KR101756541B1 - 피부지질 대사물질의 농도를 이용한 당뇨병성 피부질환의 진단방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents

피부지질 대사물질의 농도를 이용한 당뇨병성 피부질환의 진단방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드(ceramide)의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 세라마이드의 농도와 정상군으로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드의 농도를 비교하여 당뇨병성 피부질환 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 또한, 상기와 같은 원리로, 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 지질 대사물질을 당뇨병성 피부질환을 위한 마커로 활용함으로써, 특정 식품 또는 약물이 대상체의 당뇨병 또는 당뇨병성 피부질환의 치료 유효한지 여부를 효과적으로 판단하는 데에도 사용할 수 있다.

Description

피부지질 대사물질의 농도를 이용한 당뇨병성 피부질환의 진단방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법{METHOD FOR DIAGNOSING A DIABETIC SKIN DISEASE USING THE CONCENTRATION OF SKIN LIPID METABOLITES AND SCREENING THEREBY}
본 발명은 대상체로부터 분리된 혈액 중 피부지질 대사물질의 농도 측정을 이용한 피부질환 여부의 진단방법 및 이를 이용한 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 췌장의 인슐린 분비장애와 인슐린 작용의 결함으로 인하여 혈당의 지속적인 상승이 일어나면서, 탄수화물, 단백질 및 지질 대사에 있어 장애가 발생하는 병증을 지칭하며, 제1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병, IDDM), 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병, NIDDM), 그밖의 특정한 메커니즘·질환에 의한 당뇨병이나 임신 당뇨병으로 구별할 수 있다. 당뇨병은 지속적인 고혈당과 다갈, 다뇨, 다식, 체중감소, 의식장애, 혼수 등과 함께, 눈, 신장, 심혈관, 신경장애 등의 급성 또는 만성 합병증이 동반되는 것이 일반적이다.
당뇨병은 피부의 각질층에도 많은 병태생리학적 변화를 유도한다. 이에 의하여 다양한 피부 합병증이 유발되지만, 여전히 그 메커니즘은 밝혀지지 않고 있다.
지질체학(lipidomics)은 세포, 조직, 생체액 등 지질 대사물질의 포괄적인 정성 및 정량분석으로써 특화된 생화학분석 분야이며, 서로 다른 표현형을 구별하고 특정 표현형과 관련된 잠재적인 바이오 마커를 효과적으로 도출할 수 있는 적합한 기술이다. 따라서, 당뇨와 관련된 복합적 표현형 안의 대사체의 변화와 메커니즘을 이해하기 위하여 지질체학을 이용한 연구가 효과적인 것으로 인식되고 있다. 이 중, 직접주입 나노전기분무-탠덤 질량 분석법(direct-infusion nanoelectrospray-tandem mass spectrometry)을 이용한 지질체적 분석은 db/db 마우스의 피부에서 현저한 변화를 분석할 수 있다.
세라마이드(ceramide)는 인간 표피 중 각질층의 50%를 구성하고 있는 물질로, 피부장벽을 구성하는데 가장 중요한 성분인 한편, 인슐린 저항인, 인슐린 유전자 발현 및 복합 메커니즘의 감소에 중요한 역할을 한다. 일반적인 피부질환 중 하나인 아토피성피부염이나 건선은 피부지질 중 세라마이드 수준의 감소가 발병의 주원인으로 알려져 있다.
