KR101762134B1 - 이분자 형광 상보 시스템을 이용한 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법 및 이를 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

이분자 형광 상보 시스템을 이용한 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법 및 이를 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 응집체의 신경세포간 전이를 측정하기 위한 듀얼-셀 세포 모델 및 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 모델 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단과 알파-시뉴클린 단백질의 융합단백질을 각각 발현하는 형질전환 세포 및 동물 모델 시스템, 이를 이용한 알파-시뉴클린 응집체의 연속적인 세포간 전이 측정방법, 및 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

이분자 형광 상보 시스템을 이용한 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법 및 이를 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 {Method for measuring cell-to-cell transmission of α-synuclein aggregates using bimolecular fluorescence complementation system and screeing method of a substance for preventing or treating neurodegenerative disease using the same}
본 발명은 단백질 응집체의 신경세포간 전이를 측정하기 위한 듀얼-셀 세포 모델 및 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 모델 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단과 알파-시뉴클린 단백질의 융합단백질을 각각 발현하는 형질전환 세포 및 동물 모델 시스템, 이를 이용한 알파-시뉴클린 응집체의 연속적인 세포간 전이 측정방법, 및 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
α-시뉴클린 응집체(α-synuclein aggregates)의 비정상적인 축적은 파킨슨병(Parkinson’s disease, PD)의 병리학적 특징이다 (Jellinger, K. A. 2003. Acta Neuropathol 106, 191-201). 최근 연구의 큰 주체는 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이(transcellular transmission)가 PD의 진행을 조종함을 제시하고 있는데 (Danzer, K. M., et al. 2012 Mol Neurodegener 7, 42), 이러한 전이를 설명하는 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 특히 중요한 이슈는 응집체의 세포간 전이(cell-to-cell transmission)가 씨딩(seeding)-의존적인지, 상기 응집체가 지속적인 전이 및 이 과정에서 다른 PD-관련된 유전자의 역할을 통해 거대 세포군집에 전파하는지를 포함한다 (Lee, H. J. et al., 2014 Nat Rev Neurol).
유전적 및 병리학적 증거는 리소좀 장애가 루이소체(Lewy body) 질환들의 발병에서 주요 원인 제공인자임을 제시하고 있다 (Pan, T. et al., 2008 Brain). GBA1 유전자는 리소좀 가수분해효소인 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase, GCase)를 코딩하는데, 가장 일반적인 리소좀의 축적 질환인 고셔병(Gaucher disease)에서 결핍되어 있다. 또한 GBA1에서의 돌연변이들은, 비록 PD의 위험성을 증가시키는 메커니즘은 아직 명확하진 않지만, PD와 루이소체 치매에서 강력한 유전적 위험인자들이다 (Sidransky, E. et al. 2009 N Engl J Med 361, 1651-1661; Nalls, M. A. et al. 2013 JAMA neurology 70, 727-735). 세포에서 세포로 수송되는 α-시뉴클린 응집체는 엔도리소좀 경로(endolysosomal pathway)를 통해 수송되어 리소좀에서 분해되는데 (Lee, H. J. et al. 2008 Int J Biochem Cell Biol 40, 1835-1849), 본 발명자들은 GBA1 결핍이 리소좀 기능장애를 유발한다고 가정하였고, 그에 따라 응집체 전이의 효율이 증가되었다.
본 발명자들은 연속적인 세포간 전이를 통한 α-시뉴클린 응집체의 지속적인 전이 메커니즘, 나아가 α-시뉴클린 응집체의 형성 및 전이와 세포 내 리소좀의 기능 및 노화 현상과의 관계 등을 연구하는 과정에서 이분자 형광 상보(bimolecular fluorescence complementation) 시스템을 사용할 경우 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 등을 용이하게 측정할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 이분자 형광 상보 기법은 기존에 알려져 있던 단백질 절편의 상보작용을 형광단백질에 적용시켜 형광 단백질을 N 말단 및 C 말단 절편으로 나눈 후 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질과 함께 각각 발현시킨 다음, 두 단백질이 상호작용을 하기 위해 가까워질 경우 형광단백질의 두 절편이 합쳐져 온전한 형광단백질이 형성될 때 나타나는 형광을 분석하는 방법으로, Hu 등(Hu et al., Mol. Cell 2002, 9:789-798)이 고등 동물 세포에서 이분자 형광 상보 기법을 이용한 단백질 상호작용 분석이 가능함을 보고하였으며, 이 밖에도 최근에 이분자 형광 상보 기법을 이용한 단백질 상호작용 분석 결과들이 많이 보고 되고 있다.
본 발명의 목적은 인접한 세포들 사이에서 일어나는 α-시뉴클린 단백질의 세포간 이동 및 공동응집(co-aggregation)을 분석하기 위한 α-시뉴클린 응집체의 연속적인 전이(continuous transmission)를 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 측정 방법을 이용하여 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광 단백질의 N-말단 단편과 α-시뉴클린(α-synuclein)이 융합된 제 1융합단백질을 발현하는 제 1세포; 및 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 α-시뉴클린이 융합된 제 2융합단백질을 발현하는 제 2세포를 포함하는 세포 또는 동물 모델 시스템을 이용한 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 형광 단백질의 N-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 1융합단백질을 발현하는 제 1세포; 및 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 상기 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 2융합단백질을 발현하는 제 2세포를 포함하는 단백질 응집체(protein aggregates) 전이 측정용 동물 모델 시스템을 제공한다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 동물 모델은 상기 제 1융합단백질을 인두근(pharynx muscle)에서 특이적으로 발현하고, 상기 제 2융합단백질을 인두에 연결된 뉴런에서 특이적으로 발현하도록 제작된 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 형질전환 모델이다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 제 1융합단백질은 myo-2 프로모터에 연결되어 C. elegans의 인두근(pharynx muscle)에서 특이적으로 발현되며, 상기 제 2융합단백질은 flp-21 프로모터에 연결되어 인두에 연결된 뉴런에서 특이적으로 발현될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 제 2융합단백질은 flp-21 프로모터 활성에 대한 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 마커는 인두 뉴런(pharyngeal neurons)에서 특이적으로 발현된 제 2융합단백질을 표지한다. 따라서 상기 C. elegans 모델의 배양을 통해 인접한 인두근(제 1세포)과 인두 뉴런(제 2세포)에서 각각 제 1융합단백질과 제 2융합단백질을 동시-발현시킨 후 상기 형광 단백질의 N-말단 단편과 C-말단 단편이 결합하여 발생하는 BiFC (bimolecular fluorescence complementation) 형광 신호의 강도와 발현패턴 및 위치 등을 분석하면, 인접한 세포들에서 각각 유래한 α-시뉴클린 단백질의 세포간 이동 및 공동응집(co-aggregation)을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 형광 단백질의 N-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 1융합단백질을 발현하는 제 1세포(doner cell); 및 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 상기 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 2융합단백질을 발현하는 제 2세포(recipient cell)를 포함하며, 상기 제 1세포와 제 2세포의 공동-배양을 통해, 제 1세포에서 1차 방출에 의해 제 2세포로 전달된 뇌질환 관련 단백질 응집체가 씨드(seed)로 작용하여 내생적(endogenous) 뇌질환 관련 단백질과의 공동-응집으로 형성된 단백질 응집체를 측정하거나, 또는 제 2세포로부터 이들의 2차 방출을 측정하는 것을 특징으로 하는, 세포간 단백질 응집체(protein aggregates) 전이 측정용 듀얼-셀(dual-cell) 세포 모델 시스템을 제공한다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 듀얼-셀(dual-cell) 세포 모델 시스템은, 비너스(Venus) 단백질 N-말단 단편과 α-시뉴클린의 융합단백질(Venus1-αSyn, V1S)을 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 신경섬유아세포주 (KCLRF-BP-00322); 및 비너스(Venus) 단백질 C-말단 단편과 α-시뉴클린의 융합단백질(αSyn-Venus2, SV2)을 코딩하는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 신경섬유아세포주 (KCLRF-BP-00323)로 구성될 수 있다. 상기 세포주들은 본 발명의 듀얼-셀 세포 모델 시스템에 사용되는 세포로서, Venus 단백질의 단편과 α-시뉴클린의 융합단백질을 안정적으로 발현하는 세포주이다. 이러한 세포주들은 본 발명자들이 처음으로 제조한 것으로, 2014년 8월 26일자로 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00322, KCLRF-BP-00323을 각각 부여받았다.
본 발명에서 상기 단백질 응집체의 ‘2차 방출’은, 단백질 분자 자체 또는 단백질 응집체의 단순한 세포간 전이와 구별되는 것으로, 공여세포에서 1차적으로 전달된 단백질 분자 또는 응집체가 씨드로 작용하여 수용세포의 내생적 단백질과의 공동-응집으로 형성된 단백질 응집체의 모든 형태의 2차적 전이를 포함한다. 즉 일시적이고 불연속적인 신경세포간 단백질 분자의 전이와 대비되는 개념으로서 연속적인 신경세포간 단백질 응집체의 전이를 설명하고자 2차 방출 (또는 2차적 전이)라고 표현하였다. 따라서 상기 2차 방출은 단순히 2번째 방출이 아닌, 씨딩(seeding)에 의해 형성된 단백질 응집체의 모든 형태의 전이를 포함하는 개념이다.
본 발명에서, 상기 형광 단백질은 세포에서 단백질-단백질 상호작용(interaction), 및 다이머화(dimerization) 또는 올리고머화(oligomerization)를 분석하기 위한 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 분석법에 사용될 수 있는 형광 단백질로서, 세포내로 도입하여 형광을 측정할 수 있는 것이라면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 형광 단백질은 Venus 단백질, 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed, mCherry로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광 단백질의 N-말단 단편은 서열번호 1로 이루어지는 Venus 단백질의 1-158 아미노산이고, 상기 형광 단백질의 C-말단 단편은 서열번호 2로 이루어지는 Venus 단백질의 159-239 아미노산이다. 이러한 형광 단백질의 단편은 단백질의 종류, 특성, 안정성, 형광 강도에 따라 다양한 크기로 디자인될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ‘뇌질환 관련 단백질’은 파킨슨병, 알츠하이머병, 루이소체 치매 등 뇌질환 발병에서 특징적으로 발견되는 단백질들을 의미하는 것으로, α-시뉴클린(α-synuclein), 타우단백질(tau protein), β-아밀로이드(β-amyloid), 폴리글루타민 단백질(polyglutamine proteins), SOD1(Superoxide dismutase 1), 프리온 단백질(prion), 퍼스 단백질(FUS), 및 TDP-43 단백질 등이 본 발명의 뇌질환 관련 단백질로 이용될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 상기 뇌질환 관련 단백질들의 기능 및 서열정보는 이미 잘 알려져 있고 NCBI와 같은 데이터베이스로부터 용이하게 검색할 수 있다. 이들 단백질의 유래는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 포유동물에서 유래된 것일 수 있다. 하나의 예로서, 상기 α-시뉴클린(α-synuclein)은 인간에서 유래된 서열번호 3(GenBank accession No. AAI08276)의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 응집체(protein aggregates)의 세포간 전이는 제 1세포에서 발현된 형광 단백질의 N-말단 단편이 제 2세포로 전달되어 형광 단백질의 C-말단 단편과 결합하거나 또는 제 2세포에서 발현된 형광 단백질의 C-말단 단편이 제 1세포로 전달되어 형광 단백질의 N-말단 단편과 결합함으로써 나타나는 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 시그널의 검출을 통해 측정되는 것을 특징으로 한다. 상기 ‘N-말단 단편’과 ‘C-말단 단편’은 형광 단백질이 두 분자(bimolecular)로 나누어진 단편으로 각각 N-말단, C-말단 방향의 단편을 의미한다.
상기 BiFC 분석법은 단백질 절편의 상보작용(protein fragment complementation)을 형광 단백질에 적용시켜 형광 단백질을 N-말단 및 C- 말단 절편으로 나눈 후 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질과 함께 각각 발현되게 한 다음, 두 단백질이 상호작용을 하기 위해 가까워질 경우 형광단백질의 두 절편이 합쳐져 온전한 형광단백질이 형성될 때 나타나는 형광을 분석하는 방법으로, 본 발명에서는 단백질 응집체의 신경세포간 전이를 확인하기 위한 세포 모델에 이러한 BiFC 기법을 처음으로 도입하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 노란 형광 단백질의 변이체인, Venus의 N-말단 (V1S) 또는 C-말단 (SV2) 단편 중 하나와 융합된 α-시뉴클린을 발현하는 2개의 안정적인 세포주를 제조하였으며 (도 1a 참조), V1S-발현하는 세포와 SV2-발현하는 세포 모두 각각 따로 배양에서 형광을 나타내지 않은 반면 (도 1d, e 참조), 상기 세포주들이 공동-배양될 때, α-시뉴클린의 세포간 전달 동안 V1S와 SV2 융합 단백질의 다이머화 또는 올리고머화로 인한 형광이 BiFC로 가시화됨을 확인하였다 (도 1a, d, e 참조).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) 형광 단백질의 N-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 1융합단백질을 코딩하는 제 1폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1신경세포(doner cell)를 제조하는 단계; b) 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 상기 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 2융합단백질을 코딩하는 제 2폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2신경세포(recipient cell)를 제조하는 단계; c) 상기 제 1신경세포와 상기 제 2신경세포를 배양용 배지에서 혼합한 후 계대배양(subculture)하는 단계; 및 d) 상기 계대배양물에서 BiFC-양성 세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌질환 관련 단백질 응집체의 연속적인 전이(continuous transmission)를 세포의 세대를 거듭하여 측정하는 방법을 제공한다.
상기 단백질 응집체의 연속적인 전이를 측정하는 것은, 중추신경계(CNS) 내에서 병리학적 응집체의 전파에 따른 뇌질환 발병 과정을 이해하는데 매우 중요하다. 따라서 신경세포간 단백질 응집체의 전이가 단일의 불연속적인(discontinuous) 과정이 아닌, 전이의 초기에 생성되는 공동-응집된 단백질 응집체의 연속적인 전이를 측정하기 위하여 본 발명의 듀얼-셀 BiFC 시스템이 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고 Venus의 N-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질의 융합단백질을 코딩하며, 상기 제 2폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고 Venus의 C-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질의 융합단백질을 코딩하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 단백질의 N-말단 단편과 α-시뉴클린(α-synuclein)이 융합된 제 1융합단백질을 발현하는 제 1세포; 및 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 α-시뉴클린이 융합된 제 2융합단백질을 발현하는 제 2세포를 포함하는 세포 또는 동물 모델 시스템을 이용한 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법을 이용하여, α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 상기 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질은 유전자일 수 있으며, 이 경우 상기 스크리닝 방법은, 상기 세포 또는 동물 모델 시스템의 제 1세포 및 제 2세포에서 발현되는 후보 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 단계; 및 상기 후보 유전자의 발현 수준의 변화에 따른 상기 BiFC 형광 신호의 변화를 측정함으로써 후보 유전자와 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이와의 관련성을 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 1) 형광 단백질의 N-말단 단편과 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 1융합단백질을 코딩하는 제 1폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1신경세포(doner cell)를 제조하는 단계; 2) 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 상기 뇌질환 관련 단백질이 융합된 제 2융합단백질을 코딩하는 제 2폴리뉴클레오티드를 포함하고, 후보 유전자의 발현이 억제된 제 2신경세포(recipient cell)를 제조하는 단계; 3) 상기 제 1신경세포와 상기 제 2신경세포를 배양용 배지에서 혼합 한 후 계대배양(subculture)하는 단계; 4) 상기 계대배양물에서 BiFC-양성 세포의 비율을 측정하는 단계; 및 5) 상기 BiFC-양성 세포의 비율이 계대 동안 증가하면 상기 후보 유전자의 결핍이 단백질 응집체의 전이를 증가시키는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌질환 관련 단백질 응집체의 연속적인 전이(continuous transmission)를 조절하는 유전자의 탐색 방법을 제공한다.
