KR101756809B1

KR101756809B1 - 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101756809B1
Application number: KR1020150082589A
Authority: KR
Inventors: 정지윤; 이해님; 장혜연
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2017-07-12
Also published as: KR20160147098A

Abstract

본 발명은 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
피세아타놀은 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 증가시키고, 항-세포자가사멸(anti-apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 감소시켜, 구강암 세포의 세포자가사멸을 유도할 수 있어 구강암 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물{Composition for treating oral cancer cell comprising Piceatannol as an active ingredient}

본 발명은 피세아타놀(Piceatannol)을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

의학의 발달로 기대수명은 늘어났지만 생활습관의 변화로 인해 암 또는 심장질환 등의 퇴행성 질환은 오히려 증가하고 있다. 특히, 우리나라 암발생자는 지속적으로 증가하는 것으로 나타나고 있다.

구강암은 전체 암 발생률 중에 약 2%로 매우 적은 비중을 차지하는 것으로 알려져 있으나, 구강암은 치료 후에도 저작 또는 발음 등의 구강 내 기능의 저하로 정상적인 음식물 섭취가 어렵고, 말하는 기능이 떨어지며 얼굴 외형의 변형 등 만성적인 후유증을 유발하여 환자의 삶에 치명적인 영향을 주는 것으로 보고되고 있다.

구강암의 생존율은 대략 50% 정도로서 악성종양으로 알려져 있으며, 편평상피암이 가장 흔하게 발병하고, 이외에도 구강점막의 작은 침샘에서 발생하는 타액선암, 턱뼈나 안면부의 근육 등의 연조직에서 발생하는 육종, 구강점막의 입천장, 볼점막, 잇몸 등에서 발생하는 악성흑색종, 드물게는 림프종 등의 형태로 발병하며, 최근 들어 과거에 비해 젊은 층의 환자가 증가하는 것으로 보고되고 있는데, 이는 서구화된 식습관과 흡연 및 음주의 증가가 그 원인으로 보고되고 있다.

종래에 암에 대한 치료방법으로는 항암요법과 함께 외과적 수술요법, 방사선요법, 화학요법 등이 있지만 심각한 부작용과 더불어 재발의 위험도 있는 것으로 알려져 있어, 최근에는 인체에 무해하고 부작용이 나타나지 않는 천연물에서 항암물질을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다.

일례로, 천연의 항암물질인 레스베라트롤(Resveratrol)은 레드와인, 포도, 땅콩 또는 블루베리 등에 많이 함유되어 있고 항암작용, 항산화 또는 항염증작용 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 심장질환 또는 신경퇴행성질환 등의 예방에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

상기 레스베라트롤은 다양한 유형의 암세포에 존재하는 CYP1BA1 효소에 의해 활성을 나타내기 시작하며, 피세아타놀(Piceatannol)로 전환된다.

피세아타놀(3',4',3,5-tetrahydroxy-trans-stilbene)은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 물질로서, 포도, 대황 또는 사탕수수 등에 풍부하게 들어있는 레스베라트롤의 유도체의 일종인 스틸벤 계열 물질의 한 종류이며, 등대풀속 식물(Euphorbia lagascae)에서 처음 분리 동정되었다.

[화학식 1]

종래의 연구에 의하면 상기 피세아타놀은 레스베라트롤보다 강력한 항산화제 또는 항부정맥제로 알려져 있으며, 핵인자 카파 B(nuclear factor kappa B, NF-κB)의 활성 억제를 통해 항염증 활성이 보고된 바 있다.

또한, 항산화 효과 또는 항염증 효과 이외에도 폐암, 위암, 전립선암, 유방암 또는 혈액암 등의 여러 암세포에서 항암효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다.

하지만, 다양한 암세포에서의 항암효과가 밝혀진 바에 비해 피세아타놀의 구강암세포에서의 항암효능은 보고된 바 없어, 피세아타놀을 구강암 치료에 이용할 수 있는 방법에 관한 연구가 필요하다.