본 발명의 발명자들은 db/db 마우스의 피부에서 세라마이드의 수준이 증가되는 반면, 다이하이드로세라마이드(dihydroceramide) 및 파이토세라마이드(phytoceramide)의 수준이 감소되는 것을 발견하였으며, 대조군에 비하여 당뇨병군의 피부 표면 pH가 현저하게 더 높다는 것을 발견하였다. 또한, 세라마이드는 피부 pH와 양의 상관관계를 보여주는 반면, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드는 음의 상관 관계를 나타낸다는 사실 또한 발견하였다. 상기와 같은 발견을 기초로, 본원에서 피부 세라마이드가 병리학적 표현형에 대한 바이오마커가 될 수 있음을 활용하고자 하였다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0113152호 대한민국 공개특허 제10-2012-0116695호
본 발명의 대상체로부터 수득한 피부지질 중 지질 대사물질의 농도를 정상군으로부터 수득한 피부지질 중 대사물질의 농도와 각각 비교하여, 당뇨병성 피부질환의 진단 또는 치료를 위한 정보를 제공하고자 하는 것이다. 또한, 이 원리를 이용하여, 특정 식품 또는 약학적 조성물의 후보군이 대상체의 당뇨병 또는 당뇨병성 피부질환의 치료에 유효한지 여부를 판단하는 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양상은 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드(ceramide)의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 세라마이드의 농도와 정상군으로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드의 농도를 비교하여 당뇨병성 피부질환 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "개체"는 동물, 예를 들어, 영장류, 설치류, 개과, 고양이과, 말과, 양과, 돼지과 등을 포함하며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "피부지질"은 표피 유래의 지질로서, 인간의 피부에는 약 0.4~0.05mg/cm2의 지질이 존재하고 있으며, 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산 등으로 구성되어 있고, 층판 구조로 연결되어 있어, 피부 안쪽에서 바깥쪽으로의 수분 증발을 막고, 피부 안쪽으로 유해 성분의 침입을 막는 피부 장벽의 역할을 한다. 피부지질의 추출은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 마손(Masson) 방법에 의하여 대상체로부터 분리된 피부 샘플로부터 추출함으로써 수득될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 세라마이드를 비롯한 대사물질의 혈액 중 농도는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 질량분석기, 비색 분석법, 효소법, 화학발광면역측정법 등을 이용한 직접측정법 등에 의하여 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세라마이드"는 스핑고신(sphingosine) 및 지방산의 결합으로 이루어진 것으로, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가지고 있으며, 구체적으로 CER(12:0/18:1), CER(21:0/18:1), CER(24:0/16:1), CER(24:0/17:1), CER(26:0/16:1) 등이 존재한다:
Figure 112015101126393-pat00001
(상기 식 중, R은 C1-C50의 알킬기이다.)
세라마이드는 피부지질의 핵심 구성 성분으로서, 피부지질 중 세라마이드의 함량 또는 조성비에 이상이 생기는 경우 피부 장벽으로서의 기능 저하를 초래하게 되며 여러 피부질환의 악화를 가져온다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정상군"은 대상체와 동종, 동일 성별 및 유사한 나이대의 개체 중에서 당뇨병을 앓지 않는 개체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "당뇨병성 피부질환"은 당뇨병의 합병증 중 하나로, 오랫동안 혈액 중 포도당의 수치가 높게 유지되는 것에 기인하여 발병되는 피부질환을 지칭한다. 구체적으로는, 당뇨성결피증, 백반증, 흑색극세포증, 당뇨성유지방성괴사, 당뇨성물집, 확산성환상육아종 등일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 정보 제공 방법에 있어서 당뇨병성 피부질환 여부의 판단은, 정상군으로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 증가하는 경우, 대상체가 당뇨병성 피부질환을 갖는 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 양상은, 상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중에서 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도와 정상군으로부터 수득한 피부지질 중의 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도를 각각 비교하여 당뇨병성 피부질환여부를 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다이하이드로세라마이드"는 스핑가닌(sphinganine) 및 지방산으로 구성된 화합물을 지칭하며, 구체적으로 DHCER(24:1/18:0), DHCER(26:0/17:0), DHCER(28:0/18:0), DHCER(30:0/17:0) 등이 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "파이토세라마이드"는 파이토스핑고신 및 지방산으로 구성된 화합물을 지칭하며, 구체적으로 PCER(16:0/18:0), PCER(26:0/16:0), PCER(26:0/17:0), PCER (26:0/16:0) 등이 존재한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 정보 제공 방법에 있어서 당뇨병성 피부질환 여부의 판단은, 정상군으로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 증가하고, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도가 보다 감소하는 경우, 대상체가 당뇨병성 피부질환을 갖는 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 특정한 식품을 섭취 또는 약물을 투여한 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 세라마이드의 농도와 상기 대상체가 상기 식품을 섭취 또는 약물을 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드의 농도를 비교하여 상기 식품 또는 약물의 유효성을 판단하는 단계를 포함하는 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이러한 방법은 대상체에게 관심 있는 식품 또는 약물 후보군을 투여한 후, 일정 시간 경과 후에 이들로부터 피부 샘플을 채취하고 이로부터 피부지질을 수득하여 투여 전후의 피부지질 중 대사물질의 농도를 비교함으로써, 상기 식품 또는 약물 후보군이 대상체의 당뇨병 또는 당뇨병성 피부질환의 치료에 유효한 것인지 여부 및 그 효과 정도를 선별해낼 수 있다.
