KR101458425B1 - 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell - Google Patents

3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell Download PDF

Info

Publication number
KR101458425B1
KR101458425B1 KR1020140040205A KR20140040205A KR101458425B1 KR 101458425 B1 KR101458425 B1 KR 101458425B1 KR 1020140040205 A KR1020140040205 A KR 1020140040205A KR 20140040205 A KR20140040205 A KR 20140040205A KR 101458425 B1 KR101458425 B1 KR 101458425B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
polymer
culture
support
Prior art date
Application number
KR1020140040205A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
곽종영
정영훈
김창근
진송완
윤식
김태언
옥수경
Original Assignee
동아대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동아대학교 산학협력단 filed Critical 동아대학교 산학협력단
Priority to KR1020140040205A priority Critical patent/KR101458425B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101458425B1 publication Critical patent/KR101458425B1/en
Priority to PCT/KR2015/003179 priority patent/WO2015152612A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system

Abstract

The present invention relates to a 3D-structured multi-layer cell culture structure, an assay chip including the same, and a method for analyzing a cell using the assay chip. More specifically, at least cell culture layers including 3D-structured mat-shaped cell supports made of hybrid nano fibers having a nanometer-micrometer diameter are included, and one or more cells are injected, adhered, and cultured in one or more of the culture layers, wherein the cultured cells can be permeated or moved into a cell support of a cell-injected culture layer or of another culture layer. According to the present invention, the cell culture structure includes at least two cell culture layers, so that cells can be moved through a 3D space. Moreover, each of the cell culture layers is based on a 3D-structured mat-shaped cell support made of hybrid nano fibers having a nanometer-micrometer diameter, so that 3D cell cultivation and cell movement are possible.

Description

3차원 구조의 다단 세포배양 구조체, 이를 포함하는 에세이칩 및 에세이칩을 이용한 세포 분석방법{3D MULTI-LAYER CELL CULTURE STRUCTURE, ASSAY CHIP COMPRISING THE SAME, AND METHOD FOR ANALYZING CELL}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a multi-stage cell culture construct having a three-dimensional structure, an assay chip including the same, and a cell analysis method using an assay chip,

본 발명은 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체, 이를 포함하는 에세이칩 및 에세이칩을 이용한 세포분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로 세포배양 구조체가 적어도 2층 이상의 세포배양층으로 구성되어 세포간 3차원 공간을 통한 이동이 가능하도록 하고, 또한 각 세포배양층이 나노미터-마이크로 미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성된 3차원 구조의 매트형상 세포지지체를 기반으로 하여 3차원적 세포배양, 세포이동이 가능하도록 한 것이다.
The present invention relates to a multi-stage cell culture structure having a three-dimensional structure, an assay chip including the same, and a method of assaying cells using the assay chip. More particularly, the present invention relates to a cell culture construct comprising at least two cell culture layers, And each cell culture layer is made up of a three-dimensional mat-type cell scaffold formed of nanometer-micrometer-diameter hybrid nanofibers to enable three-dimensional cell culture and cell migration will be.

면역세포는 외부항원을 인식하는 역할을 수행할 뿐만 아니라, 암세포의 종양항원을 인식하는 중요한 역할도 한다. 현재까지 주로 연구된 면역반응은 외부항원에 의해 유발되는 면역반응에 관한 것이지만, 최근 암세포에 의해서도 강력한 면역반응이 유발되며 그 중요성이 매우 크다는 사실이 인식되고 있다. 암세포들이 면역세포에는 어떠한 영향을 주는가를 측정할 필요가 있게 되었으나 세포간 면역반응을 측정하는 시험관 수준의 방법에 관해서는 연구가 잘 이루어져 있지 않으며. 그러나 아직까지는 이러한 암세포에 의해 유도되는 면역세포의 반응을 측정하기 위한 효율적인 시스템은 개발되어 있지 않은 실정이다.Immune cells play a role not only to recognize external antigens but also to recognize tumor antigens of cancer cells. Although the immune response, which has been mainly studied so far, is related to the immune response induced by external antigens, it has been recognized that the immune response is strongly induced by cancer cells and is of great importance. It is necessary to measure the effect of cancer cells on immune cells. However, studies on in vitro methods for measuring intercellular immune responses have not been well conducted. However, an effective system for measuring the response of immune cells induced by such cancer cells has not yet been developed.

세포간 이동을 측정하는 방법으로는 다른 종류의 세포를 각 구획에 넣고 마이크로 크기의 직경을 가지는 미세관을 통한 이동을 측정하는 칩이 대부분이다. 또한 다른 측면으로는 각기 다른 세포를 배양한 챔버에서 연결된 미세관을 통한 세포이동 모듈 개발이 대부분이다. As a method of measuring intercellular migration, most of the chips are used to measure migration through microtubules having micro-sized diameters in different compartments. On the other hand, most of the development of cell migration modules through microtubules connected to the chambers in which different cells were cultured.