상기 유전자 탐색 방법은, 신경세포간 단백질 응집체의 전파를 조절하는 유전자의 연구에 활용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 모델 시스템을 이용한 실험 방법에서 특정 유전자(GBA1)의 결실이 리소좀 기능장애를 초래하여 단백질 응집체들의 연속적인 전이를 가능하게 함을 밝혀낼 수 있었다 (도 4, 6, 7 참조). 또한, 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 동물모델을 이용한 실험 결과, 다이나민(dynamin) 돌연변이 dyn-1(ky51)에 상기 본 발명의 융합단백질들(V1S+SV2)을 도입한 경우 BiFC 형광이 야생형에 비해 상당히 감소된 것을 확인하였으며 (도 27 A 및 B), 상기 융합단백질들(V1S+SV2)을 카텝신(cathepsin) 유전자의 돌연변이체인 asp-4(ok2693) 및 asp-1(tm666) 돌연변이에 도입하였을 때, BiFC 형광이 두 돌연변이 모두에서, 종종 봉입체 형태로, 상당히 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 27 C-E; 및 도 31 D 및 E). 이러한 결과는 동물을 연령-의존적 응집체 전달로부터 보호하는데 리소좀 반응이 결정적 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보 유전자는 노화와 관련된 유전자일 수 있다. 본 발명자들은 노화의 진행이 응집체의 전이와 퇴행성 표현형에 미치는 영향을 조사하기 위해, BiFC α-시뉴클린 제작물(constructs)을, 야생형보다 더 느려진 노화 진행(aging rate)과 연장된 수명을 나타내는 daf-2(e1370) 돌연변이와 야생형보다 더 빠른 노화 진행과 단축된 수명을 나타내는 daf-16(mu86) 돌연변이에 각각 도입하였다 (도 29 A 및 B). 그 결과 daf-2(e1370); V1S+SV2 동물은 감소된 BiFC 신호 (도 24 A 및 B; 도 29D), 더 적은 수의 봉입체 (도 24 C 및 D; 도 29E), 더 적은 신경 퇴화 (도 24 E 및 F; 도 29 F 및 G), 향상된 펌핑 활동 (도 24G; 도 29H), 및 V1S+SV2 계통보다 연장된 수명 (도 24H; 도 29I)을 나타낸 반면에, daf-16(mu86); V1S+SV2 동물의 경우, BiFC-양성 봉입체들이 V1S+SV2 동물에서보다 훨씬 빨리(L4-기 2일째) 나타났다 (도 24 C 및 D; 도 29E). 이러한 결과들은 노화가 생체 내에서 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 및 관련된 퇴화 현상의 속도를 조절하는 주된 요인이라는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 단백질 응집체의 전이에 영향을 미치는 리소좀 관련 유전자를 검색하기 위하여, 리소좀 발생(biogenesis)의 핵심 조절 전사인자인 TFEB의 오솔로그(ortholog)인 hlh-30 을 과발현하는 daf-16(mu86); V1S+SV2 형질전환 계통을 제작하였다 (실시예 2-6). 상기 형질전환 동물을 이용한 실험 결과, hlh-30 형질전환 계통은 감소된 BiFC 신호 및 이에 따른 감소된 응집체 전달을 나타냈으며, 신경퇴화를 감소시키고, 펌핑 비율을 증가시켰으며, 수명을 연장시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 27 K-R; 도 32 L-O). 이와 같이 본 발명의 유전자 탐색 방법은 단백질 응집체의 축적과 관련된 퇴행성 신경질환 또는 뇌질환의 치료적 타겟이 될 수 있는 유전자를 효과적으로 탐색하는데 이용될 수 있고, 이렇게 탐색된 유전자 또는 그 발현 단백질의 활성을 회복시킴으로써 단백질 응집체의 축적으로 인한 퇴행성 신경질환 또는 뇌질환의 치료적 접근을 더욱 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 세포 또는 동물 모델 시스템을 이용한 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법을 이용하여 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은 상기 세포 또는 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 상기 시험 물질의 처리에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 상기 BiFC 형광 신호가 감소된 경우 시험 물질을 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시험 물질의 처리에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계는 세포 또는 동물 모델의 노화(aging)에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 또는 동물 모델은 리소좀의 기능이 전부 또는 부분적으로 상실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시험 물질은 항-노화 활성을 갖는 물질일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 동물모델을 이용한 실험에서, 항-노화(anti-aging) 활성이 있는 것으로 알려진 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc)을 상기 V1S+SV2 및 daf-16(mu86); V1S+SV2 동물에 투여하였을 때, 양 동물 모두에서 BiFC-양성 봉입체의 형성이 감소하였고 (도 25 A 및 B), 신경퇴화를 나타내는 표현형이 상당히 개선되었으며 (도 25 C-F), 펌핑 활동이 증가하고 (도 25G), 수명 연장 효과 (도 25H)가 나타났으며, 이러한 결과들은 항-노화제의 처리가 시뉴클린의 축적에 의해 나타나는 퇴행성 신경질환(synucleinopathy)의 진전을 늦출 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법은 단백질 응집체의 축적과 관련된 퇴행성 신경질환 또는 뇌질환의 치료제로 사용될 수 있는 물질(화합물)을 효과적으로 탐색하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환은 파킨슨병(Parkinson's disease)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 검색된 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, N-아세틸글루코사민은 BiFC 실험동물 모델에서 알파-시뉴클린 응집체의 전이를 억제하는 효과를 나타냈다(실험결과 2-3 참조). 따라서 상기 N-아세틸글루코사민은 알파-시뉴클린 응집체의 전이와 관련된 퇴행성 신경질환, 특히 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 N-아세틸글루코사민 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 있으며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 N-아세틸글루코사민을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 유효한 양'이란 퇴행성 신경질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말하며, 위 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다. 또한, 상기 '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 퇴행성 신경질환 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여될 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 뇌질환 관련 단백질로서 α-시뉴클린 응집체의 씨딩(seeding), 응집체의 전이기작, 병리학적 관련성, 및 응집체의 연속적인 전이의 측정 방법과 관련하여 좀 더 상세히 설명한다.
본 발명은 α-시뉴클린 응집체들의 세포간 전이가 씨딩(seeding) 메커니즘에 의해 매개되고 그 결과로 씨드된 응집체들의 2차 분비는 α-시뉴클린 응집체들의 인접한(contiguous) 전파를 매개함을 밝혀내었다. 또한 응집체들의 인접한 전파는 GBA1 기능의 소실 보다 2차적인 리소좀 기능장애에 의해 현저히 촉진된다. GBA1의 이형접합(heterozygous) 돌연변이를 가진 PD 환자에서, GCase 활성 및 단백질 수준은 감소되었으며 (Gegg, M. E, et al. 2012 Ann Neurol 72, 455-463), 이는 GBA1 이형부전(heteroinsufficiency)의 병리학적 중요성을 나타낸다. 더욱이, GBA1 돌연변이 보유자(carriers)는 비보유자 보다 2배수의 외피성 루이소체(cortical Lewy bodies)를 가진다 (Clark, L. N. et al. Arch Neurol 66, 578-583). 또한 GBA1의 이형접합 돌연변이는 인지장애의 증가된 위험 (Alcalay, R. N. et al. 2012 Neurology 78, 1434-1440), 및 더 빠른 질병 진행 (Winder-Rhodes, S. E. et al. 2013 Brain 136, 392-399)과 관련되어 있는데, 이는 루이 병리학(Lewy pathology)의 전파 속도가 임상 진행의 속도를 결정한다는 가설을 뒷받침한다.
본 발명은 α-시뉴클린 전이가 단일의 불연속적인 작용이 아닌, 연속적인 것이라는 증거를 제공한다. 첫째, V1S/SV2 공동-배양의 연속적인 계대배양은, 감소가 아닌 증가된 BiFC-양성(positive) 세포 개체군(cell population)을 나타내었다. 세포 개체군이 성장함에 따라 BiFC-양성 세포들의 희석 효과가 없는 이러한 결과는 α-시뉴클린 응집체들의 지속적인 전파를 의미한다. 둘째, V1S/SV2 공동-배양으로부터 BiFC-양성 종(species)의 방출을 확인하였는데, 이는 수용세포에서 전달된 α-시뉴클린과 내생적(resident) α-시뉴클린의 공동-응집 후 이들 종의 2차 방출에 의해서만 설명될 수 있다. 이러한 응집체들의 2차 방출은 응집체들의 지속적인 전파의 전제조건이다. 셋째, V1S 세포로부터 방출된, V1S 단백질의 이소성(ectopic) 도입은 SV2 세포에서 BiFC-양성 반점들(punctates)을 신속하게 유도하였으며, 세포내 BiFC 종들이 점차 감소함에 따라, BiFC-양성 응집체 종들은 SV2 세포에서 서서히 방출되었다. 이러한 결과들은 α-시뉴클린 응집체들이 엑소시토시스(exocytosis), 엔도시토시스(endocytosis), 씨드된 응집(seeded aggregation) 및 2차 엑소시토시스의 연속적인 사이클을 통해 지속적으로 전파시킨다는 개념을 종합적으로 뒷받침한다.
공동-배양의 몇 차례 계대 후, BiFC-양성 개체군은 응집체 생산/전파 및 분해와 함께 세포 증식률 사이의 균형 상태인, 정상상태(steady state)에 도달하였으며, 이는 응집체 희석의 비율을 결정하게 된다. 신경세포들은 유사분열 후 세포(post-mitotic)이기 때문에, 세포 증식에 기인한 희석 효과는 in vivo 인자가 아닐 것이다. 본 발명은 리소좀의 분해가 연속적인 계대 동안 BiFC-양성 개체군의 제한된 증가의 이면에 있는 주요 원동력임을 제시한다. GBA1-/- 세포들을 가진 BiFC-양성 세포 개체군의 증가된 정상상태 수준은 이러한 개념을 뒷받침한다.
본 발명자들이 신규한 듀얼-셀(dual-cell) BiFC 시스템으로 분석한 세포간 전이는 비교적 드문 현상이다. 세포 밀도와 같은, 배양 조건에 따라 달라지긴 하지만, 일반적으로 BiFC-양성 반점(puncta)을 가진 2-5% 세포들이 관찰된다. 어느 한쪽의 세포주 단독으로는 BiFC 시그널을 거의 나타내기 않기 때문에, 이러한 시스템에서 관찰되는 BiFC 형광은 아티팩트(artefact)가 아니다. 본 발명에 사용된 신경섬유아세포들은 산화에 취약한 도파민과 같은 카테콜아민(catecholamines)을 생산한다. 각 세포주에서 가끔 발생하는 BiFC-양성 세포들은 아마도 카테콜(catechols)의 산화에 의해 생성되는 자가형광(autofluorescence)에 기인한 것이다. 본 발명자들이 이들 세포주를 다루는데 있어 극도의 주의를 기울였음에도 불구하고 (2주 내지 2개월된 세포만 사용함), 일부 세포들은 이러한 비특이적 백그라운드를 생성하였으며, 대개 세포들의 0.5% 미만이었다.
본 발명의 듀얼 셀 BiFC 시스템에서, V1S 세포는 SV2 세포 보다 α-시뉴클린을 훨씬 더 많이 분비하기 때문에 (도 1 참조), V1S 세포가 적어도 초기 전달에서 우세한 공여세포(donor cells)라고 간주하였다. 본 발명에서는, 일차적 목표가 전달된 α-시뉴클린을 제거하는 리소좀 기능의 역할 및 그 결과로서 응집체 전파를 평가하는 것이기 때문에, 수용세포(recipient cells)에서 GCase1의 역할을 조사하였다. 이러한 이유 때문에, 본 발명에서는 SV2GBA1-/-를 사용하였다.
비록 본 발명은 GBA1 기능의 소실이 시뉴클린질환(synucleinopathies)에서 역할을 함을 시사하고 있지만, 이는 GBA1 기능 획득 돌연변이의 병리학적 결과를 반드시 배제하지는 않는다. 예들 들어, 이전 연구들은 돌연변이 GBA1과 손상된 소포체-관련된 퇴화를 관련시켰으며 (Ron, I. et al. 2005 Hum Mol Genet 14, 2387-2398), 산성 조건(acidic conditions) 하에서 α-시뉴클린과 GCase 사이의 물리적 상호작용이 설명되어 왔다 (Yap, T. L. et al. 2011 J Biol Chem 286, 28080-28088). 이 연구들은 기능획득 GBA1 돌연변이에 대한 잠재적인 역할을 뒷받침하고, GBA1 돌연변이가 다중 메커니즘을 통해 그들의 병리학적 작용을 발휘할 수 있다는 점을 강조한다. 그렇긴 하지만, 본 발명은 활성-결핍된 GBA1 돌연변이가 아닌, 야생형 GBA1의 이소성(ectopic) 발현이 α-시뉴클린 응집체들의 전파에 대한 GBA1 결실의 효과를 역전시켰으며, 이는 특발성(idiopathic) PD에 대한 매력적인 치료 기회를 제시함을 증명한다. 이러한 결과는 GBA1의 바이러스-매개된 발현에 의한 GD 마우스 모델(D409V/D409V)의 뇌에서 시뉴클린질환 병변의 개선을 증명하는 이전 연구들과 잘 일치한다 (Sardi, S. P. et al. 2011 Proc Natl Acad Sci USA 108, 12101-12106). 종합하면, 본 발명은 질병-변경(disease-modifying) 치료적 타겟으로서 GCase의 관련성을 강력하게 제시하며, 이 단백질의 활성을 회복시키는 것이 루이 병리학의 확대를 저지하여 PD의 진행을 중단시킬 수 있음을 시사한다.
한편, 노화(aging)와 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)과의 관련성은 보고된 바 있으나, 아직까지 노화가 퇴행성 신경질환의 진행에 어떠한 역할을 하는지에 대해서는 구체적으로 밝혀지지 않았다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 C. elegans 모델을 이용한 실험을 통해 노화가 파킨슨병의 특징인 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이, 및 신경퇴화, 행동장애, 수명단축과 같은 증상의 진전을 가속화시킨다는 사실을 밝혔다. 반대로 유전적 및 약물학적 항-노화 처리에 의해 상기 응집체 및 관련 증상의 전파를 늦출 수 있음을 확인하였다. 나아가 노화 동물 모델에서는 리소좀의 분해 기능이 상당히 손상되었으나, 항-노화 처리에 의해 그러한 손상이 감소된 것을 확인하였다. 또한, 리소좀 생합성의 핵심 조절인자인 hlh-30p::hlh-30 을 노화 동물 모델에 도입하자 단백질 응집체의 세포간 전이가 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 노화가 단백질 응집체의 전이를 조절하며, 항-노화 처리는 리소좀의 기능을 회복시켜 응집체의 전파와 관련된 질병의 진행을 늦출 수 있다는 것을 보여준다.
형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단과 뇌질환 관련 단백질인 알파-시뉴클린의 융합단백질을 각각 발현하는 세포를 포함하는 본 발명의 듀얼-셀 세포 모델을 이용한 실험을 통해 GBA1 유전자에 의한 알파-시뉴클린 응집체의 전이 및 이와 관련된 증상의 조절을 검증할 수 있었다. 또한, 본 발명의 BiFC 동물 모델 시스템을 이용한 실험을 통해 인접 세포간 단백질 응집체의 연속적인 전이를 효과적으로 측정할 수 있었을 뿐만 아니라, daf-2, daf-16, dyn-1, asp-1, asp-4, hlh-30 등의 유전자 및 GlcNAc 화합물에 의한 조절을 검증할 수 있었다. 따라서 본 발명은 단백질 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 듀얼-셀(dual-cell) BiFC 세포 시스템의 제조과정을 설명한 것이다.