Rimando AM, Kalt W, Magee JB, Dewey J, Ballington JR. 2004. Resveratrol, pterostilbene, and piceatannol in vaccinium berries. J Agric Food Chem 52: 4713-4719. Hung LM, Chen JK, Lee RS, Liang HC, Su MJ. 2001. Beneficial effects of astringinin, a resveratrol analogue, on the ischemia and reperfusion damage in rat heart. Free Radicals Biol Med 30: 877-883. Lee SK, Mbwambo ZH, Chung H, Luyengi L, Gamez EJ, Mehta RG, Pezzuto JM. 1998. Evaluation of the antioxidant potential of natural products. Comb Chem High Throughput Screening 1: 35-46. Ashikawa K, Majumdar S, Banerjee B, Bharti AC, Shishodia S, Aggarwal BB. 2002. Piceatannol inhibits TNF-induced NF-κB activation and NF-κB-mediated gene expression through suppression of IκBα kinase and p65 phosphorylation. J Immunol 169: 6490-6497.

본 발명의 발명자들은 피세아타놀이 구강암세포의 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하여 구강암 세포의 생장을 억제할 수 있다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 구강암은 구강 편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암 또는 선암일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 주사제, 경구제 또는 국소투여제일 수 있다.

본 발명의 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물에 따르면, 피세아타놀은 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 증가시키고, 항-세포자가사멸(anti-apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 감소시켜, 구강암 세포의 세포자가사멸을 유도할 수 있어 구강암 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.

도 1은 피세아타놀 처리한 구강암 세포의 (a) 생존율을 나타내는 그래프 및 (b) DAPI 염색 결과를 촬영한 광학현미경(optical microscope) 이미지이다.
도 2는 농도별로 피세아타놀 처리한 구강암 세포에서 발현된 Bcl-2 단백질 및 Bax 단백질의 (a) 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 결과를 나타낸 이미지 및 (b) 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 100 μM의 농도로 피세아타놀 처리한 구강암 세포 및 대조군에서 발현된 PARP 단백질의 (a) 웨스턴 블럿팅 결과를 나타낸 이미지 및 (b) 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 0, 10 및 20 mg/kg의 농도로 피세아타놀 처리한 구강암 조직에서 (a) 처리일별 구강암 조직의 부피 변화, (b) 구강암 조직의 무게를 나타내는 그래프이고, (c) 22일 동안 0 및 20 mg/kg의 농도로 피세아타놀 처리한 구강암 조직을 촬영한 광학현미경 이미지 및 (d) TUNEL 분석을 통한 세포자가사멸율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 0, 10 및 20 mg/kg의 농도로 피세아타놀 처리한 구강암 조직에서 절단된 카스파아제-3(cleaved caspase-3)의 발현량 변화 및 세포증식 표적물질인 Ki-67의 발현량 변화를 면역화학분석(immunohistochemistry assay)한 결과를 200 배율로 촬영한 광학 현미경 이미지이다.

본 발명의 일 태양에 따라, 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 태양에 따라, 피세아타놀의 구강암 치료 용도를 제공한다.

피세아타놀(piceatannol)은 천연 폴리페놀 스틸벤(stilbene)의 일종으로, 레스베라트롤의 생체내 대사에 의해 생성되는 물질로서, 생체내 안정성이 높다는 보고가 있으므로 약효 측면에서 유리하다는 장점이 있으며, 구강암 세포의 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하여 구강암 세포의 생육을 효과적으로 억제시킴으로써, 구강암 치료제로 효과적으로 이용할 수 있다.

상기한 피세아타놀에 의한 세포자가사멸은 다양한 단백질들에 의해 세포 내ㅇ외 경로를 통해 조절된다.

구체적으로, Bcl-2 패밀리(family) 단백질은 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 단백질로 미토콘드리아 막에 존재하거나 세포자가사멸 유도 신호에 의해 미토콘드리아 막으로 이동하여 세포자가사멸을 조절하는 역할을 담당한다. 이와 같은, Bcl-2 패밀리 단백질에 속하는 몇 가지 단백질들은 세포자가사멸 조절에 가장 대표적인 유전자로 알려져 있는데, 그 중 Bcl-2는 항-세포자가사멸(anti-apoptotic) 분자로서 세포자가사멸의 유발을 억제하는 기능을 가진다.

