KR101746901B1 - 강글리오사이드를 포함하는 병용 항암 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체; 및 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 강글리오사이드 또는 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물의 단독 처리에 비해 세포독성 약물의 부작용을 최소화하면서 상승된 항암효과를 나타낼 수 있으며, 기존에 사용되는 세포독성 약물에 내성을 갖는 암 환자에 효과적으로 작용할 수 있다.

Description

강글리오사이드를 포함하는 병용 항암 치료제 {Phamaceutical combination comprising ganglioside for the treatment of cancer}

본 발명은 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체, 및 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

시스플라틴(Cisplatin; cis-diamminedichloroplatinum, 시스플라틴)은 여러 고형암에 효과적인 일반적인 항암제이다. DNA에 결합하여 DNA 부가물(adduct)을 생성하며(Jamieson ER & Lippard SJ (1999) Chem Rev 99: 2467-2498), 이온 채널의 활성, 수송 단백질, 여러 세포막효소를 조절하고(Aggarwal SK & Niroomand-Rad I (1983) J Histochem Cytochem 31: 307-317; Grunicke H & Hofmann J (1992) Pharmacol Ther 55: 1-30), 활성산소(ROS)의 생성을 유도하여 암세포를 사멸시킨다(Masuda H et al. (1994) Biochem Biophys Res Commun 203: 1175-1180). 따라서 시스플라틴은 DNA 수선, 전사 저해, 세포 주기 정지, 세포사멸을 조절한다(Siddik ZH (2003) Oncogene 22: 7265-7279).

한편, 시스플라틴에 의해 유도되는 세포사멸은 ERK, JNK/SAPK, 및 MAPK를 활성화시킨다(Dent P & Grant S (2001) Clin Cancer Res 7: 775-783; Wang X et al. (2000) J Biol Chem 275: 39435-39443). 또한, 시스플라틴은 사람상피세포에서 Fas/FasL-매개 세포사멸을 유도하며(Razzaque MS et1999) Histochem Cell Biol 111: 359-365), Bcl-2 패밀리의 발현수준을 조절하여 미토콘드리아 손상을 유발한다.

또한, 시스플라틴의 세포독성에 영향을 받아, 암세포에서 세포사멸 유발 Bax인 p53 매개의 전사촉진(transactivation), Bcl-2 발현의 감소, Bid의 분열로 인하여 미토콘드리아 전위(mitochondrial potential)가 감소하고, 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c가 방출됨으로써 캐스패이즈 매개 PARP 분해가 증가된다(Kepp O et al. (2007) EMBO J 26: 825-834; McNeish IA et al., (2003) Exp Cell Res 286: 186-198; Wang P et al. (2006) Cell Signal 18: 1528-1535; Thayyullathil F et al. (2008) Free Radic Biol Med 45: 1403-1412). 상기 세포사멸 현상은 세포막의 조성변화 때문인 것으로 보인다(d'Azzo A et al. (2006) Cell Death Differ 13: 404-414).

강글리오사이드(ganglioside) 등 일련의 시알산(sialic acid)을 포함하는 글리코스핑고리피드(glycosphingolipids, GSLs)군들은 모든 포유동물 세포막의 미세도메인(microdomain)의 구성성분으로, 세포 간 상호작용과 신호전달 등의 다양한 생물기능을 수행하며(Hakomori S (2000) Glycoconj J 17: 627-647), GM3, GD3, GD1b과 같은 특이한 강글리오사이드들이 여러 세포에 세포사멸을 유발한다는 것이 보고되었다(Chahlavi A et al. (2005) Cancer Res 65: 5428-5438; Garofalo T et al. (2005) Cell Death Differ 12: 1378-1389). 또한, 미성숙한 증식 중인 신경교세포(glial cell) 및 뉴런세포(neuronal cell)에 강글리오사이드 GM3를 처리하면 세포증식이 억제되고 세포사멸이 유발된다는 것이 보고되었다(Nakatsuji Y et al. (2001) Exp Neurol 168: 290-299; Noll EN et al. (2001) Exp Neurol 168: 300-309).