(a) 듀얼-셀 BiFC 시스템의 개략도. (b) V1S 및 SV2 안정적인 세포주의 웨스턴 블롯 분석. 사용된 일차 항체들은 Ab274 (인간 α-시뉴클린에 대한 항체; 왼쪽 패널), 항-GFP C-말단 (중앙 패널) 및 항-GFP N-말단 (오른쪽 패널)이었다. (c) 세포 배양물에 분비된 α-시뉴클린의 웨스턴 분석. SgII: secretogranin II, 분비된 단백질들에 대한 로딩 대조군. (d, e) V1S 및 SV2 세포주의 개별적 배양물과 공동-배양물은 Venus의 N-말단 (d) 또는 C-말단 (e) 단편 중 어느 하나와 α-시뉴클린에 대해서 면역염색 되었다. BiFC 시그널(녹색)은 이러한 면역염색으로 나타났다. 삽입도(inserts)에서 파선은 세포 경계를 나타낸다. 스케일 바: 20 μm. (f) BiFC 시그널(녹색)은 phospho-α-시뉴클린(위쪽 패널) 및 유비퀴틴(아래쪽 패널)과 함께 나타났다. 박스 표시된 영역은 삽입도에서 확대된다. 삽입도에서 파선은 세포 경계를 나타낸다. 파란색: 핵. 스케일 바: 20 μm. (g) BiFC 형광을 포함하는 세포들의 3차원적 재구성. 스케일 바: 5 μm.
도 2는 V1S CM에서 α-시뉴클린 응집체 및 그들의 “씨딩(seeding)" 효과를 나타낸 것이다.
(a) V1S CM 및 V1S CM-FT (100 kDa 컷오프 여과의 통과액 분획)의 크기 배제 크로마토그래피. 파란색: V1S CM, 빨간색: V1S CM-FT. (b) (a)에서 지시된 분획의 웨스턴 블로팅 이미지. (c) (b)에서 웨스턴 블롯 이미지의 정량화. (d) V1S CM 또는 V1S CM-FT 중 어느 하나로 처리된 SV2 세포에서 BiFC 형광 이미지. 스케일 바: 20 μm. (e) (d)에서 BiFC-양성 세포들의 퍼센트. 500개 세포들이 각 세 번의 독립된 실험에서 분석되었다. **: p<0.01.
도 3은 α-시뉴클린 응집체들의 인접한 세포간 전이를 나타낸 것이다.
(a) 듀얼-셀 BiFC 시스템의 계대배양(subcultures). BiFC-양성 봉입체(inclusions)는 화살촉으로 표시되어 있다. 아래쪽 패널은 박스 표시된 영역의 확대된 이미지이다. 스케일 바: 20 μm. (b) (a)에서 BiFC-양성 세포들의 정량화. n=4, 각 실험 당 1000개 세포, *: p<0.05, **: p<0.01. (c) 지시된 계대배양에서 배양액의 BiFC 형광. **: p<0.01. (d) 각 계대배양의 배양액에서 α-시뉴클린 멀티머(multimer)에 특이적인 ELISA. **: p<0.01. (e, g) 지시된 계대배양에서 BiFC-양성 세포들의 퍼센트에 대한 배지 세척(e) 및 Ab274 (g)의 효과. n=3, 각 실험 당 1000개 세포, *: p<0.05, **: p<0.01. (f, h) (e)와 (g) 각각에서 확인된 배양의 배양액에서 BiFC 형광. (i-k) V1S 배양의 조건 배양액을 SV2 세포에 10분 동안 첨가한 다음 V1S 배양액을 제거하였다. (i) 세포내 BiFC 형광에서 시간-의존적 감소는 SV2 세포에서 분석되었다. (j) BiFC-양성 응집체들의 2차 방출의 시간 경과 및 (k) 멀티머 α-시뉴클린은 세포 배양물에서 분석되었다.
도 4는 SV2 세포 ZFN(zinc-finger nucleases)에서 GBA1 넉아웃을 나타낸 것이다.
(a) SV2 세포에서 GBA1 유전자의 두 대립형질에서 프레임-쉬프트 돌연변이. (b) SV2GBA1-/- 세포에서 감소된 GCase1 발현을 보여주는 웨스턴 블롯. (c) 총 GCase 활성의 감소. n=3, **** p<0.0001. (d) GCase1 활성의 특이적 감소. n=3, **** p<0.0001. (e) SV2GBA1-/- 세포에서 갈락토세레브로시드(galactocerebroside, GalCer)에 대한 글루코세레브로시드(glucocerebroside, GL1)의 증가된 비율. n=3, **** p<0.0001.
도 5는 GBA1 결핍이 리소좀 기능장애를 유발함을 나타낸 것이다.
(a) Triton-가용성 분획들에서 p62의 수준; n=3, * p<0.05. (b) 폴리유비퀴틴화된 단백질들의 수준. 블롯에서 정량화된 영역은 오른쪽 상의 선으로 표시되어 있다; n=4, * p<0.05. (c) 산성 컴파트먼트의 축적. 500개 세포들이 각 4번의 독립된 실험에서 분석되었다. 스케일 바: 20 μm. n=4, * p<0.05. (d) 내재화된(internalized) 덱스트란-형광 이소티오시아네이트(isothiocyanate); 스케일 바: 20 μm. n=4, 각 실험 당 100개 세포, * p<0.05. (e) 엔도좀 구조의 축적. 100개 세포들이 분석되었다. 스케일 바: 5 μm (왼쪽 패널), 2 μm (오른쪽 패널), ** p<0.01.
도 6은 GBA1 결핍이 α-시뉴클린 응집체들의 인접한 세포간 전이의 증가를 유도함을 나타낸 것이다.
스케일 바: 20 μm. (a) 듀얼-셀 BiFC 시스템에서 세포간 α-시뉴클린 전이. BiFC-양성 응집체들은 화살촉으로 표시되어 있다; n=4, 각 실험 당 500개 세포, * p<0.05. (b) 이소성으로 도입된 α-시뉴클린 응집체들의 축적 (초음파 처리된 피브릴). 형광은 4번의 독립된 실험에서 500개 세포에서 측정되었다. * p<0.05. (c) 듀얼-셀 BiFC 시스템의 계대배양. (d) (c)에서 나타난 BiFC-양성 세포의 정량화. n=3, 각 실험 당 500개 세포, * p<0.05, *** p<0.005, **** p<0.0001. (e) 지시된 계대배양으로부터 얻은 세포 배양물의 멀티머 α-시뉴클린 ELISA 분석. n=3, * p<0.05, *** p<0.005. (f, g) 활성-결핍된 E235K GBA1 돌연변이가 아닌, 야생형 GBA1의 발현에 의한 GBA1 넉아웃 표현형의 역전(reversal); n=4, 각 실험 당 1000개 세포, * p<0.05, # p<0.05.
도 7은 GBA1 결핍이 in vivo에서 α-시뉴클린 병리학의 전파를 증가시킴을 나타낸 것이다.
(a) 세 가지 서로 다른 항체들을 이용한 α-시뉴클린의 면역조직화학. 위쪽 패널에서 박스로 표시된 영역은 아래 패널들에 확대되어 있다. 이식된 세포들은 화살촉으로 표시되어 있다. 스케일 바: 위쪽 패널, 250 μm; 아래쪽 패널, 20 μm. (b, c) 이식된 영역의 퍼센트로서 정량화되고 발현된 α-시뉴클린 면역반응성; n=8, *p<0.01 by t-test. (d, e) 이식된 세포들 (화살촉)의 공동-면역형광 분석. 동물 당 40 세포에서 측정된 α-시뉴클린 수준의 픽셀 강도 (n=8). 스케일 바: 5 μm. (f, g) TH에 대해 염색된 이식된 세포들(화살촉)의 공동-면역형광 분석. 동물 당 40개 세포에서 측정된 α-시뉴클린 표지들의 픽셀 강도 (n=6). 스케일 바: 5 μm.
도 8은 듀얼-셀 BiFC 시스템에서 α-시뉴클린-의존적 세포간 전이를 나타낸 것이다.
Venus 단편들 사이의 상호작용에 기인한 비특이적 형광의 가능성을 배제하기 위하여, α-시뉴클린 없이 N-말단 Venus 단편으로 트랜스펙션된 세포들은 SV2 세포들과 공동-배양되었다 (V1+SV2). 마찬가지로, V1S 세포들은 α-시뉴클린 없이 Venus C-말단 단편으로 트랜스펙션된 세포들과 공동-배양되었다 (V1S+V2). V1+SV2 및 V1S+V2 공동-배양 모두에서 BiFC 형광은 없었다. 스케일 바: 20 μm.
도 9는 도 1d에서 박스 표시된 영역의 확대된 이미지이다.
도 10은 도 1e에서 박스 표시된 영역의 확대된 이미지이다.
도 11은 도 1f에서 박스 표시된 영역의 확대된 이미지이다.
도 12는 듀얼-셀 BiFC 시스템의 몇 차례 계대배양의 예정된 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 V1S 및 SV2 세포에서 BiFC 형광의 분포를 나타낸 것이다.
빨간색 형광은 Venus의 N-말단 단편을 나타내므로, VIS 세포이다. 오른쪽에 있는 그래프는 V1S (흰색) 및 SV2 (검은색) 세포에서 BiFC 형광을 나타낸다. V1S와 SV2 세포 사이에서 BiFC 형광의 분포는 변화가 없었다. 스케일 바: 20 μm, n=3, 각 실험 당 1000개 세포, * p<0.05, ** p<0.01.
도 14는 α-시뉴클린 응집체들의 인접한 전이를 위해 제안된 모델을 나타낸 것이다.
도 15는 ZFN(zinc finger nuclease)를 이용한 표적화된 돌연변이생성을 나타낸 것이다.
(a) 타겟 유전자에 특이적인 서열을 인식하는 각각 한 쌍의 ZFNs는 DNA의 이중가닥 모두를 절단하도록 디자인되어 있다. (b) ZFN에 의해 생성된 Nicks는 NHEJ(Non-Homologous End Joining)에 의해 수리되는데 이때 다양한 돌연변이들이 도입된다. 프레임-쉬프트 돌연변이들은 ZFN 타겟 부위의 종결코돈 다운스트림을 생성한다.
도 16은 α-시뉴클린의 분비가 듀얼-셀 BiFC 시스템의 연속적인 계대배양 동안 증가되었음을 나타낸 것이다.
분비된 α-시뉴클린의 수준은 웨스턴 블로팅으로 분석되었다. (a) 세포용해물(cell lysates). α-시뉴클린의 세포내 수준은 별다른 변화가 없었다. (b) 세포 배양물(culture media). 고분자 α-시뉴클린(HM)의 분비는 듀얼-셀 BiFC 시스템의 연속적인 계대배양 동안 증가되었다.
도 17은 V1S 및 SV2 GBA1-/- 세포에서 BiFC 형광의 분포를 나타낸 것이다.
빨간색 형광은 Venus의 N-말단 단편을 나타내므로, V1S 세포이다. 오른쪽에 있는 그래프는 VIS (흰색) 및 GBA1-/- SV2 (검은색) 세포들에서 BiFC 형광을 나타낸다. V1S 및 GBA1-/- SV2 세포 사이에서 BiFC 형광의 분포는 연속적인 계대 동안 크게 변화되지 않았다. 스케일 바: 20 μm, n=3, 각 실험 당 1000개 세포, * p<0.05, ** p<0.001.
도 18은 GBA1 넉다운의 효율을 나타낸 것이다. GBA1 넉다운의 효율은 웨스턴 블로팅(a) 및 GCase1 활성 분석(b)으로 분석되었다. n=3, *** p<0.005, ### p<0.005.
도 19는 α-시뉴클린의 세포간 전이에 대한 GBA1 넉다운의 효과를 나타낸 것이다.
(a) α-시뉴클린을 발현하는 분화된 SH-SY5Y 세포들(doner)은 GBA1 넉다운에 대한 shRNA를 발현하는 세포들(recipient)과 공동-배양되었다. 또한 shRNSs에 대한 벡터들은 GFP를 포함하여 트랜스펙션된 세포들을 표지하였다. shRNSs의 효과를 구제(rescue)하기 위해, GFP 유전자가 GBA1 유전자로 대체된 별개의 벡터가 구성되었다. 또한 수용세포들은 Qdot로 표지되었다. 전달된 α-시뉴클린을 가진 수용세포들은 화살촉으로 표시되어 있다. 스케일 바: 20 μm. (b) α-시뉴클린 면역형광은 수용세포에서 측정되었다; n=4, 각 실험 당 500개 세포, * p<0.05, # p<0.05.
도 20은 이식 실험에서 이식된 SH-SY5Y 세포의 평가를 나타낸 것이다.
이식된 마우스 뇌 조직에서 이식된 세포를 평가하기 위해, 분화된 SH-SY5Y 세포들은 이식에 앞서 GFP 렌티바이러스로 감염되었다. in vivo 실험에서, GFP-양성 세포의 95%는 TH-양성였다. GFP를 과발현하는 SH-SY5Y 세포로 이식된 마우스 해마에서, 이식된 SH-SY5Y 세포의 약 80%는 TH-양성였다.
도 21은 SV2 및 GBA1-/- SV2 세포의 증식률을 나타낸 것이다.
도 22는 융합단백질 V1S(Venus1-αSyn) 및 SV2(αSyn-Venus2)의 염기서열 구조를 나타낸 것이다.
도 23은 시뉴클린질환(synucleinopathy)의 전이를 분석하기 위한 본 발명의 C. elegans 모델의 제작 및 특성을 보여준다.
도 24는 daf-2, daf-16 돌연변이가 세포간 α-시뉴클린 전이에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다.
도 25는 GlcNAc가 α-시뉴클린의 세포간 전이에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다.
도 26은 항-노화 처리에 따른 폴리유비퀴틴화된 단백질의 정상 수준(steady-state level)의 변화를 보여주는 실험 결과이다.
도 27은 항-노화 처리가 응집체의 전이에 미치는 영향이 증가된 리소좀의 기능과 관련되어 있다는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 28은 본 발명의 C. elegans BiFC 모델의 제작 및 특성을 보여주는 추가 실험 결과이다.
도 29는 노화 돌연변이 C. elegans BiFC 모델의 제작 및 특성을 보여주는 추가 실험 결과이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 단일 조직 발현 계통(single tissue expression lines)에서 GlcNAc가 미치는 영향을 실험한 결과이다.
도 31은 도 26과 관련하여 폴리유비퀴틴화된 단백질의 정상 수준의 변화를 보여주는 실험 결과이다.
도 32는 도 27과 관련하여 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 계통들의 엔도리소좀 기능(endolysosomal functions)을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
듀얼-셀 모델의 제작 및 이를 이용한 α-시뉴클린의 세포간 전이 측정
실험재료 및 방법
다음의 항체들이 본 발명에 사용되었다 : α-시뉴클린 모노클로날 항체(BD Biosciences; #610787, San Diego, CA), α-시뉴클린 모노클로날 항체 #274, 인산화된 α-시뉴클린 폴리클로날 항체(Abcam, ab59264; Cambridge, MA), GFP (c-terminus) 폴리클로날 항체(IMGENEX, #5127A; San Diego, CA), GFP (N-terminus) 폴리클로날 항체(Cell signaling Technology, #2555; Beverly, MA), GFP (N-terminus) 모노클로날 항체(Abcam, ab127417), GCase 모노클로날 항체 8E4 (from J. Barranger, University of Pittsburgh), GCase 폴리클로날 항체(Sigma, G4171; St. Louis, MO), p62 모노클로날 항체(BD Transduction laboratories, #c2384-0B; Swampscott, MA), 유비퀴틴 폴리클로날 항체(Dako; Glostrup, Denmark and Chemicon; Temecula, CA), 및 β-액틴 모노클로날 항체(Sigma). 형광 염료-콘쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG는 Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA)로부터 구입하였다. Q tracker 858 세포 라벨링 키트는 Invitrogen (Carlsbad, CA)로부터 구입하였다.