또한, Bax 단백질은 대표적인 세포자가사멸을 유도하는(pro-apoptotic) 물질로서, 미토콘드리아의 막에 통로를 만들고 이 통로를 통해 사이토크롬 C(cytochrome C)가 세포질로 유입되면 세포자가사멸을 위한 신호전달을 유도하는 물질로서 세포자가사멸을 발생시키는 기능을 가진다.

그리고, PARP 단백질은 손상된 DNA를 복구하는 단백질로서, 세포자가사멸의 유발을 억제하는 기능을 가진다.

아울러, 카스파아제(caspase)는 세포자가사멸을 조절하는 조절인자로 다양한 세포자가사멸 신호(apoptosis signal)의 공통적인 경로로서, 특히, 개시 카스파아제(initiator casapse)에 의해 활성화된 카스파아제-3(caspase-3)는 크로모좀의 뉴클레오좀 단편화(nucleosomal fragmentation)로 분해되고 손상된 DNA를 복구하는 단백질인 PARP를 절단할 수 있다.

상기 피세아타놀은 세포자가사멸 유도 인자인 Bax 패밀리 단백질의 발현을 증가시키고, 항-세포자가사멸 인자인 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현을 감소시켜, 구강암 세포의 세포자가사멸을 유도할 수 있다.

또한, 누클레오좀 단편화를 유도하여 활성화된 카스파아제-3의 발현을 증가시키며, 이에 의해, 손상된 DNA의 복구에 관여하는 PARP 단백질의 절단을 유도하여 구강암 세포의 세포자가사멸을 유도할 수 있다.

상기와 같이 본 발명에 의해 구강암 세포의 세포자가사멸 유도 효과가 확인된 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물은 다양한 형태의 구강암 치료에 이용될 수 있으며, 구강 편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암 또는 선암 등의 구강암 세포에 세포자가사멸을 유도하여 구강암 치료제로 효과적으로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 구강암 치료용 약학 조성물에 함유되는 피세아타놀의 함량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 적절히 조절하여 첨가하도록 구성할 수 있다. 예를 들면, 상기 피세아타놀은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 200 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있고, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 구강암 치료용 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 피세아타놀을 0.001 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.

또한, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 주사제, 경구제 또는 국소투여제로 제형화하여 사용할 수 있다.

이를 위해, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 락토스(lactose), 덱스트로스(dextrose), 수크로스(sucrose), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말티톨(maltitol), 전분(starch), 아카시아 고무(acacia gum), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 실리케이트(calcium silicate), 셀룰로오즈(cellulose), 메틸 셀룰로즈(methyl cellulose), 미정질 셀룰로스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinvlpyrrolidone), 물, 메틸히드록시벤조에이트(methyl hydoxy benzoate), 프로필히드록시벤조에이트(propyl hydoxy benzoate), 탈크(tarc), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 또는 미네랄(minerals) 등을 대표적인 예로 들 수 있으며, 이들을 단독 또는 이들의 혼합물을 구강암 치료용 약학 조성물에 포함되도록 구성할 수 있다.

상기 구강암 치료용 약학 조성물에 상기와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하여 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸의 형태로 구강암 치료용 약학 조성물을 제형화할 수 있으며, 상기와 같이 제형화된 구강암 치료용 약학 조성물을 이용하여 주사제, 경구제 또는 국소투여제 타입으로 제조할 수 있다.

일례로, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 비수성 용제, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 또는 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등의 현탁제를 포함하도록 구성하여 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조 제제 등의 형태인 주사제 또는 국소투여제 타입으로 제조할 수 있다.

그리고, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴(gelatin) 등의 부형제를 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함하도록 구성하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 타입의 경구제로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 피세아타놀을 유효성분으로 포함하는 구강암 치료용 약학 조성물은, 피세아타놀을 유효성분으로 포함하여 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 증가시키고, 항-세포자가사멸(anti-apoptosis)을 유도하는 단백질의 발현을 감소시켜 구강암 세포의 세포자가사멸을 유도할 수 있어 구강암 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.