상기 식품 또는 약물 후보군은 각각의 특성에 따라 통상적으로 행해지는 방법으로 섭취 또는 투여되나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 식품 또는 약물 후보군은 경구투여가 일반적이나, 주사제, 좌제, 연고제 등 비경구투여에 의한 투여도 가능하다.
상기 스크리닝 방법을 위한 구체적인 마커의 종류는 상기 당뇨병성 피부질환여부 판단에 이용된 마커와 동일하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물의 유효성 판단은, 대상체가 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 섭취 또는 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 섭취 또는 투여한 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 감소하는 경우, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물로서 유효한 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 양상은, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 대상체로부터 수득한 피부지질에서 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도를 추가로 측정하고, 상기 측정값과 상기 대상체가 상기 식품을 섭취 또는 약물을 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도를 비교하여 상기 식품 또는 약물의 유효성을 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물의 유효성 판단은, 대상체가 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 섭취 또는 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 감소하고, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드 중 하나 이상의 농도가 보다 증가하는 경우, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물로서 유효한 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 피부질환의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법, 및 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 사용하면, 대상체에서 수득한 피부지질 중에 존재하는 지질 대사물질을 당뇨병성 피부질환의 진단을 위한 마커로 활용함으로써, 특히 당뇨병성 피부질환 환자의 진단, 식품 또는 약물의 항당뇨 또는 당뇨병성 피부질환에의 유효성 여부를 효과적으로 판단할 수 있다.
도 1은 대조군 마우스(n = 5) 및 당뇨병 db/db 마우스(n = 5)의 특성((A) 체중 및 (B) 피부 pH)을 나타낸다.
도 2는 음성 모드에서 작동하는 나노전기분무 이온화-탠덤 질량 분석기로의 직접주입에 의한 마우스 피부에서의 세라마이드 분석을 나타낸다(이때, CER: 비수산화 지방산-스핑고신(Non-hydroxy fatty acid-Sphingosine), PCER: 비수산화 지방산-파이토스핑고신(Non-hydroxy fatty acid-Phytosphingosine), DHCER: 비수산화 지방산-다이하이드로스핑고신(Non-hydroxy fatty acid-Dihydrosphingosine) 및 HCER: 비수산화 지방산-6-수산화스핑고신(Non-hydroxy fatty acid-6-hydroxysphingosine)을 의미함).
도 3은 두 군으로부터의 주성분 분석(PCA)을 나타내는 것으로, (A)는 2D 스코어 플롯(PC1 vs. PC2)[대조군 마우스(○), 당뇨병 db/db 마우스(■), 및 품질 관리 샘플(QC,◇)](스코어 플롯 위의 각 점은 개별 샘플을 나타냄. 타원의 중앙과 가장자리는 평균과 표준편차를 의미함); (B)는 대조군 마우스(○) 및 당뇨병 db/db 마우스(■)로부터 수득한 피부 세라마이드의 직접주입 나노전기분무-질량 분석기 프로파일; (C)는 부분최소자승-판별분석 스코어 플롯(R2X: 0.70 및 Q2: 0.95); 및 (D)는 로딩 플롯을 나타낸다. 동정된 세라마이드를 로딩 플롯 상에 숫자로 표시하였으며, 세라마이드 목록 및 예상 벡터는 표 1 및 2에 주어진 바와 같다.