실시예 1-1. 안정적인 세포주의 구성
안정적인 세포주(stable cell lines)를 제조하기 위해, SH-SY5Y 인간 신경섬유아세포를 Venus1-αSyn (V1S) 또는 αSyn-Venus2 (SV2) (Massachusetts General Hospital (Charlestown, MA)의 Dr. Pamela McLean로부터 입수)로 전기천공법을 이용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포들은 콜로니가 나타날 때까지 2-3주 동안 600 mg/mL G418 (Invitrogen)로 선별하였다. 안정적인 세포주들은 200 mg/mL G418로 유지되었다.
실시예 1-2. GBA1 넉아웃(KO) 세포주의 제조
SH-SY5Y 세포들을 ZFN 및 마크네틱 리포터(ToolGen; Seoul, Korea)를 코딩하는 플라스미드로 전기천공법을 이용하여 트랜스펙션 시켰다. 48시간 동안 배양한 후, 세포들을 마그네틱 분리에 제공하였다. 트립신 처리한 후, 세포들을 H-2Kk (MACSelect Kk microbeads; Miltenyi Biotech; Germany)에 대한 마그네틱 비드-콘쥬게이트된 항체와 혼합하고 그 혼합물을 MACSLS 컬럼 (Miltenyi Biotech)에 사용하였다. 상기 용출액으로부터 얻은 단일 세포들은 클로날 콜로니(clonal colony)가 배양 접시로부터 선택될 때까지 유지하였다. GBA1 유전자에서 넌센스 돌연변이(nonsense mutations)는 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
실시예 1-3. 세포 배양
SH-SY5Y 인간 신경섬유아세포주는 이전에 기술된 바와 같이 유지되었다 (Lee, H. J. et al. 2004 J. Neurosci. 24, 1888-1896). 공동-배양을 위해, V1S와 SV2 (또는 SV2GBA1-/-) 안정적인 세포 (각각 180,000 세포)를 커버슬립에서 혼합하고 3일간 배양하였다. α-시뉴클린의 지속적인 전이를 확인하기 위하여, V1S와 SV2 (또는 SV2GBA1-/-) 세포의 혼합물을 2일(48h) 마다 계대배양(subculture)하였다. SV2 및 SV2GBA1-/-의 성장률은 계대(passage) 실험 동안 별다른 차이는 없었다 (도 21).
전이에 대한 배지 세척의 영향을 확인하기 위해, V1S/SV2 공동-배양물을 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)으로 세척한 후 분석 전날 신선한 성장 배지로 배양하였다. α-시뉴클린의 전이에 대한 항체들의 영향을 확인하기 위해, 5 μg/ml의 대조군 IgG 또는 Ab274를 분석 전날 V1S/SV2 공동-배양물에 첨가하였다.
실시예 1-4. α-시뉴클린 조건 배양액의 제조
α-시뉴클린 조건 배양액(conditioned media)은 100 mm 디쉬 20개로부터 확보하였다. V1S 세포가 90% 컨플루언트(confluent)일 때, DMEM으로 세 번 세척 한 후 배지를 무혈청 DMEM으로 교체하였다. 세포들은 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 조건 배양액(100 ml)을 V1S 세포의 20개 디쉬로부터 수집하였다. 1,000ㅧg에서 10분간 원심분리 후, 상층액을 10,000에서 20분간 원심분리하여 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하였다. 상기 상층액을 Amicon 10K MWKO 필터(Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 300배로 농축하였다.
실시예 1-5. 크기 배제 크로마토크래피
크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)는 AKTA purifier (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ)를 이용하여 수행되었다. 샘플들을 인산 버퍼(20 mM sodium phosphate, pH 7.4, 0.15 M NaCl)로 평형시킨 Superdex 200 HR 10/30 칼럼(GE Healthcare Life Science)에 사용하여 0.5 ml/minute의 유속으로 용출시켰다.
실시예 1-6. GCase 활성 및 글리코스핑고지질 수준의 정량
세포의 GCase 활성은 인공 기질로서 4-methylumbelliferyl (4-MU)-β-D-glucoside를 이용하여 이전에 기술된 바와 같이 측정하였다 (Sardi, S. P. et al. 2011 Proc Natl Acad Sci USA 108, 12101-12106). 모든 측정은 GCase 효소적 활성을 활성화시키는 세정제인, 타우로콜레이트(taurocholate) 없이 수행되었다. GCase2 특이적 활성은 GCase1 저해제인 conduritol-B-epoxide (100 μM)가 있는 상태에서 측정되었다. GCase1 활성은 총 GCase 활성에서 GCase2 활성 수준을 빼서 구하였다. 세포의 GlcCer 및 GalCer 수준은 이전에 기술된 바와 같이 질량분석법으로 측정하였다 (Sardi, S. P. et al. 2011 Proc Natl Acad Sci USA 108, 12101-12106). 간략히 설명하면, 유기성 세포 추출물을 GlcCer 및 GalCer 분리용 Atlantis HILIC 실리카 칼럼(Waters Corp.; Milford, MA)에 주입하여, AB Sciex API-5000 질량 분석기를 이용하여 측정하였다.
실시예 1-7. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로 감염
계대 후, 세포들을 Ad-TS129 (3 M.O.I.) 및 다양한 AAV (5e6 M.O.I.)으로 공동-감염시켰다. 세포들을 온도-민감성 헬퍼 아데노바이러스(helper adenovirus)의 활성화를 위해 39℃에서 24시간 동안 배양하였다. 몇몇 AAV 벡터는 GBA1 (GFP-miRNA GBA1a and b)의 넉다운 및 miRNA-저항성 GBA1 * (GBA1 * -miRNA GBA1b)을 발현하는 레스큐 벡터(rescue vector)를 위해 디자인되었다.
실시예 1-8. 분비된 α-시뉴클린 응집체의 정량
분비된 α-시뉴클린 공동-응집체들의 수준을 측정하기 위해, V1S/SV2 공동-배양물로부터 얻은 배양액을 10,000ㅧg에서 10분간 원심분리 하였다. 배양액으로부터 얻은 상층액을 96-웰 블랙 플레이트(Corning Inc.; Corning, NY)에 옮기고 형광 마이크로플레이트 리더(Spectra Max GeminiEM;, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 형광분석을 수행하였다. ELISA를 위한 과정은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Lee, H. J. et al. 2011 J Neurosci Methods 199, 249-257). 간략히 설명하면, 50 mM 카보네이트 버퍼(pH 9.6)에 있는 1 μg/ml의 포획 항체(capture antibody) #62를 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc; Rochester, NY) 상에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(phosphate-buffered saline) (PBST)로 세척한 후, SuperBlock T20 PBS 블로킹 버퍼 (Pierce; Rockford, IL)를 진탕하면서 실온(RT)에서 1시간 동안 첨가하였다. PBST로 세척한 후, 표준 및 배양액으로부터 얻은 α-시뉴클린 응집체를 진탕하면서 RT에서 2.5시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBST로 다시 세척하고, 그 후에 1 μg/ml의 바이오틴 결합된(biotinylated) 리포터 항체 #62를 첨가하고 RT에서 1.5시간 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 후, 아비딘-콘쥬게이트된 페록시다아제(ExtrAvidin; Sigma; St. Louis, MO)를 상기 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 3,3’5,5’-tetramethylbenzidine 용액(Sigma)과 반응시켰다. 2 N H2SO4의 첨가 후, SpectraMax190 분광광도계(MolecularDevices)를 이용하여 490 mm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-9. 세포 추출물의 제조
차가운(ice-cold) PBS로 세척한 후, 세포들을 추출 버퍼(1% Triton X-100, 1% (v/v) protease inhibitor cocktail (Sigma) in PBS)에서 용해시켰다. 세포 용해물을 얼음 상에서 10분간 반응시키고 16,000ㅧg에서 10분간 원심분리 하였다. 가용성 분획에 있는 Triton X-100을 1X Laemmli 샘플 버퍼에 재현탁하고 순간적으로 초음파 처리하였다.
실시예 1-10. 웨스턴 블랏팅
웨스턴 블랏팅은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Lee, H. J. et al. 2002 J Biol Chem 277, 48976-48983). 이미지를 확보하고 FUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS-3000 및 Multi Gauge (v3.0) 소프트웨어(FUJIFILM; Tokyo, Japan)를 이용하여 정량화 하였다.
실시예 1-11. 면역형광 염색
면역형광 염색을 위한 과정은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Lee, H. J. et al. 2002 J Biol Chem 277, 48976-48983). 간략히 설명하면, 폴리-L-리신-코팅된 커버슬립 상에서 성장시킨 세포들을 PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고 PBS에 녹인 0.1% Triton X-100에서 투과를 용이하게 하였다. 블로킹 용액(5% bovine serum albumin/3% goat serum in PBS)에서 반응 후, 블로킹 용액으로 희석된 일차 항체들을 세포에 첨가하였다. 세척 후, 세포들을 형광 염료-콘쥬게이트된 이차 항체들과 반응시켰다. 핵은 TOPRO-3 iodide (Invitrogen)로 염색하였다. 세포들을 Prolong Gold Antifade 시약(Invitrogen)이 있는 상태에서 슬라이드 글라스에 올려놓았다. 세포의 관찰에는 Olympus FV1000 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하였다.
실시예 1-12. 리소좀 기능장애의 특성
리소트래커-양성 컴파트먼트(lysotracker-positive compartment)의 이미징을 위해, SH-SY5Y 세포들을 성장배지로 희석된 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 75 nM 리소트래커 용액(Lysotracker Red DND-99; Invitrogen)으로 염색하고, CO2 인큐베이터에서 37℃로 1시간 동안 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척한 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액에서 고정시켰다. 내재화된(internalized) 덱스트란의 분해율을 측정하기 위해, 세포들을 20 μg/ml의 FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지된 덱스트란(Invitrogen)으로 2시간 동안 반응시켰다. DMEM으로 세척한 후, 세포들을 신선한 성장배지로 30분간 배양하고 4% PFA 용액으로 고정시켰다. 형광 강도는 Olympus FV1000 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
실시예 1-13. 전자현미경 관찰
세포들을 100 mm 디쉬에서 성장시킨 후 Karnovsky’s 고정 용액(2% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 0.5% CaCl2)으로 고정시켰다. 1% 오스뮴 테트라옥사이드(osmium tetraoxide)에서 1.5시간 동안 담근 후, 세포들을 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100%의 에탄올로 탈수시켰다. 세포들은 EPON 혼합물을 포매하기 앞서 프로필렌옥사이드(propyleneoxide)와 EPON 혼합물(EPON812, MNA, DDSA, DMP30)로 10분 동안 스며들게 하였다. 포매한 후, 상기 세포들을 LEICAEMUC-7 Ultra-microtome(Leica Microsystems, Austria)으로 잘라낸 다음, 6% 우라닐아세테이트(uranylacetate) 및 납시트레이트(lead citrate)로 염색하였다. 그리드(grids)는 투과전자현미경(JEM-1011; JEOL, Japan)으로 관찰되었으며, Megaview III 소프트웨어(Soft imaging system, Germany)를 이용하여 분석되었다. 형태학적 분석을 위해, 15개 세포들이 각 실험 마다 분석되었다.
실시예 1-14. 세포에서 외부로부터 유입된 재조합 α-시뉴클린 응집체의 분석
세포들은 0.2 μM의 α-시뉴클린 피브릴(α-synuclein fibrils)로 1일간 반응시킨 후 4% PFA로 고정시켰다. 면역형광 염색한 후, 단일 세포에서 α-시뉴클린의 강도를 Olympus FV1000 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
실시예 1-15. 실험동물
본 발명을 위해 mThy1 프로모터의 조절 하에서 야생형 인간 α-시뉴클린을 발현하는 이형접합 형질전환 마우스(heterozygous transgenic mice; Line 61)를 사용하였다 (Rockenstein, E. et al. 2002 J Neurosci Res 68, 568-578). 이 마우스들은 PD와 루이소체 치매를 가진 환자에서 관찰되는 것과 유사하게 운동 및 비운동 결함(motor and non-motor deficit)을 동반하는, 신피질(neocortex), 변연계(limbic system), 및 선조체-흑질 시스템(striato-nigral system)에 걸쳐 광범위한 신경세포 및 시냅스 축적을 나타내기 때문에 (Fleming, S. M. et al. 2004 J Neurosci 24, 9434-9440) 선택되었다.
실시예 1-16. SH-SY5Y GBA1 -/- 세포를 α-시뉴클린 형질전환 마우스로 뇌정위 전달(stereotaxic delivery)
α-시뉴클린 형질전환 마우스 및 그들의 비-형질전환 한배 새끼(litter mates)(그룹 당 n = 8, 10 개월령, 총 4 그룹, 32 마리)는 이전에 기술된 바와 같이 (Desplats, P. et al. 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106, 13010-13015), 해마에 2 μl의 야생형 또는 GBA1-/- 세포 제조물(1.2 million cells)을 한쪽 뇌정위 주사(unilateral stereotaxic injections) 받았다. 마우스들을 마취시키고 Koft 뇌정위고정장치(stereotaxic apparatus)에 위치시켰다. 전자 전달 펌프 시스템을 활용하면서, SH-SY5Y 또는 SH-SY5Y GBA-/- 세포 제조물들은 Hamilton 실린지를 이용하여 주사되었다. 해마에 대한 조정은 다음과 같다: AP-2.0 mm, lateral 1.5 mm, depth 1.3 mm. 마우스들은 이식 주사 후 4주 동안 생존하였다. 마우스들을 클로랄 수화물(chloral hydrate)로 마취시키고 0.9% 식염수로 심장을 통해 관류(flush-perfused)시켰다. 뇌를 떼어내어 인산-완충된 4% PFA (pH7.4)로 4℃에서 48시간 동안 신경병리학적 분석을 위해 고정시켰다.
실시예 1-17. 면역세포화학 분석 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경
뇌는 바이브라톰(vibratome; Leica, Deerfield, IL, USA)을 이용하여 40 μm에서 연속절편(serially sectioned)으로 잘라내었다. WT 및 SH-SY5Y GBA1-/- 세포로 이식된 형질전환 및 비-형질전환 마우스로부터 얻은 일련의, 자유-유동성(free-floating), 블라인드-처리된 바이브라톰(blind-coded vibratome) 절편들은 이전에 기술된 바와 같이 (Bae, E. J. et al. 2012 J Neurosci 32, 13454-13469), 총 α-시뉴클린(Millipore), α-시뉴클린 c-말단(SYN105 항체), 및 인간 α-시뉴클린(SYN211)에 대한 항체들로 면역염색 되었다. 그런 다음 절편들을 바이오틴-태그된 이차 항체들과 반응시키고 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)으로 현상하였다. α-시뉴클린에 대한 항체들로 면역표지된 절편들(100 μm 간격으로 각 마우스로부터 3개씩)은 Stereo-Investigator System (MBF Bioscience; Williston, VT)을 이용한 해독법(dissector method)을 통해 분석되었으며 그 결과는 평균을 내고 이식된 영역에서 양성(positive) 세포의 퍼센트로 나타내었다.
