KR101744385B1 - Hydrogel Micro-pattern on Nanoporous Membrane, Manufacturing Method Thereof and Cell Floating Culture Device Using The Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막, 이 나노투과막의 제조방법, 및 상기 나노투과막을 포함한 세포 배양장치에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 3차원 구조를 갖는 나노투과막상에 선택적인 위치에서 하이드로젤 마이크로 패터닝이 가능하다. 또한, 3차원 구조를 갖는 나노투과막상에 세포와 생리활성 물질을 함께 또는 분리하여 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 패터닝을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 하이드로젤 마이크로 패터닝된 나노투과막 및 이를 포함하는 3차원 세포 배양장치는 인체모방이 가능한 3차원 미세환경을 제공하므로 조직공학, 세포분화, 세포를 기초로 한 진단기술 및 약물 스크리닝 분야에 적용할 수 있다. The present invention relates to a nanofiltration membrane in which a hydrogel microstructure is patterned, a method for manufacturing the nanofiltration membrane, and a cell culture apparatus including the nanofiltration membrane. According to the present invention, hydrogel micro patterning is possible at a selective position on a nano permeable membrane having a three-dimensional structure. In addition, encapsulated hydrogel micropatterning can be provided by separating the cells and the physiologically active substance together or separating them on a nano permeable membrane having a three-dimensional structure. In addition, the hydrogel micropatterned nanofiltration membrane of the present invention and the three-dimensional cell culture apparatus including the nanofiltration membrane of the present invention provide a three-dimensional micro environment capable of mimicking the human body, and thus can be applied to tissue engineering, cell differentiation, It can be applied to the field.
Description
본 발명은 나노투과막상의 하이드로젤 마이크로 구조체와 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 부유 배양 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a nanoporous membrane-like hydrogel microstructure, a method for manufacturing the same, and a cell suspension culture apparatus using the same.
하이드로젤(hydrogel)은 고유의 생체적합성이 있어 세포고정화 및 전달에 사용될 수 있는 생체적합성 고분자 재료이다. 하이드로젤은 물을 분산매로 하는 젤로서 화학적 반응, 열에 의한 반응 또는 빛에 의한 반응에 의하여 가교결합(cross-linked bond)을 이룬다. 포토리소그래피(photolithography)와 같이 빛에 의해 수행되는 하이드로젤의 가교결합은 복잡한 구조체를 가장 정확하게 만드는 방법이다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 광가교 결합성 생체재료로써, 생활성 물질의 방출조절, 재생의학(regenerative medicine), 또는 줄기세포분화(stem cell differentiation)분야에 많이 응용된다. 특히, 말단기가 메타크릴염(methacrylate) 또는 아크릴계(acrylate group)로 처리된 PEG는 광개시제(photoinitiator)를 첨가하여 자외선에 노출시키면 빠른 가교결합(cross-linked bond)을 하는 특성이 있어 포토리소그래피 공정에 많이 사용된다. 이러한 PEG의 광가교결합 특성은 세포 미세환경 상호작용(cell-microenvironment interaction) 또는 생체모방조직(biomimetic tissue)을 제조하는데 사용될 수 있다. Hydrogel is a biocompatible polymeric material that has inherent biocompatibility and can be used for cell immobilization and delivery. Hydrogels are gels with water as a dispersion medium and cross-linked by chemical reaction, heat reaction or light reaction. Crosslinking of hydrogels performed by light, such as photolithography, is the most accurate way to make complex structures. BACKGROUND ART Polyethylene glycol (PEG) is a photo-crosslinkable biomaterial, and is widely applied to the regulation of release of bioactive materials, regenerative medicine, or stem cell differentiation. Particularly, PEG having a methacrylate or acrylate group as a terminal group has a characteristic of cross-linked bond when it is exposed to ultraviolet rays by adding a photoinitiator. Thus, the photolithography process It is widely used. The photocrosslinking properties of such PEGs can be used to produce cell-microenvironmental interactions or biomimetic tissue.
하이드로젤-마이크로시스템(hydrogel-microsystem)을 기초로 한 조직공학은 재생의학 또는 암세포연구에서 활용되고 있다. Tissue engineering based on the hydrogel-microsystem has been used in regenerative medicine or cancer cell research.
하이드로젤-마이크로패터닝(hydrogel-micropatterning)은 하이드로젤을 미세하게 패턴화하고 각 하이드로젤에 세포 또는 생활성물질(bioactive material)을 첨가하여 미세환경을 조절하는 기술로 세포캡슐화연구, 세포응집 연구 및 세포간 상호작용 연구에 활용되고 있다. Hydrogel-micropatterning is a technique to finely pattern a hydrogel and control the microenvironment by adding a cell or a bioactive material to each hydrogel. It is used for cell encapsulation studies, cell aggregation studies, Cell interactions.
포토리소그래피, 현적방법(hanging drop) 및 마이크로주형(micro-mold)방법과 같은 하이드로젤-마이크로패터닝(hydrogel-micropatterning)은 특정한 세포에 적용되는 생활성물질(bioactive substance)을 이용하여 세포의 미세환경을 구성할 수 있으므로 적은 양의 세포와 생활성물질만으로도 다양한 실험을 수행할 수 있는 장점이 있다. Hydrogel-micropatterning, such as photolithography, hanging drop, and micro-mold methods, uses a bioactive substance applied to a specific cell, It is possible to perform various experiments with only a small amount of cells and bioactive substances.
특히, 포토리소그래피를 기초로 한 하이드로젤-마이크로패터닝은 매우 간단하고 정확하게 패턴을 형성할 수 있다. Kahp Y. Suh 등은 간단한 방법으로 유리 기판 위에 패턴을 형성하여 세포캡슐화 및 세포간 결합을 보여주었다. 그러나 이런 장점에도 불구하고, 유리 기판 또는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 기판과 같은 고정기판에서 이루어진 패턴은 2D 구조체라는 한계가 있다. 이처럼 하이드로젤을 기초로 한 마이크로 패터닝 기술은 플라스틱 플레이트와 슬라이드 글라스와 같은 기판의 사용으로 인한 제한이 있다. In particular, hydrogel-micro patterning based on photolithography can form a pattern very simply and accurately. Kahp Y. Suh et al. Formed a pattern on a glass substrate by a simple method and showed cell encapsulation and intercellular binding. Despite these advantages, however, the pattern formed on a fixed substrate, such as a glass substrate or a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, is a 2D structure. Such hydrogel based micropatterning techniques are limited by the use of substrates such as plastic plates and slide glasses.
종래의 포토리소그래피공정은 UV 방사선을 광결합이 가능한 폴리머 용액에 직접적인 노출시킴으로 하이드로젤-마이크로패턴을 제작하였다. 상기방법은 투명성이 뛰어난 유리를 기초로 한 기판 위에 원하는 크기와 모양을 완벽하게 제어하여 만들 수 있다. 기판 때문에 3차원의 미세환경을 만들어낼 수 없었던 단점은 다공성인 나노투과막(nanofiber membrane)을 사용함으로 상기의 한계를 극복할 수 있다. 전기 방사로 제작된 나노투과막은 특유의 망목구조로 인하여 조직 지지체로서 재생의학(regenerative medicine)에 응용될 수 있어 주목받고 있다. 망목구조는 실제 생체조직과 매우 유사하여 생체모방의 미세환경을 구현 할 수 있다. 나노투과막의 특징은 생체 적합성이 뛰어나고 말단 그룹이 기능화된 재료로 이루어진 완벽한 단일 구조체를 만들어 낼 수 있다는 점이다. 그러므로 나노투과막과 결합된 하이드로젤 마이크로 패턴은 나노투과막-하이드로젤 이중층을 토대로 실제의 3차원의 환경을 만들어낼 수 있다.Conventional photolithography processes have produced hydrogel-micropatterns by directly exposing UV radiation to optically-bondable polymer solutions. The above method can be achieved by perfectly controlling the desired size and shape on a glass-based substrate having excellent transparency. The disadvantage that the substrate can not create a three-dimensional micro environment due to the substrate can overcome the above limitation by using a porous nanofiber membrane. Nanofiber membranes fabricated by electrospinning have attracted attention because they can be applied to regenerative medicine as a tissue scaffold because of its unique network structure. The network structure is very similar to the actual living tissue, so that a micro environment of biomimetic can be realized. The nano-permeable membrane is characterized by its excellent biocompatibility and its ability to produce a complete single structure of functionalized end groups. Therefore, the hydrogel micropattern combined with the nanoporous membrane can create an actual three-dimensional environment based on the nanofiber membrane-hydrogel bilayer.
그러나 상기 시스템의 세포가 미디어 속에서 배양되면 구조체의 패턴과 패턴 사이의 확산 방향이 무작위로 되는 단점이 있다. 상기 현상은 세포간 결합 또는 세포 거동의 효과를 감소시킨다. 몇몇의 연구자들은 3차원의 하이드로젤 마이크로 구조체와 전기 방사된 나노투과막에 결합된 하이드로젤 마이크로 구조체를 구현하였으나, 패턴에서 패턴으로 또는 패턴에서 기판방향으로의 선택적인 확산을 조절 할 수 없었다. 상기 단점을 극복하고 나노투과막의 다양한 활용을 위하여 세포 부유 배양 장치는 멤브레인의 동적이고 선택적인 확산을 위한 최고의 응용방법이 될 수 있다. 그러나 앞선 연구에서는 세포 부유 배양 장치로부터의 확산은 위에서 아래의 방향인 하이드로젤 마이크로 패턴-나노막으로 제한된다. 이는 생리활성 물질에 의한 세포 신호 또는 세포 거동의 세포간 결합을 가속시켜줄 수 있으나 모든 방향에서의 선택적인 확산을 보여주기 위해서는 선택적인 패터닝이 필요하다. However, when the cells of the system are cultured in media, there is a disadvantage that the diffusion direction between the pattern and the pattern of the structure becomes random. This phenomenon reduces the effect of intercellular binding or cell movement. Some researchers have implemented hydrogel microstructures bonded to three-dimensional hydrogel microstructures and electrospun nanotransflective membranes, but they have not been able to control selective diffusion from pattern to pattern or from pattern to substrate. In order to overcome the above disadvantages and to utilize various kinds of nano permeable membranes, the cell suspension culture apparatus can be the best application method for the dynamic and selective diffusion of the membrane. However, in the previous study, diffusion from the cell suspension culture system was limited to hydrogel micropattern-nanofibers in the downward direction. This may accelerate the intercellular binding of cellular signals or cell behavior by physiologically active substances, but selective patterning is required to demonstrate selective diffusion in all directions.