도 4는 대조군 마우스군(n = 5)과 당뇨병 db/db 마우스군(n = 5) 간에 수준이 상당히 차이 나는 화합물을 보여주는 상자수염그림(Box-and-whisker plot)을 나타낸다. Y-축은 피크 강도를 나타내고, 당뇨병 군에서의 각 바이오마커 후보들의 대조군과 비교한 통계적 분석을 분산분석을 통하여 수행하였다[(*)p < 0.05, (**)p < 0.01, and (***)p < 0.001].
도 5는 피부 세라마이드 바이오마커 후보들과 마우스 피부 pH간의 상관관계 분석을 나타낸다.
도 6은 각질층 세라마이드의 생산에 대한 제안된 경로를 나타낸다. 8종의 각질층 세라마이드(Cer1-Cer8)의 생산 도식은 글루코세라마이드와 스핑고미엘린 의존 경로를 구별한다. 여기서, SPT는 세린 팔미토일 이동효소(serine palmitoyltransferase), KSR은 3-케토스핑가닌 환원효소(3-ketosphinganine-reductase), ACER1/2/3은 알칼라인 세라마이드 분해효소(alkaline ceramidase 1/2/3), CERS는 세라마이드 합성효소(ceramide synthase), DES1/2는 다이하이드로세라마이드 불포화효소(dihydroceramide desaturase 1/2), GCS는 글루코실세라마이드 합성효소(glucosylceramide synthase), SMS는 스핑고미옐린 합성효소(sphingomyelin synthase), GBA는 글루코실세레브로시다아제(glucosylcerebrosidase), 및 Smase는 스핑고피옐린 분해효소(sphingomyelinase)를 의미한다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 실험 재료 및 방법
1.1. 화학물질 및 시약
메탄올을 Merck사로부터 구입하였다(LC-MS 등급). 아세트산 암모늄, 클로로폼과 다이클로로메탄을 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 표준 세라마이드 N-라우로일-D-에리트로-스핑고신(세라마이드(12:0/18:1)), N-헥사데칸오일-피토스핑고신(파이토세라마이드(16:0/18:0)), 및 N-너보노일-D-에리트로-스핑가닌(다이하이드로세라마이드(24:1/18:0))를 Avanti　Polar Lipids사 및 Matreya사로부터 구입하였다.
1.2. 동물 연구
당뇨 모델 동물(db/db 마우스) 및 대조군 동물 각각 5마리를 Jackson Lab에서 구매한 후, 표준사육조건(온도: 22±0.5℃, 상대습도 60±5% 및 12시간/12시간 명/암 조건)에서 사육하여 실험에 사용하였다. 글루코오스 산화효소 기술을 사용하여 혈중 포도당 농도를 측정하고, 혈중 포도당 농도가 300mg/dl 이상인 경우 당뇨가 유발된 것으로 진단하였다.
1.3. 샘플 제조
피부지질을 일부 변형된 마손(Masson) 방법에 의하여 추출하였다. 간략하게, 동결 건조된 마우스 피부 샘플을 조직파쇄기(Tissue Lyser)(30Hz(1/s), 5분, QIAGEN사)로 500μL 메탄올에 균질화시켰다. 균질화된 샘플을 4℃ 및 12,000rpm에서 10분간 원심분리시키고, 상층액을 중성지질 분석을 위해 깨끗한 튜브로 옮겨 담았다. 남은 펠렛을 조직파쇄기(동일 조건)로 500μL 다이클로로메탄/메탄올(3:1, v/v)에 재균질화시키고, 균질화된 샘플을 원심분리시켰다. 수득된 상층액을 잔잔한 질소 흐름 하에서 건조시키고, 건조된 샘플을 100μL 클로로폼/메탄올(1:9, v/v)에 재현탁시킨 후, 7.5mM 아세트산 암모늄을 함유한 클로로폼/메탄올(1:9, v/v)로 10배 희석시켰다. 마우스 피부 세라마이드를 프로파일링하기 위하여, 직접주입 나노전기분무-탠덤 질량분석 시스템을 이용하였다.