α-시뉴클린과 신경세포 마커들 사이의 공동-위치를 확인하기 위해, 이전에 기술된 바와 같이 (Masliah, E. et al. 2011 PLoS One 6, e19338), 이중-라벨링 실험을 수행하였다. 이를 위해, 바이브라톰 절편(vibratome sections)을 인간 α-시뉴클린에 대한 항체(SYN211)와, TH (Millipore) 및 GCase (Abcam, ab55080)에 대한 항체들로 면역표지 하였다. TH- 및 GCase-면역반응성 이식된 세포들은 FITC-태그된 항체들(1:75; Vector; Burlingame, CA)로 검출된 반면, α-시뉴클린은 Tyramide Red (NEN Life Sciences)로 검출되었다. 모든 절편들은 동일한 조건 하에서 동시에 진행되었으며, 실험들은 결과의 재현성을 평가하기 위해 이중으로 수행되었다. 절편들은 MRC1024 LSCM(laser scanning confocal microscope) 시스템(BioRad)이 장착된 Axiovert 35 현미경(Zeiss) 상에서 Zeiss 63X (N.A. 1.4) 대물렌즈로 이미지화하였다 (Masliah, E. et al. 2011 PLoS One 6, e19338). 일련의 짝지어진 광학 절편들은 ImageJ co-localization color map 소프트웨어로 분석하여 WT 및 GBA1-/- 세포들과 관련된 α-시뉴클린 픽셀 강도(pixel intensity)를 측정하였다. 마우스 당 평균 20개 디지털 이미지를 분석하였다. 각 디지털 이미지는 평균 4개 세포를 포함하였다. 도면에서 값들은 평균±SEM으로 나타내었다.
실험결과
실험결과 1-1. 신규한 듀얼-셀 BiFC 시스템에서 씨딩-의존적 응집체 전이
α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이를 직접적으로 관찰함으로써 응집체 전파의 메커니즘을 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)에 기초한 분석법을 개발하였다. 본 발명자들은 노란 형광 단백질의 변이체인, Venus의 N-말단 (V1S) 또는 C-말단 (SV2) 단편 중 하나와 융합된 α-시뉴클린을 발현하는 2개의 안정적인 세포주를 제조하였다 (도 1a). V1S 및 SV2 구성체는 각각 따로 SH-SY5Y 세포로 트랜스펙션 시키고, 2가지 α-시뉴클린 융합 단백질을 유사한 수준으로 발현하는 안정적인 세포주를 선택하였다 (도 1b). 예상대로, V1S-발현 세포와 SV2-발현 세포 모두 각각 따로 배양될 때는 형광을 나타내지 않았다 (도 1d, e). 그러나 상기 세포주들이 공동-배양될 때, α-시뉴클린의 세포간 전달 과정 동안 V1S와 SV2 융합 단백질의 다이머화 또는 올리고머화로 인한 형광이 BiFC로 가시화되었다 (도 1a, d, e). V1S와 Venus의 C-말단 단편(V2)을 발현하는 세포들의 공동-배양, 또는 SV2와 Venus의 N-말단 단편(V1)을 발현하는 세포들의 공동-배양 모두에서 BiFC 형광이 나타나지 않았으며 (도 8), 이는 α-시뉴클린 단백질들 사이의 동형성 상호작용(homotypic interaction)의 특이성을 설명하는 것이다. V1S가 SV2 보다 더 높은 수준으로 분비되기 때문에 (도 1c), 상기 세포주들의 공동-배양 동안 α-시뉴클린의 전달은 주로 V1S와 관련되어 있을 것으로 추정된다.
면역형광 분석은 대략 2-5%의 세포들이 α-시뉴클린과 Venus의 N- 및 C-말단 (도 1d, e), phospho-α-시뉴클린 (Ser129) 및 유비퀴틴(ubiquitin) (도 1f)에 대해 양성(positive)인 작은 형광 봉입체들(inclusion bodies)을 포함하였다. 이러한 특성은 형질전환 모델에서 관찰되는 루이소체 및 병원성 봉입체와 유사하다 (Spillantini, M. G. et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95, 6469-6473). 3차원적으로 재구성된 z-stack 이미지는 형광 봉입체가 세포내 구조물임을 의미한다 (도 1g). 이러한 결과는 세포간 전달 및 수용세포(recipient cells) 고유의(resident) α-시뉴클린과 전달된 α-시뉴클린의 공동-침전을 증명하였다.
웨스턴 블랏 분석에 의한 평가에 따르면, V1S 및 SV2 세포에서 대부분의 세포내 α-시뉴클린은 triton x-100 가용성이며 모노머(monomeric)였다 (도 1b). 그러나 상기 세포 배양물(culture media)은 α-시뉴클린의 응집체들을 포함하였으며 (도 1c), 이는 응집체가 세포로부터 우선적으로 분비됨을 의미한다. 배양물에서 응집체의 존재를 좀 더 평가하기 위해, 총 배양물(V1S CM) 및 100 kDa 컷오프 필터를 통과한 배양물(V1S CM-FT)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다 (도 2a-c). V1S CM의 히스토그램은 모노머 (13 mL)에서 공극부피(void volume) 분획 (8 mL) 범위의 폭 넓은 크기에서 α-시뉴클린의 분포를 나타낸 반면, V1S CM-FT의 히스토그램은 모노머에서만 나타났다 (도 2b, c). 이는 V1S CM이 응집된 형태들을 포함하고, 100 kDa 컷오프 필터(여과)가 상기 응집체를 효과적으로 제거하여, 모노머만 남아 있음을 의미한다. 수용세포에서 씨드된(seeded) 응집을 확증하기 위해, SV2 세포를 총 V1S CM 또는 V1S CM-FT 중 하나로 처리하고 BiFC-양성(positive) 응집체들을 분석하였다. 총 V1S CM의 투여는 SV2 세포에서 BiFC-양성 응집체를 유도하는 반면, V1S CM으로부터 고분자량 응집체들의 제거(V1S CM-FT)는 CM의 “씨딩(seeding)" 능력을 소거하였다 (도 2d, e). 이러한 데이터는 세포들이 응집된 α-시뉴클린을 방출하고, 그 응집된 형태가 본 발명의 듀얼 셀(dual cell)-BiFC 모델에서 수용세포의 응집을 씨드(seed)할 수 있음을 강하게 제시한다.
실험결과 1-2. 연속적인 세포간 전이를 통한 α-시뉴클린 응집체의 지속적인 전파
중추신경계(CNS) 내에서 퍼져나가는 병리학적 응집체를 설명하기 위해서는, 세포간 전이가 단일의 불연속적인(discontinuous) 과정이어서는 안 된다. 전이의 첫 번째 라운드(round)에서 생성되는 공동-응집된 α-시뉴클린의 2차 방출은 응집체의 병리학적 전파에 절대적으로 필요하다. 이러한 문제를 다루기 위해, 본 발명자들은 듀얼-셀 BiFC 시스템을 사용하였다. 만약 전이가 단일의 불연속적인 작용이라면, V1S 및 SV2-발현 세포들의 연속적인 계대배양(subculture) 동안, BiFC-양성(positive) 세포의 비율(퍼센트)은 계대 횟수가 증가할수록 감소할 것이다. 반대로, 만약 전이가 연속적인 작용이라면, BiFC-양성 세포들의 비율(퍼센트)은 정상상태(steady state)에 도달할 때까지 계대 횟수에 따라 증가할 것이다 (도 12). 몇 차례의 계대(각 계대 당 48시간 동안 배양됨)를 위한 V1S 및 SV2 세포의 공동-배양 결과 BiFC-양성 세포의 비율(퍼센트)은 연속적으로 증가하였다 (도 3a, b). 이와 유사하게, “씨드(seed)"와 내생적(endogenous) α-시뉴클린의 공동-침전의 2차 분비를 나타내는, 상기 배양물에서 BiFC 형광은 계대 횟수의 증가에 따라 역시 증가하였다 (도 3c). 이는 배양물에서 올리고머들의 증가된 양에 의해 확인되었다 (도 3d). 또한 V1S 및 SV2 세포들 사이에서 BiFC-양성 세포들의 비율이 연속적인 계대배양 동안 별다른 변화가 없었음을 확인하였다 (도 13).
유체상(fluid phase)을 통한 씨드의 전달을 설명하기 위해, 다음으로 배지 세척 및 항체 블로킹 실험을 수행하였다. V1S 및 SV2 세포의 공동-배양 동안, 배양 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체하였다. BiFC 형광은 배지 교체 1일 후 분석하였을 때, 세포내 및 배지 BiFC 시그널 모두 감소되었으며 (도 3e, f), 이는 상기 씨드의 유체상 전달과 일치하였다. 다음으로, 분비된 α-시뉴클린을 억제(hijack)하기 위해, α-시뉴클린 특이적 항체인 Ab274를 첨가하여, BiFC 분석 1일전 공동-배양함으로써, 이 단백질의 전달을 블로킹하였다. 이러한 항체 처리는 세포질(cytoplasm) 및 배양액(media) 모두에서 BiFC 시그널을 억제하였다 (도 3g, h). 씨딩(seeding)과 2차 분비의 일시적인 변화를 분석하기 위해, V1S 배양물로부터 얻은 조건 배양액(conditioned medium, CM)이 SV2 세포에 첨가될 때, 펄스-추적실험(pulse-chase experiment)을 수행하였다. 정상상태에 도달한 후, V1S CM을 세척하고 BiFC 시그널을 지시된 시점에서 세포 및 배양액에서 분석하였다. V1S 및 SV2 단백질의 공동침전물은 배지 세척 후 세포질로부터 신속하게 사라진 반면, 분비된 BiFC 시그널은 역으로 증가하였다 (도 3i, j). 올리고머-특이적 ELISA는 상기 배양물에서 α-시뉴클린 올리고머의 수준의 증가를 확인하였다 (도 3k). 종합하면, 이러한 결과는 α-시뉴클린 응집체들이 세포간 응집체 전달, 내생적 α-시뉴클린 응집의 씨딩(seeding), 및 씨드된 응집체의 2차 분비를 포함하는, 순차적인 작용의 사이클을 통해 세포에서 세포로 인접하여 전달됨을 의미한다 (도 14).
실험결과 1-3. GBA1 결핍에 의한 리소좀의 기능장애
α-시뉴클린 응집체 전이에 있어서, PD에 대한 강력한 유전적 위험인자인, GBA1의 역할을 평가하기 위해, ZFN(zinc finger nuclease)에 기초한 방법을 사용하여 GBA1 유전자의 대립형질(alleles) 모두에서 넌센스 돌연변이를 포함하는, SV2GBA1-/-인 SV2 세포주를 수립하였다 (도 4a, 도 15). 이 세포주는 GCase1을 발현하지 못하기 때문에 (도 4b), 총 GCase 활성은 크게 감소되었다 (도 4c). GCase2 활성은 CGase1 활성 보다 매우 낮았으며, GBA1 유전자 돌연변이에 따른 변화는 없었다 (도 4d). GCase1 감소의 결과로서, 효소의 기질인 글루코실세라마이드(glucosylceramide)는 SV2GBA1-/- 세포에 축적되었다 (도 4e).
SV2GBA1-/- 세포는 p62 및 폴리유비퀴틴화된 단백질과 같은 리소좀의 기질들의 축적으로 특징되는데 (도 5a, b), 이는 리소좀 기능장애를 의미한다. 리소좀 이상과 일치하게, 이 세포들은 증가된 리소트래커(Lysotracker)-양성 구조를 가지며 (도 5c), 이소성으로(ectopically) 생성된 덱스트란의 분해를 감소시키고 (도 5d), 세포질에서 공포성 구조(vacuolar structures)의 축적을 나타내는데 (도 5e), 이 모든 것들은 명백하게 리소좀의 손상을 증명하는 것이다. 나아가 본 발명자들은 GBA1 유전자 결실이 모(parental) SH-SY5Y 세포에서 리소좀의 기능장애를 유발함을 확인하였다.
실험결과 1-4. GBA1 결핍에 따른 α-시뉴클린 응집체들의 연속적 전이
다음으로, GBA1 결핍이 α-시뉴클린의 세포간 전이에 영향을 미치는지를 조사하였다. V1S 세포들이 SV2GBA1-/- 세포들과 공동-배양될 경우, BiFC-양성 세포의 퍼센트는 V1S/SV2 공동-배양과 비교하여 현저히 증가되었다 (도 6a). 본 발명자들은 이를 내재화된(internalized) 응집체들을 제거하는 SV2GBA1-/-의 능력이 리소좀의 손상으로 인해 감소되었음을 반영하는 것으로 해석하였다 (도 6b). 그 후에 인접한 전이에 대한 GBA1 유전자 결실의 효과를 조사하였다. V1S 및 SV2GBA1-/- 세포들의 공동-배양은 몇 차례 계대 동안 V1S/SV2 공동-배양과 비교하여 BiFC-양성 세포들의 수에서 현저한 증가를 유도하였다 (도 6c, d). 유사하게, α-시뉴클린 올리고머의 수준은 V1S/SV2 공동-배양 보다 V1S/SV2GBA1-/- 공동-배양의 배양액에서 더 높았다 (도 6e, 도 16). 또한, V1S와 SV2GBA1-/- 사이에서 BiFC-양성 세포들의 비율은 계대배양 동안 큰 변화가 없었다 (도 17). 이 과정에서 GCase 활성의 역할을 더 잘 설명하고 있고, 이러한 현상은 야생형 GBA1 유전자의 AAV 벡터-매개된 이소성(ectopic) 발현으로 역전되었지만, 활성-결핍 E235K 돌연변이를 코딩하는 것에서는 그렇지 않았다 (도 6f, g).
GBA1 유전자 결실의 결과가 “오프-타겟(off-target)” 효과를 나타내지 않음을 확증하기 위해, 다음으로 AAV 벡터를 이용한 RNA 간섭(RNAi)을 수행하였다. 2가지 서로 다른 shRNA를 이용한 GCase1 발현의 감소는 웨스턴 분석 및 활성 분석으로 수행하였다 (도 18). GCase1 생산의 넉다운은 α-시뉴클린의 세포간 전달의 일관된 증가를 유도하였다. 이러한 GCase1 넉다운의 효과는 GCase1 생산의 회복으로 역전되었고, 따라서 야생형 GBA1 유전자의 이소성(ectopic) 발현으로부터 활성이 회복되었다 (도 19). 종합하면, 이러한 결과는 GBA1 결핍이 α-시뉴클린 응집체들의 지속적인 전이를 촉진하고 야생형 GBA1의 이소성 발현이 이러한 효과를 역전시킴을 보여주는데, 이는 GBA1 기능의 소실이 α-시뉴클린 응집체 전파를 증가시킨다는 것을 의미한다.