요약하자면, 이전의 하이드로젤 마이크로 패터닝 연구는 포토리소그래피를 기초로 했다. 이 패터닝 기술에서, PEG하이드로젤의 광가교결합 특성으로 인해 하이드로젤 마이크로 구조체를 형성하는데 쓰였다. 이런 기술은 간단하고 정확하다는 특성을 가지나, 유리나 PDMS 같은 정적인 기판으로 인해 2차원적인 구조체라는 한계를 갖는다. In summary, previous hydrogel micro patterning studies were based on photolithography. In this patterning technique, it was used to form hydrogel microstructures due to the photo-crosslinking properties of PEG hydrogels. This technique is simple and accurate, but has the limitation of a two-dimensional structure due to a static substrate such as glass or PDMS.
3차원적인 구조체를 위해, 몇몇의 연구는 마이크로 주형 또는 전기 방사된 나노투과막을 사용하였으나, 선택적이고 동적인 확산방법은 수행할 수 없었다. 또한 몇몇의 연구자들은 세포 부유 배양 시스템을 시도하였으나, 위에서 아래로의 확산방향만 보여줄 뿐 좌우를 포함한 전 방향으로의 선택적인 확산은 하지 못했다.
For the three-dimensional structure, some studies have used microtextured or electrospun nanofiber membranes, but selective and dynamic diffusion methods could not be performed. In addition, several researchers have attempted a cell suspension culture system, but not only in the direction of diffusion from top to bottom, but in all directions including left and right.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다. The patent documents and references cited herein are hereby incorporated by reference to the same extent as if each reference was individually and clearly identified by reference.
본 발명자들은 하이드로젤 마이크로 패터닝을 통해 3차원 생체모방 미세환경을 제공하기 위하여 연구 노력한 결과, 폴리디메틸실록산 오목주형을 이용하여 HepG2 세포와 VEGF가 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 구조체를 폴리에테르설폰 나노투과막상에 성공적으로 패터닝하고 이를 세포 부유 배양장치에서 배양하여 세포의 기능을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다. As a result of efforts to provide a three-dimensional biomimetic microenvironment through hydrogel micropatterning, the present inventors have found that a hydrogel microstructure encapsulating HepG2 cells and VEGF using a polydimethylsiloxane concave template is formed on a polyether sulfone nanotransfer membrane The present invention has been accomplished by successfully patterning and culturing it in a cell suspension culture apparatus to confirm the function of the cells.
본 발명의 목적은 오목주형을 이용하여 나노투과막상에 하이드로젤 마이크로 구조체를 패터닝하는 방법을 제공하는 것에 있다. It is an object of the present invention to provide a method of patterning a hydrogel microstructure on a nano permeable membrane using a concave mold.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노 투과막을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide a nanotransflective film patterned with the hydrogel microstructure fabricated by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 투과막을 포함하는 세포 부유 배양 장치를 제공하는 것에 있다.
It is still another object of the present invention to provide a cell suspension culture apparatus including the nanofiltration membrane.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다. Other objects and technical features of the present invention will be described in more detail with reference to the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 나노투과막상에 하이드로젤 마이크로 구조체를 패터닝하는 방법을 제공한다: According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method of patterning a hydrogel microstructure on a nanoporous membrane comprising the steps of:
(a) 오목면을 갖는 주형(mold)을 준비하는 단계; (a) preparing a mold having a concave surface;
(b) 상기 주형의 오목면에 광경화성 폴리머를 채우는 단계; (b) filling the concave surface of the mold with a photocurable polymer;
(c) 상기 오목면에 광경화성 폴리머가 채워진 주형상에 나노투과막을 씌우는 단계; (c) covering the concave surface with a photocurable polymer;
(d) 상기 나노투과막이 씌워진 주형상에 광을 조사하는 단계; 및 (d) irradiating light onto the main shape covered with the nano-permeable membrane; And
(e) 상기 주형을 제거하는 단계.
(e) removing the template.
단계(a): 오목면을 갖는 주형(mold)을 준비하는 단계 Step (a): preparing a mold having a concave surface
먼저, 하이드로젤 마이크로 구조체를 형성하기 위한 오목면을 갖는 주형을 제조한다. 본 발명의 오목면을 갖는 주형은 다수의 음각패턴이 형성된 고분자로 제조할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 오목면을 갖는 주형은 실리콘(silicon) 재질로 제조된다. First, a mold having a concave surface for forming a hydrogel microstructure is manufactured. The mold having the concave surface of the present invention can be made of a polymer having many engraved patterns. According to an embodiment of the present invention, the mold having the concave surface is made of a silicon material.
상기 실리콘(silicone)은 규소와 산소의 결합(...-Si-O-Si-O-...)을 주축으로 하는 중합체를 의미한다. 결정 형태의 실리콘에 염화메틸(CH3Cl)을 반응시켜 디메틸디클로로실란(dichlorodimethylsilane)을 합성한 후 가수분해 시키면 실록산 결합이 형성된다. The silicone refers to a polymer having a silicon-oxygen bond (-Si-O-Si-O- ...) as a main axis. Synthesis of dimethyldichlorosilane by reacting silicon with methyl chloride (CH 3 Cl) in the crystalline form followed by hydrolysis yields siloxane bonds.
상기 실리콘은 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 또는 올리고실록산(oligosiloxane)으로 이루어진 실리콘 수지를 사용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다. The silicone may preferably be a silicone resin composed of polydimethylsiloxane (PDMS) or oligosiloxane, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 오목면을 갖는 주형은 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조한다. According to one embodiment of the present invention, the mold having the concave surface is made of polydimethylsiloxane (PDMS).
본 발명에서 오목면의 반경과 오목면 사이의 간격은 패터닝하고자 하는 하이드로젤 마이크로 구조체의 특성에 따라 적합하게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 오목면의 반경은 200 - 300μm, 오목면간의 간격이 400 - 500μm 의 범위에서 선택할 수 있다.
In the present invention, the radius of the concave surface and the distance between the concave surfaces may be appropriately selected according to the characteristics of the hydrogel microstructure to be patterned. Preferably, the radius of the concave surface is 200 to 300 占 퐉, 500 [mu] m.
단계(b): 오목면에 광경화성 폴리머 및 광개시제를 채우는 단계 Step (b): filling the concave surface with a photo-curable polymer and a photoinitiator
상기 제조한 오목면을 갖는 주형에 광경화성 폴리머를 채운다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 광경화성 폴리머는 폴리머 및 광개시제(photoinitiator)를 포함하는 혼합물이다. The mold having the concave surface is filled with a photo-curable polymer. According to one embodiment of the invention, the photocurable polymer is a mixture comprising a polymer and a photoinitiator.
상기 광경화성 폴리머는 자외선(Ultraviolet, UV)에 의해 경화하는 자외선 경화성 폴리머 또는 전자선(Electron Beam)에 의해 경화하는 전자선 경화성 폴리머를 포함한다. The photo-curable polymer includes an ultraviolet curable polymer that is cured by ultraviolet (UV) or an electron beam curable polymer that is cured by an electron beam.
본 발명에서 사용할 수 있는 자외선 경화성 폴리머는 골격분자의 구조에 따라 라디칼 중합(Radical Polymerization) 타입의 폴리에스테르 아크릴레이트, 에폭시 아크릴레이트, 우레탄 아크릴레이트, 폴리에테르 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트 및 실리콘 아크릴레이트가 있으며 양이온 중합(Cationic Polymerization)타입의 치환식 에폭시 수지, 글리시딜에테르 에폭시 수지, 에폭시 아크릴레이트 및 비닐에테르가 있으나 이에 한정되지 않는다. The ultraviolet ray curable polymer that can be used in the present invention may be selected from the group consisting of radically polymerized polyester acrylate, epoxy acrylate, urethane acrylate, polyether acrylate, polyethylene glycol diacrylate, But not limited to, cationic polymerization type substitutional epoxy resins, glycidyl ether epoxy resins, epoxy acrylates, and vinyl ethers.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광경화성 폴리머를 구성하는 폴리머는 폴리에스테르아크릴레이트, 에폭시아크릴레이트, 우레탄아크릴레이트, 폴리에테르아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트, 실리콘아크릴레이트, 치환식 에폭시수지, 글리시딜에테르 에폭시수지, 에폭시 아크릴레이트 또는 비닐에테르로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자 또는 이들의 중합체 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the polymer constituting the photocurable polymer may be at least one selected from the group consisting of polyester acrylate, epoxy acrylate, urethane acrylate, polyether acrylate, polyethylene glycol diacrylate, silicone acrylate, , A glycidyl ether epoxy resin, an epoxy acrylate or a vinyl ether, or a polymer thereof, or a mixture thereof.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 광경화성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트(PEGDA)이다. According to a specific embodiment of the present invention, the photo-curable polymer of the present invention is poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA).
본 발명의 자외선 경화성 폴리머에 사용할 수 있는 광개시제는 라디칼 중합 타입의 벤조인에테르류 및 아민류가 있으며 양이온 중합 타입의 디아조늄염, 요오드늄염, 술포늄염, 메탈노센화합물이 있으나 이에 한정되지 않는다. Photoinitiators that can be used in the ultraviolet curable polymer of the present invention include radical polymerization type benzoin ethers and amines, and cation polymerization type diazonium salts, iodonium salts, sulfonium salts, and metal nosecane compounds, but are not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광개시제는 벤조인에테르류, 아민류, 디아조늄염, 요오드늄염, 술포늄염, 케톤류화합물 또는 메탈노센화합물으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the photoinitiator may be at least one selected from the group consisting of benzoin ethers, amines, diazonium salts, iodonium salts, sulfonium salts, ketone compounds or metal nosecane compounds.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 광개시제는 irgacure2959(Ciba specialty chemical, Germany)이다. According to a specific embodiment of the present invention, the photoinitiator of the present invention is irgacure 2959 (Ciba specialty chemical, Germany).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 광경화성 폴리머는 UV에 의해 경화된다. According to one embodiment of the present invention, the photocurable polymer of the present invention is cured by UV.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 오목면에 광경화성 폴리머를 채우기 전에 오목면에 세포 또는 생리활성물질을 먼저 채우거나, 또는 광경화성 폴리머와 세포 또는 생리활성물질을 혼합한 후 오목면에 채울 수 있다. According to another embodiment of the present invention, before the concave surface is filled with the photocurable polymer, the concave surface may be filled with a cell or a physiologically active substance first, or a photocurable polymer may be mixed with a cell or a physiologically active substance, have.
본 발명에 사용할 수 있는 세포는 간세포, 상피 세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수유래 중간엽 줄기세포, 신경 세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구(B 및 T 림프구), 적혈구, 대식세포, 단핵구, 단핵 세포, 섬유모세포, 심근 세포 및 다른 근육 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. Cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, hepatocytes, epithelial cells, fibroblasts, osteoblasts, cartilage cells, human-derived umbilical cord blood cells, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, neuronal cells, epidermal cells, keratinocytes, hematopoietic cells, But are not limited to, chondrocytes, lymphocytes (B and T lymphocytes), red blood cells, macrophages, monocytes, mononuclear cells, fibroblasts, myocardial cells and other muscle cells.