또한, 국내외적으로 인체 내 종양미세환경을 모사한 시험관 내(in vitro) 수준에서 암세포에 대한 면역세포의 인식, 이동, 활성화 측정을 목표로 하는 연구는 아직 거의 없는 실정이다. In addition, there are few studies aiming at measuring the recognition, migration and activation of immune cells against cancer cells at the in vitro level simulating the tumor microenvironment in the human body.

이와 같이, 면역세포와 질환세포의 상호작용에 대한 측정이 현재 transwell 막을 이용하거나, 미소유체관을 통한 이동 측정이 가능한 스크리닝 단계의 수준에 머무르고 있는 이유는, 면역세포와 질환세포의 3차원적 동시 배양을 위한 시스템이나 플랫폼이 개발되어 있지 않은 데 그 이유가 있다. 따라서 이러한 중요성 때문에 현재 국내외적으로 미세유체역학 장치를 이용하여 세포 간 상호작용의 인터페이스 측정에 관한 연구가 진행되고 있으며, 이 연구는 부착분자에 의한 세포와 세포 사이의 직접적인 부착 정도를 측정하는 정도의 초기 개발 단계 수준이며, 세포와 세포 사이의 상호작용이 이루어지는 인터페이스를 관찰할 수 있는 미세유체역학장치의 개발에 대한 연구는 현재 진행 중에 있다.The reason why the measurement of the interaction between immune cells and diseased cells is currently at the level of the screening step using the transwell membrane or the measurement through the microfluidic channel is that the three- There is no reason to develop a system or platform for cultivation. Because of this importance, the interfacial interfacial interaction measurement using the microfluid dynamics device is currently being carried out domestically and internationally. This study is based on the observation that the degree of direct adhesion between cells and cells The development of a microfluid dynamics device capable of observing the interfacial interaction between cells and cells at the initial stage of development is underway.

관련하여 국내 공개특허 제10-2007-0024092호에는 나노-마이크로 다공성 지지체를 개시하고 있으나, 나노-마이크로 사이즈를 가져서 세포가 부착할 수 있는 넓은 표면적을 만들어 세포와 접촉할 수 있는 표면부문에 관한 내용이 개시되어 있고, 또한, 다공성 지지체로서 수십 마이크로미터의 직경을 가지며 일정한 형태와 강도가 있는 지지체로 구성되어 있어 조직모사가 다소 어려운 단점이 있다.Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-2007-0024092 discloses a nano-microporous support, but it has a nano-microsized size and has a large surface area capable of adhering cells, And the porous support is composed of a support having a diameter of several tens of micrometers and a uniform shape and strength, which is a drawback in that it is somewhat difficult to simulate a tissue.

또한, 나노섬유가 면역조직과 같은 연질 조직의 세포 지지를 위한 효과적인 구조체 중 하나로써 사용될 수 있으나, 현재까지 나노구조체는 연질조직과 같이 면역세포를 3차원적으로 배양하기 위한 나노구조체로서 세포 지지체는 그 형상 제어가 곤란하여 다양한 조직으로 구성된 연질조직의 제작에는 어려움을 가지고 있다. In addition, nanofibers can be used as one of effective structures for cell support of soft tissues such as immune tissues. To date, nanostructures are nanostructures for culturing immune cells three-dimensionally, such as soft tissue, It is difficult to control the shape thereof and it is difficult to fabricate a soft tissue composed of various tissues.

또한, 바이오칩은 점차 그 형태가 세포칩, 조직칩, 나아가 장기칩으로 발전해 나가고 있는데, 이러한 칩들은 생체내부의 공간적(spatial), 시간적(temporal) 조건을 정교하게 모사(mimicking)함으로써, 복잡한 생화학적 생체 내(in vivo) 환경을 이해할 수 있는 새로운 기회를 제공하고는 있으나, 면역세포의 배양칩은 면역세포가 가지는 면역반응의 특성으로 인하여 공학적인 접근으로 많은 제한이 동반되고 있어서, 제한적인 수준에서만 나노공학 기반의 생체재료를 활용하고 있는 실정이다. 현재까지 주로 개발된 것은 2차원적 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것이 전부이다.In addition, biochips are gradually being developed into cell chips, tissue chips, and even long-term chips. These chips are capable of deliberately mimicking the spatial and temporal conditions of the living body, Although it provides a new opportunity to understand the in vivo environment, the immune cell culture chip has many limitations due to the engineering approach due to the immune response of immune cells, And biomaterials based on nanotechnology are utilized. Up to now, all that has been developed is the two-dimensional nanofiber sheet and the nanofiber support for tissue culture using the same.