그 중 GM3는 활성산소종의 축적을 유발하며, 신경세포 안으로 칼슘 이온을 유입시켜 세포사멸을 유발한다(Fujimoto Y et al. (2005) J Neurooncol 71: 99-106; Sohn H et al. (2006) FASEB J 20: 1248-1250). 설치류의 방광암에서 GM3의 과발현은 세포사멸을 유발하고 암세포의 악성도를 감소시킨다고 보고된바 있다(Watanabe R et al. (2002) Cancer Res 62: 3850-3854).

그러나, 상기 종래 항암치료제의 항암 효과는 충분하지 못하여, 보다 항암 효과가 뛰어난 화학치료제에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 보다 항암 효과가 뛰어난 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체를, 활성산소종(ROS) 생성을 증가시켜 세포사멸을 유발함으로써 항암효과를 나타내는 약물과 병용 투여할 경우 두 약물의 협력 작용으로 인하여 현저한 항암 효과가 나타나는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체, 및 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체, 및 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 강글리오사이드는 시알산(sialic acid)을 포함하는 글리코스핑고리피드이다. 일 예로 상기 강글리오사이드는 GM3, GD3, 또는 GD1b일 수 있다. 본 발명자들은 강글리오사이드 또는 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물을 단독으로 처리했을 때에 비하여, 두 물질을 같이 처리했을 때 그 협동 작용으로 인하여 세포 생존율이 최대 6.5±0.3(%)까지 현저하게 감소하여, 뛰어난 항암 효과가 있음을 확인하였다.

일 예로 상기 강글리오사이드는 GM3일 수 있다. 본 발명자들은 여러 강글리오사이드에 대해 병용투여 효과를 실험한 결과 GM3(monosialodihexo sylganglioside)가 가장 높은 약리 활성을 가짐을 확인하였다.

상기 GM3는 NANA-Gal-Glc-ceramide의 구조로 이루어지며, 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

상기 NANA는 하기 화학식 2로 표시되는 N-아세틸-알파-뉴라미니데이트 (N-Acetyl--neuraminidate)이다.

[화학식 2]

상기 강글리오사이드의 당쇄체는 강글리오사이드에 당이 첨가된 화합물로, 일 예로 상기 당쇄체는 3'-시아릴락토오스(3'-Sialyllactose), 6'-시아릴락토오스(6'-sialyllactose), α2-3시알릴락토오스(α2-3sialyl lactose)일 수 있다. 본 발명자들은 상기 당쇄체들이 세포독성 약물의 협동 작용으로 인하여 암세포 생존이 현저히 억제됨을 확인하였으며, 특히 α2-3시알릴락토오스와 세포독성 약물의 협동 작용으로 인하여 암세포 생존이 현저히 억제됨을 확인하였다.

세포독성 약물(cytotoxic drug)은 세포에 독성을 유발하는 약물로, 세포의 증식분화기능을 저해하며, 세포분열을 할 때 염색체 복제 이전 단계에서 염색체의 활성을 방해할 수 있다.

활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물은 활성산소종(ROS) 생성을 증가시켜 세포사멸(apoptosis)을 유발함으로써 항암효과를 나타내는 약물을 의미한다(Gina Manda et al., Current Chemical Biology, 2009, 3, 342-366, Damian G. Deavall et al., Journal of Toxicology, 2012, 13, Giuseppina Barrera, Oncology, 2012). 상기 활성산소(ROS)는 인체 대사활동에 의해 발생되는 산소 부산물로 세포의 성장과 분화를 돕고 염증을 억제하는 유익한 기능을 하는 한편 세포손상을 유발하여 암, 당뇨 등 여러 질병을 일으키고, 노화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

일 예로, 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물은 빈블라스틴(vinblastine), 마이토마이신(mitomycin), 시스플라틴(cisplatin, cis-diamminedichloroplatinum), 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 캠토테신(camptothecin), 이노스타마이신(inostamycin), 또는 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)일 수 있다.