1.4. 직접 주입 질량 분석
5.5μm 직경 분사 노즐을 갖는 나노전기분무 칩을 사용하는 나노흐름 이온 공급원(nanoflow ion source)인 TriVersa Nanomate(Advion Biosciences사)가 장착된 LTQ XL 질량분석기(Thermo Fischer Scientific사)를 통하여 피부지질 프로파일링을 수행하였다. 이온 공급원을 Chipsoft 8.3.1 소프트웨어(Advion Biosciences사)를 사용하여 제어하였다. 이온화 전압은 음성 모드(negative mode)에서 1.4kV였고, 배압(back pressure)은 0.4psi로 세팅하였다. 이온 전달 모세관(ion transfer capillary)의 온도는 200℃였고, 튜브 전압은 100V였다. 샘플 5μL를 TriVersa Nanomate 이온 공급원의 96-웰 플레이트(Eppendorf사)에 로딩하였다. 각 샘플을 2분 동안 분석하였다. 데이터 수집 방법은 전체 스캔(full scan)(스캔 범위: m/z 500 내지 900) 및 가장 풍부한 이온들의 데이터-의존 MS/MS 스캔과 관련되어 있다. MS/MS 스펙트럼을 30eV CID 상에서 수득하였다. 모든 스펙트럼을 Thermo Xcalibur 소프트웨어(2.1. 버전, Thermo Fisher Scientific사)로 기록하였고, 피부지질을 이의 특정 MS/MS 단편 패턴에 기초하여 시험적으로 동정하였다.
1.5. 데이터 전처리 및 세라마이드 동정
신호 세기 및 질량 대 전하 값(m/z)을 포함하는 LC-MS 데이터는 엑셀 파일로 추출되었다. 데이터를 반복적으로 각각의 품질관리(QC) 샘플의 이온 세기로 평준화시켰다. QC 샘플을 연구된 모든 피부 샘플로부터 얻은 세라마이드 추출물의 동일한 부피를 혼합함으로써 제조하였다. 평준화된 LC/MS 데이터 세트를 SIMCA-P+ 13.0(Umetrics사)의 다변량 통계적 분석으로 분석하였다. 또한, 피부 세라마이드를 시판 중인 세라마이드 표준 및 본 발명자들의 사내 세라마이드 도서관의 MS/MS 단편 패턴과 비교함으로써 시험적으로 동정하였다.
1.6. 통계적 분석
두 군(대조군과 당뇨병 마우스군) 간의 차이의 정도를 규명하기 위하여, 주성분 분석(PCA), 부분최소자승-판별분석(PLS-DA) 및 직교부분최소자승분석(OPLS-DA)을 수행하였다. R2X 및 Q2Y 값을 각각 측정함으로써 적합함 및 예측가능성의 수준을 평가하였다. 일반적으로, R2Y는 0 내지 1 사이에서 변하며, 이때 1은 완벽히 들어맞는 모델을 의미하는 한편, 0.5 초과의 Q2Y 값은 우수한 예측가능성을 반영하는 것으로 간주된다. 모델에서의 모든 변수들은 투영에서의 변수 중요도(VIP) 값(>1.1) 및 p-값(<0.05)에 의하여 선택되었다(SIMCA P+ 13.0 및 Stastistica 7(StatSoft Inc.)을 사용함). 피부 pH의 통계적 분석, 기저 경피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL)과 각질층(SC) 보전 함량은 던칸(Duncan)의 다중 범위 시험을 사용하여 수행하였다.
2. 실험 결과
2.1. 동물 특성
14주령 당뇨 모델 마우스는 14주령 대조군 마우스에 비하여 체중이 유의적으로 무거웠다(도 1의 (A) 참조). 또한, 피부 표면 pH는 당뇨 모델 마우스가 대조군 마우스에 비하여 유의적으로 높은 pH 값을 나타내었다(도 1의 (B) 참조).