면역세포가 질환세포를 인식하여 상호작용하는 면역 네트워크 칩을 개발하기 위해서는, 면역세포(혹은 조직) 및 질환세포(암 조직) 등 다수의 조직이 연관되어 있기 때문에, 세포간의 상호작용을 2차원적인 배양상태에서는 세포와 세포사이의 비특이적인 접촉으로 인하여 세포간의 상호작용의 정확한 측정이 이루어지는 힘든 실정이다.In order to develop immune network chips in which immune cells recognize and interact with disease cells, a number of tissues such as immune cells (or tissues) and diseased cells (cancer tissues) are involved, In the cultured state, nonspecific contact between cells and cells makes it difficult to accurately measure interactions between cells.

따라서, 3차원적 조직칩을 개발하는 동시에, 다수의 세포 사이 네트워크를 구성하고, 모사하는 측정이 필요하고, 이 경우 특히 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유기반 세포배양구조체를 3차원 인공지지체로 적용하기 위해서는, 세포배양구조체 내부에 세포의 침윤, 배양 및 이동이 가능하도록 제작하는 것이 요구된다.
Therefore, it is necessary to develop a three-dimensional tissue chip, to construct a large number of intercellular networks, and to perform simulated measurement. In this case, particularly, a hybrid fiber-based cell culture structure of nanofiber-micro fiber is applied as a three- It is required to prepare the cell culture structure so that it can infiltrate, cultivate and move the cells inside the cell culture structure.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 요구에 착안하여, 나노미터-마이크로미터 직경의 하이브리드 나노섬유 기반의 세포배양 구조체로서 다단 구조를 갖는 세포배양 구조체를 제작함으로써, 세포가 3차원 매트 형상으로 된 나노섬유에서 3차원적으로 배양되고, 동시에 세포간 3차원적 공간이동이 가능하고 이를 분석할 수 있는 에세이칩을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the inventors of the present invention have focused on the above-mentioned needs and have developed a cell culture structure having a multi-stage structure as a hybrid cell structure based on a nanometer-micrometer diameter hybrid cell, The present invention has been accomplished by developing an essay chip that can be cultured three-dimensionally and capable of three-dimensional spatial movement between cells and capable of analyzing the three-dimensional space movement.

따라서 본 발명은 나노미터-마이크로미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상의 세포지지체를 포함하는 세포배양층을 적어도 2층 이상 포함하는, 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 제공하는 것을 제1 해결과제로 한다. Accordingly, the present invention provides a three-dimensional multi-stage cell culture construct comprising at least two cell culture layers including a mat-like cell support of a three-dimensional structure formed of nanometer-micrometer diameter hybrid nanofibers As a first problem to be solved.

또한, 본 발명은 상기 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 제공하는 것을 제2 해결과제로 한다.It is another object of the present invention to provide an essay chip including the above-described multi-cell culture structure having a three-dimensional structure.

또한 본 발명은 상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서 세포의 침윤, 이동, 세포의 형태, 세포의 활성, 세포간 연결 또는 세포간 작용을 측정·분석하는, 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 분석방법을 제공하는 것을 제3 해결과제로 한다.
Further, the present invention is an analysis method using the above-mentioned assay chip, wherein an assay using an assay chip including a cell culture construct for measuring and analyzing cell invasion, migration, cell shape, cell activity, intercellular junction or intercellular action The third problem is to provide a method.

상기 과제를 해결하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따르면, In order to solve the above problems, according to a first aspect of the present invention,

나노미터-마이크로미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상의 세포지지체를 포함하는 세포배양층을 적어도 2층 이상 포함하고, A cell culture layer comprising a mat-like cell support of a three-dimensional structure formed of hybrid nanofibers having a nanometer-micrometer diameter,

상기 배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포가 주입되어 부착·배양하되, 배양된 세포가 세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 침윤 또는 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체가 제공된다.
Characterized in that one or more cells are injected into at least one of said culture layers and adhered and cultured so that the cultured cells can infiltrate or migrate into the cell support of the culture layer or other culture layer into which cells have been injected, Lt; / RTI > cell culture construct is provided.

또한 본 발명의 제2 측면에 따르면, According to a second aspect of the present invention,

기판; 및 Board; And

상기 기판 상에 상기 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 적층하여 형성된 세포배양분석층;을 포함하고, And a cell culture analysis layer formed by laminating the multi-stage cell culture structure having the three-dimensional structure on the substrate,

상기 세포배양 구조체의 세포배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포가 주입되어 부착·배양하되, 배양된 세포의 세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 침윤 또는 이동을 측정· 분석하는 것을 특징으로 하는, 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩이 제공된다.
At least one cell is injected into at least one cell culture layer of the cell culture structure and adhered and cultured, and the infiltration or migration is measured or analyzed into the cell support of the cultured cell or the other culture layer of the cultured cell Wherein the microcrystalline cell culture structure has a three-dimensional structure.

