 섞인 구토를 하며 심한 설사를 하고 결국 사망하게 된다.

상술한 세 가지 탄저병 중 가장 치명적인 것은 호흡기 탄저이다. 호흡기 탄저는 폐로 탄저균 포자(spores)가 이행되어 발병하며, 폐포(pulmonary alveoli)에 존재하는 대식 세포가 유입된 탄저균 포자를 포획하기 시작한다. 그러나 대식 세포의 공격을 받더라도 포자는 사멸하지 않고 대식 세포 내에서 발아(germination)하면서 오히려 임파절(lymph nodes)을 경유하며 대식 세포와 함께 체내로 확산된다. 이때, 탄저균이 혈류로 침투하게 되고 탄저병의 주 원인이 되는 탄저 독소를 분비하면서 결국 심각한 증상을 야기하게 된다.(도 1 참조)

탄저균은 세 가지 독소인 방어항원(PA), 부종 요소(EF), 치사 요소(LF)를 분비하며, 독소에 대한 유전자는 pXO1과 pXO2의 2개의 플라스미드에 위치한다. pXO1은 탄저독소의 구조유전자인 lef(치사 요소), cya(부종 요소) 및 pagA(방어 항원)를 포함한다고 알려져 있다(비특허문헌 0001, 비특허문헌 0003).

탄저 독소는 균주가 영양세포로 성장하는 동안 합성되고 세포 외부로 방출된다. 탄저 독소는 세포질 내에서 효소작용을 하는 A 부분(moiety)과 세포에 결합할 수 있는 B 부분으로 구분되고, 탄저 독소는 세포에 결합하여 세포 내로 들어가게 되는 세균성 "AB" 독소군에 포함된다. 부종 요소와 치사 요소는 A 부분에 포함되고, B 부분인 방어 항원에 의해 각각의 독소들이 운반된다(비특허문헌 0004). (도 2 참조)

방어 항원은 735-아미노산 길이의 83-kDa의 단백질로서, 탄저 독소 작용의 첫 번째 단계로 방어 항원은 세포의 수용체에 결합한다. 방어 항원이 세포의 수용체에 결합하면, 퓨린(furin)이나 퓨린과 유사한 엔도프로테이즈(endoprotease)에 의해 N-말단 부위가 잘려지게 된다(비특허문헌 0006). 퓨린은 방어 항원의 N-말단 부위의 R-X-K/R-R 서열에 특이성을 보인다. 퓨린에 의해 N-말단의 20 kDa단편(PA20)이 절단되어 방출되면 남아있는 63 kDa 단편(PA63)은 빠르게 햅타머(heptamer)를 형성하는데, N-말단의 20 kDa이 남아 있게 되면 햅타머가 형성되지 못한다(비특허문헌 0006). 햅타머(Heptamer)를 형성한 PA63에는 부종 요소와 치사 요소가 결합을 한다. 부종 요소와 치사 요소의 N-말단 도메인이 방어 항원과 결합한다(비특허문헌 0007). PA63 햅타머당 부종 요소 또는 치사 요소 세 개의 분자가 결합하며, 이들이 서로 경쟁적으로 결합한다(비특허문헌 0008).

치사 독소와 부종 요소가 결합된 PA63 햅타머가 수용체 매개 세포 내 이동(receptor mediated endocytosis)에 의하여 세포 내로 들어가서 엔도좀(endosome)을 형성한다. 앤도좀 내부의 pH가 낮아지게 되면 햅타머의 구조가 변화하게 되어, 부종 요소와 치사 요소는 앤도좀에서 세포질로 이동한다(비특허문헌 0009, 비특허문헌 0010). 세포 내로 운반된 후, 치사 독소와 부종 요소는 효소 활성을 나타낸다.

치사 요소는 아연 의존성 단백질 가수분해효소(zinc-dependent endoproteases)이다(비특허문헌 0011, 비특허문헌 0012). 치사 요소의 기질은 MAPKK(mitogen-activated protein kinase kinases)로 밝혀졌는데(비특허문헌 0013, 비특허문헌 0014), 치사 요소는 MAPKK5를 제외한 알려진 모든 MAPKK들(MAPKK1~ MAPKK7)를 절단한다(비특허문헌 0013, 비특허문헌 0014, 비특허문헌 0015, 비특허문헌 0016). 절단 위치는 N-말단의 프롤린이 많은 부위로 이 부위가 절단되면 MAPKK는 기질인 MAPK와 결합할 수 없게 되며, MAPKK들의 활성이 줄어들게 된다(비특허문헌 0017). 이런 MAPKK들의 절단은 MAPK 대사 경로(MAP kinase pathway)를 저해하여 p38, ERK, JNK와 같은 단백질의 인산화를 저해하여 세포사멸을 유발한다(비특허문헌 0018).