2.2. 피부 세라마이드 수준의 다변량 통계적 분석
5개의 피부 추출물 군을 수행한 후에 QC 샘플을 분석함으로써 시스템 안정도를 평가하였다. 검출된 250개의 이온 중, CV 값이 30% 초과인 이온의 수는 90% 초과였고, 이는 중요한(instrumental) 시스템이 샘플 분석 동안 안정하다는 것을 의미한다. 그 결과, QC 샘플의 클러스터링은 또한 주성분 분석으로 분석된 모든 샘플에서 고수준의 중요 반복성과 안정성을 나타낸다(도 3의 (A) 참조). 직접 주입 나노전기분무 이온 트랩 질량 분석법을 통해 결정되는 바와 같이, PLS-DA 모델을 이용하여, 대조군 및 당뇨병 db/db 마우스에서 수득한 피부의 대사물질 프로파일을 통계적으로 평가하였다. 도 3의 (B)는 대조군 및 당뇨병 db/db군에 대한 피부의 전형적인 직접 주입 질량 스펙트럼을 보여준다. 대조군은 첫번째 2성분 PLS-DA 스코어 플롯에서 db/db 마우스군과 명확하게 구별될 수 있다(도 3의 (C) 참조). 두 군 간의 상당한 차이는 대사 패턴이 별개라는 것을 나타낸다(p < 0.017). PLS-DA 모델을 이용하여 우수한 품질의 매개변수를 수득하였으며, 이는 교차검증에 의하여 검증되었다(적합함(R2X = 0.704 및 R2Y = 0.982), 및 예측가능성(Q2 = 0.954)](하기 표 1 및 도 3의 (C) 참조). 주요 대사물질은 p-값 및 투영에서의 변수 중요도(VIP)에 기초하여 동정되었고(하기 표 2 참조), PLS-DA 로딩 플롯 상에 번호화되었다(도 3의 (D) 참조). 이들 대사물질은 대조군과 db/db 마우스군 간에서의 차이를 관찰하는데 중요한 역할을 한다.
Figure 112015101126393-pat00002
Figure 112015101126393-pat00003
2.3. 당뇨병 db/db 마우스 특정 세라마이드 마커
직접 주입 질량 분석법에 의하여 검출된 250종의 대사물질 중에서, 23종의 세라마이드의 수준은　비모수 t 시험을 이용하여 통계적으로 분석된 두 군 간의 차이를 설명하는 것과 관련되어 있다. 23종의 세라마이드 중에서, 9종의 세라마이드는 두 군 간의 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다(p < 0.05)(상기 표 2 참조). 이들 중에서, 세라마이드의 수준(CER(21:0/18:1), CER(24:0/16:1), CER(24:0/17:1) 및 CER(26:0/16:1))은 당뇨병 db/db 마우스군에서 상당히 증가한 반면, 다이하이드로세라마이드(DHCER(26:0/17:0), DHCER(28:0/18:0) 및 DHCER(30:0/17:0)) 및 파이토세라마이드(PCER(26:0/16:0), PCER(26:0/17:0) 및 PCER(26:0/16:0))의 수준은 감소하였다(도 4 참조).
이러한 발견에 기초하여, 세라마이드의 수준이 당뇨병성 피부질환을 포함하는 대사성 질환의 매우 유용한 마커로서 제공될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드(ceramide), 다이하이드로세라마이드(dihydroceramide) 및 파이토세라마이드(phytoceramide)의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도와 정상군으로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도를 비교하여 당뇨병성 피부질환 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 당뇨병성 피부질환 여부의 판단은 정상군으로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 증가하고, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도가 보다 감소하는 경우, 대상체가 당뇨병성 피부질환을 갖는 것으로 결정하는 것인 방법.
  5. 특정한 식품을 섭취 또는 약물을 투여한 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도와 상기 대상체가 상기 식품을 섭취 또는 약물을 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질 중의 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도를 비교하여 상기 식품 또는 약물의 유효성을 판단하는 단계를 포함하는 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물의 유효성 판단은, 대상체가 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 섭취 또는 투여하기 전 상기 대상체로부터 수득한 피부지질에서의 농도를 기준으로, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 섭취 또는 투여한 대상체로부터 수득한 피부지질 중 세라마이드의 농도가 보다 감소하고, 다이하이드로세라마이드 및 파이토세라마이드의 농도가 보다 증가하는 경우, 상기 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물의 후보군 화합물을 항당뇨 식품 또는 당뇨병성 피부질환 치료용 조성물로서 유효한 것으로 결정하는 것인 방법.
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Changes in Sphingolipid metabolism in the Vitreous from Diabetic Patients, ARVO Annual Meeting Abstract, 2012.*
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