본 발명자들은 시스플라틴을 강글리오사이드, 또는 그의 당쇄체와 같이 투여했을 때, 협동 작용으로 인한 우수한 항암 효과를 확인하였다(실시예 1). 또한, 상기 병용 투여 효과는 상기 약물의 활성산소종 생성 유도 및 이로 인한 암세포사멸 유도에 의한 것임을 확인하였다(실시예 2). 따라서 시스플라틴과 같이 활성산소종의 생성을 유도하는 세포독성 약물을 강글리오사이드, 또는 그의 당쇄체와 같이 투여했을 때 동일한 효과를 나타낼 수 있다.

상기 유효성분인 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체, 및 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물의 함량은 이에 제한되지 않으나 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물은 전체 유효성분 대비 0.001 내지 99.999중량부로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 활성산소종 생성 또는 축적을 유도하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 부작용이 있는 세포독성 약물을 소량 섭취하더라도 강글리오사이드 또는 그의 당쇄체와의 협동 작용으로 인하여 부작용을 최소화하면서도 암세포 활성 억제를 극대화할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 암이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 상기 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 강글리오사이드 또는 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물의 단독 처리에 비해 세포독성 약물의 부작용을 최소화하면서 상승된 항암효과를 나타낼 수 있다.

특히, 시스플라틴, 독소루비신 등 기존에 사용되는 세포독성 약물에 내성을 갖는 암 환자에 효과적으로 작용할 수 있다.

도 1은 항암활성에 대한 시스플라틴과 GM3 당쇄체의 협력 효과를 나타낸 것으로, 도 1a는 시스플라틴 및 GM3를, 도 1b는 시스플라틴 및 α2-3시알릴락토오스를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2f는 대장암세포 HCT116에서 시스플라틴 처리에 의한 활성산소종 생성 유도 및 이로 인한 암세포 사멸 유도를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 대장암세포 HCT116에서 시스플라틴 처리 시 GM3 합성효소의 발현 및 그 생성물인 GM3가 증가함을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 시스플라틴 및 GM3 당쇄체의 병용 투여 효과: 대장암세포주 HCT116의 생존 확인

시스플라틴 및 GM3 당쇄체의 병용 투여에 의한 항암효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 XTT 증식 어세이를 이용하여 암세포의 생존율을 측정하는 실험을 진행하였다.

인간 대장암세포주 HCT116은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, JBI, 대한민국 대구) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가하여 37, 5% CO2에서 배양하였다.

상업적으로 판매되는 증식 키트 Ⅱ(XTT; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 사용하여 세포의 증식을 확인하였다. EGM-2 배지(DMEM 및 10% FBS 배지) 100 μl에 상기 대장암세포주를 웰당 1x10³ 세포 농도로 96-웰 배양 플레이트 분주하여 배양하였다. 배양 24시간 후, 96-웰 플레이트내의 배지를 버리고 1% FBS를 함유하는 새로운 EBM-2 배지 100 μl로 교체하였다. 상기 새로운 EBM-2 배지에는 다양한 농도의 시스플라틴(동아제약, 서울, 대한민국)과 GM3 또는 α2-3시알릴락토오스(α2-3sialyllactose)를 첨가하였다.

이후 상기 플레이트를 5% CO2 조건의 인큐베이터 내에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 5 ml의 XTT-표지 시약과 100 μl의 전자 결합 시약 (electron coupling reagent)을 혼합하여 제조한 50 μl의 XTT 시험 시약을 각 웰에 가했다. 5% CO2 조건의 인큐베이터 내에서 37℃로 4시간 배양 한 후, ELISA 리더(Molecular Devices, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 시스플라틴 및 GM3 당쇄체의 병용 투여에 의한 세포 생존율을 도 1a, 도 1b, 및 하기 표 1, 2에 나타내었다.