부종 요소는 칼슘과 칼모듈린이 있으며, 아데닐레이트 싸이클레이즈(adenylate cyclase)로 작용하여 세포 내부의 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 농도를 증가시켜 부종을 유발한다. 미생물 내의 부종 요소 활성은 진핵세포의 칼모듈린에 의해 활성화되는 아데닐레이트 싸이클레이즈 활성보다 1,000배 이상 높지만, 미생물 내에는 칼모듈린이 없기 때문에 진핵세포의 세포질에서만 활성을 나타낸다(비특허문헌 0019).

치사 인자와 방어 항원을 합쳐서 치사 독소 (lethal toxin)라 하며, 치사 독소는 실험동물을 사망에 이르게 한다(비특허문헌 0020). (도 2 참조)

방어 항원과 부종 요소로 구성된 부종 독소(edema toxin)는 세포 조직에 부종을 일으키며, 숙주의 면역계를 억제하여 탄저균의 감염 활동을 지속시킨다(비특허문헌 0021, 비특허문헌 0022). 부종 독소는 실험동물에게 주입하였을 때 부종을 일으키며, 농도에 따라서는 숙주를 죽음에 이르게 한다(비특허문헌 0023).

탄저병의 발병 기작, 조기 진단 및 정확한 판정은 조기에 의학적 치료를 가능하게 하여 탄저병의 진행을 늦추는데 유용하기 때문에 임상적으로 중요하다. 기존 탄저병을 진단하기 위한 방법으로는 탄저균 검출, 탄저균에 대한 DNA 프라이머(primer)를 이용한 방법이 있는데, 탄저균을 측정할 수 있는 최소량 이상 배양을 해야 진단이 가능 하다는 단점이 있다.

또 다른 진단법으로는 방어 항원에 대한 특이적 항체를 효소면역측정법 (ELISA)으로 확인할 수 있으나, 항체가 생성되기까지 최소 12일 정도가 소요되기 때문에 빠른 진단을 할 수 없다는 단점이 있다.

한편, 탄저병에 불완전한 진단뿐만 아니라 치료 효과에 대해 모니터링을 할 수 있는 방법도 없는 실정이다. 항생제 치료 또는 독소 중화제 치료를 할 경우 더는 탄저균과 독소가 검출되지 않기 때문에 환자에 대한 치료 효과를 모니터링할 수 없다. 리서스 원숭이(Rhesus monkey)에 호흡기 탄저를 감염시킨 후 항생제 치료를 하더라도, 100일 후에도 여전히 탄저 포자가 존재하고 있는 것을 실험적으로 확인하였다(비특허문헌 0024). 또 다른 실험에서는 호흡기 탄저에 감염된 리서스 원숭이에 30일 동안 항생제 치료를 했음에도 불구하고 58일 째에 사망하는 결과를 제시하고 있다(비특허문헌 0025). 2001년 발생했던 탄저균 우편물 테러에서도 호흡기 탄저에 감염된 10명의 환자 모두 항생제 치료를 했음에도 불구하고, 10명 중 4명이 사망하는 결과가 발생했고 회복된 환자들의 경우는 회복 기간에 일관성이 없는 것으로 나타났다(비특허문헌 0026).

이와 같이 예후를 예측할 수 없는 것은 치료 효과에 대한 모니터링 방법의 부재로, 환자의 상태에 따라 적절한 치료법을 선택 적용하지 못하기 때문이다. 따라서 탄저병의 진단과 치료 효과 모니터링을 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 있다.

한편, 프로테오믹스(proteomics)는 생명체의 어떤 특정 상태에서 발현되는 모든 단백질 즉 프로테옴(proteome)을 연구하는 학문으로 프로테옴의 발현을 연구하는 발현 프로테오믹스(expression proteomics)와 단백질 간의 상호작용 및 기능(protein-protein interactions, post-translational modification) 등을 연구하는 기능적 프로테오믹스(functional proteomics)가 있다(비특허문헌 0027).

현재까지 가장 많이 사용되고 있는 프로테오믹스 기술은 전기영동(electrophoresis)다. 이 방법은 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 상에서 분자량에 따라 분리하는 기술이다(비특허문헌 0028). 단백질을 겔에서 분리한 후 염색을 하고 겔을 조각내어 트립신(trypsin)으로 겔내 절단(in-gel digestion)을 수행한다. 얻어진 단백질을 펩타이드 단위로 절단한 후 질량분석기(LC-ESI-MS/MS)를 이용하여 질량값을 얻고, 얻어진 질량값을 데이터 베이스에서 조사하여 단백질을 동정한다. 전기영동법은 좋은 해상도와 번역 후 변이(post-translational modification)의 변화, 단백질 가수분해(proteolysis)에 의한 변화 등을 알 수 있다.(도 3, 4 참조)

따라서 탄저병을 정확하게 진단하고 환자에 대한 치료 효과를 모니터링하기 위해 혈액학적 진단에 사용할 수 있는 최적화된 방법이 필요하고, 탄저병 상태에서 혈액 속으로 분비되는 특이적인 단백질을 프로테오믹스 기술을 이용하여 분석함으로써 발굴할 수 있다.