따라서, 상기 구강암 치료용 약학 조성물은 주사제, 경구제, 외용제 또는 좌제 타입으로 제조되어 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여되어 구강암 치료를 위해 효과적으로 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다. 제시된 실시예 및 시험예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

<실시예>

실시예에 따른 구강암 치료용 약학 조성물의 제조를 위해, 피세아타놀(Piceatannol)은 시그마알드리치사(Sigma Aldrich, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 100 mM에 혼합하여 저장 용액(stock solution)으로 만든 후 적정농도로 배지에 희석하여 보관하였다.

<시험예> 피세아타놀의 구강암 세포 억제 효과 평가

(1) 피세아타놀의 구강암 세포에 대한 생존율 억제 효과 분석

한국 세포주 은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로 부터 구강암 세포주(YD-15, human oral cancer cells)를 구입하였으며, YD-15 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)에 1%의 스트렙토마이신/페니실린(streptomycin/penicillin)이 포함된 90%의 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기(incubator)에서 배양하였다.

175-cm² 플라스크에 세포가 80 내지 90% 정도 배양되었을 때 인산완충식염수(phosphate buffered saline solution, PBS)로 2회 세척하고 트립신-에틸렌디아민사아세트산(trypsin-EDTA)을 이용하여 계대배양하였으며, 배지는 2 내지 3일마다 교환하였다.

피세아타놀의 구강암 세포에 대한 생존율 억제 효과를 분석하기 위해서, 배양된 YD-15 세포를 96웰 플레이트(96 well plate)에 2×10⁴ 세포수/mL(cells/mL)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 피세아타놀을 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM로 각각 처리하여 24시간 관찰하였다.

24시간이 경과한 후 배지를 제거하고, PBS에 녹인 3-(4,5-디메틸트리아졸-2-일)-2,5-디펜틸테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 혼합용액(MTT solution)을 각 웰당 40 μL씩 처리한 후, 2시간 동안 CO₂배양기에서 배양한 다음, MTT 혼합용액을 제거한 뒤 디메틸술폭시드(DMSO)를 100 μL씩 각각 처리하여 웰에 형성된 포르마잔(formazan)을 모두 녹인 후 측정기(ELISA reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 변화(MTT assay)를 관찰하였으며, 관찰 결과를 도 1에 나타내었다.

참고로, 모든 실험결과는 평균치와 표준오차를 사용하여 나타내고 각 군간 비교는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)에 이은 t-검정(t-test) 분석을 실시하였다. 대조군과 비교하여 P < 0.05 일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

도 1(a)에 나타난 바와 같이, 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μM의 피세아타놀로 24시간 동안 처리된 구강암 세포의 농도별 세포 생존율은 처리된 농도가 증가될수록 감소하는 것으로 나타났으며, 50 μM 처리군의 경우 대조군에 비해 약 30% 정도 세포 생존율 감소가 관찰되었으며, 100 μM 처리군은 대조군에 비해 약 60% 이상 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 피세아타놀이 YD-15 구강암세포에서 농도의존적으로 세포 증식을 억제시켜 피세아타놀이 암세포 증식 억제에 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.

(2) 구강암 치료용 약학 조성물에 의한 구강암 세포의 세포자가사멸(apoptosis) 유도 효과 분석

피세아타놀 처리에 의한 YD-15 세포의 생존율 저하가 세포자가사멸 유도에 의한 것인지 조사하기 위하여, 세포자가사멸이 유도되었을 때 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌을 이용하여 DAPI 핵 염색(staining)을 수행하여 핵의 형태적 변화를 측정하였다.

이를 위해, YD-15 세포를 60 디쉬에 1×10⁵ 세포수/mL(cells/mL)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 피세아타놀을 0, 50, 100 μM을 처리하여 24시간 배양기에서 배양한 다음 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데히드 혼합용액(paraformaldehyde solution)으로 15분간 고정시켰다. 그 후, PBS로 다시 세척한 후 PBS에 10배 희석한 DAPI 혼합용액을 2 mL씩 처리하여 암실에서 형광현미경(Zeiss fluorescence microscope, Thornwood, NY, USA)으로 200배율의 시야로 관찰하였으며, 관찰결과를 도 1(b)에 나타내었다.