본 발명의 상기 생리활성물질(physiological active substance)은 미량으로 생체의 기능에 큰 영향을 미치는 물질을 의미한다. 상기 생리활성물질은 예를 들어 비타민, 호르몬, 효소, 신경전달물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 포함하나, 이에 한정된 것은 아니다. The physiological active substance of the present invention means a substance having a very small influence on the function of a living body. The physiologically active substance includes, but is not limited to, one or more substances selected from the group consisting of, for example, vitamins, hormones, enzymes, and neurotransmitters.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생리활성물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 핵산 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. According to one embodiment of the present invention, the physiologically active substance may be one or more substances selected from the group consisting of proteins, peptides, carbohydrates, lipids, nucleic acids and bioactive molecules, but is not limited thereto.
상기 단백질은 화학적으로는 약 20종의 아미노산이 펩티드결합으로 연결되어 있는 생체고분자이며 효소, 구조단백질, 세포골격단백질, 수축성단백질, 접착단백질, 방어단백질(항원 또는 항체), 수용체단백질, 수송단백질 및 영양단백질을 포함하나 이에 한정된 것은 아니다. The protein is a biomolecule having about 20 amino acids chemically linked by a peptide bond, and is an enzyme, a structural protein, a cytoskeletal protein, a shrinkable protein, an adhesive protein, a protective protein (antigen or antibody), a receptor protein, But are not limited to, nutritional proteins.
상기 펩타이드는 아미노산의 중합체로서 항균펩타이드, 디펩타이드(dipeptide), 코퍼펩타이드(copper peptide), 테트라펩타이드(tetrapeptide), 펜타펩타이드(pentapeptide), 헥사펩타이드(hexapeptide), 옥타펩타이드(octapeptide) 및 올리고펩타이드(oligopeptide)를 포함하나 이에 한정된 것은 아니다. The peptide may be a polymer of amino acids, such as an antimicrobial peptide, a dipeptide, a copper peptide, a tetrapeptide, a pentapeptide, a hexapeptide, an octapeptide, and an oligopeptide oligopeptides).
상기 지질은 세포를 구성하는 주요 유기화합물의 하나로 중성지방, 지방산, 인지질 및 콜레스테롤을 포함하나 이에 한정된 것은 아니다. The lipid is one of the main organic compounds constituting the cell, and includes, but not limited to, triglyceride, fatty acid, phospholipid and cholesterol.
상기 탄수화물은 단당류가 결합한 중합체로서 포도당, 과당, 수크로스, 락토스, 녹말, 글리코겐 및 셀룰로스를 포함하나 이에 한정된 것은 아니다. The carbohydrate includes, but is not limited to, glucose, fructose, sucrose, lactose, starch, glycogen and cellulose as the polymer to which the monosaccharide binds.
상기 핵산은 질소를 함유하는 염기, 오탄당 및 인산으로 이루어지는 단일 뉴클레오타이드를 기본 단위로 하여, 각 뉴클레오타이드가 인산 디에스테르 결합으로 중합된 긴 쇄상의 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함하나 이에 한정된 것은 아니다. The nucleic acid includes DNA and RNA as a long-chain polynucleotide in which each nucleotide is polymerized with a phosphate diester linkage, with a single nucleotide consisting of a nitrogen-containing base, a pentose and a phosphoric acid as a basic unit, but is not limited thereto.
본 발명에서 사용할 수 있는 생리활성물질은 바람직하게는 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 또는 화합물 등을 포함하며, 구제척으로, 전환성장인자(transforming growth factor, TGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골형태발생단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자(placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)의 성장인자; 헤파린(heparin), 동물 성장 호르몬(porcine growth hormone, pGH), 인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH), 적혈구 증강제(erythropoietin, EPO), 과립구 집락 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, gCSF), 인터페론 (interferon, INF), 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH), 황체 호르몬(luteinizing hormone, LH), 고세릴린 아세테이트(goserelin acetate), 루프로레인 아세테이트(leuprorelin acetate), 데카The physiologically active substance that can be used in the present invention preferably includes a growth factor, a growth hormone, a peptide or protein drug, an anti-inflammatory agent, an anti-cancer agent, an antiviral agent, a sex hormone, an antibiotic, an antibacterial agent or a compound, A growth factor (TGF), a fibroblast growth factor (FGF), a bone morphogenic protein (BMP), a vascular endothelial growth factor (VEGF) Like growth factor (IGF), a platelet-derived growth factor (PDGF), a nerve growth factor (NGF), an insulin-like growth factor Growth factors of hepatocyte growth factor (HGF), placental growth factor (PIGF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); It has been shown that heparin, porcine growth hormone (pGH), human growth hormone (hGH), erythropoietin (EPO), granulocyte colony stimulating factor (gCSF) interferon, INF), follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), goserelin acetate, leuprorelin acetate,
펩틸(triptorelin acetate), 황체 호르몬 방출 호르몬 작동약(luteinizing hormone-releasing hormone agonist, LH-RH agonist)의 펩타이드 또는 단백질 의약품; 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신 (indomethacin), 이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 피록시캄(piroxicam), 플루비프로펜(flurbiprofen), 디클로페낙(diclofenac)의 소염진통제; 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 캄토테신(camptothecin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracin), 사이토신 아라비노스(cytosine arabinose), 메토트렉세이트(methotrexate)의 항암제; 아시클로버(acyclovir), 루바빈(robavin), 타미플루(tamiflu)의 항바이러스제; 테스토스테론(testosterone), 에스트로젠(estrogen), 프로게스테론(progesterone), 에스트라다이올(estradiol)의 성호르몬; 테트라사이클린(tetracycline), 미노사이클린(minocycline), 독시사이클린(doxycycline), 오플록사신(ofloxacin), 레보프록사신(levofloxacin), 시프로프록사신(ciprofloxacin), 클라리스로마이신(clarthromycin), 에리쓰로마이신(erythromycin), 세파클러(cefaclor), 세포탁심(cefotaxim), 이미페넴(imipenem), 페니실린(penicillin), 겐타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 반코마이신 (vacomycin)의 항생제; 케토코나졸(ketoconanzole), 이트라코나졸(itraconazole), 플루코나졸(fluconazole), 암포테리신-B(amphotericin-B), 니스타틴(mystatin), 그리 세오풀빈(griseofulvin) 등의 항진균제(anti-fungal drug); β-인산글리세롤(β-glycerophosphate), 아스코르베이트(ascorbate), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5-아자사이티딘(5-azacytidine) 등의 화합물 사용될 수 있다.
Triptorelin acetate, peptides or protein drugs of the luteinizing hormone-releasing hormone agonist (LH-RH agonist); Antiinflammatory agents for dexamethasone, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, piroxicam, flurbiprofen, diclofenac; Paclitaxel, doxorubicin, camptothecin, 5-fluorouracin, cytosine arabinose, methotrexate; anticancer agents; Antiviral agents of acyclovir, robavin, and tamiflu; Testosterone, estrogen, progesterone, sex hormone of estradiol; The use of tetracycline, minocycline, doxycycline, ofloxacin, levofloxacin, ciprofloxacin, clarthromycin, erythromycin (e. G. erythromycin, cefaclor, cefotaxim, imipenem, penicillin, gentamicin, streptomycin, antibiotics of vacomycin; Anti-fungal drugs such as ketoconanzole, itraconazole, fluconazole, amphotericin-B, mystatin, and griseofulvin; compounds such as? -glycerophosphate, ascorbate, hydrocortisone, and 5-azacytidine may be used.
단계(c): 오목면에 광경화성 폴리머 및 광개시제가 채워진 주형상에 나노투과막을 씌우는 단계 Step (c): covering the nano-permeable membrane with the main shape filled with the photo-curable polymer and the photoinitiator on the concave surface
상기 주형상의 오목면에 폴리머 및 광개시제를 채운 후에 나노투과막을 씌운다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 주형의 표면은 친수성 특성을 부여하기 위해 산소플라즈마로 처리할 수 있다. 친수성 특성이 부여된 주형은 나노투과막과의 접착성이 향상된다. The main shape concave surface is filled with a polymer and a photoinitiator, and then a nanotransflective film is coated. According to a specific embodiment of the present invention, the surface of the mold may be treated with an oxygen plasma to impart hydrophilic properties. The mold to which the hydrophilic property is imparted has improved adhesion with the nanotransflective film.
본 발명 일 구현예에 따르면, 상기 나노투과막은 고분자, 예를 들어, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)) (PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄) (PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)] (PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린 (PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되나 이에 한정된 것은 아니다. According to one embodiment of the present invention, the nanotransflective film is made of a polymer such as elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone Polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polyethersulfone (PES), polyurethane (PU), poly (lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [ ), poly (ester urethane) (PEUU), poly (lactide) -co- (3-hydroxyvalerate) (PHBV), polydioxanone (PDO) Poly (vinyl alcohol)] (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVA) At least one biocompatible polymer selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline (PAN), copolymers thereof, or mixtures thereof. Not specified.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 나노투과막은 전기방사(electrospining) 방식으로 제조될 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the nanotransflective film may be manufactured by an electrospinning method.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 나노투과막은 상기 고분자 물질을 사용하여 전기방사방식으로 제조될 수 있다.
According to another embodiment of the present invention, the nanotransflective film of the present invention can be manufactured by electrospinning using the polymeric material.
단계(d): 상기 나노투과막이 씌워진 주형상에 광을 조사하는 단계 Step (d): irradiating the main shape covered with the nanotransflective film with light
나노투과막이 씌워진 주형상에 광을 조사하여 광경화성 폴리머의 경화를 유도한다. Light is irradiated on the main shape covered with the nanotransflective film to induce curing of the photo-curable polymer.
본 발명의 주형상에 조사되는 광은 상기 광경화성 폴리머의 경화를 유도할 수 있는 광으로서, 바람직하게는 UV 이다.
The light irradiated on the main shape of the present invention is light capable of inducing curing of the photo-curable polymer, preferably UV.
단계(e): 상기 주형을 제거하는 단계 Step (e): removing the template
상기 광을 조사한 후 주형을 제거하여 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막을 얻는다.
After the light is irradiated, the mold is removed to obtain a nanotransflective film patterned with a hydrogel microstructure.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a nanotransflective film patterned with a hydrogel microstructure, characterized in that it is manufactured by the method described above.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조된 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막을 포함하는 세포 부유 배양 장치를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a cell suspension culture apparatus, wherein the hydrogel microstructure is formed by a nanofiltration membrane.