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본 발명은 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 항원-항체 반응을 통하여 시료로부터 탄저균 감염 여부를 진단할 수 있는 바이오칩을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은항원-항체 반응을 통하여 시료로부터 탄저균 감염 여부를 진단할 수 있는 진단 발명을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 제1폴리펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 제2폴리펩티드 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제1항체, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제2항체 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제3항체 중 적어도 하나를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오칩을 제공한다.

일 실시 예에 있어서, 상기 제1 내지 제3항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체일 수 있다.

일 실시 예에 있어서, 상기 제1 내지 제3항체 중 어느 하나에 특이적으로 결합하며, 검출가능한 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(Conjugate)를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 제1폴리펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 제2폴리펩티드 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출하는 단계 및 상기 시료에서 검출된 제1 내지 제3폴리펩티드와 정상 대조군에 포함된 상기 제1 내지 제3폴리펩티드의 양을 비교하는 단계를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법을 제공한다.

일 실시 예에 있어서, 상기 제1 내지 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출하는 단계는, 항원-항체 반응을 통해, 상기 제1 내지 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출할 수 있다.

일 실시 예에 있어서, 상기 시료는 피검체의 혈액, 혈장 및 혈청 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따르면, 탄저균 감염 여부를 단시간 내에 진단할 수 있게 되고, 치료 효과를 주기적으로 모니터링할 수 있게 된다.

도 1은 호흡기형 탄저병의 발병 기작을 나타내는 개념도이다.
도 2는 탄저균의 독소가 세포 내부로 침입하는 과정을 나타나는 개념도이다.
도 3은 프로테오믹스적 관점에서 세포에서 분비된 세크리톰(secretome)을 질량 분석하여 단백질을 동정하는 것을 나타낸 개념도이다.
도 4는 탄저균 독소 치사 독소 및 부종 독소에 노출된 HAECs의 단백질에 대한 일차원 전기영동을 수행한 겔 사진이다.
도 5는 HAECs에 치사 독소와 부종 독소를 처리하였을 때 세포 내부 및 외부에 lactotransferrin isoform 2(LTF)의 양을 웨스턴블롯을 통해 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 HAECs에 치사 독소와 부종 독소를 처리하였을 때 세포 내부 및 외부에 pregnancy zone protein precursor(PZP)의 양을 웨스턴블롯을 통해 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 HAECs에 치사 독소와 부종 독소를 처리하였을 때 세포 내부 및 외부에 sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP)의 양을 웨스턴블롯을 통해 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 본 명세서에 개시된 실시 예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 실시 예의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시 예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오마커 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 탄저병은 호흡기형 탄저병이다.

탄저균이 호흡기를 통해 감염된 경우를 호흡기형 탄저병이라고 정의한다. 탄저병의 호흡기 형은 치료를 받지 않으면 90% 이상의 사망률을 보인다. 증상은 감염 후 7일 내지 10일 정도 지나서 나타나기 시작한다. 호흡기 형은 초기에는 열이 오르고 기침이 나는 등 감기와 비슷한 증상을 보이다가 호흡곤란·청색증·심혈관 허탈 등의 중증이 나타난 뒤 2~3일 안에 사망한다. 그리고 항생제 치료를 하더라도 체내에 포자가 남아 있어 탄저병이 재발할 가능성도 배제할 수 없다.

따라서, 본 발명에서 탄저병의 진단 및 치료 효과 모니터링은 탄저병에 감염된 시점부터 탄저 포자가 체내에 더이상 존재하지 않을 시점까지로 정의한다.

본 발명에 따른 바이오마커 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 제1폴리펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 제2폴리펩티드 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다.

먼저, 제1폴리펩티드는 Lactotransferrin isoform 2(LTF)이다. LTF는 서열번호 1번의 아미노산 서열을 가지며, 서열변호 1은 Genbank Accession No.(NP_001186078.1)에 기재된 서열일 수 있다.

LTF는 철이온을 운반하는 단백질로 72-80 kDa의 분자량을 가지며 당화(glycosylation) 부위가 다양한 수로 존재한다. LTF는 항미생물(antimicrobial)·항바이러스(antiviral) 기능과 같은 숙주 방어 체계에 중요한 역할을 한다. LTF는 외분비물인 모유에서 7000 ug/mL, 침에서 26 ug/mL, 그리고 눈물에서 3mg/mL로 다량 존재한다. LTF는 혈액 중에는 0.02ug/mL 내지 1.52ug/mL의 범위로 소량 존재한다.