시스플라틴 (μg/ml)	0	10	30	0	0	10	10	30	30
GM3 (μM)	0	0	0	10	20	10	20	20	30
세포생존율 (대조군 대비%)	100	77.3±10.4	68.7±50.5	94.8±3.7	89.2±4.4	50.5±3.5	28.6±3.6	13.2±2.3	6.5±0.3

시스플라틴 (μg/ml)	0	0	0	10	10	30	30
α2-3시알릴락토오스 (μM)	5	10	30	5	10	20	30
세포생존율 (대조군 대비%)	80.6±5.5	70.4±7.6	52.3±6.4	42.3±4.1	26.6±3.3	13.2±0.5	7.3±0.5

도 1a, 도 1b에 도시된 것과 같이, 시스플라틴을 10 μg/ml의 농도로 단독 처리한 경우, 대장암세포주는 77.3±10.4 (%) 의 세포생존율을 나타내었으나, 여기에 GM3 10μM 을 처리한 결과 50.5±3.5(%)의 생존율을 보여 2배 이상 생존율이 감소하였으며, GM3 20μM 을 처리한 결과 28.6±3.6(%)의 생존율을 보여 3배 이상 생존율이 감소하였다. 따라서, 각각 처리하였을 때에 비하여 시스플라틴과 GM3을 병용 투여하였을 때 매우 우수한 항암효과가 있음을 확인하였다.

또한, 시스플라틴과 GM3의 당쇄체인 α2-3시알릴락토오스를 병용투여한 결과, GM3에 비하여 세포 생존율이 더 낮게 나타났음을 확인하였다.

따라서 시스플라틴을 소량 섭취하더라도 시스플라틴과 GM3 또는 그의 당쇄체의 협동 작용으로 인하여 우수한 항암 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 활성산소종 생성 유도 및 이로 인한 암세포사멸 유도 확인

(1) DNA 단편화 유발 효과

시스플라틴이 HCT116 대장암세포에 세포사를 유도하는지 확인하기 위하여 대장암세포에 여러 가지 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. 시스플라틴-처리된 HCT116 세포로부터 DNA를 분리하여 2% 아가로오스 젤 전기영동으로 분석하였다.

도 2a는 상기 DNA를 EtBr(ethidium bromide)로 염색하고 UV 하에서 발색하여 나타낸 것이다. 시스플라틴 30 μg/ml에서 DNA 단편화가 관찰되었다. 이와 같이 시스플라틴은 DNA의 단편화를 유발함을 확인하였다.

(2) 시스플라틴에 의한 세포 내 활성산소종(ROS)의 생성여부 확인

ROS생성이 시스플라틴에 의한 세포사나 세포독성의 중요한 원인이라는 사실은 알려져 있다(Benhar M et al. (2001) Mol Cell Biol 21: 6913-6926). 이에, 시스플라틴의 처리가 대장암의 세포 내 산화환원(redox) 상태에 대한 미치는 영향을 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 진행하였다.

HCT116 대장암세포에 ROS 저해제로서 항산화물질인 NAC (N-acetyl-L- cysteine, Molecular ProbesTM, Invitogen, 캐나다)를 10 nM 전처리하고, 30μg/mL 시스플라틴을 처리하였다. 이후 10μM 의 H2DCFDA (dichlorodi hydrofluorescein diacetate, Molecular Probes, Carlsbad, CA) 시약으로 염색하였다. 이 후 세포를 DMEM-10% FBS로 2번 세척하고, DMEM으로 희석시킨 10μM H2DCFDA 시약을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, PBS로 세척하고 트립신(trypsin)을 처리하였다. 분리된 세포들을 차가운 얼음에 보관한 PBS로 2회 세척하고, PBS로 다시 부유시켜 유세포 분석기(flow cytometry; FACS Calibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA)로 형광강도를 측정하였다.

시스플라틴을 처리하지 않은 대조군을 1로 한 뒤 이에 대비하여 증가한 배수를 결과로 나타내었다. Data 는 3번 실험측정치의 mean±SD이다(***P < 0.001 vs. 시스플라틴-처리 실험군).

도 2b 내지 도 2d는 ROS의 생성 비율(%)을 나타낸 것으로, Con은 대조군(무처리), CDPP는 시스플라틴을 의미한다. ROS의 생성은 시스플라틴을 처리하지 않은 세포에 비해서 처리를 한 세포에서 크게 증가하였다.