본 발명의 세포 부양 배양 장치는 부착 세포 배양을 위한 방법으로 종래의 부착 세포 배양법이 가진 2차원적 세포 성장의 한계를 하이드로젤 마이크로 구조체와 나노투과막의 다공성 성질을 이용하여 3차원적 세포 성장이 가능케 한다. The cell lifting culture apparatus of the present invention is a method for culturing adherent cells, and it is possible to limit the limit of the two-dimensional cell growth possessed by the conventional adherent cell culture method to three-dimensional cell growth using the porous nature of the hydrogel microstructure and nano- do.
본 발명에서 사용한 하이드로젤 마이크로 구조체와 나노투과막은 캡슐화된 생리활성 물질의 확산의 방향을 3차원으로 조절할 수 있으며 및 세포의 성장을 3차원으로 관찰할 수 있는 장점이 있다. The hydrogel microstructure and nanofiltration membrane used in the present invention can control the diffusion direction of the encapsulated physiologically active substance to three dimensions and have an advantage of observing the growth of cells in three dimensions.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 세포 부유 배양 장치는 상기 세포 부유 배양 장치는 (i) 나노투과막이 부착되는 나노투과막 부착프레임; (ii) 상기 나노투과막 부착 프레임을 지지하는 지지다리; 및 (iii) 상기 나노투과막 부착 프레임에 부착된 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막을 포함한다. According to an embodiment of the present invention, the cell suspension culture apparatus comprises: (i) a nanofiltration membrane attachment frame to which a nanofiltration membrane is attached; (ii) a supporting leg for supporting the nanofilter membrane attaching frame; And (iii) a nano-permeable membrane patterned with a hydrogel microstructure attached to the nano-permeable membrane attachment frame.
본 발명의 세포 부유 배양 장치에 부착되는 나노투과막은 상기 설명된 방법에 의해 제조된 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막일 수 있다. The nanotransflective membrane attached to the cell suspension culture apparatus of the present invention may be a nanotransflective film in which the hydrogel microstructures prepared by the above-described method are patterned.
상기 세포 부유 배양 장치에서 나노투과막 부착 프레임은 나노투과막의 형상에 따라 달라질 수 있으며 특정의 형태로 한정되지 않는다. 예컨대 나노투과막이 4각형인 경우 나노투과막 부착 프레임도 4각형 모양일 수 있다. In the cell suspension culture apparatus, the nanofiltration membrane attachment frame may vary depending on the shape of the nanofiltration membrane, and is not limited to a specific shape. For example, when the nanofiber membrane is tetragonal, the nanofiber membrane attachment frame may also have a quadrangular shape.
상기 나노투과막 부착 프레임을 지지하는 지지다리는 하이드로젤 마이크로 구조체가 패터닝된 나노투과막이 세포 배양 장치의 표면에서 부착하지 않도록 하여, 하이드로젤 마이크로 구조체 내부에 포함된 세포가 세포 배양액내에서 3차원적으로 배양될 수 있도록 프레임을 지지하는 역할을 한다. 따라서, 상기 지지다리는 상기한 목적을 달성할 수 있도록 하는 범위에서 나노투과막 부착 프레임의 적합한 위치에 결합될 수 있다. 바람직하게는 상기 나노투과막 부착 프레임의 하단부에 부착된다. The support leg supporting the nanofiltration membrane attachment frame prevents the nanofiltration membrane on which the hydrogel microstructure is patterned from adhering on the surface of the cell culture apparatus so that the cells contained in the hydrogel microstructure can be three- To support the frame so that it can be cultured. Therefore, the support leg can be coupled to a suitable position of the nanofiltration membrane attaching frame within a range that can achieve the above object. And is preferably attached to the lower end portion of the nanofiltration membrane attaching frame.
본 발명의 이점은 다음과 같다:The advantages of the present invention are as follows:
(i) 본 발명에 의하면 3차원 구조를 갖는 나노투과막상에 선택적인 위치에서 하이드로젤 마이크로 패터닝이 가능하다. (i) According to the present invention, hydrogel micro patterning is possible at a selective position on a nano permeable membrane having a three-dimensional structure.
(ii) 본 발명에 의하면 3차원 구조를 갖는 나노투과막상에 세포와 생리활성 물질을 함께 또는 분리하여 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 패터닝을 제공할 수 있다. (ii) According to the present invention, it is possible to provide encapsulated hydrogel micropatterning by separating cells and a physiologically active substance together on a nanoporous membrane having a three-dimensional structure.
(iii) 본 발명에 의하면 하이드로젤 마이크로 패터닝된 나노투과막을 포함하는 3차원 세포 배양장치를 제공할 수 있다. (iii) According to the present invention, a three-dimensional cell culture apparatus including hydrogel micropatterned nanofiltration membrane can be provided.
(iv) 본 발명의 하이드로젤 마이크로 패터닝된 나노투과막 및 이를 포함하는 3차원 세포 배양장치는 인체모방이 가능한 3차원 미세환경을 제공하므로 조직공학, 세포분화, 세포를 기초로 한 진단기술 및 약물 스크리닝 분야에 적용할 수 있다. (iv) The hydrogel micropatterned nanoporous membrane of the present invention and a three-dimensional cell culture device containing the same provide a three-dimensional micro environment capable of imitating the human body, and thus can be applied to tissue engineering, cell differentiation, It can be applied to screening field.
도 1은 나노투과막상에 하이드로젤 마이크로 패터닝을 수행하는 방법을 보여준다.
도 2는 세포 부유 배양 장치에서 나노투과막상에 하이드로젤 마이크로 패터닝을 수행하는 방법을 보여준다.
도 3의 패널 (a)와 패널 (b)는 PES 나노투과막의 전자현미경 사진을 보여준다. 패널 (c)는 PES나노투과막 인장강도를 보여준다. 패널 (d)는 PES나노투과막의 공극크기를 보여준다.
도 4의 패널 (a)는 나노투과막상에 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 광학사진을 보여준다. 패널 (b)는 나노투과막상에 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 형광사진과 광학사진이 병합된 것을 보여준다. 패널 (c)는 나노투과막상에 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체를 측면에서 촬영한 사진을 보여준다. 패널 (d)는 나노투과막상에 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체를 공초점 레이져 현미경으로 촬영한 사진을 보여준다.
도 5의 패널 (a)는 절반이 막힌 PDMS 오목주형을 보여준다. 패널 (b)는 왼편에는 나노투과막상에 로다민 B가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체와 오른편에서는 나노투과막상에 형광비드가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 형광사진과 광학사진이 병합된 사진을 보여준다. 패널 (c)는 왼편에는 나노투과막상에 BSA-FITC가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체와 오른편에서는 나노투과막상에 형광비드가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체를 공초점 레이져 현미경으로 촬영한 사진을 보여준다.
도 6의 패널 (a)는 HepG2세포가 배양된 주형의 광학사진을 보여준다. 패널 (b)는 나노투과막상에 HepG2세포가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 사진을 보여준다. 패널 (c)는 나노투과막상에 캡슐화된 HepG2세포가 염색되어 패터닝된 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체를 공초점 레이져 현미경으로 촬영한 사진을 보여준다.
도 7의 패널 (a)는 반쪽이 막힌 PDMS 오목주형에 배양된 세포의 광학사진을 보여준다. 패널 (b)는 나노투과막상에 HepG2세포가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 형광사진을 보여준다. 패널 (c)는 나노투과막상에 HepG2세포가 캡슐화되어 패터닝된 하이드로젤 마이크로 구조체의 공초점 레이져 현미경으로 촬영한 사진을 보여준다.
도 8은 각 실험군에서 5일간 HepG2세포를 배양한 후 요소생성을 측정하여 세포의 간특이기능을 평가한 것을 보여준다. 패널 (a)는 음성대조군으로 사용한 나노투과막상에 HepG2세포만을 캡슐화하여 패터닝한 하이드로젤 마이크로 구조체의 결과를 보여준다. 패널 (b)는 나노투과막상의 반쪽 면에 HepG2세포가 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 구조체와 나노투과막상의 다른 반쪽 면에 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 구조체를 패터닝한 결과를 보여준다. 패널 (c)는 나노투과막상의 HepG2세포가 캡슐화된 하이드로젤 마이크로 구조체와 나노투과막에 NIH3T3 섬유아세포가 공배양 된 결과를 보여준다. 1 shows a method of performing hydrogel micro patterning on a nano permeable membrane.
Figure 2 shows a method of performing hydrogel micropatterning on nanoporous membranes in a cell suspension culture apparatus.
Panel (a) and panel (b) of FIG. 3 show electron micrographs of the PES nanotransflective film. Panel (c) shows the tensile strength of PES nanotransfer membrane. Panel (d) shows the pore size of the PES nanotransflective membrane.
Panel (a) of FIG. 4 shows an optical photograph of a hydrogel microstructure patterned on a nano-permeable membrane. Panel (b) shows the fluorescence and optical photographs of the hydrogel microstructures patterned on the nanoporous membrane incorporated. Panel (c) shows a photograph taken from the side of the hydrogel microstructure patterned on the nano permeable membrane. Panel (d) shows a photograph of a hydrogel microstructure patterned on a nanotransflective film by a confocal laser microscope.
Panel (a) of FIG. 5 shows a PDMS recessed mold half clogged. On the left side of the panel (b), the hydrogel microstructure encapsulated with rhodamine B on the nanotransflective film and the fluorescent beads encapsulated on the nanotransflective film on the right side were merged with the fluorescence and optical photographs of the patterned hydrogel microstructure Show photos. In the panel (c), the hydrogel microstructure encapsulated with BSA-FITC on the nanotransflective film and the fluorescence bead encapsulated on the nanotransflective film on the right side were used to photograph the patterned hydrogel microstructure with a confocal laser microscope Lt; / RTI >
Panel (a) of Fig. 6 shows an optical photograph of a template in which HepG2 cells were cultured. Panel (b) shows a photograph of a hydrogel microstructure encapsulated with HepG2 cells on the nanoporous membrane and patterned. Panel (c) shows a photograph of a PEGDA hydrogel microstructure stained with HepG2 cells encapsulated on a nanoporous membrane and photographed with a confocal laser microscope.
Panel (a) of FIG. 7 shows an optical photograph of cells cultured in PDMS recessed molds with half closed. Panel (b) shows a fluorescence photograph of hydrogel microstructures in which HepG2 cells were encapsulated and patterned on the nanoporous membrane. Panel (c) shows a photograph taken with a confocal laser microscope of a hydrogel microstructure encapsulated with HepG2 cells on a nanotransflective membrane.