도 1(b)에 나타난 바와 같이, 0, 50 및 100 μM의 피세아타놀로 24시간 동안 처리되어 세포자가사멸된 구강암 세포의 세포자가사멸체를 DAPI 염색한 결과, 피세아타놀을 100 μM 처치한 군에서 세포자가사멸 발현세포의 증가가 관찰되었으며, MTT 분석 결과와 동일하게 DAPI 염색에서도 대조군에 비해 피세아타놀을 처리한 군에서 세포 수가 줄어들었고, 50 μM 및 100 μM의 농도로 피세아타놀 처리된 구강암 세포주에서는 흰 화살표에 나타난 바와 같이, 세포질의 위축, 염색사 응축(chromatin condensation), 핵 분열(cleaved nuclei) 및 세포자가사멸체(apoptotic body) 등과 같은 세포자가사멸이 관찰되었으며, 농도 의존적으로 세포의 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 종합해볼 때, 피세아타놀 처리에 의한 YD-15 구강암세포의 세포생존율 감소는 세포자가사멸 유도에 의해 이루어지는 것으로 확인되었다.

(3) 구강암 치료용 약학 조성물이 세포자가사멸 경로 단백질 발현에 미치는 영향 분석

YD-15 세포에서 피세아타놀에 의한 세포자가사멸 유도 기전을 확인하기 위해, 175-cm² 플라스크에 YD-15 구강암세포를 24시간 배양한 후 피세아타놀을 0, 50, 100 μM로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, trypsin-EDTA을 처리하여 세포를 부유상태로 만들어 원심분리(1,200 rpm, 5 분, 4℃)하였다. PBS로 세포를 세척하고 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)에 세포용해완충액(cell lysis buffer, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 4℃에서 30분간 반응하여 세포를 용해시켰다.

용해시킨 용해물(lysate)을 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 취해 세포용해물(cell lysate)로 사용하였으며, 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 통하여 세포자가사멸을 조절하는 Bcl-2 군 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

이를 위해, 세포용해물에서 단백질을 추출하고, 추출한 단백질의 농도는 브래드포드법(Bradford protein assay)를 이용해 측정하였다. 그리고, 단백질을 12% 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)로 크기별로 분리한 후, 니트로섬유소 맴브레인(nitrocellulose membrane, Bio-Rad, Hercules, CA)에 이동시켰다. 이때, 맴브레인은 5% 탈지유(skim milk)로 2시간 동안 블로킹(blocking)한 후, anti-Bcl-2, 항-Bax, 항-PARP, 항-β-액틴의 1차 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안(overnight) 반응 시켰다. 그 후, 항-토끼 면역글로불린(anti-rabbit IgG)를 첨가하여 2시간 반응시키고, 형성된 각각의 단백질 밴드(protein band)는 전기화학발광 탐지 시약(ECL detection reagents, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여, 피세아타놀을 50 및 100 μM로 24시간 동안 처리된 구강암 세포와 생존한 구강암 세포의 Bax 단백질 및 Bcl-2 단백질의 단백질 농도를 웨스턴 블럿팅을 수행해 실험결과를 관측하여 도 2에 관측결과를 나타내었다.

참고로, 항-토끼 면역글로불린과 Bcl-2 항체, Bax 항체, PARP 항체, Caspase-3 항체, Ki-67 항체, β-액틴 항체(β-actin antibody)는 셀시그널링테크놀로지사(Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.

도 2(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 피세아타놀 0, 50 및 100 μM로 처리한 군에서 세포자가사멸 유도(pro-apoptotic) 인자인 Bax 단백질의 발현이 피세아타놀의 처리량에 비례하여 증가하였으며, 항-세포자가사멸(anti-apoptotic) 인자인 Bcl-2 단백질의 발현이 피세아타놀의 처리량에 반비례하여 감소하는 경향을 보였다.