또한, 시스플라틴을 처리한 상태에서 ROS 저해제로서 항산화물질인 NAC를 농도를 높여가며 처리하자 세포 안의 ROS 축적은 점차 감소하였다.

(3) ROS 생성 및 축적에 의한 세포사멸 유도 확인

시스플라틴이 미토콘드리아-의존성 세포사를 유발하는 신호물질들에 미치는 영향, 및 항암유전자로 알려진 p53 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 아래와 같은 실험을 진행하였다.

상기 (2)의 HCT116 대장암세포를 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.02% NaN3, 100 mg/mL PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 mg/mL 아프로티닌(aprotinin), 및 1% Triton X-100를 포함하는 버퍼에서 파쇄하였다. 그 후 단백질 농도를 바이오-라드 단백질 어세이(Bio-Rad, Richmond, CA)를 통하여 측정하였다.

30 mg의 총 세포 파쇄물(lysate)을 SDS-PAGE로 분획하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시켰다. 전기영동은 Hoefer electrotransfer system(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하였다.

항-PARP(poly (ADP-ribosyl) polymerase), 항-BCL-2, 항-Bax, 및 항-p53 항체는 산타크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 캐나다)에서, 항-GAPDH (Anti-glyceraldehyde-3-phosphate -hydrogenase)는 케미콘(Chemicon, Temecula, LA, 미국)에서 구입하였다.

목적 단백질을 확인하기 위하여, 상기 막에 각 항체를 처리하고 배양하였다. 그 후 서양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)가 부착된 안티 마우스 및 안티 래빗 2차 항체(Santa Cruz), 및 ECL 화학발광 시스템(ECL chemiluminescence system; Amersham Biosciences)을 사용하여 목적 단백질을 검출하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다.

도 2e는 대장암세포 HCT116에서 전체 단백질을 분리한 후 각각의 항체를 이용하여 PARP, BCL-2, Bax, p53에 대하여 면역 블로팅 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다.

HCT116 대장암세포에 시스플라틴을 처리하면 p53과 Bax발현이 증가하지만 Bcl-2발현은 감소하였다. 나아가 시스플라틴을 처리한 결과 세포안의 PARP분해가 급격히 증가하였는데, 이는 미토콘드리아막의 전위(potential) 감소가 원인으로 알려진 사이토크롬(cytochrome) c 방출에 의하여 캐스페이즈(caspase)가 활성화되었기 때문이다.

한편, NAC 10 nM로 전처리한 뒤에 시스플라틴 30 μg/mL를 첨가한 HCT116세포에 대하여 상기 (3)과 동일한 방법으로 면역 블로팅 분석을 진행하여 그 결과를 도 2f에 나타내었다.

도 2f와 같이, 시스플라틴이 세포사멸 관련 단백질인 Bax와 p53발현을 촉진하고 PARP 절단을 유발하며 항세포사 단백질인 Bcl-2발현을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 시스플라틴이 사람 대장암세포에 미치는 효과는 NAC에 의해 저해되었다. 즉, NAC가 ROS 생성을 억제하는 능력과 비례하여, NAC가 동시에 시스플라틴존재 하에서 세포사와 관련된 신호들을 억제하는 활성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 시스플라틴의 항암활성은 ROS생성을 유발하는 것으로 이것이 HCT116 세포의 세포사의 핵심임을 확인하였다.

(4) 시스플라틴의 세포 내 GM3 생성 촉진 효과 확인

강글리오사이드 GM3 합성효소와 그 생성물을 대장암세포 HCT116에서 과발현하였다. 구체적으로, GM3 합성효소 발현 플라스미드를 구축하기 위해, 인간 GM3 합성효소 암호영역을 함유하는 1.1kb DNA단편을 PCR증폭하였다. 사람 태아 뇌 cDNA를 주형으로 사용하였으며, 하기 표 3의 프라이머를 사용하였다. 프라이머에는 Hind III 와 Eco RI 제한효소 절단 부위가 존재하도록 제작하였다(밑줄 표시).