또한 본 발명의 제3 측면에 따르면, According to a third aspect of the present invention,

세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 분석방법으로서, An assay method using an assay chip including a cell culture construct,

상기 세포배양 구조체의 세포배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하여 배양하는 제1 단계; 및A first step of injecting at least one cell or a culture solution of the cell into at least one cell culture layer of the cell culture structure and culturing the same; And

세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 상기 배양된 세포의 침윤 또는 이동, 세포의 형태, 세포의 활성, 세포간 연결 또는 세포간 작용을 측정· 분석하는 제2 단계를 포함하는, 상기 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 분석방법이 제공된다.
And a second step of measuring and analyzing the infiltration or migration of the cultured cells, the morphology of the cells, the activity of the cells, the intercellular connection or the intercellular action of the cultured cells into the cell support of the cultured cell layer or other cultured layer. There is provided an assay method using an assay chip including a multi-cell culture construct having a three-dimensional structure.

이상 살펴본 바와 같이, As described above,

본 발명에 따르면, 세포배양 구조체가 적어도 2층 이상의 세포배양층으로 구성되어 세포간 3차원 공간을 통한 이동이 가능하도록 하고, 또한 각 세포배양층이 나노미터-마이크로 미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성된 3차원 구조의 매트형상 세포지지체를 기반으로 하여 3차원적 세포배양, 세포이동이 가능하게 되어 세포를 실시간으로 측정·분석할 수 있다. According to the present invention, a cell culture construct is constituted by at least two cell culture layers, allowing movement through a three-dimensional space between cells, and each cell culture layer is formed of hybrid nanofibers having a nanometer-micrometer diameter Based on the matted cell support of the three-dimensional structure, three-dimensional cell culture and cell migration are possible, and the cells can be measured and analyzed in real time.

본 발명에 따른 세포배양구조체는 세포배양 및 세포이동의 측정·분석이 가능한 조직칩 및 에세이칩으로 이용될 수 있다. The cell culture construct according to the present invention can be used as a tissue chip and an assay chip capable of measuring and analyzing cell culture and cell migration.

또한 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 실시간 세포분석이 가능한 효과가 있다. 즉, 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 여러 종류의 면역세포와 질환 세포의 상호작용 및 결합을 실시간으로 측정할 수 있게 되어 실시간으로 3차원적 세포분석이 가능하게 된다. 특히 본 발명에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석방법의 경우, 면역세포와 암세포를 각기 다른 구획에서동시 배양한 후 한 구획에서 동시 배양할 수 있음으로써 면역세포의 이동을 측정할 뿐만 아니라 면역세포의 활성, 암세포에 대한 반응을 실시간으로 측정할 수 있는 효과를 가지며 암조직으로 이동한 면역세포를 포함하는 암조직-유사 배양구조물을 제공하는 효과도 가진다.
In addition, it is possible to perform real-time cell analysis by measuring cell culture and cell migration using the assay chip according to the present invention. In other words, by using the assay chip according to the present invention, it is possible to measure the interaction and binding between various kinds of immune cells and diseased cells in real time, thereby enabling three-dimensional cell analysis in real time. In particular, in the case of the cell analysis method using the assay chip according to the present invention, since the immune cells and the cancer cells can be co-cultured in different compartments and co-cultured in one compartment, not only the migration of immune cells can be measured, , And has an effect of measuring the response to cancer cells in real time, and also has an effect of providing a cancer tissue-like culture structure including immune cells that have been transferred to cancer tissues.