다음으로, 제2폴리펩티드는 Pregnancy zone protein precursor(PZP)이다. PZP는 서열번호 2번의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2는 Genbank Accession No.(NP_002855.2)에 기재된 서열일 수 있다.

PZP는 혈중으로 분비되는 당단백질(glycoprotein)로 단백질 분해 효소 억제제(protease inhibitor) 중 하나이다. PZP는 180 kDa의 아단(subunit)가 두 개 결합되어있는 369 kDa의 이량체(dimer) 또는 네 개의 아단위가 결합된 720 kDa의 사량체로 존재한다. PZP는 bait region이라는 다양한 절단 부위가 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단되면서 억제제로서의 기능을 나타내고, 절단된 다양한 분자량의 PZP가 검출되기도 한다. PZP는 정상 여성 혈중에서 10-30 ug/mL, 정상 남성 혈중에서 10 ug/mL 이하로 존재하지만, 임신한 여성의 혈중에서는 1000 ug/mL로 증가한다.

다음으로, 제3폴리펩티드는 Sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP)이다. SLMAP은 서열번호 3번의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 3은 Genbank Accession No.(NP_009090.2)에 기재된 서열일 수 있다.

SLMAP는 꼬인 코일 꼬리 구조의 막 단백질(coiled-coil tail-anchored membrane proteins)로 근섬유막의 구성성분이다. SLMAP는 특히 심장 막에서 흥분수축결합에 관여한다고 알려졌지만 자세한 기능은 아직 알려지지 않았다. 다양한 동형(isoform)의 존재로 분자량 또한 35kDa, 45kDa, 63kDa, 83kDa 내지 91kDa으로 다양하다.

한편, 본 발명은 상기 제1 내지 제3폴리펩티드와 항원-항체 반응을 일으키는 항체를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오칩을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 제1폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제1항체, 제2폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제2항체 및 제3폴리펩티드와 상보적으로 결합하는 제3항체 중 적어도 하나를 포함하는 바이오칩을 제공한다.

상기 제1 내지 제3항체는 각각 LTF, PZP 및 SLMAP의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 제1 내지 제3항체 각각은 LTF, PZP 또는 SLMAP에 대해 특이적으로 결합한다.

한편, 제1 내지 제3항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

한편, 제1 내지 제3항체는 담체 또는 지지체에 다양한 방법을 통해 고정될 수 있다.

여기서, 상기 담체 또는 지지체는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환 수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵 및 플랫 팩(flat packs), 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막일 수 있다.

한편, 상기 지지체는 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 바이오칩은 제1 내지 제3항체 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하며, 검출가능한 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate)를 더 포함할 수 있다.

여기서, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지체는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 한다. 예를 들어, 상기 표지체는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 일 수 있다.

상기 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 일 수 있다.

상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 일 수 있다.

상기 리간드는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 일 수 있다.

상기 미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 일 수 있다.

상기 레독스 분자는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 일 수 있다.

상기 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 일 수 있다.

다만, 상기 표지체는 상술한 실시 예에 한정되지 않고, 면역학적 분석법에 사용될 수 있는 모든 물질일 수 있다. 여기서, 면역학적 분석법은 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(Immunoblot), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법을 포함한다.

한편, 본 발명은 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법을 제공한다.

먼저, 본 발명에 따른 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법에서는 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 제1폴리펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 제2폴리펩티드 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출하는 단계가 진행된다.

이때, 제1 내지 제3폴리펩티드는 상술한 항원-항체 반응에 의하여 검출될 수 있으며, 상술한 바이오칩이 이용될 수 있다.

이후, 상기 시료에서 검출된 제1 내지 제3폴리펩티드와 정상 대조군에 포함된 상기 제1 내지 제3폴리펩티드의 양을 비교하는 단계가 진행된다.

구체적으로, 본 발명에서 시료의 탄저균 감염 여부의 진단은 상기 시료에 포함된 제1 내지 제3폴리펩티드의 양과 탄저균 미감염 세포인 정상 대조군에 포함된 제1 내지 제3폴리펩티드의 양의 비교결과를 통해 이루어질 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 상기 시료에 포함된 폴리펩티드의 양이 정상 대조군에서의 양보다 2배 이상일 경우 개체가 탄저균에 감염되었다고 판단할 수 있다.

여기서, 상기 시료는 피검체의 혈액, 혈장, 혈청 및 혈관의 내피세포 중 어느 하나일 수 있다.

한편, 상기 정상 대조군은 탄저균 미감염 세포일 수 있으며, 바람직하게는 개체의 탄저균 미감염 혈관내피세포 또는 공지된 혈관내피세포주일 수 있다.

이하에서는, 실시 예 및 실험 예들을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만, 후술할 실시 예 및 실험 예들에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석되지 않는다.