방향	서열	서열번호
센스	5'-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3'	1
안티-센스	5'-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3'	2

증폭단편은 Wizard SV Gel과 PCR Clean-Up System(Promega)을 이용하여 1% 아가로오스 젤로부터 분리하고 제한효소로 절단한 후 T4 ligase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)로 pcDNA3 벡터 내에 삽입시켜 pcDNA-GM3을 제작하였다. 그 후 제한 지도를 작성하고 DNA 시퀀싱을 실시하여 GM3 합성효소 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.

6-웰 플레이트에서 웰 당 10⁵ 세포의 밀도로 HCT116 세포를 배양하였다. WelFect-EXTM PLUS 방법(JBI)을 이용하여 1 μg의 pcDNA 또는 pcDNA-GM3 플라스미드로 세포를 형질전환시켰다. 배양한 후 형질전환 세포주들을 500 μg/mL G418 (Life Technologies, Inc.)를 포함하는 선택 배지에서 21일 배양 한 후, 각 G418-내성 콜로니들을 분리하였다.

그 후, 상기 대장암세포 HCT116에 시스플라틴을 12시간 동안 처리한 뒤, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen)으로 총 RNA를 분리하고, 분리된 RNA 1μg을 올리고(oligo) dT 프라이머 및 AccuPower RT-PreMix (Bioneer Co., 대전, 대한민국) 시약을 이용하여 역전사 PCR을 실시하였다.

GM3 합성효소, GM2 합성효소, GalNAc-T(GM2/GD2 합성효소), β-액틴(actin)의 cDNA를 하기 표 4의 프라이머 EF-Taq 중합효소(SolGent, 서울, 대한민국)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 역전사 PCR의 실행 여부를 확인하기 위하여 상기 -액틴을 이용하여 동량의 mRNA에 대하여 역전사 PCR을 실시하였다(대조군).

목적 유전자	방향	서열	서열번호
GM3 합성효소 (413 bp)	센스 프라이머	5'-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3'	3
	안티-센스 프라이머	5'-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3'	4
GD3 합성효소 (460 bp)	센스 프라이머	5'-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3'	5
	안티-센스 프라이머	5'-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3'	6
GalNAc-T (230 bp)	센스 프라이머	5'-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3'	7
	안티-센스 프라이머	5'-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3'	8
β-액틴 (247 bp)	센스 프라이머	5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3'	9
	안티-센스 프라이머	5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'	10

PCR 산물은 0.5 x TAE (Tris-acetate-EDTA) 버퍼 및 EtBr(ethidium bromide)을 포함하는 1.5% 아가로오스 젤에서 전기영동을 이용하여 분리하였다.

막 조성의 변화로 인하여 세포 사멸이 유도될 수 있음이 알려져 있다(dAzzo A et al. (2006) Cell Death Differ 13: 404.414, Iwamori M & Iwamori Y (2005) Glycoconj J 22: 119.126). 시스플라틴이 HCT116 대장암세포에서 GM2와 GD3 합성 효소 유전자들의 발현을 조절하고 결과적으로 ganglioside GM2와 GD3가 생성이 조절되는지 조사하였으나 이들 유전자와 생성물의 변화가 보이지 않았다(도 3a).

한편, 도 3b에 나타난 것과 같이, 시스플라틴은 시스플라틴을 처리한 세포사 유발조건에서 대장암세포 HCT116의 GM3 합성효소 발현을 증대시킴을 확인하였다.

또한, Choi HJ 등(FEBS Lett 555: 204-208, 2003)에 기재된 것과 같이 프로모터가 없는 발광효소 벡터 pGL3-Basic(Promega)의 해당 위치에 23번의 프로모터 가상영역이 존재하는 Sac I/Bgl II 단편들을 삽입시켜 리포터 플라스미드(reporter plasmid)인 pGL3-1600을 제작하였다.