도 1는 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 2층의 하이브리드 나노섬유 지지체로 구성된 에세이칩의 제작 모식도를, (b), (c)는 제작된 에세이칩의 종단면을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩의 실제 모형의 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 나노미터-마이크로미터 하이브리드섬유의 제작을 위한 전기방사법의 모식도(왼쪽)와 본 발명의 일 실시예에 따른 에체이칩을 구성하는 나노섬유의 직경이 500nm~2㎛가 되도록 제작한 하이브리드 나노섬유의 상부 및 하부의 SEM 사진(중간), 및 하이브리드 나노섬유의 공극의 크기 정도를 표시한 것이다(오른쪽).
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 녹색형광으로 염색한 마우스 복강 호중구가 케모카인인 interleukin-8 (IL-8)이 있는 쪽으로 이동하는 것을 형광현미경으로 측정한 그림을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 케모카인인 IL-8의 반응에 의하여 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체로 이동을 한 호중구의 수를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 위층 하이브리드 나노섬유 지지체에서 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체로 활성형 수지상세포가 케모카인인 CCL21에 반응하는 것을 측정한 형광현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 케모카인인 CCL21의 반응에 의하여 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체로 이동을 한 활성형 수지상세포의 수를 나타낸 것이다.
도 8은 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있는 케모카인 CCL21의 분획으로 이동하는 수지상세포의 모양을 비교분석한 데이터로서 z-stack 결과에서 수지상세포의 액틴(actin)이 아래쪽으로 향하는 세포 염색을 보임으로써 세포가 3차원 공간을 통하여 아래쪽으로 이동하는 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 위층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있는 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있는 적색형광으로 염색한 후 항암제인 mitoxanthrone (MXT)를 처리한 마우스 대장암세포(CT26) 쪽으로 이동하는 것을 확인한 형광현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 위층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있던 수지상세포가 아래층의 대장암암세포 분획으로 이동하여 이들 세포들이 섞여 있는 것을 형광현미경으로 관찰한 데이터를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 항암제를 처리한 대장암세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 데이터로서 위층 및 아래층의 하이브리드 나노섬유 지지체에서 측정된 세포수의 비교데이터를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 위층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있는 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있는 적색형광으로 염색한 후 항암제인 MXT를 처리한 마우스 림프종세포(A20) 쪽으로 이동하는 것을 확인한 형광현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 항암제를 처리한 림프종세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 데이터로서 아래층 하이브리드 나노섬유 지지체에서 측정된 세포수가 항암제 처리에 의하여 증가하는 비교데이터를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 위층 하이브리드 나노섬유 지지체에 있던 수지상세포가 아래층의 대장암암세포 분획으로 이동한 후 이들 두 가지 종류의 세포가 분포하고 있는 형태를 관찰한 데이터를 나타낸 것이다.
도 14은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 위층의 하이브리드 나노섬유 지지체에 있던 수지상세포가 아래층의 림프종세포 분획으로 이동한 후 수지상세포가 림프종세포를 탐식하여 두 가지 형광이 겹쳐서 나오는 사진을 나타내었다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포 분석에 있어서 를 참고하면, 항암제를 처리한 A20 림프종세포가 이동한 수지상세포에 의하여 탐식하여 두 가지 형광이 겹쳐서 나오는 사진을 나타내었다. FIG. 1 (a) is a schematic view showing the production process of an essay chip composed of a two-layered hybrid nanofiber support according to an embodiment of the present invention, and FIGS. 2 (b) and 2 (c) are longitudinal sectional views of the produced essay chip.
2 shows an image of an actual model of an essay chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic view of an electrospinning method (left) for fabricating the nanometer-micrometer hybrid fiber according to the present invention and a nanofiber fiber constituting the etch chip according to an embodiment of the present invention so that the diameter of the nanofiber is 500 nm to 2 μm SEM photographs (middle) of the upper and lower portions of the hybrid nanofibers produced, and sizes of the pores of the hybrid nanofibers (right).
FIG. 4 is a graph showing a fluorescence microscope image showing that a green fluorescence-stained mouse peritoneal neutrophil migrates toward the side of a chemokine interleukin-8 (IL-8) in an assay using an assay chip according to an embodiment of the present invention Lt; / RTI >
FIG. 5 shows the number of neutrophils migrated to the lower layer hybrid nanofiber support by the reaction of chemokine IL-8 in cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a fluorescence microscopic result obtained by measuring the response of active dendritic cells to CCL21 as a lower layer hybrid nanofiber support in the upper layer hybrid nanofiber support in the analysis of cells using an assay chip according to an embodiment of the present invention will be.
FIG. 7 shows the number of active dendritic cells migrated to the lower layer hybrid nanofiber support by reaction of chemokine CCL21 in cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 is a comparative analysis of the dendritic cell morphology of chemokine CCL21 in the lower layer hybrid nanofiber support. The z-stack results show that the actin of dendritic cells underwent downward cell staining, It shows the result of moving downward through three-dimensional space.
FIG. 9 is a graph showing the results of cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention. In FIG. 9, green fluorescence-stained dendritic cells on a supernatant hybrid nanofiber support were stained with red fluorescence on a lower hybrid nanofiber support, (CT26) treated with mouse anti-mouse T cells (MXT).
10 is a graph showing the results of cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention, in which dendritic cells in a supernatant of hybrid nanofiber scaffold migrate to the colon cancer cell fraction of the lower layer, .
11 is a graph showing cell counts of dendritic cells transferred to colon cancer cells treated with an anticancer agent in the analysis of cells using an assay chip according to an embodiment of the present invention, Number comparison data.
FIG. 12 is a graph showing the results of cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention. In FIG. 12, green fluorescence-stained dendritic cells on a supernatant hybrid nanofiber support were stained with red fluorescence in a lower layer hybrid nanofiber support, To the mouse lymphoma cell line (A20) treated with the mouse lymphoma cell line.
13 is a graph showing the number of cells in which dendritic cells migrated into lymphoma cells treated with an anticancer agent in the analysis of cells using an assay chip according to an embodiment of the present invention, wherein the number of cells measured in the lower layer hybrid nanofiber scaffold As shown in FIG.
FIG. 14 is a graph showing the results of cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention, wherein the dendritic cells in the supernatant hybrid nanofiber scaffold migrate to the colon cancer cell fraction of the lower layer, Of the data.
14 is a graph showing the results of cell analysis using an assay chip according to an embodiment of the present invention. After dendritic cells in a hybrid nanofiber support on the upper layer migrate to the lymphoma cell fraction in the lower layer, This is a picture of the overlapping.
FIG. 15 is a photograph showing an A20 lymphoma cell treated with an anticancer drug by dendritic cells which have migrated through the analysis of cells using the assay chip according to an embodiment of the present invention.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 제1 측면에 따르면, According to a first aspect of the present invention,