실시 예 1. 탄저균 처리 세포의 배양과 단백질 수득 및 정량

1-1. 탄저 독소와 세포의 준비

인간의 대동맥 내피 세포를 EBM-2(Endothelial cell basal medium-2, Lonza)배지에 rhEGF, rhFGF-B, GA-1000, R3-IGF-1, 아스코르빈산, VEGF, 헤파린, 하이드로코티손(hydrocortisone), 2% FBS를 첨가하여 배양하였다. 안정적인 세포 부착을 위해 Phosphate buffered saline(PBS)에 0.1%의 젤라틴을 혼합한 용액을 코팅한 100mm의 접시에서 세포를 배양했다. HAECs는 아큐테이즈(accutase, Innovative Cell Tech, San Diego, CA)에 의해 접시로부터 유리시켰다.

탄저 독소는 탄저 독소 DNA가 인코딩 되도록 재조합 한 세균으로부터 정제하였다. 그리하여 방어 항원, 치사 요소, 부종 요소를 각각 1.7mg/mL, 1.8mg/mL, 1.6mg/mL를 수득하였다.

1-2. 단백질의 수득 및 정량

100mm 접시에 접종한 세포에 무혈청 배지로 용해된 방어 항원 500ng/ml를 처리하고 1000ng/ml의 치사 요소 또는 부종 요소를 각각 처리하였다.

치사 요소를 처리한 군을 각각 12시간, 18시간 배양하고 부종 요소를 처리한 군은 각각 4시간 8시간 배양하였다. 대조군은 FBS가 없는 배지에서 12시간 동안 배양되었다. 독소를 처리한 후 각각의 배양을 마치면, 상층액을 분리하여 4℃에서 1500rpm으로 10분간 원심분리를 실시하였다. 상층액을 Amicon Ultra Centrifugal 3 K filter tube(Millipore, Billerica, MA)로 옮겨 원심분리를 실시하였다. 그 후 농축된 샘플들은 나노-LC-ESI-MS/MS와 면역블롯에 사용되었다.

실시 예2. 전기영동( SDS - PAGE )

농축된 배지 안의 단백질을 microBCA™ 단백질 정량 키트(PIERCE, Rockford, IL)로 정량하였다. 그 후 각각 일정량의 단백질(50μg)을 NuPAGE® 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 주입하였다.

도 4와 같이 전기영동을 통해 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 그 후 겔을 GelCode® 푸른 색소(Thermo scientific, Rockford, IL)로 염색하고 그 후 염색된 겔 레인을 지침서에 명시된 대로 잘라내었다. 푸르게 염색된 각각의 겔 레인을 5개의 단편으로 잘라서 분리하고 각각의 단편은 1~3mm로 더 얇게 잘라 깨끗한 1.5ml 튜브에 옮겨 담았다.

실시 예3. 전기영동 된 겔 내에서 단백질의 효소분해

SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질을 겔로부터 잘라내고 단백질을 포함하는 각각의 겔 단편을 50mM NH4HCO3가 포함된 50% acetonitrile(ACN)으로 탈염색시켰다. 그리고 염료가 모두 제거될 수 있도록 Vortex를 실시하였다. 이 겔 단편들을 100% ACN로 탈수시켰고 speedVac으로 20분간 건조하였다. 단백질을 효소로 분해하기 위해 단백질 단편에 56°C에서 45분간 NH4HCO3에 용해된 10mM DTT를 처리하였다. 그 다음 50mM NH4HCO3에 용해된 55mM iodoacetamide을 암실에서 30분 동안 처리하여 알킬화하였다. 각각의 겔 단편에 12.5ng/μl의 트립신(Promega, Madison, WI)과 50mM NH4HCO3 버퍼(pH 7.8)를 처리하여 37℃에서 하루 동안 반응시켰다. 단백질을 분해한 후에는 단편 내의 단백질을 실온에서 20분간 ACN용액에 용해된 5% 포름산을 가하여 추출하였다. 상층액은 speedVac을 실시하여 회수하였고 그 샘플은 MS 분석 위해 C18 ZipTips(Millipore, MA)를 사용하여 0.1% 포름산으로 정제하였다.