이러한 결과는 피세아타놀이 YD-15 구강암세포의 Bcl-2 패밀리 단백질의 수준을 변화시킨 것과 동일한 결과로 나타나, 피세아타놀의 세포자가사멸 유도 기전은 Bcl-2 패밀리 단백질과 연관이 있음을 확인하였다.

또한, YD-15 세포에 피세아타놀 0, 100 μM로 처리하여 웨스턴 블럿팅을 통해 DNA 복구와 관련된 PARP 단백질(poly(ADP-ribose) polymerase protein)의 발현 양상을 확인하였으며, 확인 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, PARP 단백질은 대조군에 비해 100 μM로 처리된 YD-15 세포에서 PARP의 절단이 증가하였으며, 이러한 결과를 종합했을 때, 피세아타놀은 YD-15구강암 세포의 Bcl-2 및 Bax 단백질의 발현 수준을 변화시키고 PARP의 절단을 유도하여 세포자가사멸을 유도시키는 것으로 확인되었다.

(4) 피세아타놀이 구강암세포에서 세포자가사멸 관련 단백질의 발현 및 종양성장에 미치는 영향 분석

피세아타놀이 구강암세포에서 세포자가사멸 관련 단백질의 발현 및 종양성장에 미치는 영향을 분석하기 위해서, 37℃, 5% CO₂ 분위기가 유지되는 배양기에서 5% 소태아혈청을 첨가한 RPMI-1640 배지에 YD-15 구강암세포를 배양하였다.

175-cm² 플라스크에 80 내지 90%의 세포가 배양되었을 때 트립신-에틸렌디아민사아세트산을 첨가해 세포를 부유시켜 원심분리(1,200 rpm, 5 분, 4℃)하였으며, PBS로 세척한 후 다시 원심분리(1,200 rpm, 3 분, 4℃)하여 세포펠렛(cell pellet)을 수득하였고, 1×10⁷ 세포수/mL가 되도록 배지에 분주하였다.

분주된 세포에 1주일의 순화기간을 보낸 누드 마우스에 200 μL씩 YD-15 구강암세포를 주입하여 YD-15 구강암세포를 이종이식(xenograft)해 종양을 유발시키고, 종양 사이즈가 군별로 일정하게 나오도록 군 분류를 한 후 고농도군 3마리는 피세아타놀을 DMSO에 희석시켜 매주 5번 피세아타놀 20 mg/kg의 농도로 같은 시간에 3주간 복강투여 하였으며, 저농도군 3마리는 매주 5번 피세아타놀 10 mg/kg 농도로 같은 시간에 3주간 복강투여 하였다.

또한, 대조군은 DMSO와 PBS 섞어 매주 5번 같은 시간에 3주간 복강투여 하였다. 투여기간 동안 마우스의 일반적인 상태를 살피고 종양사이즈는 주 2회 측정하였다.

이때, 실험동물은 4 주령의 누드 마우스를 (주)오리엔트바이오사(Orient-Bio Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여, 실내온도 23±5℃, 습도 40±10%, 환기횟수 10 내지 12회/시간, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등), 조도 150 내지 200 lux로 유지되는 공주대학교 특수동물학과 실험동물실 내 공간에서 1주일간 순화시키면서 사육하고 물과 식이는 자유급여 하였다.

순화 기간 중 건강한 개체를 선별하여 피세아타놀 복강투여량에 따라 군당 4마리씩 3개군으로 나누어 군별로 한 우리(cage)에서 3주간 사육하였다. 동물의 개체식별법은 문신법을 사용하였으며, 태그(tag) 표시법에 의해서 사육 상자를 구별하였다. 또한, 동물실험은 공주대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KNU_2014-13)을 받아 동물실험윤리위원회규정에 따라 수행되었다.

상기와 같이 이종 이식을 실시한 누드 마우스의 종양조직에서 피세아타놀이 세포자가사멸 관련 단백질 및 종양성장의 증식 속도를 평가하는 단백질의 발현을 관찰하기 위해 실험동물을 희생하여 적출한 종양에서 면역화학염색(immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다.