나노미터-마이크로미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상의 세포지지체를 포함하는 세포배양층을 적어도 2층 이상 포함하고, A cell culture layer comprising a mat-like cell support of a three-dimensional structure formed of hybrid nanofibers having a nanometer-micrometer diameter,

상기 배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포가 주입되어 부착·배양하되, 배양된 세포가 세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 침윤 또는 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체가 제공된다. Characterized in that one or more cells are injected into at least one of said culture layers and adhered and cultured so that the cultured cells can infiltrate or migrate into the cell support of the culture layer or other culture layer into which cells have been injected, Lt; / RTI > cell culture construct is provided.

본 발명에 있어서 상기 하이브리드 나노섬유 세포지지체는 마이크로 직경과 나노직경을 갖는 마이크로 섬유 및 나노섬유의 집합체로서 3차원적 매트릭스의 구조를 갖는 매트형상인 것이 특징이다. 이에 따라 상기 지지체는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하게 된다. 특히, 생체적합성 고분자를 이용하여 제작되는 생체적합성 고분자 섬유의 경우 세포의 통과가 가능할 정도로 다수의 공극(PORE)을 형성하고 있어 세포의 침윤·부착 및 이에 따른 세포배양이 가능하게 된다. In the present invention, the hybrid nanofiber cell supporter is an aggregate of microfibers and nanofibers having a microdiameter and a nanometer diameter, and is a mat having a three-dimensional matrix structure. Accordingly, the support has a large surface area in a small space, is strong in durability, is very easy to handle, can be manufactured in various forms, and is easily chemically bonded with various materials. In particular, a biocompatible polymer fiber fabricated using a biocompatible polymer forms a large number of pores so that cells can pass therethrough, allowing infiltration and attachment of cells and cell culture therefor.

이 때, 상기 하이브리드 섬유 지지체 내 세포의 부착은 주로 나노섬유에서 이루어지고, 마이크로 섬유에 의하여 공극의 크기를 증가시킴에 따라 세포의 이동이 가능하게 하는 역할을 하게 되어 3차원 매트릭스 구조를 형성하게 되는 것이다. At this time, the attachment of the cells in the hybrid fiber support is mainly performed in nanofibers, and as the size of the pores is increased by the micro fibers, the cells are allowed to move, thereby forming a three-dimensional matrix structure will be.

따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유는 상기 나노섬유 55~85 중량%과 마이크로 섬유 15~45 중량%로 구성되는 것이 적합하다. 상기 나노섬유가 상기 범위를 초과하여 포함하는 경우에는 공극률이 저하됨에 따라 세포의 침윤·부착이 이루어지지 않아 세포배양이 상기 지지체 상부(TOP)에서만 이루어지게 되고, 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 공극률이 지나치게 높아짐에 따라 세포의 침윤에 의하여 상기 지지체 하부(BOTTOM)에서만 세포의 배양이 일어나게 되는 문제점이 있으므로 상기 범위 내에서 혼합되어 하이브리드 섬유를 구성하는 것이 바람직하다. 이 경우, 보다 바람직하게는 상부에서는 마이크로 섬유의 비율이 40% 이상으로 많이 함유되고, 하부에서는 마이크로 섬유의 비율이 30중량% 이하로 적게 함유되도록 하이브리드 섬유를 구성할 때 상부에서 하부로 세포의 침윤·부착이 잘 일어날 수 있다. Accordingly, it is preferable that the hybrid fiber according to the present invention is composed of 55 to 85% by weight of the nanofiber and 15 to 45% by weight of the microfiber. When the nanofibers are contained in a range exceeding the above range, cell infiltration and attachment are not performed as the porosity is lowered, so that cell cultivation is performed only in the upper part of the supporter (TOP) It is preferable to form hybrid fibers by mixing within the above range because there is a problem that cells are cultured only in the lower part of the support (BOTTOM) due to infiltration of cells. In this case, more preferably, when the hybrid fiber is constituted such that the proportion of micro fibers is more than 40% and the proportion of micro fibers is less than 30% by weight in the upper part, · Adhesion can occur well.