실시 예 4. LC- ESI - MS / MS 분석을 이용한 단백질의 동정

4-1. LC-ESI-MS/MS분석 실시

트립신으로 분해된 펩타이드를 C18 reversed phase resin (5μm, 200A)으로 충진된 실리카 미세 모세관 컬럼(12cm × 75μm)에 로드하였다. 액체 크로마토그래피는 3-40% 용액B(100% ACN 내 0.1% 포름산 용액)의 농도구배 하에 진행하였다. 용액은 60분 동안 250nL/min의 속도로 통과하였으며 컬럼은 LTQ linear ion-trap 방식의 질량분석기(Finnigan, CA)에 바로 연결하였다. 질량 분석기 내 이온스프레이 전압은 1.95kV, MS에서 MS/MS로의 전환 임계값은 500으로 하였다. MS/MS의 충돌 에너지는 무선 주파수 진폭(RF)의 35%이고, 활성 지속 시간은 30ms이었다. 모든 스펙트럼은 데이터 종속 스캔모드로 얻었다. 동적 배제(dynamic exclusion) 피크의 반복 횟수는 1회이고, 그 반복 지속시간은 30초로 하였다. 동적 제외(dynamic exclusion) 지속 시간은 180초 동안으로 설정하고 배제 질량(exclusion mass)의 폭은 ±1.5 Da으로 설정하였다.

4-2. 데이터베이스 조사 및 확인

BioWorksBrowserTM(version Rev. 3.3.1 SP1, Thermo Fisher Scientific Inc., CA)프로그램 이용하여 LC-ESI-MS/MS 단편 스펙트럼의 자료를 분석하였다. 자료 검색은 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 non-redundant human database (version: Dec 17, 2012; 35720 proteins)를 기반으로한 SEQUEST 검색 엔진을 이용하였다. 검색 조건은 트립신 효소에 특이적이며 소실된 단편에 대해 2개까지 허용하였다.

또한, 펩타이드 저항성에 대해 ±2amu 만큼, 이온 단편에 대해서는 ±1amu 만큼의 질량 오류를 허용하였다. 크리스테인(+57Da)의 carbamidomethylation 변형과 메티오닌(+16 Da)의 산화 잔기에 대해서도 감안하여 조사하였다. 델타 CN은 0.1; Xcorr 값은 1.8 (+1 전하 상태), 2.3 (+2), 3.5 (+3); 그리고 합의 점수(consensus score)는 SEQUEST 분류에 의해 10.15이었다.

그 결과 하기 표 1에 표시한 단백질의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다. Lactotransferrin isoform 2(73kDa)의 경우 치사 독소를 12시간 처리하였을 경우 독소를 처리하지 않았을 때보다 7.82배 발현이 증가하였으며 18시간 처리하였을 경우 5.80배 발현이 증가하였다. 또한, 부종 독소를 4시간 처리하였을 경우 독소를 처리하지 않았을 때보다 무려 18.90배 발현이 증가하였으며 8시간 처리하였을 경우 10.84배 발현량이 증가하였다. 이 외에도 alpha-fetoprotein precursor (69kDa), pregnancy zone protein precursor(164kDa)와 sarcolemmal membrane-associated protein(93kDa)이 독소를 처리하지 않은 세포에 비해 발현량이 증가하였다.

4-3. 단백질 동정을 위한 면역 블롯

단백질 분해 효소와 인산화효소 저해제 혼합물(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)을 포함하는 RIPA 버퍼(50mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)로 세포를 용해시켰다. 단백질 농축 정도는 바이신코닉 산 단백질 정량 시약 키트(Thermo Scientific Inc., Rockford, IL)를 사용하여 측정하였다. 세포 내부 및 외부의 단백질 시료를 8% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하여 0.2um PVDF 막(Millipore Corporation, Billerica, MA)에 옮겼다. 그 후 막으로의 단백질 이동이 5% 무지방 우유내 0.1% tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBS-T)에 의해 차단되었다. 그런 다음 이 막을 1차 항체와 1% 무 지방 우유가 든 TBS-T 와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 일차 항체는 alpha-fetoprotein(C3, sc-8399, Santa Cruz Biotechnology, TX, U.S.A.), pregnancy zone protein(21742-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, U.S.A.), lactoferrin(KT33, sc-101487, Santa Cruz Biotechnology, TX, U.S.A.), SLMAP(A01, H00007871-A01, Abnova, Taipei, Taiwan)를 사용하였다. 항체와 반응시킨 막은 TBS-T와 함께 10분마다 3회 세척 하였다. 단백질을 동정하기 위해 HRP이 접합된 염소 항-생쥐 또는 염소 항-토끼 이차 항체를 넣어 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 베타-액틴(C4, sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, TX, U.S.A.) 항체는 정량화 할 수 있는 대조군으로 사용하였고 단백질 밴드는 ECL 용액(GE healthcare, Buckinghamshire, U.K.)으로 관찰하였다.

그 결과 도 5에 도시된 바와 같이, 각각 치사 독소 및 부종 독소를 가하였을 경우 독소를 가하지 않은 세포(NC)보다 세포 외로 분비된 lactotransferrin isoform 2(LTF)가 당화된 형태로 많이 발현된 것을 확인하였다.

또한, 도 6에 도시된 바와 같이, pregnancy zone protein precursor(PZP)의 경우 독소를 가한 경우 세포 외부에서 다양한 형태의 분절된 단백질을 발견할 수 있었다.