FIG. 8 shows that the hepatic cell function was evaluated by measuring urea production after culturing HepG2 cells for 5 days in each experimental group. Panel (a) shows the results of a hydrogel microstructure in which only HepG2 cells were encapsulated and patterned on a nanotransflective film used as a negative control group. Panel (b) shows the result of patterning hydrogel microstructures in which HepG2 cells were encapsulated on the nanoporous membrane and hydrogel microstructures encapsulating vascular endothelial growth factor (VEGF) on the other half of the nanoporous membrane Show. Panel (c) shows the results of co-culture of NIH3T3 fibroblasts in hydrogel microstructures and nanoporous membranes encapsulating HepG2 cells on nanoporous membranes.
실시예 Example
실험재료 및 방법Materials and Methods
1. 실험재료 1. Experimental material
N,N-디메틸아세트아마이드(N, N-dimethylacetamide, DMAC, 대정화금, 한국)은 폴리에테르설폰(poly ether sulfone, PES, Basf Co. Germany)의 용매로 사용하였고 디메틸포름아미드(dimethylformamide, Junsei, 일본)는 폴리우레탄(polyurethane, PU, Dow chemical, U.S.A.)의 용매로 사용하였다. 세포의 형광염색을 위해 Alexa Fluor 594 phalloidin (Invitrogen, U.S.A.)과 Live/Dead assay kit (Invitrogen, U.S.A.)를 사용하였으며 살아있는 세포를 추적 및 관찰하기 위하여 Cell Tracker™ Red CMTPX (Invitrogen, U.S.A.)을 사용하였다. 포토리소그래피방법을 이용한 하이드로젤 마이크로 패터닝을 위하여 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Poly ethylene glycol diacrylate, PEGDA, Polyscience, Invitrogen, U.S.A.)와 광경화제인 Photoinitiator Irgacure2959 (2-Hydroxy-4′ -(2-hydroxyethoxy)-2- methylpropiophenone)를 혼합하고 UV를 이용하여 광가교결합을 수행하였다.
N, N-dimethylacetamide, DMAC, and purified water were used as a solvent for polyether sulfone (PES, Basf Co. Germany), dimethylformamide (Junsei) , Japan) was used as a solvent for polyurethane (PU, Dow chemical, USA). Cell Tracker ™ Red CMTPX (Invitrogen, USA) was used for fluorescence staining of cells, and Alexa Fluor 594 phalloidin (Invitrogen, USA) and Live / Dead assay kit (Invitrogen, USA) . (2-Hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) - (2-hydroxyethoxy) -phenyl) glycidyl acrylate (PEGDA, Polyscience, Invitrogen, USA) and photoinitiator Irgacure 2959 2-methylpropiophenone) were mixed and photo-crosslinked using UV.
2. 폴리에테르설폰(PES)나노투과막의 제조 2. Preparation of polyethersulfone (PES) nanotransflective membrane
전기방사를 이용하여 세포의 확산이 가능한 세포지지체인 폴리에테르설폰(PES) 또는 폴리우레탄(PU)나노투과막을 제작하였다. PES나노투과막의 제조를 위하여 40중량％의 PES를 용매인 디메틸아세크아마이드(DMAC)에 혼합하고 로테이터(PTR-35, Grant bio, England)에서 8시간 동안 교반하였다. PES의 전기방사를 위하여 상기 교반 된 상기 PES용액 10㎖을 전기방사용 10㎖ 실린지에 주입하고 실린지에 전도성 금속으로 제작된 25G 실린지 팁을 설치하였다. 콜렉터는 드럼 방식의 회전콜렉터를 사용하였으며 콜렉터에 A4 용지를 감싸 제조된 PES나노투과막을 콜렉터로부터 쉽게 떼어낼 수 있도록 하였다. 실린지 팁과 콜렉터의 거리를 35 - 40cm가 되도록 설정한 후 11kV의 전기장을 실린지 팁에 가하여 방사속도 0.1㎖/시간으로 90시간 동안 방사하였다. 방사 후 80°C 오븐에서 24시간 동안 잔여 유기용매를 제거하였다. 폴리우레탄(PU)나노투과막을 제조하기 위하여 15중량%의 PU를 용매인 디메틸포름아미드와 혼합하고 24시간 동안 교반하였다. 혼합된 PU용액 10㎖을 전기방사용 10㎖실린지에 주입하고 전도성 금속으로 제작된 25G 실린지 팁을 설치하였다. 실린지 팁과 콜렉터의 거리를 35 - 40cm으로 설정하고 15kV의 전기장을 가하여 방사속도 0.1㎖/시간으로 70시간 동안 방사한 후 80°C의 오븐에서 24시간 동안 유기용매를 제거하였다.
Polyethersulfone (PES) or polyurethane (PU) nanoporous membranes, which are cell supports capable of cell diffusion, were prepared using electrospinning. For the preparation of the PES nanotransflective film, 40 wt.% Of PES was mixed with dimethyl acicular (DMAC) as a solvent and stirred in a rotator (PTR-35, Grant Bio, England) for 8 hours. For electrospinning of the PES, 10 ml of the stirred PES solution was injected into a 10 ml syringe using an electric furnace, and a 25G syringe tip made of a conductive metal was installed in the syringe. The collector uses a drum type rotating collector and easily removes the PES nanotransflective film manufactured by wrapping A4 paper on the collector from the collector. The distance between the syringe tip and the collector was set to 35 - 40 cm. An electric field of 11 kV was applied to the syringe tip and radiated at a radiation rate of 0.1 ml / hour for 90 hours. After spinning, the remaining organic solvent was removed in an 80 ° C oven for 24 hours. To prepare a polyurethane (PU) nanotransflective membrane, 15 wt% PU was mixed with dimethylformamide as a solvent and stirred for 24 hours. 10 mL of the mixed PU solution was poured into a 10 mL syringe using an electric stirrer and a 25G syringe tip made of conductive metal was installed. The distance between the syringe tip and the collector was set to 35 - 40cm, the electric field of 15kV was applied, the spinning was carried out at a spinning rate of 0.1 ml / hr for 70 hours, and then the organic solvent was removed in an oven at 80 ° C for 24 hours.
3. 나노투과막의 특성 평가 3. Characterization of nano-permeable membranes
PES나노투과막의 인장강도는 마이크로장력시험장치(micro tensile test machine, TopTac2000, YeonJin, Korea)을 사용하여 측정하였다. 측정조건은 상온; 게이지의 길이는 25mm; 시편의 두께 80μm; 시편의 너비 8mm; 및 시편을 당기는 속도는 0.17mm/초로 하였다. PES 또는 PU나노투과막의 표면 분석은 전계방사형주사현미경(field emission scanning electron microscopy, S-4300, Hitachi, Japan)을 사용하였다. PES나노투과막의 기공도는 기공측정기(capillary flow porometer, CFP-1500-AE, Porous Materials Inc, Taiwan)를 사용하여 측정하였다.
The tensile strength of the PES nano-permeable membrane was measured using a micro tensile tester (TopTac 2000, Yeonjin, Korea). Measurement conditions were room temperature; The length of the gauge is 25 mm; Thickness of specimen: 80 m; Width of specimen 8mm; And the pulling speed of the specimen was 0.17 mm / sec. Surface analysis of the PES or PU nanoporous membrane was performed using field emission scanning electron microscopy (S-4300, Hitachi, Japan). The porosity of the PES nano-permeable membrane was measured using a pore-size meter (capillary flow porometer, CFP-1500-AE, Porous Materials Inc, Taiwan).
4. 패터닝을 위한 마이크로 주형의 제조4. Fabrication of micro-molds for patterning
에폭시를 이용하여 반구모양의 패턴반경이 250μm이며 패턴간격이 450μm인 SU-8 주형을 제조하였다. 폴리디메틸실록산(PDMS)용액은 PDMS silgard 184 kit (dow corning, U.S.A.)의 PDMS 베이스와 건조시약(curing agent)를 각각 10:1.2의 무게비율로 10분간 혼합하여 제조하였다. 상기 제조된 PDMS용액은 진공건조기에서 거품을 제거한 후 SU-주형 위에 부어주고, 80°C의 오븐에서 30분간 경화하여 폴리디메틸실록산 오목 마이크로 주형(polydimethylsiloxane concave micro-mold)를 제조하였다.
An SU-8 mold having a hemispherical pattern radius of 250 mu m and a pattern interval of 450 mu m was prepared using an epoxy. The polydimethylsiloxane (PDMS) solution was prepared by mixing the PDMS base of the PDMS silgard 184 kit (dow corning, USA) and the drying reagent at a weight ratio of 10: 1.2 for 10 minutes. The prepared PDMS solution was removed from the vacuum in a vacuum dryer, poured onto an SU-mold, and cured in an oven at 80 ° C for 30 minutes to prepare a polydimethylsiloxane concave micro-mold.
5. 광가교성 PEGDA 하이드로젤 전구체의 제조 5. Preparation of photo-crosslinkable PEGDA hydrogel precursor
PEGDA 하이드로젤 전구체를 제조하기 위하여, 광개시제(photoinitiator, PI)인 irgacure2959를 사용하였으며 광개시제의 안정성을 고려하여 모든 과정을 암실에서 진행하였다. 15㎖ 튜브에 irgacure2959, PEGDA 하이드로젤 및 메탄올(대정화금, 한국)을 0.3, 0.6 및 1의 질량비로 혼합한 후 37°C의 인큐베이터에서 한 시간 동안 인큐베이션하여 PI용액을 제조하였다. 메탄올을 먼저 넣고 PEGAD 하이드로젤 및 irgacure2959을 차례대로 넣었다. 상기 제조한 PI용액과 PBS(Pasching, Austria)를 각각 5중량%와 95중량%으로 혼합하고 PEGDA 하이드로젤을 10중량%으로 첨가한 후 37°C의 인큐베이터에 1시간 동안 인큐베이션 하여 완벽하게 용해시켰다.
To prepare the PEGDA hydrogel precursor, a photoinitiator (PI), irgacure2959, was used. All procedures were carried out in the dark room in consideration of the stability of the photoinitiator. A 15 mL tube was mixed with irgacure2959, PEGDA hydrogel and methanol (purified gold, Korea) in a mass ratio of 0.3, 0.6, and 1, followed by incubation for 1 hour in an incubator at 37 ° C to prepare a PI solution. Methanol was first added and PEGAD hydrogel and irgacure2959 were added in turn. The prepared PI solution and PBS (Pasching, Austria) were mixed at 5% by weight and 95% by weight, respectively. PEGDA hydrogel was added in an amount of 10% by weight and incubated in an incubator at 37 ° C for 1 hour to completely dissolve .