이전 연구에서 형질전환 인간 α-시뉴클린이 숙주세포(host cells)에서 이식된 세포(engrafted cells)로 전달됨을 밝혀내었다 (Desplats, P. et al. 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106, 13010-13015). in vivo에서 GBA1의 역할을 평가하기 위해, 정상 SH-SY5Y 세포 및 GBA1-/- (SH-GBA1-/-) 세포들이 인간 α-시뉴클린을 발현하는 형질전환 마우스의 해마로 이식된 이식 실험을 수행하여, 숙주세포에서 이식된 세포로의 α-시뉴클린의 전달을 분석하였다. 이식된 SH-SY5Y 세포들은 α-시뉴클린을 과발현하지 않고, 단지 소량의 내생적 α-시뉴클린만을 발현하는데, 이는 보통의 면역학적 검출 프로토콜에서는 거의 나타나지 않는다 (도 7a-c). 본 발명자들은 숙주-유래 α-시뉴클린이 정상 SH-SY5Y 세포에서 보다 SH-GBA1-/- 세포에서 더 높은 비율로 축적됨을 밝혀내었다 (도 7a-c). 또한 공동-면역형광 분석은 SH-GBA1-/- 세포들이 정상 SH-SY5Y 세포들 보다 더 높은 수준으로 숙주-유래 α-시뉴클린을 축적시킴을 나타내었다 (도 7d, e). SH-SY5Y 세포들은 내생적 α-시뉴클린을 낮은 수준으로 발현하긴 하지만, 본 발명자들이 이식된 SH-SY5Y 세포에서 내생적 α-시뉴클린의 발현을 검출하는데 실패했음에 주목해야 한다 (도 7a-c). SH-SY5Y 세포들은 도파민을 포함하는, 카테콜아민(catecholamines)을 생산하는 인간 섬유아세포이다. 본 발명의 분석이 이식된 세포들에 특이적이라는 것을 확증하기 위해, 티로신수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)에 대한 면역염색을 수행하였으며, 숙주-유래 α-시뉴클린의 수준이 TH-양성 이식된 SH-SY5Y 세포에서 보다 TH-양성 이식된 SH-SY5Y GBA1-/- 세포에서 더 높음을 밝혀내었다 (도 7f, g). 해마에는 TH-양성 섬유질(fibers)이 있긴 하지만, TH-양성 세포들은 없다. 따라서 해마에서 TH-양성 세포들은 이식된 세포들을 나타낸다. 또한 본 발명자들은 분화된 SH-SY5Y 세포들이 렌티바이러스 감염을 통해 eGFP(enhanced green fluorescence protein)로 태그되고 TH를 위해 공동-표지된 대조군 실험을 수행하였다. in vitro에서 eGFP-양성 세포들의 대략 95%가 TH-양성임을 밝혀내었다. 마찬가지로, 마우스 해마(n=5)에서 이식된 SH-SY5Y-eGFP 세포들의 약 80%는 TH-양성이었다 (도 20).
<실시예 2>
C. elegans 모델의 제작 및 이를 이용한 α-시뉴클린의 세포간 전이 측정
실험재료 및 방법
실시예 2-1. 실험균주 및 배양
모든 균주들은, 대장균 균주 OP50의 세균층(a lawn of E. coli)을 포함하는 선충 성장배지(nematode growth medium, NGM) 플레이트에서 20℃로 표준 절차에 따라 취급하였다(Brenner, S. 1974. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics 77, 71-94). 야생형 Bristol N2 및 돌연변이 균주 unc-119(ed3), dyn-1(ky51), 및 asp-4(ok2693)는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC, University of Minnesota, St. Paul, MN)로부터 구하였다. 돌연변이 균주 asp-1(tm666)는 C. elegans National BioResource Project (NBRP, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokyo, Japan)에서 제공받았다. 돌연변이 균주 daf-2(e1370) 및 daf-16(mu86)는 김규형 교수(DGIST, Daegu, Korea)로부터 제공받았다.
실시예 2-2. C. elegans 용 플라스미드 제작
V1S 및 SV2 주형(template) 플라스미드는 Dr. Pamela McLean (Massachusetts General Hospital, Boston, USA)으로부터 제공받았다.
1) Pmyo-2::EGFP
야생형 N2 선충(worms)으로부터 얻은 게놈(genomic) DNA로부터 myo-2 프로모터(Pmyo-2)를 PCR 증폭하였다. HindIII 부위를 포함하는 센스(sense) 프라이머, 5′-GACAAGCTTGGGGTTTTGTGCTGTGGACGTT-3′(서열번호 6) 및 BamHI 부위를 포함하는 안티센스(anti-sense) 프라이머, 5′-GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-3′(서열번호 7)를 사용하였다. Pmyo-2::EGFP는 상기 PCR 산물을 pFX_EGFPT 벡터(Gengyo-Ando et al., 2006)의 HindIII 및 BamHI 부위에 삽입하여 제작하였다.
2) Pmyo-2::α-synuclein(Myc)
SalI 부위를 포함하는 센스 프라이머, 5′-AGCGTCGACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-3′(서열번호 8), 및 myc 표지(tag) 서열과 BglII 부위를 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-AGCAGATCTCTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTG-3′ (서열번호 9)를 사용하여, pcDNA3.1 MycHis α-시뉴클린 벡터(ref)로부터 myc 표지된 사람 α-시뉴클린을 증폭하였다. Pmyo-2::EGFP의 EGFP 단편을 상기 PCR-증폭시킨 myc 표지된 사람 α-시뉴클린 단편으로 치환하여 Pmyo-2::α-synuclein(Myc)을 제작하였다.
3) Pmyo-2::V1S
SalI 부위를 포함하는 센스 프라이머, 5′-AGCGTCGACGCCACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-3′(서열번호 10) 및 BglII 부위를 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-AGCAGATCTTTAGGCTTCAGGTTCGTAGTC-3′(서열번호 11)를 사용하여 V1S를 증폭시켰다. 또한, Pmyo-2::EGFP의 EGFP 단편을 PCR 증폭시킨 V1S 단편으로 치환하여 Pmyo-2::V1S를 제작하였다.
4) Pflp-21::SV2
pFX_EGFPT 의 EGFP 단편을 PCR-증폭시킨 SV2 단편으로 치환하여 SV2 벡터를 만들었다. SpeI 부위를 포함하는 센스 프라이머, 5′-AGCACTAGTGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGG-3′(서열번호 12) 및 BglII 부위를 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′(서열번호 13)를 사용하였다. flp-21 프로모터(Pflp-21)를 N2 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하고, SV2 벡터의 KpnI 및 SalI 부위에 서브클론(subcloned)하여, Pflp-21::SV2 를 제작하였다. KpnI 부위를 포함하는 센스 프라이머, 5′-AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-3′(서열번호 14) 및 SalI 부위를 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-AGCGTCGACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-3′(서열번호 15)를 사용하여 flp-21 프로모터를 증폭하였다.
5) Pflp-21::SV2-ICR-DsRed
인두 뉴런 마커(pharyngeal neuronal marker)로서 DsRed를 공동-발현(co-expressing)하는 SV2 벡터를 만들기 위해, Pflp-21 을 pFX_DsRedxT 벡터(Gengyo-Ando, K., et al. 2006. An efficient transgenic system by TA cloning vectors and RNAi for C. elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun 349, 1345-1350)의 KpnI 및 SalI 부위에 서브클론하고, Pflp-21::DsRed 로 명명하였다. N2 로부터 PCR-증폭시킨 ICR (intercistronic region)을 SV2 와 DsRed 사이에 위치시킴으로써 flp-21 프로모터 하에서 SV2 및 DsRed을 공동-발현시켰다(Lee, L.W., et al. 2010a. Vectors for co-expression of two genes in Caenorhabditis elegans. Gene 455, 16-21). SV2 단편을 융합(fusion) PCR로 ICR 영역에 융합시키고(Hobert, O. 2002. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. BioTechniques 32, 728-730), Pflp-21::DsRed 에 서브클론하여 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 를 제작하였다. SalI 부위를 포함하는 센스 프라이머, 5′-AGCGTCGACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-3′(서열번호 16) 및 ICR 과의 중복(overlapping) 영역을 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC-3′(서열번호 17)를 SV2에 대한 PCR 반응에 사용하였다. SV2와의 중복 영역을 포함하는 센스 프라이머, 5′-GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAATCATCG-3′(서열번호 18) 및 SpeI 부위를 포함하는 안티센스 프라이머, 5′-AGCACTAGTTACCCTGTAATAATATATTAAAC-3′(서열번호 19)를 사용하여 ICR 영역을 증폭하였다.
실시예 2-3. BiFC 형질전환 선충 모델의 제작
후기 L4-기(late L4-stage) N2 선충의 생식선(gonads)에 Pmyo-2::V1S 및 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 플라스미드를 선별마커인, 돌연변이 콜라겐 유전자 rol-6(su1006)를 발현하는(Mello, C.C., et al. 1991. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO J 10, 3959-3970), pRF4 와 함께 동시-주입(co-injected)하여, 상기 BiFC 쌍(pair)을 발현하는 이중 형질전환 계통(double transgenic line)을 만들었다. BiFC 에 대한 음성 대조군으로, pRF4와 함께 Pmyo-2::V1S를 단독으로 주입한 N2 선충과, unc-119(+) 유전자를 발현하는 선별마커인 pCFJ151 (Frokjaer-Jensen, et al. 2008. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet 40, 1375-1383)와 함께 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed를 단독으로 주입한 unc-119(ed3) 돌연변이 선충을 제작하였다. QuickChange Site-Directed Mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여, Pmyo-2::V1S에서 α-시뉴크린 코딩 서열 바로 앞에 정지 코돈을 삽입하여, BiFC 부분 서열만을 발현하는 플라스미드 Pmyo-2::V1을 제작하였다. 그 후 Pmyo-2::V1 및 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 플라스미드를 pRF4와 함께 N2에 동시-주입(co-injected)하였다. 또한, 뉴런에서의 일반적인 단백질 과발현에 대한 대조군으로, pRF4와 함께 Pflp-21::DsRed를 N2에 주입하였다. 도입된 플라스미드들의 염색체 삽입(chromosomal integration)을 위하여, 삽입된 형질전환 계통(injected lines)에게 UV를 조사하였다. UV 조사 후에, 각각의 삽입된 형질전환 계통(integrated line)을 N2와 4차례 이종교배하였다. Pmyo-2::V1S 삽입 형질전환 계통과 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 삽입 형질전환 계통을 교배시켜 Pmyo-2::V1S 와 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed를 갖고 있는 이중 형질전환 계통을 제작하였다. 상기 형질전환 선충들은 모두 롤러 형(roller phenotype)을 나타냈으며, 인두 뉴런(pharyngeal neurons)에서 DsRed 형광을 발현하였다.
실시예 2-4. 비표지된(untagged) α-시뉴클린 모델의 제작
QuickChange Site-Directed Mutagenesis 키트를 이용하여, α-시뉴클린 코딩 서열 바로 뒤에 정지 코돈을 삽입하여, α-시뉴클린만을 발현하는 Pmyo-2::α-synuclein 및 Pflp-21::α-synuclein 플라스미드를 제작하였다. 음성 대조군으로, pRF4와 함께 Pmyo-2::α-시뉴클린을 단독으로 주입한 N2 선충을 만들었다. 후기 L4-기(late L4-stage) N2 선충의 생식선(gonads)에 pRF4와 함께 Pmyo-2::α-synuclein 및 Pflp-21::α-synuclein 플라스미드를 동시-주입(co-injected)하였다. 상기 선충들은 모두 롤러 형(roller phenotype)을 나타냈으며, 각 유전자형(genotype)에서 대표적인 3개의 형질전환 계통(transgenic lines)을 실험에 사용하였다.
실시예 2-5. 노화(aging) 관련 BiFC 모델의 제작
후기 L4-기의 daf-2(e1370) 및 daf-16(mu86) 돌연변이 선충의 생식선에 Pmyo-2::V1S 및 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 플라스미드를 pRF4 와 함께 동시-주입하였다. 노화 관련 BiFC 모델의 대조군으로, Pmyo-2::V1S 또는 Pflp-21::SV2::ICR::DsRed을 단독으로 후기 L4-기의 N2 및 daf-16(mu86) 돌연변이 선충의 생식선에 pRF4 와 함께 주입하였다. 도입된 플라스미드를 포함하는 여러 형질전환 계통(transgenic lines)을 얻은 후에, 각각의 돌연변이 백그라운드(background)에서 3개의 대표적인 계통을 실험에 사용하였다.
실시예 2-6. hlh-30 형질전환 계통의 제작
hlh-30p::hlh-30::gfp 를 발현하는 플라스미드를 Sanford-Burnham Medical Research Institute (CA, USA)의 Dr. Malene Hansen로부터 입수하였다. 상기 플라스미드 hlh-30p::hlh-30 은 QuickChange Site-Directed Mutagenesis 키트를 사용하여 GFP 코딩 서열 앞에 코돈을 삽입시켜 GFP 발현을 저해하도록 설계되었다. 대조군으로, 각각의 Pmyo-2::V1S 또는 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 와, hlh-30p::hlh-30 을 후기 L4-기의 N2 선충의 생식선에 pRF4 와 함께 동시-주입하였다. Pmyo-2::V1S, Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 및 hlh-30p::hlh-30 을 발현하는 플라스미드를 후기 L4-기의 daf-16(mu86) 돌연변이 선충의 생식선에 pRF4 와 함께 동시-주입하였다. 리소좀의 기능장애를 분석하기 위하여, 리소좀 효소인 카텝신(cathepsin)의 유전자가 불활성화된 asp-4(ok2693) 및 asp-1(tm666) 돌연변이 선충을 사용하였다. Pmyo-2::V1S 및 Pflp-21::SV2-ICR-DsRed 플라스미드를 후기 L4-기 돌연변이 선충의 생식선에 pRF4 와 함께 동시-주입하였다. 삽입된 플라스미드를 포함하는 형질전환 계통을 얻은 후에, 각 유전자형(genotype)에서 대표적인 3개의 형질전환 계통을 실험에 사용하였다.
실시예 2-7. 면역형광현미경 관찰(Immunofluorescence microscopy)
선충들에 대한 면역형광 염색을 위해, 야생형 N2 및 형질전환 선충들을 수집하고, M9 버퍼(22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4)로 세척한 뒤, MRWB (80 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 mM EGTA, 5 mM spermidine, 50% methanol)에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 전-고정(pre-fixed)시켰다. 침투를 위해 큐티클(cuticle) 층의 강도를 약화시키기 위하여, 액체 질소를 이용하여 선충들에게 여러 사이클의 냉동/해동(freeze/thaw)을 가하고, 4 ℃에서 2시간 동안 교반하면서 배양하였다. 환원 및 산화 과정은 선충의 투과성을 증가시키기 때문에, 선충들을 Tris-Triton 버퍼[100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% Triton X-100, 1 mM EDTA]로 세척하고, Tris-Triton 버퍼에서 1% 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 선충들을 콜라게나아제(collagenase) 용액 [100 mM Tris-HCl (pH 7.4) 내 100유닛의 collagenase type IV, 1 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100]에서 4시간 동안 실온으로 회전시키면서 배양하였다. 그 후 선충들을 0.3% 과산화수소(H2O2)를 첨가한 Tris-Triton 버퍼에서 15분간 실온으로 배양하였다. 블록킹 버퍼(1% BSA, 0.5% Triton X-100, 1 mM EDTA in PBST)에서 배양한 후에, 선충들을 1차 항체 용액(1% BSA, 0.5% Triton X-100, 1 mM EDTA in PBS)에서 모노클로날 항체, 274mAb (Lee et al., 2011)와 함께 4 ℃로 밤새(overnight) 배양하였다. 그 다음 날, 선충들을 블록킹 버퍼로 세척하고 로다민 레드 X-결합 염소 항-마우스 IgG (rhodamine red X-conjugated goat anti-mouse IgG) (Jackson Immunoresearch Laboratories, West grove, PA, USA)와 함께 2시간 동안 배양하였다. 그 후 선충들을 블록킹 버퍼로 세척하고, Antifade 시약(Invitrogen, Eugene, OR, USA)에 고정시켰다. 샘플들은 Olympus (Tokyo, Japan) FV1000 공초점 레이져-스캐닝 현미경을 사용하여 분석하였다.
실시예 2-8. 싱글-웜(single-worm) PCR.