더불어 도 7에서는 sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP)은 오직 치사 독소를 가한 경우 세포 외부에서 SLMAP를 확인하였다.

본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

또한, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

<110> Agency for Defense Development <120> BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING ANTHRAX AND METHOD FOR DIAGNOSING USING THE SAME <130> PT20160103 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 666 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactotransferrin isoform 2(LTF) <400> 1 Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser 1 5 10 15 Pro Ile Gln Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val 20 25 30 Thr Leu Asp Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys 35 40 45 Leu Arg Pro Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg 50 55 60 Thr His Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln 65 70 75 80 Leu Asn Glu Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Gly Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn 100 105 110 Trp Thr Gly Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe 115 120 125 Ser Ala Ser Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu 130 135 140 Cys Arg Leu Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys 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Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr 4530 4535 4540 Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Ala Ala Ala 4545 4550 4555 4560 Ala Thr Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala 4565 4570 4575 Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr 4580 4585 4590 Gly Thr Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys 4595 4600 4605 Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala 4610 4615 <210> 3 <211> 811 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP) <400> 3 Met Pro Ser Ala Leu Ala Ile Phe Thr Cys Arg Pro Asn Ser His Pro 1 5 10 15 Phe Gln Glu Arg His Val Tyr Leu Asp Glu Pro Ile Lys Ile Gly Arg 20 25 30 Ser Val Ala Arg Cys Arg Pro Ala Gln Asn Asn Ala Thr Phe Asp Cys 35 40 45 Lys Val Leu Ser Arg Asn His Ala Leu Val Trp Phe Asp His Lys Thr 50 55 60 Gly Lys Phe Tyr Leu Gln Asp Thr Lys Ser Ser Asn Gly Thr Phe Ile 65 70 75 80 Asn Ser Gln Arg Leu Ser Arg Gly Ser Glu Glu Ser Pro Pro Cys Glu 85 90 95 Ile Leu Ser Gly Asp Ile Ile Gln Phe Gly Val Asp Val Thr Glu Asn 100 105 110 Thr Arg Lys Val Thr His Gly Cys Ile Val Ser Thr Ile Lys Leu Phe 115 120 125 Leu Pro Asp Gly Met Glu Ala Arg Leu Arg Ser Asp Val Ile His Ala 130 135 140 Pro Leu Pro Ser Pro Val Asp Lys Val Ala Ala Asn Thr Pro Ser Met 145 150 155 160 Tyr Ser Gln Glu Leu Phe Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Gln Glu Ala Leu 165 170 175 His Arg Glu Gln Met Leu Glu Gln Lys Leu Ala Thr Leu Gln Arg Leu 180 185 190 Leu Ala Ile Thr Gln Glu Ala Ser Asp Thr Ser Trp Gln Ala Leu Ile 195 200 205 Asp Glu Asp Arg Leu Leu Ser Arg Leu Glu Val Met Gly Asn Gln Leu 210 215 220 Gln Ala Cys Ser Lys Asn Gln Thr Glu Asp Ser Leu Arg Lys Glu Leu 225 230 235 240 Ile Ala Leu Gln Glu Asp Lys His Asn Tyr Glu Thr Thr Ala Lys Glu 245 250 255 Ser Leu Arg Arg Val Leu Gln Glu Lys Ile Glu Val Val Arg Lys Leu 260 265 270 Ser Glu Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Thr Glu Asp Glu Cys Thr His 275 280 285 Leu Lys Glu Met Asn Glu Arg Thr Gln Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ala 290 295 300 Asn Lys Tyr Asn Gly Ala Val Asn Glu Ile Lys Asp Leu Ser Asp Lys 305 310 315 320 Leu Lys Val Ala Glu Gly Lys Gln Glu Glu Ile Gln Gln Lys Gly Gln 325 330 335 Ala Glu Lys Lys Glu Leu Gln His Lys Ile Asp Glu Met Glu Glu Lys 340 345 350 Glu Gln Glu Leu Gln Ala Lys Ile Glu Ala Leu Gln Ala Asp Asn Asp 355 360 365 Phe Thr Asn Glu Arg Leu Thr Ala Leu Gln Glu His Leu Leu Ser Lys 370 375 380 Ser Gly Gly Asp Cys Thr Phe Ile His Gln Phe Ile Glu Cys Gln Lys 385 390 395 400 Lys Leu Ile Val Glu Gly His Leu Thr Lys Ala Val Glu Glu Thr Lys 405 410 415 Leu Ser Lys Glu Asn Gln Thr Arg Ala Lys Glu Ser Asp Phe Ser Asp 420 425 430 Thr Leu Ser Pro Ser Lys Glu Lys Ser Ser Asp Asp Thr Thr Asp Ala 435 440 445 Gln Met Asp Glu Gln Asp Leu Asn Glu Pro Leu Ala Lys Val Ser Leu 450 455 460 Leu Lys Asp Asp Leu Gln Gly Ala Gln Ser Glu Ile Glu Ala Lys Gln 465 470 475 480 Glu Ile Gln His Leu Arg Lys Glu Leu Ile Glu Ala Gln Glu Leu Ala 485 490 495 Arg Thr Ser Lys Gln Lys Cys Phe Glu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Glu 500 505 510 Glu Arg Lys Ala Tyr Arg Asn Gln Val Glu Glu Ser Thr Lys Gln Ile 515 520 525 Gln Val Leu Gln Ala Gln Leu Gln Arg Leu His Ile Asp Thr Glu Asn 530 535 540 Leu Arg Glu Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Ser Thr Arg Asp Glu Leu 545 550 555 560 Leu Ser Ala Arg Asp Glu Ile Leu Leu Leu His Gln Ala Ala Ala Lys 565 570 575 Val Ala Ser Glu Arg Asp Thr Asp Ile Ala Ser Leu Gln Glu Glu Leu 580 585 590 Lys Lys Val Arg Ala Glu Leu Glu Arg Trp Arg Lys Ala Ala Ser Glu 595 600 605 Tyr Glu Lys Glu Ile Thr Ser Leu Gln Asn Ser Phe Gln Leu Arg Cys 610 615 620 Gln Gln Cys Glu Asp Gln Gln Arg Glu Glu Ala Thr Arg Leu Gln Gly 625 630 635 640 Glu Leu Glu Lys Leu Arg Lys Glu Trp Asn Ala Leu Glu Thr Glu Cys 645 650 655 His Ser Leu Lys Arg Glu Asn Val Leu Leu Ser Ser Glu Leu Gln Arg 660 665 670 Gln Glu Lys Glu Leu His Asn Ser Gln Lys Gln Ser Leu Glu Leu Thr 675 680 685 Ser Asp Leu Ser Ile Leu Gln Met Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Gln 690 695 700 Val Gly Ser Leu Lys Glu Gln His Leu Arg Asp Ser Ala Asp Leu Lys 705 710 715 720 Thr Leu Leu Ser Lys Ala Glu Asn Gln Ala Lys Asp Val Gln Lys Glu 725 730 735 Tyr Glu Lys Thr Gln Thr Val Leu Ser Glu Leu Lys Leu Lys Phe Glu 740 745 750 Met Thr Glu Gln Glu Lys Gln Ser Ile Thr Asp Glu Leu Lys Gln Cys 755 760 765 Lys Asn Asn Leu Lys Leu Leu Arg Glu Lys Gly Asn Asn Lys Pro Trp 770 775 780 Pro Trp Met Pro Met Leu Ala Ala Leu Val Ala Val Thr Ala Ile Val 785 790 795 800 Leu Tyr Val Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ser Pro 805 810