6. 나노투과막 위에 하이드로젤 마이크로 패터닝6. Hydrogel micro patterning on nano permeable membrane
나노투과막 위에 반구의 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴을 형성하는 전체의 과정은 도 1에서 보여준다. PDMS 오목주형(PDMS concave mold)를 준비한 뒤 (도 1의 패널 a) 산소 플라즈마로 60초간 표면 처리를 수행하여 표면을 소수성에서 친수성으로 바꾸었다. 준비된 PEGDA 전구체를 표면 처리한 PDMS 오목주형 위에 도포하고(도 2의 패널 a) 셀 스크래퍼를 이용하여 용액을 오목한 패턴에 채워 주었다(도 1의 패널 c). PEGDA 전구체 용액으로 채워진 PDMS 오목주형을 PES나노투과막으로 덮고(도 1의 패널 d) 30초 동안 2.08W의 강도로 UV를 광원과 4cm의 거리에서 노출시켰다(도 1의 패널 e). PES나노투과막은 소수성을 띄기 때문에 증류수를 흡수하진 않지만, PEGDA는 천천히 흡수할 수 있고 PES나노투과막에 뿌리를 내리듯 패터닝이 된다. PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴은 주형을 걷어냄으로써 얻어낼 수 있으며 (도 1의 패널 f), 하이드로젤 마이크로 패턴은 PES나노투과막 위에 고정된 형태로 형성 된다(도 1의 패널 h).
The entire process of forming a hemispherical PEGDA hydrogel micropattern on the nanoporous membrane is shown in FIG. A PDMS concave mold was prepared (panel a in FIG. 1) and then subjected to surface treatment with oxygen plasma for 60 seconds to change the surface from hydrophobic to hydrophilic. The prepared PEGDA precursor was applied onto the surface-treated PDMS concave mold (panel a in FIG. 2) and the solution filled in the concave pattern using a cell scraper (panel c in FIG. 1). The PDMS recessed mold filled with the PEGDA precursor solution was covered with a PES nanotransflective film (panel d in FIG. 1), and the UV was exposed at a distance of 4 cm from the light source at an intensity of 2.08 W for 30 seconds (panel e in FIG. The PES nano permeable membrane is hydrophobic, so it does not absorb distilled water, but PEGDA can absorb slowly and is patterned as it roots on the PES nanotransflective membrane. The PEGDA hydrogel micropattern can be obtained by scraping the mold (panel f of FIG. 1) and the hydrogel micropattern is formed on the PES nanofiltration membrane in a fixed form (panel h of FIG. 1).
7. 세포 및 생리활성 물질의 고정화7. Immobilization of cells and physiologically active substances
간세포를 실험하는 매개체로 HepG2 세포주 (88065, Korea Cell Line Bank, South Korea)를 사용하였다. 세포배양은 90부피% DMEM, 10부피% FBS 및 1부피% 페니실린/스트렙토마이신로 구성된 배지에서 37°C 및 5% CO2 분위기인 인큐베이터에서 배양하였다. 트립신/EDTA를 처리하여 세포현탄액을 수득하고 세포의 수를 카운팅하여 1× 106 세포/㎖의 세포현탄액을 제조하였다. 산소 플라즈마로 표면이 처리된 PDMS 오목주형에 세포현탁액 100㎕을 주입하고 5일 동안 5% CO2 분위기의 37°C하에서 배양하였다. 배양과정이 끝난 뒤에, 세포추적자(cell tracker)를 세포에 주입하기 위해 세포추적자(cell tracker) 용액을 세포가 있는 페트리디쉬에 넣어 주고 30분간 인큐베이션 하였다. 세포를 하이드로젤 마이크로 패턴에 캡슐화(encapsulation)하기 위해, 세포가 배양된 PDMS 오목주형을 트립신/EDTA로 1분간 인큐베이터에서 처리한 후 PEGDA 전구체 용액을 PDMS 오목주형에 상기 설명한 바와 같이 도포하고 30초간 UV에 노출시켰다. 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 하이드로젤 마이크로 패턴에 캡슐화하기 위하여 혈관내피세포성장인자를 250ng/㎖의 농도로 PEGDA 전구체 용액에 혼합한 후 상기 혼합용액을 PDMS 오목주형에 도포하고 UV에 30초간 노출시켰다.
HepG2 cell line (88065, Korea Cell Line Bank, South Korea) was used as a medium to test hepatocytes. Cell cultures were incubated in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 in a medium consisting of 90% by volume DMEM, 10% by volume FBS and 1% by volume penicillin / streptomycin. And it was treated with trypsin / EDTA to give a cell suspension and counting the number of cells was prepared to 1 × 10 6 cells / ㎖ of cell suspension. 100 μl of the cell suspension was injected into a PDMS recessed mold having a surface treated with an oxygen plasma and incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere for 5 days. At the end of the incubation period, a cell tracker solution was added to a petri dish containing cells to inject a cell tracker into the cells, followed by incubation for 30 minutes. In order to encapsulate the cells in a hydrogel micropattern, the cell-cultured PDMS concave molds were incubated with trypsin / EDTA in an incubator for 1 minute, then the PEGDA precursor solution was applied to the PDMS concave mold as described above and UV Lt; / RTI > To encapsulate vascular endothelial growth factor (VEGF) in a hydrogel micropattern, the vascular endothelial growth factor was mixed with a PEGDA precursor solution at a concentration of 250ng / ml, and the mixture solution was applied to a PDMS recess mold And exposed to UV for 30 seconds.
8. 패터닝 공정 제어를 통한 선택적인 패터닝 8. Selective patterning through patterning process control
2 가지의 다른 물질을 한 개의 PDMS 오목주형을 이용하여 캡슐화하기 위해서, PDMS 오목주형의 반쪽을 PU나노투과막으로 덮었다. 전기적 인력으로 인해 PDMS 오목주형과 PU나노투과막이 붙어 있는 동안 PDMS 용액을 이용하여 완벽하게 접착시켰다. PU나노투과막이 접착된 PDMS 오목주형을 UV광에 하루 동안 노출시켜 멸균하고 상기 설명한 바와 같이 세포를 배양하였다. PU나노투과막을 제거하고 VEGF/PEGDA 전구체용액을 PU나노투과막으로 가려져 있던 PDMS 오목주형에 도포하여 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴을 완성하였다. 결과적으로, 한쪽에는 세포, 다른 한쪽에는 VEGF가 담긴 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴을 제조하였다.
To encapsulate two different materials using one PDMS recessed mold, one half of the PDMS recess mold was covered with a PU nanotransflective film. Due to the electric attraction, the PDMS recessed mold and the PU nanotransflective film were completely adhered using the PDMS solution while attached. The PDMS recessed molds to which the PU nano permeable membrane was adhered were exposed to UV light for a day to sterilize and the cells were cultured as described above. PU nanofiltration membrane was removed and a VEGF / PEGDA precursor solution was applied to a PDMS recessed mold covered with a PU nanotransfer membrane to complete a PEGDA hydrogel micropattern. As a result, PEGDA hydrogel micropatterns containing cells on one side and VEGF on the other side were prepared.
9. PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴을 포함한 세포 부유 배양 장치의 제작 9. Fabrication of cell suspension culture device containing PEGDA hydrogel micropattern
세포 부유 배양 장치의 제조방법은 도 2에 나타낸 모식도에서 보여준다. 세포 부유 배양 장치는 아크릴 재료로 이용하여 제조하였다. 레이저 가공을 통하여 높이가 3mm이며 패터닝 영역이 10 x 10mm인 정사각형의 세포 부유 배양 장치를 제작하였다(도 2의 패널 a). PDMS용액을 이용하여 PES나노투과막을 세포 부유 배양 장치의 뒷면에 부착하고 80°C의 오븐에서 30분간 경화하였다(도 2의 패널 b). 세포 부유 배양 장치를 고압멸균하고 오븐에서 하루 동안 건조시켰다(도 2의 패널 c). PEGDA용액을 PDMS 오목주형 위에 도포하고(도 2의 패널 d), 스크래퍼로 밀어주어 패턴의 안쪽을 채웠다(도 2의 패널 e). PEGDA 용액이 채워진 PDMS 오목주형을 PES나노투과막 위에 덮고(도 2의 패널 f), 2.08 W강도의 UV 빛에 30 초간 노출시켰다. PDMS 오목주형을 제거하여(도 2의 패널 g) 세포 부유 장치에 형성된 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴을 얻을 수 있었다 (도 2의 패널 h).
A manufacturing method of the cell suspension culture apparatus is shown in the schematic diagram shown in Fig. The cell suspension culture apparatus was manufactured using acrylic material. A square cell suspension apparatus with a height of 3 mm and a patterning area of 10 x 10 mm was fabricated through laser processing (panel a of FIG. 2). The PES nanofiltration membrane was attached to the backside of the cell suspension culture apparatus using a PDMS solution and cured in an oven at 80 ° C for 30 minutes (panel b in FIG. 2). The cell suspension culture apparatus was autoclaved and allowed to dry in the oven for one day (panel c in Figure 2). The PEGDA solution was applied onto the PDMS recessed mold (panel d in FIG. 2) and pushed with a scraper to fill the inside of the pattern (panel e in FIG. 2). The PDMS recessed mold filled with the PEGDA solution was covered on the PES nanotransflective film (panel f of FIG. 2) and exposed to UV light of 2.08 W intensity for 30 seconds. The PDMS recessed mold was removed (panel g in FIG. 2) to obtain a PEGDA hydrogel micropattern formed in the cell suspension device (panel h in FIG. 2).
10. 2D 또는 3D에서의 세포 거동 관찰10. Observation of cell behavior in 2D or 3D
세포추적자(cell tracker)가 삽입된 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체에 캡슐화한 세포는 형광 현미경(observe A1, Ziess)을 통해서 매일 관찰하고 메타모프(metamorph) 프로그램을 통해 강도(intensity)를 측정하였다. 세포 배양이 끝난 PEGDA 하이드로젤마이크로 구조체를 PBS로 2회 세척하고 live and dead assay kit를 첨가하고 30분간 인큐베이션 하였다. 염색된 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체를 PBS로 세척한 후 공초점 레이져 현미경(confocal laser microscope, MP-LSM, Zeiss)를 사용하여 배양된 세포의 3차원적인 형태를 측정하였다.
Cells encapsulated in a PEGDA hydrogel microstructure inserted with a cell tracker were observed daily through a fluorescence microscope (observe A1, Ziess) and the intensity was measured through a metamorphic program. The cell-cultured PEGDA hydrogel microstructures were washed twice with PBS, and the live and dead assay kit was added and incubated for 30 minutes. The stained PEGDA hydrogel microstructures were washed with PBS and the three-dimensional morphology of the cultured cells was measured using a confocal laser microscope (MP-LSM, Zeiss).