또한, 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 세포지지체를 형성하는 하이브리드 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000, 예컨대, 50,000 내지 500,000의 범위인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중 PCL을 이용하여 나노섬유를 제작하였다.Preferably, in the present invention, the hybrid nanofibers forming the cell support are selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly (lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) Poly (L-lactide) -co- (caprolactone)], poly (ester urethane) (PEUU), poly [ (PVA), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinyl pyrrolidone (PVP), polystyrene (PS), and polyvinyl pyrrolidone Polyaniline (PAN), or a copolymer thereof, or a mixture thereof. The biocompatible polymer to be used in the present invention is not limited thereto, but may have a number average molecular weight of 10,000 to 1,000,000, for example, 50,000 to 500,000. In one embodiment of the present invention, nanofibers were fabricated using PCL.

이 때, 바람직하게는 본 발명에 있어서 각층에 사용하는 하이브리드 나노섬유 지지체는 전기방사법에 의해 형성될 수 있다. At this time, preferably, the hybrid nanofiber support used in each layer in the present invention may be formed by electrospinning.

상기 전기방사법은 통상의 나노섬유 지지체 제조 시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 나노섬유를 제조한다. 상기 나노섬유의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조 시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생체적합성 고분자 나노섬유 지지체의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.The electrospinning can be carried out by a method used in the production of conventional nanofiber supports. For example, a polymer solution is prepared by dissolving a biocompatible polymer in a solvent, and the polymer solution is injected into an electrospinning device and discharged to prepare a biocompatible polymer nanofiber having a porous structure. The concentration of the solvent, the concentration of the polymer solution, the voltage used for electrospinning, the scattering distance, and the flow rate used in the preparation of the polymer solution used for the production of the nanofibers can be determined by the type of the polymer used or the desired biocompatible polymer nanofiber support And the like can be appropriately adjusted by those skilled in the art.

본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자 하이브리드 나노섬유에 있어서, 하이브리드 나노섬유 세포지지체의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 필요에 따라 고분자 용액의 농도, 전기방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있는바, 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 나노섬유는 100 나노미터 ~ 1.5 마이크로미터의 직경을 가지고, 하이브리드 나노섬유 매트의 두께는 70~100 마이크로미터인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 하이브리드 나노섬유는 PCL을 재료로 하여 전기방사법으로 제조된 것으로 평균 700 나노미터 ~ 1.2 마이크로미터의 직경으로 평균 700 마이크로미터의 두께를 가지는 매트로 제작되도록 한다.In the biocompatible polymer hybrid nanofiber used in the present invention, the diameter, void size, porosity, etc. of the hybrid nanofiber cell support can be controlled by adjusting the concentration of the polymer solution and the condition of electrospinning In the present invention, it is preferable that the hybrid nanofiber has a diameter of 100 nanometers to 1.5 micrometers, and the thickness of the hybrid nanofiber mat is 70 to 100 micrometers. More preferably, the hybrid nanofibers are produced by electrospinning using PCL as a material, and are manufactured as a mat having an average diameter of 700 nanometers to 1.2 micrometers and an average thickness of 700 micrometers.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 세포배양층은 폴리머층; 및 상기 폴리머층에 상기 하이브리드 나노섬유 세포지지체를 적층하여 형성된 세포지지체층을 포함하는 것을 특징으로 한다. 폴리머층을 형성함으로써 상기 하이브리드 나노섬유와의 부착성을 증가시킬 수 있게 되는 것으로 상기 폴리머층은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 형성될 수 있다. Preferably, in the present invention, the cell culture layer comprises a polymer layer; And a cell support layer formed by laminating the hybrid nanofiber cell supporter on the polymer layer. (PDMS), polystyrene (PS), polymethylmethacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PMMA), polymethylmethacrylate (PMMA), and the like. PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose, and silicone rubber.