이를 위해, 단백질 정량 분석법(Dead End^TMColorimetric TUNEL System, Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 비색정량해서 DNA 분절화가 발생한 세포의 손상도를 측정(TUNEL assay)을 통해 세포자가사멸 세포를 확인하였다.

단백질 정량 분석을 위해, 자일렌(xylene)을 이용해 탈파라핀화를 실시하였으며, 탈파라핀화된 단백질을 100, 95, 85, 70, 50% 순서로 에탄올을 이용하여 함수시켰다. 그 후, PBS로 세척 후 단백질분해효소 K(Proteinase K)를 각 슬라이드에 떨어트려 실온에서 15분간 반응시키고, 평형 완충용액(equilibration buffer)과 바이오티닐(Biotinylated Nucl. Mix, rTdT)을 섞어 각 슬라이드에 처리하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 0.3% 과산화수소(hydrogen peroxide)를 PBS와 섞어 5분간 반응 후 스트렙타비딘(Streptavidin) HRP를 각 슬라이드에 처리하였고, 각 슬라이드에 3,3′-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB) 혼합 용액을 10분간 반응시킨 후, 현미경(× 200)으로 양성 세포(positive cell)를 관찰하였으며, 관찰결과를 도 4에 나타내었다.

도 4(a)에 나타난 바와 같이, 피세아타놀 처리 8일 경과 후 부터 암세포 조직의 부피가 급격히 감소하는 것으로 나타났으며, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 피세아타놀 20 mg/kg의 농도로 처리된 암세포의 무게가 피세아타놀 처리되지 않은 대조군 암세포의 무게보다 줄어든 것을 확인할 수 있었으며, 도 4(c)에 나타난 바와 같이, 피세아타놀 20 mg/kg의 농도로 처리된 암세포 군락에서 세포자가사멸 효과가 발생하는 것을 현미경을 통해 육안으로 확인할 수 있었다.

또한, 도 4(d)에 나타난 바와 같이, 피세아타놀 20 mg/kg의 농도로 처리된 암세포의 세포자가사멸률이 15% 이상으로 나타나, 피세아타놀에 의한 암세포의 세포자가사멸 유도효과를 확인할 수 있었다.

또한, TUNEL 분석을 통해 세포자가사멸된 세포를 확인한 후 세포자가사멸과 관련된 표적 단백질을 확인하기 위해, 5 μm 두께로 절단된 파라핀 조직을 먼저 자일렌을 이용해 탈파라핀화를 한 후, 에탄올을 이용해 재수화(rehydration)를 시켰다(100, 90, 80, 70%). 그 후, PBS로 세척 후 0.3% H₂O₂를 이용하여 내인성 페록시다아제(peroxidase) 불활성화 시켰다. PBS로 세척 후 탈지유를 이용하여 내인성 비오틴(biotin)을 불활성화 시킨 후 1차 항체를 반응시켰다. 세척 후 2차 항체를 반응시키고, DAB에 H₂O₂를 첨가하여 반응시켰다. 그 후 현미경(×200)으로 표적 단백질을 관찰하여, 면역화학염색을 실시하여, 세포자가사멸을 조절하는 주요 인자인 카스파아제-3의 활성과 종양세포의 증식 속도를 평가하는 Ki-67을 확인하였고, 확인 결과를 도 5에 나타내었다.

참고로, Ki-67은 증식하는 세포에 존재하는 핵을 검출하는 항체로서 증식하는 세포의 G1, S, G2, M기에는 핵에 존재하나 휴식세포의 핵에는 존재하지 않는 특성을 나타내, YD-15 구강암 세포의 증식 여부를 효과적으로 관찰할 수 있다.

도 5에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 피세아타놀 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 농도로 처리한 군에서 분열된 카스파제-3(cleaved caspase-3)의 발현이 증가하였고, Ki-67의 발현은 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과에 따라 피세아타놀은 YD-15 구강암 세포에 세포자가사멸을 유발하여 종양의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

피세아타놀을 유효성분으로 포함하고, 피세아타놀을 1일 20 mg/kg의 용량으로 주사제로 투여하는 점액표피양암인 구강암 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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