세포를 6웰 플레이트에서 웰 당 10⁵ 세포수의 밀도로 밤새 배양하였다. 그 후, 상기 프로모터(pGL3-1600) 또는 그 CREB 변이 프로모터(pGL3-1600 CREB Mu) 0.5 pmol 및 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 플라스미드 0.5 mg을 WelFect-EXTM PLUS method (JBI)를 이용하여 함께 대장암세포 HCT116에 도입하였다. 상기 세포는 10% FBS 및 시스플라틴을 포함하는 배지에서 12시간 동안 배양되었다. 발광효소와 베타-갈락토시다아제의 활성은 발광효소와 베타-갈락토시다아제 효소 어세이 시스템(Luciferase, β-galactosidase enzyme assay system, Promega)으로 측정하였다. 발광효소의 활성은 세포 파쇄물에서의 베타-갈락토시다아제 활성에 대하여 표준화하였고, 결과는 3회 실험에서 각 3번씩 측정수치의 means±SD로 나타내었다(***P < 0.001 vs. 시스플라틴-처리 실험군).

그 결과, 도 3c에 도시된 것과 같이, GM3 합성효소 유전자의 프로모터를 포함하는 pGL3-1600을 도입한 대장암세포 HCT116에서 시스플라틴 처리 후에 GM3 합성효소의 발현이 증대됨을 확인하였다.

또한, 대장암세포 HCT116를 6 웰 배양 플래이트 상의 12mm 직경의 멸균된 커버 슬립에 올려놓았다. 세포를 3.7% 포름알데히드/PBS에 고정시킨 후, PBS로 3회 세척하고 5분 동안 실온에서 0.5% 트윈-20/PBS로 투과하였다. 1% 소혈청알부민(BSA)를 포함하는 PBS로 비특이적 위치를 30분 동안 블로킹하였다. 그 후, GM3 (M2590, Biotest Laboratories, 일본), GD3 또는 GM2-특이적 항체를 세포에 잠기게 두고 밤새 4℃에서 배양하였다. 그 후 PBS로 세척하고, 세포를 FITC 결합된 항-마우스 IgM과 함께 30분 동안 실온에서 배양하였다. 다시 PBS로 세척하고, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 포함하는 항-페이드 시약(fade reagent, Molecular Probes)을 고정시켰다.

형광 현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 상기 슬라이드를 분석하였다. 2차 항체만을 미리-흡수시킨 경우를 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다.

도 3d에 도시된 것과 같이, 시스플라틴을 처리한 대장암세포 HCT116에서 GM3의 발현이 증가하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 강글리오사이드 또는 활성산소종 생성을 유도하는 세포독성 약물의 단독 처리에 비해 세포독성 약물의 부작용을 최소화하면서 상승된 항암효과를 나타낼 수 있다.

나아가, 기존에 사용되는 세포독성 약물에 내성을 갖는 암 환자에 효과적으로 작용할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Phamaceutical combination comprising ganglioside for the treatment of cancer <130> KPA140446-KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(sense) <400> 1 ctaagcttat gagaaggccc agcttgttat taaaagacat c 41 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(anti-sense) <400> 2 atgaattcgt tcaaaattca cgatcaatgc ctccactgag atc 43 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(sense) for GM3 synthase <400> 3 ccctgccatt ctgggtacga c 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(anti-sense) for GM3 synthase <400> 4 cacgatcaat gcctccactg agatc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(sense) for GD3 synthase <400> 5 tgtggtccag aaagacattt gtgga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(anti-sense) for GD3 synthase <400> 6 tggagtgagg tatcttcaca tgggt 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(sense) for GalNAc-T <400> 7 ccaactcaac aggcaactac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(anti-sense) for GalNAc-T <400> 8 gatcataacg gaggaaggtc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(sense) for beta-actin <400> 9 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(anti-sense) for beta-actin <400> 10 tccttctgca tcctgtcggc a 21

Claims (5)

1. 강글리오사이드 GM3 (monosialodihexo sylganglioside) 또는 α2-3시알릴락토오스 (α2-3 sialyllactose), 및 세포독성 약물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 세포독성 약물은 시스플라틴(cisplatin)인 것인, 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 활성산소종 생성 또는 축적을 유도하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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