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 모유, 침, 눈물 및 혈액 중 적어도 하나에 존재하는 제1폴리펩티드(lactotransferrin isoform 2(LTF)), 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제2폴리펩티드(pregnancy zone protein precursor (PZP)) 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제3폴리펩티드(sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP)) 중 적어도 하나를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오마커 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 모유, 침, 눈물 및 혈액 중 적어도 하나에 존재하는 제1폴리펩티드(lactotransferrin isoform 2(LTF))와 상보적으로 결합하는 제1항체, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제2폴리펩티드(pregnancy zone protein precursor (PZP))와 상보적으로 결합하는 제2항체 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제3폴리펩티드(sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP))와 상보적으로 결합하는 제3항체 중 적어도 하나를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오칩.
제2항에 있어서,
상기 제1 내지 제3항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체인 것을 특징으로 하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오칩.
제2항에 있어서,
상기 제1 내지 제3항체 중 어느 하나에 특이적으로 결합하며, 검출가능한 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(Conjugate)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링용 바이오칩.
시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 모유, 침, 눈물 및 혈액 중 적어도 하나에 존재하는 제1폴리펩티드(lactotransferrin isoform 2(LTF)), 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제2폴리펩티드(pregnancy zone protein precursor (PZP)) 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고, 사람의 혈액에 존재하는 제3폴리펩티드(sarcolemmal membrane-associated protein(SLMAP)) 중 적어도 하나를 검출하는 단계; 및
상기 시료에서 검출된 제1 내지 제3폴리펩티드와 정상 대조군에 포함된 상기 제1 내지 제3폴리펩티드의 양을 비교하는 단계를 포함하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법.
제5항에 있어서,
상기 제1 내지 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출하는 단계는,
항원-항체 반응을 통해, 상기 제1 내지 제3폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출하는 것을 특징으로 하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법.
제5항에 있어서,
상기 시료는 피검체의 혈액, 혈장 및 혈청 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 탄저병 진단 및 치료 효과 모니터링 방법.