실험결과 Experiment result
1. 나노투과막의 특성 평가 1. Characterization of nano-permeable membranes
도 3의 패널 (a)는 PES나노투과막의 주사전자현미경(scanning electron microscope) 이미지를 보여준다. PES나노투과막의 나노섬유는 랜덤하게 형성되었으며 여러 겹으로 쌓인 망목구조를 형성되었다. 도 3의 패널 (b)는 PU나노투과막의 전자현미경이미지를 보여준다. 이미지에 의하면 나노섬유가 쌓여서 다공성 나노 구조가 완벽히 형성된 것을 보여준다. 도 3의 패널 (c)는 PES나노투과막의 인장 강도 측정값을 보여준다. PES나노투과막은 세포 배양액에 의해 파동이 생겨 세포에 영향을 미치지 않을 만큼 팽팽하게 세포 부유 배양 장치에 부착하여야 한다. 그렇지 않으면, PES나노투과막을 붙이는 동안 데미지를 입어 확산에 영향을 미칠 수 있다. 인장강도시험결과는 PES나노투과막이 세포 부유 배양 장치에 부착되었을 때 손상을 입지 않을 만큼의 힘이 어느 정도인지 알 수 있다. 도 3의 패널 (d)는 PES나노투과막의 기공의 크기를 보여준다. PES나노투과막의 기공의 크기는 120nm 이하로 측정되었으며, 이것은 PES나노투과막의 기공도가 나노 단위라는 것을 보여준다.
Panel (a) of FIG. 3 shows a scanning electron microscope image of the PES nanotransflective film. The nanofibers of the PES nano permeable membrane were randomly formed and formed multiple layers of network structure. Panel (b) of FIG. 3 shows an electron microscope image of the PU nanotransflective film. According to the image, nanofibers are stacked and porous nanostructures are perfectly formed. Panel (c) of FIG. 3 shows tensile strength measurements of the PES nanotransflective film. The PES nanoporous membrane should be attached to the cell suspension culture device in such a way that the cells are not affected by the cell culture fluids. Otherwise, damage may occur while attaching the PES nanofiltration membrane, which may affect diffusion. The results of the tensile strength test show how much force the PES nanofiber membrane is not damaged when attached to a cell suspension culture apparatus. Panel (d) of FIG. 3 shows the pore size of the PES nanotransflective membrane. The pore size of the PES nano-permeable membrane was measured to be 120 nm or less, indicating that the porosity of the PES nanotransflective membrane was in the nanometer range.
2. 나노투과막상의 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴 형성2. Formation of nanoporous PEGDA hydrogel micropatterns
도 4의 패널 (a)는 PES나노투과막 위에 광가교 결합된 PEGDA 하이드로젤 마이크로 패턴의 형상을 보여준다. 패턴은 PES나노투과막 위에 완벽하게 반구의 형태로 형성되었으며 일정한 간격을 가지고 나열되었다. 도 4의 패널 (b)는 광학 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 것을 병합한 이미지로, 위에서 본 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 이미지를 보여준다. PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체은 로다민(rhodamine) B에 의해 염색되었다. 붉은색 원 모양은 형광 염료인 로다민 B가 캡슐화 된 것을 보여주며 원의 주변은 PES나노투과막의 망목구조를 보여준다. PDMS 오목주형을 이용하여 제조하였으므로 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 단일 패턴 사이즈는 PDMS 오목주형과 같은 450μm이어야 한다. 그러나 측정된 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 사이즈는 대략 420μm로 PDMS 오목주형에 비해 7% 정도 작은 것으로 측정되었다. 이는 PES나노투과막이 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체를 흡수하여 좀 더 작은 사이즈로 보인 것을 의미한다. 유리 기판에서는 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 손실 없이 패턴이 완성 되지만 PES나노투과막에서는 망목구조로 인하여 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체가 멤브레인에 흡수되기 때문에 PDMS 오목주형의 크기에 비교하여 작은 사이즈로 패터닝 된다. 이러한 흡수현상은 멤브레인에 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체가 흡수되어 뿌리를 내리는 것과 같은 구조가 되므로 서로 물리적으로 강하게 결합하게 된다. 도 4의 패널 (c)는 PES나노투과막 위에 패턴된 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 측면 이미지를 보여준다. 상기 이미지는 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체의 패턴이 3차원적인 구조체임을 보여준다. PES나노투과막이 PEGDA 하이드로젤마이크로 구조체를 흡수하여 실제의 사이즈보다 더 두꺼워진 대략 300μm의 사이즈를 보여준다. 도 4의 패널 (d)는 PES나노투과막 위에 패턴된 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체의 이미지를 보여준다. 상기 패턴은 로다민 B(rhodamine B)에 염색되었으며 패턴의 높이는 250μm보다 작다. 상기 이미지는 PEGDA하이드로젤 마이크로 구조체가 3차원적으로 형성된 것을 보여주며 반구의 모양인 것을 보여준다. Panel (a) of FIG. 4 shows the shape of a PEGDA hydrogel micropattern photocrosslinked on a PES nanotransflective film. The patterns were completely hemispherical on the PES nanotransflective film and were arranged at regular intervals. Panel (b) of FIG. 4 shows an image of the PEGDA hydrogel microstructure viewed from above, which is an image merged with an observation by an optical microscope and a fluorescence microscope. The PEGDA hydrogel microstructures were stained with rhodamine B. The red circle shows encapsulation of the fluorescent dye rhodamine B and the circle surrounds the network structure of the PES nanofiber membrane. PDMS concave mold, the single pattern size of the PEGDA hydrogel microstructure should be 450 μm like the PDMS concave mold. However, the size of the measured PEGDA hydrogel microstructures was about 420 μm, which is about 7% smaller than the PDMS recessed mold. This means that the PES nanotransflex membrane absorbs the PEGDA hydrogel microstructure and appears to be smaller in size. In the glass substrate, the pattern is completed without loss of the PEGDA hydrogel microstructure, but in the PES nanotransflective film, the PEGDA hydrogel microstructure is absorbed into the membrane due to the network structure, so it is patterned in a small size compared to the size of the PDMS recessed template. This absorption phenomenon is due to the fact that the PEGDA hydrogel microstructure is absorbed into the membrane and the structure becomes like that of the root, so that they are physically and strongly bonded to each other. Panel (c) of FIG. 4 shows a side view of a PEGDA hydrogel microstructure patterned on a PES nanotransflective film. The image shows that the pattern of the PEGDA hydrogel microstructure is a three-dimensional structure. The PES nanotransflex membrane absorbs the PEGDA hydrogel microstructure and shows a size of approximately 300 microns thicker than the actual size. Panel (d) of Figure 4 shows an image of a PEGDA hydrogel microstructure patterned on a PES nanotransflective membrane. The pattern was stained with rhodamine B and the height of the pattern was less than 250 탆. This image shows that the PEGDA hydrogel microstructures are formed in three dimensions and show the shape of hemispheres.
도 5는 PDMS 오목주형에 의해 형광염료와 세포를 나타내는 형광비드가 동시에 캡슐화된 것을 보여준다. 도 5의 패널 (a)는 PU나노투과막에 의한 선택적 패터닝 및 캡슐화의 이미지를 보여준다. PDMS 용액에 의에 접착된 부위가 PDMS 오목주형 윗부분까지 된 것을 알 수 있다. 도 5의 패널 (b)는 광학 이미지와 형광이미지가 병합된 이미지이다. PDMS 오목주형의 왼쪽 4줄은 로다민 B가 캡슐화 되었으며 오른쪽 4줄은 형광비드가 캡슐화 되었다. 도 5의 패널 (b)는 상기의 선택된 패턴의 경계면을 보여주고 있다. 상기 이미지를 통하여 두 가지의 다른 재료가 완벽하게 분리하여 캡슐화된 것을 알 수 있다. 상기의 방법을 이용하연 HepG2 세포와 VEGF도 완벽하게 분리하여 캡슐화 할 수 있다. 도 5의 패널 (c)는 BSA-FITC와 형광비드가 동시에 캡슐화 패턴의 공초점 레이져 현미경 이미지를 보여준다. 상기 이미지를 통하여 패턴이 완벽하게 3차원적으로 캡슐화 된 것을 알 수 있다.
Figure 5 shows that the fluorescent beads representing the fluorescent dye and the cell are simultaneously encapsulated by the PDMS recess mold. Panel (a) of FIG. 5 shows an image of selective patterning and encapsulation with a PU nanotransflective film. It can be seen that the area adhered to the PDMS solution reaches the upper part of the PDMS concave mold. Panel (b) of Fig. 5 is an image in which an optical image and a fluorescent image are merged. Rhodamine B was encapsulated in the left four lines of the PDMS recessed mold and fluorescent beads were encapsulated in the right four lines. The panel (b) of FIG. 5 shows the boundary of the selected pattern. It can be seen through this image that the two different materials are completely separated and encapsulated. Using the above method, HepG2 cells and VEGF can be completely separated and encapsulated. Panel (c) of FIG. 5 shows a confocal laser microscope image of BSA-FITC and fluorescent beads simultaneously encapsulating patterns. It can be seen that the pattern is completely three-dimensionally encapsulated through the image.
3. PES 나노투과막에 고정화된 세포의 관찰3. Observation of cells immobilized on PES nanotransflective membrane
도 6의 패널 (a)는 1 x 106 세포/㎖의 HepG2 세포를 PDMS 오목주형에 2일 동안 배양하여 세포가 회전타원체(spheroid) 모양으로 응집된 것을 보여준다. PDMS 오목주형의 사이즈는 HepG2 세포의 회전타원체의 크기를 조절하여 500μm 이하로 만들 수 있는 것을 알 수 있다. 또한 HepG2 세포는 스스로 응집하는 특성으로 인해 패턴에서 중앙에 자리 잡고 회전타원체를 형성하는 것을 알 수 있다. 도 6의 패널 (b)는 Live and Dead mammalian assay kit를 통하여 HepG2 세포의 생존력을 측정한 결과이다. PES나노투과막 위에 1㎕의 칼세인-AM(calcein-AM), 4㎕의 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1) 및 HepG2 세포를 함께 캡슐화하여 하이드로젤 마이크로 구조체를 제조하였다. 비록 UV 공정이 세포의 생존력에 좋은 영향을 미치지 못하지만 캡슐화된 세포가 좋은 생존력을 보여주는 것을 알 수 있다. 도 6의 패널 (c)는 패턴에 캡슐화된 세포의 공초점 레이져 현미경 이미지를 보여준다. 캡슐화된 세포는 live and dead mammalian assay kit에 의해 염색되었지만 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체는 어느 것으로도 염색되지 않았기 때문에 형광이 띄지 않고 세포의 형광에 의해 산란된 빛만 보이게 된다. The panel (a) of FIG. 6 shows that cells were aggregated in the form of spheroids by culturing in a PDMS concave mold for 1 day at a concentration of 1 x 10 6 cells / ml of HepG2 cells. It can be seen that the size of the PDMS recessed mold can be made 500 탆 or less by controlling the size of the spheroids of HepG2 cells. In addition, HepG2 cells are located at the center of the pattern and form a spheroid due to the self-aggregating property. Panel (b) of FIG. 6 shows the viability of HepG2 cells measured by a live and dead mammalian assay kit. Hydrogel microstructures were prepared by encapsulating 1 μl of calcein-AM, 4 μl of ethidium homodimer-1 and HepG2 cells on a PES nanoporous membrane. Although the UV process does not have a good effect on cell viability, it can be seen that the encapsulated cells show good viability. Panel (c) of FIG. 6 shows a confocal laser microscope image of cells encapsulated in a pattern. The encapsulated cells were stained by the live and dead mammalian assay kit, but since the PEGDA hydrogel microstructures were not stained at all, only the light scattered by the fluorescence of the cells was visible without fluorescence.