각 계통(line)의 임신한 단일 선충(single worm)을 0.1 mg/ml proteinase K (Sigma)와 함께 용해 버퍼(50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 2.5 mM MgCl2, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20)로 용해시켰다. 액체 질소를 이용하여 버퍼 안의 단일 선충에 여러 사이클의 냉동-해동(freeze-thaw) 처리를 하고, 65℃에서 1시간 동안 배양하여 게놈 DNA를 방출시킨 후, 95 ℃ 로 15분간 가열하여 proteinase K를 불활성화시켰다. 싱글-웜 PCR 분석은 Ex Taq™ 중합효소(Takara Shuzo Co. Ltd, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2-9. PCR-RFLP 유전형 분석(genotyping)
각 계통으로부터 임신한 5마리의 선충을 0.1 mg/ml proteinase K와 함께 용해 버퍼에서 용해시켰다. 액체 질소를 이용하여 버퍼 안의 단일 선충에 여러 사이클의 냉동-해동(freeze-thaw) 처리를 하고, 65℃에서 1시간 동안 배양하여 게놈 DNA를 방출시킨 후, 95 ℃ 로 15분간 가열하여 proteinase K를 불활성화시켰다. PCR을 수행한 후에, PCR 산물을 NcoI 효소(New England Biolabs Inc., MA, USA)로 37 ℃에서 밤새(overnight) 절단하고, RFLP를 검출하기 위해 전기영동하였다.
실시예 2-10. dyn-1 돌연변이의 열-충격 처리(heat-shock treatment)
이중 형질전환된 선충들(Pmyo-2::V1S + Pflp-21::SV2-ICR-DsRed)을 dyn-1(ky51) 돌연변이 선충과 교배시켰다(Clark, S.G., et al. 1997. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94, 10438-10443). dyn-1(ky51) 돌연변이를 갖거나 갖지 않은, 이중 형질전환 계통의 어미 성충(adult worms)을 E. coli OP50을 포함하는 NGM 플레이트에서 4시간 동안 20 ℃로 배양하여 알을 낳게 한 후 제거하였다. 관찰을 위하여 L4-기의 각 균주의 동기(synchronized) 자손들을 30 ℃에서 배양하였다.
실시예 2-11. 살아 있는 선충에 대한 형광 현미경 관찰
선충들을 M9 버퍼에서 10 mM 아지드화 나트륨(sodium azide)으로 고정시키고, 2% 아가 패드(agar pads)에 올린 후, 커버슬립(coverslip)으로 덮었다. Olympus FV1000 공초점 레이져 스캐닝 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 선충들의 이미지를 얻었다.
실시예 2-12. 수명 측정
어미 성충(adult worms)이 낳은 알들을, E. coli OP50을 접종한 NGM 플레이트에서 20℃로 L4 유충기까지 동시에 키웠다. L4-기 선충들을 100 mM 5-플루오로-2′-디옥시유리딘(5-fluoro-2′-deoxyuridine) (Sigma)을 함유한 NGM 플레이트로 옮겨 자손번식을 막았다. 살아 있거나 죽은 선충의 수를 매 1-2일마다 기록하였다.
실시예 2-13. 인두 펌핑 분석(pharyngeal pumping analysis)
인두 펌핑(pharyngeal pumping)은 형광 현미경을 사용하여 실온에서 1분간 측정하였다. 각 균주로부터 25마리의 선충을 분석하였다. 데이터는 PPM (Pumps Per Minute)으로 표현하였다.
실시예 2-14. 항-노화제(anti-aging agent) 처리
GlcNAc (N-acetylglucosamine) (Sigma)을 증류수에 용해시켜 1 M의 보관용액(stock solution)을 만들었다. 보관용액을 LB 액체 배지로 희석시켰다. 각 형질전환 계통의 L4-기 선충을 최종 농도 10 mM의 GlcNAc를 함유한 NGM 플레이트로 옮겼다.
실시예 2-15. 웨스턴 블랏팅
성충을 M9 버퍼와 1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 연속적으로 세척하였다. 선충 펠렛(pellet)을 1% Triton X-100, 1% (v/v) 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) (Sigma)을 함유한 PBS 안에서 초음파 분해하고, 원심분리하여 트리톤-용해성(Triton-soluble) (상층액) 및 비용해성 (펠렛) 분획을 얻었다. 단백질 농도는 BCA 단백질 어세이 키트(Pierce, Rockford, USA)를 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플(α-시뉴클린 발현 테스트를 위해 3 ㎍, 및 폴리유비퀴틴(polyubiquitin) 단백질 검출을 위해 50 ㎍)을 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 웨스턴 블랏팅에 사용하는 1차 항체들은 모노클로날 항-알파-시뉴클린 항체(monoclonal anti-α-synuclein antibody), 274mAb 및 항-유비퀴틴 항체(anti-ubiquitn antibody) (ab7254; Abcam, Cambridge, MA)였다. 화학발광(chemiluminescence) 검출은 LAS-3000 luminescence image analyzer (Fujifilm, Tokyo, Japan), 및 Multi Gauge (v3.0) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
실시예 2-16. 닷 블랏팅(Dot blotting)
각 균주의 성충들을 M9 버퍼와 1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 연속적으로 세척하였다. 선충 펠렛(pellet)을 1% Triton X-100, 1% (v/v) 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) (Sigma)을 함유한 PBS 안에서 초음파 분해하였다. 단백질 샘플(500 ng)을 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막에 로딩하고, 건조시키고 블록킹 용액에서 배양하였다. 닷 블랏팅에 사용된 1차 항체들은 모노클로날 항-알파-시뉴클린 항체 274mAb 및 Syn-O2 이며, 후자의 경우 응집된 α-시뉴클린에 특이적인 항체이다. 화학발광(chemiluminescence) 검출은 LAS-3000 luminescence image analyzer 및 Multi Gauge (v3.0) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
실시예 2-17. qPCR (Quantitative PCR).
hlh-30p::hlh-30 발현을 나타내거나 나타내지 않는 daf-16(mu86) 돌연변이로부터 유래한 형질전환 성충을 수집하고, M9 버퍼로 세척하였다. 버퍼 내의 선충들을 초음파 분해하고, 액체 질소를 이용하여 샘플들에 여러 사이클의 냉동-해동 처리를 하였다. Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 RNA를 추출하고, RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, California, USA)를 사용하여 정제하였다. iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 500 ng의 총 RNA로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. 실시간(real-time) PCR을 위하여, 표적 유전자 및 특정 프라이머들을 SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Shiga, Japan)와 함께 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 상기 특정 프라이머들은 이전에 다른 연구그룹에 의해 설계된 것을 사용하였다(Lapierre, L.R., et al. (2013). The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nat. Commun 4, 2267). The DNA products were analyzed using the 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA). 표적 유전자들의 상대적인 mRNA 수준을 act-1 에 대해 표준화하였다.
실시예 2-18. 통계분석
모든 실험들은 블라인드 코드화(blind-coded)화여 수행하였으며, 적어도 3반복을 수행하였다. 측정값들은 평균±S.E.M 으로 나타내었다. p 값이 < 0.05인 경우 편차를 유의적인 것으로 간주하였다. 그래프는 Prism 5 소프트웨어(Graphpad Software Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 도시하였다. 수치들은 InStat (version 3.05) 소프트웨어(Graphpad Software Inc.)를 사용하여 Tukey's post-hoc 테스트와 함께 일방향(one-way) ANOVA로 분석하였다.
실험결과
실험결과 2-1. 시뉴클린 전이 분석용 C. elegans 모델의 제작 및 특성 분석
세포간(cell-to-cell) 단백질 전이를 간편하게 분석할 수 있는 동물 모델을 개발하기 위하여, 본 발명자들은 황색형광단백질의 변이체인 비너스(Venus)의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 α-시뉴클린을 발현하는 C. elegans 형질전환 계통을 제작하였다 (도 23A). 비너스의 N-말단 부분(V1)을 α-시뉴클린의 N-말단(V1S)에 붙이고, 비너스의 C-말단 부분(V2)을 α-시뉴클린의 C-말단(SV2)에 붙였다. C. elegans 모델에서, V1S 는 myo-2 프로모터(Pmyo-2)를 사용하여 인두근(pharynx muscle)에서 발현되도록 하였으며, SV2 및 DsRed 는 flp-21 프로모터(Pflp-21)를 사용하여 인두에 연결된 뉴런에서 동시-발현(co-expressed)되도록 하였다 (도 23B). 상기 전이유전자(transgene)들의 존재 및 발현은 싱글-웜(single-worm) PCR 과 항-α-시뉴클린 항체 Ab274를 사용한 면역형광분석으로 확인하였고 (도 28 A-D), 그 결과 의도한 세포 유형에서만 단백질들이 특이적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
Pflp-21 의 발현 패턴은 공지된 문헌(Rogers, C., et al. 2003. Inhibition of Caenorhabditis elegans social feeding by FMRFamide-related peptide activation of NPR-1. Nat. Neurosci 6, 1178-1185)에 잘 기술되어 있는데, 본 발명의 일실시예에서 사용된 flp-21 프로모터 활성에 대한 마커(Ds-Red) 역시 동일한 발현 패턴을 나타냈으며, 여기에는 ADL, ASE 및 ASH 감각 뉴런(sensory neurons), URA 운동 뉴런(motor neurons), MC, M2 및 M4 인두 뉴런(pharyngeal neurons), 및 장(intestine)에서의 발현이 포함된다 (도 28 E).
V1S 또는 SV2의 단독 발현으로는 BiFC 형광이 생성되지 못한다. 그러나 양 제작물(construct)을 공동으로 주입(coinjection)하면 인두근(pharyngeal muscle)과 인접 뉴런들 모두에서 강한 BiFC 형광이 생성되며, 후자에 DsRed 표지를 하였다 (도 23 C 및 D; 도 28 E 및 G). 실험 결과는 단백질 전이가 양 방향에서 일어난다는 것을 보여준다. Pflp-21::SV2-DsRed 와 Pmyo-2::V1 (α-시뉴클린 유전자가 없음)의 공동발현은 BiFC 신호를 생성하지 않았으며 (도 23 C 및 D; 도 28E), 이는 상기 신호가 비너스 단편들 사이의 비특이적 상호작용으로 인한 것이 아니라는 것을 보여준다. BiFC 시스템의 특이성을 실험하기 위하여, 본 발명자들은 Pmyo-2::V1Q25 + Pflp-21::SV2-DsRed 계통(line)을 제작하였다. 이 형질전환 선충은 뉴런에서, myo-2 프로모터의 조절을 받는 25 글루타민 가지(glutamine stretch)를 가진 헌팅턴 엑손 1(huntingtin exon 1)과, SV2를 발현한다. 이 선충들은 인두근(pharyngeal muscle) 또는 뉴런에서 BiFC 신호를 나타내지 않았다 (도 23D; 도 28E). 이러한 결과는 상기 본 발명의 BiFC 형질전환 선충이 α-시뉴클린 전이에 대해 특이적이라는 것을 보여준다.
또한, 본 발명자들은 V1S와 SV2-DsRed를 각각 발현하는 삽입된 형질전환 계통(integrated transgenic lines)을 수립하고, 이들을 교배시켜 삽입된 이중 형질전환 계통(integrated double transgenic line)을 만들었다. 예상대로 V1S 또는 SV2-DsRed 삽입 계통 모두 BiFC 형광을 만들지 못한 반면, 삽입된 이중 형질전환 계통은 인두근과 인접 뉴런들 모두에서 강한 BiFC 형광을 생성하였다 (도 28 F 및 H). 따라서, 상기 C. elegans BiFC 시스템은, 인접한 세포들에서 유래한 α-시뉴클린 단백질들 사이의 단백질의 이동 및 공동응집(co-aggregation) 모두를 정확히 정량적으로 실시간 분석할 수 있는 생체 내(in vivo) 모델로 사용될 수 있다.
한편, BiFC 형광은 선충이 성숙(노화)함에 따라 증가하였고 (도 23 E 및 F), 더 성숙한(older) 동물들은 응집된 BiFC 신호를 나타낸 반면, 더 어린 동물들은 주로 확산된 신호 패턴을 나타냈다 (도 23 E). 이러한 결과는 α-시뉴클린 전이가 연속적인 프로세스이며, 축적된 응집체(aggregates)가 이후에 더 큰 봉입체(inclusions)를 만든다는 것을 보여준다.
본 발명자들은 URA 운동 뉴런으로부터 액손 프로세스(axonal processes)의 퇴화를 조사하였다(Rogers et al., 2003). 이 신경들은 8일째의 야생형 N2에서는 손상되지 않은 상태였다. 뉴런에서 SV2의 발현은 신경 수포(neuritic bleb) 형성을 야기하며, 일부 선충에서는 신경분절화(nerve fragmentation)를 나타냈다 (도 23 G-K). 이는 뉴런에서 나타나는 α-시뉴클린의 자가(autonomous) 세포독성을 보여준다. 이러한 퇴행적 현상은 V1S 가 인두근에서 발현될 때 더욱 심화되었고, 약 15%의 신경이 완전히 상실되었다 (도 23K). 신경분절화(nerve fragmentation)를 확인하기 위하여, 신경 프로세스(nerve processes)의 이미지 스택(stacked images)에 대해 3차원 재건(3-D reconstruction)을 수행하였다. 그 결과 신경분절화 및 수포 형성을 명확히 확인할 수 있었으며 (도 23H), 이는 뉴런 생존에 미치는 비자가적 세포 효과(non-autonomous cellular effects)를 보여준다. 신경 퇴행현상은 형질전환 선충이 노화함에 따라 더욱 악화되었다 (도 23J).
α-시뉴클린 응집체의 전이에 의한 행동 변화를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 인두 펌핑 분석(pharyngeal pumping analysis)을 수행하였다. 야생형 N2의 펌핑 비율은 16일째까지는 크게 변화하지 않았다. 성숙한(old age) 선충의 인두근 및 인접 뉴런에서의 V1S 또는 SV2-DsRed의 단독 발현은 펌핑 비율을 약간 감소시켰다. 모든 단독 발현체들의 펌핑 비율은 13일째 상당히 감소하였다(도 23L; 표 1). 공동주입(co-injection) 및 이중 삽입된 계통은 펌핑 비율에 더 큰 감소를 나타냈으며, 그 변화는 2일째부터 뚜렷하였고, 시간이 지남에 따라 점진적으로 약화되었다 (도 23L; 표 1). 하기 표 1은 인두 펌핑 비율의 P 값이다.
Figure 112015086073824-pat00001
수명(longevity) 분석 결과, 단독 형질전환 동물들은 N2 야생형에 비해 약간 감소된 수명을 나타낸 반면, 이중 형질전환 동물의 수명은 단독 형질전환 계통에 비해 더 짧았다 (도 23M). 따라서, 응집체의 전이 및 봉입체(inclusion body) 형성은 퇴행성 형질과 관련이 있으며, 노화에 따라 더욱 진전된다는 것을 알 수 있다. 타임라인(timelines)을 비교해 보면, 개체의 죽음은 BiFC 신호의 축적, 신경 퇴화, 및 펌핑 능력의 감소에 의해 진행된다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과들은 BiFC 모델로서 같은 세포 유형에서 비표지된(non-tagged) α-시뉴클린을 발현하는 선충으로 재현하였으며 (도 28 I-L), 이는 BiFC 모델에서 관찰된 표현형이 α-시뉴클린에 기인한 것이라는 것을 보여준다.