공초점 레이져 현미경은 형광에 염색된 샘플만을 보여주기 때문에 상기 이미지에 보이는 샘플은 제대로 패턴이 형성되지 않아 보일 수 있다. 그러므로 세포는 공간적으로 패턴의 한 가운데에 위치하여 공중에 떠 보이는 것으로 볼 수 있다. 도 7의 패널 (a)는 PDMS 오목주형의 절반의 영역에서 배양된 HepG2 세포를 보여준다. PDMS 오목주형의 오른쪽은 배양된 세포를 보여주고 도 7의 패널 (b)를 통해서 완벽하게 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체에 캡슐화된 것을 알 수 있다. PDMS 오목주형의 왼쪽은 VEGF를 캡슐화하기 위하여 PU나노투과막으로 패턴화시키지 않은 것을 확인 할 수 있고 VEGF는 어느 형광도 띄지 않기 때문에 도 7의 패널 (b)에서 캡슐화가 안된 것처럼 보일 수 있지만 도 6을 통해 방법적으로 캡슐화 되었다고 할 수 있다. 도 7의 패널 (c)는 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체의 왼편에는 HepG2세포가 캡슐화 되었고 오른편에는 VEGF가 캡슐화된 이미지를 보여준다.
Because the confocal laser microscope only shows samples dyed in fluorescence, the samples shown in the image may not appear to be properly patterned. Therefore, the cell is located in the center of the pattern spatially and can be seen floating in the air. Panel (a) of Figure 7 shows HepG2 cells cultured in half the area of the PDMS recessed mold. The right side of the PDMS recessed mold shows the cultured cells and is completely encapsulated in the PEGDA hydrogel microstructure through panel (b) of FIG. It can be seen that the left side of the PDMS recessed mold is not patterned with a PU nanotransflective film to encapsulate VEGF and VEGF is not encapsulated in panel (b) of FIG. 7 because no fluorescence is visible, It is encapsulated in a method. Panel (c) of FIG. 7 shows an image in which HepG2 cells are encapsulated on the left side of the PEGDA hydrogel microstructure and VEGF is encapsulated on the right side.
4. 3차원 부유 배양법에 의한 패터닝 된 간세포의 기능평가4. Functional Evaluation of Patterned Hepatocytes by 3-D Floating Culture
최종적으로 캡슐화 된 HepG2 세포의 기능은 간세포의 특정적인 기능인 요소 합성(urea synthesis)을 통해 확인하였다. 세포의 부유 배양 방식과 부유하지 않는 배양 방식을 비교하기 위해 3가지 실험을 진행하였다. 첫째, 한쪽에 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체에 오직 세포만을 캡슐화하여 음성대조군(negative control)으로 사용하였다. 둘째, 세포와 VEGF를 각각의 반쪽에 캡슐화하였다. 섯째, HepG2 세포를 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체에 캡슐화하여 배양하고 NIH3T3 섬유화 세포를 PES나노투과막에서 배양하였다. 모든 패턴된 PES나노투과막은 3cm 페트리디쉬에서 3㎖의 배지로 배양하였으며 매일 배양액을 교체해 주며 1, 3, 및 5 일 시점에서 배양액을 수득하였다. Finally, the function of encapsulated HepG2 cells was confirmed by urea synthesis, a specific function of hepatocytes. Three experiments were conducted to compare the suspension and non-suspension cultures of cells. First, only the cells were encapsulated in a PEGDA hydrogel microstructure on one side and used as a negative control. Second, cells and VEGF were encapsulated in each half. Fifth, HepG2 cells were encapsulated in PEGDA hydrogel microstructures, cultured, and NIH3T3 fibroblasts were cultured in PES nanoporous membrane. All the patterned PES nanoporous membranes were cultured in a 3-ml culture medium in a 3-cm Petri dish, and the culture medium was changed every day, and cultures were obtained at 1, 3, and 5 days.
결과는 각각 도 8의 패널 (a), 패널 (b) 및 패널 (c)에 그래프로 나타내었다. 첫 번째 샘플(도 8의 패널 (a))과 두 번째 샘플(도 8의 패널 (b))에서는 큰 차이가 없으나 NIH3T3 섬유화 세포와 공배양된 샘플(도 8의 패널 (c))에서는 부유 배양 방식을 통해 배양한 샘플이 더 많은 요소를 합성한 것을 알 수 있었다.
The results are shown graphically in panel (a), panel (b) and panel (c) of FIG. There was no significant difference in the first sample (panel (a) of FIG. 8) and the second sample (panel (b) of FIG. 8), but in the sample co- cultured with NIH3T3 fibroblast And that the sample cultured through the method synthesized more elements.
결론conclusion
본 발명에서는 세포간 결합과 나노투과막위에 하이드로젤 마이크로 패터닝에 의한 성장인자의 확산을 위한 3차원적인 간세포 지지체를 개발하였다. 본 발명의 주요한 부분은 포토리소그래피에 의해 나노투과막 위에 하이드로젤 마이크로 패터닝을 했다는 점이며, 선택적인 패터닝이 가능하며 생체적으로 안정하다는 것이다. 그로 인한 결론은 다음과 같다. In the present invention, a three-dimensional hepatocyte scaffold for the intercellular binding and diffusion of growth factors by hydrogel micropatterning on the nanoporous membrane was developed. A major part of the present invention is that the hydrogel micropatterning is performed on the nanoporous film by photolithography, and that selective patterning is possible and is biostable. The conclusion is as follows.
1. 3차원으로 하이드로젤 마이크로 패터닝을 PES나노투과막 위에 행함으로써 생체 모방이라는 의미를 부여할 수 있었고 마이크로단위로 패터닝을 조작함으로 인해 미세환경을 가지는 지지체의 의미를 부여할 수 있었다. 또한 마이크로 하이드로젤과 나노투과막이라는 나노와 마이크로와 융합된 지지체를 보여줄 수 있었다. 1. By applying hydrogel micropatterning on a PES nanotransflective film in a three-dimensional manner, it was possible to give the meaning of biomimetry, and by manipulating the patterning in micro units, it was possible to give meaning to a support having a microenvironment. We could also show a support fused with micro-hydrogel and nano-permeable membranes called nano and micro.
2. PES나노투과막 위에 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체를 3차원적으로 패터닝하면서 형광 염색 물질과 형광 비드를 캡슐화 함으로써 세포와 생리활성 물질의 캡슐화 가능여부를 판단할 수 있었고, 선택적인 패터닝을 가시적으로 보여줄 수 있었다. 2. PEGDA hydrogel microstructures were three-dimensionally patterned on a PES nanotransflective membrane to encapsulate a fluorescent dye and fluorescent beads to determine whether encapsulation of cells and bioactive materials was possible, and selective patterning was shown visually I could.
3. PES나노투과막 위의 PEGDA 하이드로젤 마이크로 구조체에 간세포(HepG2 세포)를 성공적으로 캡슐화하였고 생존시킬 수 있어 간세포지지체로 패터닝에 이용할 수 있다는 점을 보여줄 수 있었으며, 실제 세포와 혈관내피세포성장인자의 선택적인 패터닝이 가능하였다. 3. Hepatocyte (HepG2 cells) successfully encapsulated and survived in the PEGNA hydrogel microstructure on the PES nanoporous membrane, indicating that it can be used for patterning with hepatocyte supporter. The actual cell and vascular endothelial cell growth factor Lt; RTI ID = 0.0 > patterning < / RTI >
4. 세포 부유 배양 장치를 통해 성장인자의 확산 및 공배양방식을 통한 간세포의 기능성을 확인하였다.
4. The function of hepatocytes was confirmed by diffusion of growth factors and co-culture through a cell suspension culture device.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. The specific embodiments described herein are representative of preferred embodiments or examples of the present invention, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and other uses of the invention do not depart from the scope of the invention described in the claims.
Claims (12)
(a) 산소플라즈마 표면처리를 수행하여 친수성 성질을 가지는 오목면을 갖는 주형(mold)을 준비하는 단계;
(b) 상기 주형의 오목면에 광가교성 하이드로젤, 광개시제 및 PBS의 혼합물 또는 광가교성 하이드로젤, 광개시제, PBS 및 세포 또는 생리활성물질의 혼합물을 채우는 단계;
(c) 상기 오목면에 상기 광가교성 하이드로젤 및 광개시제의 혼합물 또는 상기 광가교성 하이드로젤, 광개시제 및 세포 또는 생리활성물질의 혼합물이 채워진 주형상에 나노투과막을 씌우는 단계;
(d) 상기 나노투과막이 씌워진 주형상에 광을 조사하는 단계; 및
(e) 상기 주형을 제거하는 단계.A method of patterning a hydrogel microstructure on a nano-permeable membrane comprising the steps of:
(a) performing an oxygen plasma surface treatment to prepare a mold having a concave surface having hydrophilic properties;
(b) filling a concave surface of the template with a mixture of a photocurable hydrogel, a photoinitiator and PBS or a photocurable hydrogel, a photoinitiator, PBS and a mixture of cells or a physiologically active substance;
(c) covering the concave surface with a nanotransflective film on a main shape filled with the mixture of the photo-crosslinkable hydrogel and the photoinitiator or the photo-crosslinkable hydrogel, the photoinitiator and the mixture of cells or physiologically active substance;
(d) irradiating light onto the main shape covered with the nano-permeable membrane; And
(e) removing the template.
[12] The cell suspension culture apparatus of claim 11, wherein the cell suspension culture apparatus comprises: (i) a nanofiltration membrane attachment frame to which a nanofiltration membrane is attached; (ii) a supporting leg for supporting the nanofilter membrane attaching frame; And (iii) a hydrogel microstructure attached to the nanofiltration membrane attaching frame comprises a patterned nanotransflective membrane.
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