실험결과 2-2. 노화 관련 유전인자들이 α-시뉴클린의 세포간 전이에 미치는 영향
본 발명자들은 노화의 진행이 응집체의 전이와 퇴행성 표현형에 미치는 영향을 조사하였다. BiFC α-시뉴클린 제작물(constructs)을 daf-2(e1370) 및 daf-16(mu86) 돌연변이에게 도입하였다 (도 29 A 및 B). daf-2(e1370)와 daf-16(mu86)은 노화에 따른 효과를 보여주는 모델로, daf-2(e1370) 돌연변이는 더 느려진 노화 진행(aging rate)과 연장된 수명을 나타내며, daf-16(mu86) 돌연변이는 야생형보다 더 빠른 노화 진행과 단축된 수명을 나타낸다(Kenyon, C., et al. 1993. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature 366, 461-464). daf-2(e1370); V1S+SV2 동물은 감소된 BiFC 신호 (도 24 A 및 B; 도 29D), 더 적은 수의 봉입체 (도 24 C 및 D; 도 29E), 더 적은 신경 퇴화 (도 24 E 및 F; 도 29 F 및 G), 향상된 펌핑 활동 (도 24G; 도 29H), 및 V1S+SV2 계통보다 연장된 수명 (도 24H; 도 29I)을 나타냈다. 반면에, daf-16(mu86); V1S+SV2 동물의 경우, BiFC-양성 봉입체들이 V1S+SV2 동물에서보다 훨씬 빨리(L4-기 2일째) 나타났다 (도 24 C 및 D; 도 29E). BiFC 신호 자체는 V1S+SV2에서 보다 daf-16(mu86); V1S+SV2에서 더 낮았으며 (도 24B; 도 29D), 이는 아마도 봉입체가 이른 시기에 튼튼하게 형성되었기 때문인 것으로 보인다. daf-16(mu86); V1S+SV2 동물들은 더 심한 신경 퇴화현상 (도 24 E 및 F, 및 도 29 F 및 G), 더 감소된 펌핑 활동 (도 24G; 도 29H), V1S+SV2 동물보다 더 단축된 수명 (도 24H; 도 29I)을 나타냈다. 각 유전자형에 대한 3개의 독립적 계통에서 유사한 결과들이 관찰되었다. 이러한 결과들은 노화가 생체 내에서 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 및 관련된 퇴화 현상의 속도를 조절하는 주된 요인이라는 것을 보여준다.
실험결과 2-3. 항-노화제 처리가 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이에 미치는 영향
본 발명자들은 항-노화제(anti-aging agent)인 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc) (Denzel, M.S., et al. 2014. Hexosamine pathway metabolites enhance protein quality control and prolong life. Cell 156, 1167-1178)이 응집체 전이에 미치는 효과를 측정하였다. GlcNAc를 V1S+SV2 및 daf-16(mu86); V1S+SV2 동물에 투여하였을 때, 양 동물 모두에서 BiFC-양성 봉입체의 형성이 감소하였고 (도 25 A 및 B), 신경퇴화를 나타내는 표현형이 상당히 개선되었으며 (도 25 C-F), 펌핑 활동이 증가하고 (도 25G), 수명 연장 효과 (도 25H)가 나타났다. 이러한 결과들은 항-노화제의 처리가 시뉴클린의 축적에 의해 나타나는 퇴행성 신경질환(synucleinopathy)의 진전을 늦출 수 있다는 것을 보여준다.
실험결과 2-4. 항-노화제 처리가 폴리유비퀴틴화된(polyubiquitinated) 단백질의 정상 수준(steady-state level)에 미치는 영향
응집체 수준의 변화에 관한 현미경 관찰 결과를 확인하기 위하여, 베타-시트-리치 알파-시뉴클린 멀티머(β-sheet-rich α-synuclein multimers) (Syn-O2)에 특이적인 항체로 닷 블랏(dot blot) 분석을 수행하였다. BiFC 봉입(inclusion) 분석 결과와 일치하게, 닷 블랏 분석 결과 daf-2 돌연변이 및 GlcNAc에 의해 베타-시트-리치 알파-시뉴클린 응집체가 감소한 반면, daf-16 돌연변이는 응집체를 증가시켰다 (도 26 A 및 B). 나아가, 항-노화제 처리는 형질전환 선충의 트리톤(Triton)-불용성 (Tx-insol) 분획에서 고분자량(HM) α-시뉴클린 응집체의 수준을 상당히 감소시켰다 (도 26 C 및 D).
노화는 단백질 항상성(homeostasis)을 점진적으로 감소시킨다(Denzel et al., 2014; Lapierre et al., 2013). 따라서 본 발명자들은, 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(ubiquitin-proteasome system) 및 오토파지(autophagy)와 같은 주요 단백질 분해 시스템의 활성을 나타내는, 폴리유비퀴틴화된(polyubiquitinated) 단백질들의 정상 수준(steady state level)을 조사하였다. 그 결과, daf-16 형질전환 동물에서는 폴리유비퀴틴화된 단백질들의 수준이 증가한 반면, daf-2 형질전환 동물에서는 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 26E; 도 31A). 이와 유사하게, GlcNAc를 처리한 경우에는 폴리유비퀴틴화된 단백질의 수준이 감소하는 것을 확인하였다 (도 26F; 도 31B). 이러한 결과들은 시뉴클린의 축적에 의해 나타나는 퇴행성 신경질환(synucleinopathy)의 진전에 미치는 노화 및 항-노화 처리의 효과가 단백질 분해 시스템 능력(capacity)의 변화에 의해 매개된다는 것을 보여준다.
실험결과 2-5. α-시뉴클린 전이의 엔도리소좀(endolysosomal) 경로
세포 모델을 사용한 이전 연구에서 세포간 α-시뉴클린 전이가 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 매개되며, 전이된 단백질들이 리소좀에 전달되어 분해된다는 사실이 알려졌다(Hansen, C., et al. 2011. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J. Clin. Invest 121, 715-725; Desplats, P., et al. 2009. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-toneuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 13010-13015). V1S+SV2 는 다이나민(dynamin) 돌연변이, dyn-1(ky51)에 도입되었으며(Clark, S.G. et al., 1997. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94, 10438-10443), BiFC 형광은 야생형에 비해 상당히 감소되었다 (도 27 A 및 B). dyn-1(ky51) 형질전환 동물에서의 BiFC 신호 감소는 2일째보다 5일째 더 크게 나타났으며, 이는 상기 효과가 누적적이라는 것을 보여준다. 상기 실시예 1과 본 발명자들의 이전 연구 결과에 따르면, 리소좀 기능은 α-시뉴클린 전이 과정에서 "씨드(seeds)"를 제거하는데 중요하며, 리소좀의 기능이상은 응집체 전이의 증가를 초래한다. 이러한 결과들과 일치하게, V1S+SV2를 카텝신(cathepsin) 유전자의 돌연변이체인 asp-4(ok2693) 및 asp-1(tm666) 돌연변이(Syntichaki, P., et al., 2002. Specific aspartyl and calpain proteases are required for neurodegeneration in C. elegans. Nature 419, 939-944)에 도입하였을 때, BiFC 형광이 두 돌연변이 모두에서, 종종 봉입체 형태로, 상당히 증가하였다 (도 27 C-E; 및 도 31 D 및 E). 이러한 결과는 동물을 연령-의존적 응집체 전달로부터 보호하는데 리소좀 반응이 결정적 역할을 한다는 것을 보여준다. 이러한 해석과 일치하게, GlcNAc 처리는 오토파지(autophagy)와 관련된 유전자인 sqst-1/p62 뿐만 아니라 리소좀 유전자들의 발현을 증가시켰다 (도 26 G 및 H). 추가로 이는 asp-4(ok2693); V1S+SV2 및 asp-1(tm666); V1S+SV2 선충에 GlcNAc을 처리한 상위성(epistasis) 분석에 의해서도 검증되었다. V1S+SV2 선충과는 달리, asp-1 및 asp-4 돌연변이 동물들에서 노화-관련 형질들은 GlcNAc 처리에 의해 복구되지 않았다 (도 27 F 및 G).
실험결과 2-6. 항-노화제 처리가 응집체 전이에 미치는 영향과 증가된 리소좀 기능과의 연관성
응집체 전달에 대한 보호에 있어서 리소좀의 역할을 확인하기 위해, 리소좀 발생(biogenesis)의 핵심 조절 전사인자인 TFEB의 오솔로그(ortholog)인 hlh-30 을 과발현하는 hlh-30 형질전환 계통을, hlh-30p::hlh-30 벡터를 daf-16(mu86); V1S+SV2 형질전환 동물에 도입하여 제작하였다(Lapierre et al., 2013; Sardiello, M., et al. 2009. A gene network regulating lysosomal biogenesis and function. Science 325, 473-477). 리소좀 및 오토파지 유전자들에 더하여, HLH-30에 대한 하위의(down-stream) 표적 유전자들은 대사, 세포사멸(apoptosis), 및 신호전달(ref)과 관련된 유전자들을 포함한다. daf-16(mu86); V1S+SV2 동물에서 hlh-30p::hlh-30 의 발현은, sqst-1, asp-1와 같은 오토파지(autophagy)-관련 및 리소좀 유전자의 유도를 증가시켰으며 (도 27H), α-시뉴클린 응집체의 형성 (도 27I)과 폴리유비퀴틴화된 단백질들의 정상 수준 (도 27J; 도 31C)을 감소시켰다. 이는 단백질 분해 능력의 회복을 의미한다. hlh-30 형질전환 계통은 감소된 BiFC 신호 (및 이에 따른 감소된 응집체 전달)를 나타냈으며, 신경퇴화를 감소시키고, 펌핑 비율을 증가시켰으며, 수명을 연장시켰다 (도 27 K-R; 도 32 L-O).
실험결과 2-7. 세포-자율적(cell-autonomous) 응집 vs. 세포간 전이
상기 실험결과들은 세포간 응집체 전이와 세포-자율적(cell-autonomous) 응집의 차이를 나타내지 못하므로, 본 발명자들은 이를 밝히기 위해 N2 및 daf-16(mu86) 돌연변이 선충에서 V1S 또는 SV2를 단독으로 발현하는 네 개의 형질전환 계통을 제작하였다. 또한, V1S 또는 SV2 와 함께 hlh-30p::hlh-30 전이유전자를 과발현하는 두 개의 형질전환 선충들을 제작하였다. 발현 수준은 싱글 웜(single worm) PCR과 웨스턴 분석(V1S 계통의 경우) 또는 Ds-Red 형광(SV2 계통의 경우)으로 표준화하였다. 돌연변이 백그라운드(backgrounds)에서의 형질전환 선충들의 신경퇴화, 펌핑 활동 및 수명을 정상적인 유전적 백그라운드에서의 것들과 비교하였다. 그 결과 표현형질에서 유의적인 차이는 발견하지 못했으며(도 30 및 도 31 D-G), 이는 본 발명자들이 조사한 유전적 변형이 각각의 조직들에서 α-시뉴클린 응집에 큰 영향을 미치지 못했음을 의미한다.
또한, 본 발명자들은 N2 및 daf-16(mu86) 돌연변이 선충에서 V1S 또는 SV2를 단독으로 갖고 있는 단일 조직 발현 계통(single tissue expression lines)에 GlcNAc를 처리하고, 동일한 표현형에 대한 실험결과를 비처리 동물들의 것과 비교하였다. 전이 모델과 달리, 단일 조직 발현 계통은 GlcNAc 처리에 의해 병원성 형질에 큰 변화를 나타내지 않았다 (도 30 D-M). GlcNAc가 α-시뉴클린의 발현 수준에 미치는 영향을 조사하기 위해, 닷 블랏(dot blot)으로 α-시뉴클린의 수준을 측정하였다 (도 30 N-P). 그 결과 발현수준은 GlcNAc 처리에 의해 변화하지 않았다. 또한, 본 발명자들은 GlcNAc 처리에 의한 flp-21 프로모터의 뉴런 발현을 Ds-Red의 관찰을 통해 조사하였다. Ds-Red의 발현은 GlcNAc를 처리하거나 또는 처리하지 않거나 뉴런 세포에 엄격히 제한되었으며(도 30Q), 이는 위 처리가 프로모터의 세포-유형에 대한 특이성을 변화시키지 않는다는 것을 보여준다.
이러한 결과들은 본 발명에 사용된 항-노화 및 프로-리소좀(pro-lysosomal) 처리에 따른 효과가 세포간 응집체 전이에 미친다는 것을 보여준다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00322 20140826 한국세포주연구재단 KCLRFBP00323 20140826
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Dual-cell model system for measuring neuronal cell-to-cell protein transmission <130> NP14-1194 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Venus 1-158 amino acid <400> 1 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln 145 150 155 <210> 2 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Venus 159 to 239 amino acid <400> 2 Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp 1 5 10 15 Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly 20 25 30 Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser 35 40 45 Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu 50 55 60 Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 85 90 <210> 3 <211> 140 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 4 <211> 933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Venus1 linker alphaSyn fusion protein <400> 4 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagct gatctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcaaatcgat 480 ggtggcggtg gctctggagg tggtgggtcc cttaaggatg tattcatgaa aggactttca 540 aaggccaagg 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<210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 ggacgagctg tacaagtaat ctccaaaatc atcg 34 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 agcactagtt accctgtaat aatatattaa ac 32

Claims (15)

  1. 형광 단백질의 N-말단 단편과 α-시뉴클린(α-synuclein)이 융합된 제 1융합단백질을 발현하는 제 1세포; 및 상기 형광 단백질의 C-말단 단편과 α-시뉴클린이 융합된 제 2융합단백질을 발현하는 제 2세포를 포함하는 세포 또는 동물 모델 시스템을 이용한 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 측정방법으로서,
    상기 제 1세포와 제 2세포의 공동배양 또는 상기 제 1세포와 제 2세포를 모두 포함하는 동물모델의 배양을 통해 제 1세포와 제 2세포에서 각각 제 1융합단백질과 제 2융합단백질을 동시-발현시키는 단계; 및
    상기 제 1세포와 제 2세포에서, 상기 형광 단백질의 N-말단 단편과 C-말단 단편이 결합하여 발생하는 BiFC (bimolecular fluorescence complementation) 형광 신호를 정량적으로 검출함으로써, 인접한 세포들에서 각각 유래한 α-시뉴클린 단백질의 세포간 이동 및 공동응집(co-aggregation)을 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 동물 모델은 상기 제 1융합단백질을 인두근(pharynx muscle)에서 특이적으로 발현하고, 상기 제 2융합단백질을 인두에 연결된 뉴런에서 특이적으로 발현하도록 제작된 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 형질전환 모델인 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 측정방법은 KCLRF-BP-00322로 기탁된 형질전환 신경섬유아세포주를 제 1세포로, KCLRF-BP-00323으로 기탁된 형질전환 신경섬유아세포주를 제 2세포로 하는 세포 모델 시스템을 이용한 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1세포와 제 2세포를 배양용 배지에서 혼합한 후 계대배양(subculture)하는 단계; 및 계대배양물에서 BiFC-양성 세포의 비율을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 비너스(Venus) 단백질이며, 상기 제 1융합단백질은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 상기 제 2융합단백질은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제 1융합단백질은 myo-2 프로모터에, 상기 제 2융합단백질은 flp-21 프로모터에 각각 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제 2융합단백질은 flp -21 프로모터 활성에 대한 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제7항 중의 어느 한 항의 방법을 이용하여 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 세포 또는 동물 모델 시스템의 제 1세포 및 제 2세포에서 발현되는 후보 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 단계; 및
    상기 후보 유전자의 발현 수준의 변화에 따른 상기 BiFC 형광 신호의 변화를 측정함으로써 후보 유전자와 α-시뉴클린 응집체의 세포간 전이와의 관련성을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제7항 중의 어느 한 항의 방법을 이용하여 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 세포 또는 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;
    상기 시험 물질의 처리에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및
    상기 BiFC 형광 신호가 감소된 경우 시험 물질을 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 시험 물질의 처리에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계는 세포 또는 동물 모델의 노화(aging)에 따른 BiFC 형광 신호의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 세포 또는 동물 모델은 리소좀의 기능이 전부 또는 부분적으로 상실된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 후보 유전자는 노화와 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 시험 물질은 항-노화 활성을 갖는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 α-시뉴클린의 응집과 관련된 퇴행성 신경질환은 파킨슨병(Parkinson's disease)인 것을 특징으로 하는 방법.

  15. 삭제
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