또한 본 발명은, 상기 하이브리드 나노섬유 세포지지체를 포함하는 세포배양층은 적어도 2층 이상을 포함하여 다단 구조의 세포배양 구조체인 것을 특징으로 한다. 이로써 세포배양층 내 세포지지체 내에서 배양된 세포는 세포침윤 또는 세포이동에 의하여 3차원적으로 배양되게 되고 상기 배양된 세포는 다시, 각 세포배양층 내 배양된 세포 상호간의 작용 또는 각 세포배양층에 포함된 생리활성인자 등의 영향으로 세포간 3차원 공간을 통한 이동이 가능하게 되어 3차원적 세포배양, 세포간 접촉이 가능하게 되는 것이다. 즉, 본 발명의 상기 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체는, 상기 배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포가 주입되어 부착·배양하게 되어, 배양된 세포가 세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 침윤 또는 이동이 가능하게 된다. In addition, the present invention is characterized in that the cell culture layer containing the hybrid nanofiber cell support is a multi-stage cell culture structure including at least two layers. As a result, the cells cultured in the cell support in the cell culture layer are cultured three-dimensionally by cell invasion or cell migration, and the cultured cells are again cultured in a cell culture medium, , It is possible to move through the three-dimensional space between the cells due to the influence of the physiologically active factors contained in the cell. That is, in the multi-stage cell culture structure having the three-dimensional structure of the present invention, at least one or more cells are injected into at least one of the above-mentioned culture layers to adhere and culture the cultured cells, Lt; RTI ID = 0.0 > of cell < / RTI > support.

이 때, 상기 2층 이상으로 형성되는 세포배양층 각각에 다른 종류의 세포를 1종 이상 주입하여 세포를 배양하게 되면, 배양된 다른 종류의 세포간 상호작용으로 상기 하이브리드 나노섬유 세포지지체 내에서 세포침윤 또는 아래층의 세포배양층으로 세포이동이 일어나게 되어 아래층의 세포배양층에서는 3차원적 세포간 접촉이 가능하고, 이에 따라 세포간 상호작용이 가능하게 된다. 예를 들어 약물을 처리한 암세포와 면역세포를 배양하는 경우에는 약물을 처리한 암세포가 면역 반응을 유도해 수지상세포가 상기 하이브리드 나노섬유 세포지지체 내에서 세포침윤 또는 아래층의 세포배양층으로 세포이동이 일어나게 되어 아래층의 세포배양층에서는 3차원적 세포간 접촉이 가능하고, 이에 따라 세포간 상호작용이 가능하게 된다. At this time, when one or more kinds of cells are injected into each of the cell culture layers formed by the two or more layers, and the cells are cultured, the cells of the hybrid nanofiber cell support Cell migration into the cell culture layer of the lower layer becomes possible, and three-dimensional intercellular contact is possible in the cell culture layer of the lower layer, thereby allowing intercellular interactions. For example, when cancer cells treated with the drug and immune cells are cultured, cancer cells treated with the drug induce an immune response, and the dendritic cells migrate into the hybrid nanofiber cell support, In the lower layer of the cell culture layer, three-dimensional intercellular contact is possible and thus intercellular interactions are possible.

또한 각기 다른 종류의 세포 배양시 아래층으로 이동한 각기 다른 종류의 세포는 3차원적으로 배양되고, 암세포와 면역세포를 배양하는 경우에는 면역세포가 자발적으로 암세포 이동하여 면역 반응을 유도함으로써 환경이 구축되고 이를 관찰할 수 있는 모듈로 사용가능하다. 이 때, 상기 암세포로는 다양한 종류의 암세포뿐만 아니라 종양조직으로부터 분리한 조직의 구성 세포 모두를 배양할 수 있다. In addition, when different types of cells are cultured, different types of cells migrating downward are cultured three-dimensionally, and when cancer cells and immune cells are cultured, immune cells spontaneously move cancer cells to induce an immune response. And can be used as a module to observe it. At this time, the cancer cells can be cultured not only in various kinds of cancer cells, but also all constituent cells of tissues isolated from tumor tissues.

또한, 상기 세포배양층 중에서 최하단의 세포배양층에는 약물학적 유효물질 또는 이들의 혼합물이 더 포함되도록 할 수 있다. 이 경우, 상기 하이브리드 나노섬유 지지체에 아가로즈 층을 함유하도록 하고, 상기 아가로즈 층에 상기 약물학적 유효물질 또는 이들의 혼합물을 포함하도록 하는 방법을 이용할 수 있다. 이 경우, 최하단을 제외한 위층의 세포배양층에서 배양된 세포가 아래층으로 세포이동을 하게 되면 최하단의 세포배양층에서는 약물학적 유효물질과 3차원적 세포 접촉이 가능하게 되어, 약물학적 유효물질에 대한 세포 반응이 일어날 수 있게 된다. In addition, a pharmacologically active substance or a mixture thereof may be further contained in the cell culture layer at the bottom of the cell culture layers. In this case, the hybrid nanofiber support may contain an agarose layer, and the agarose layer may contain the pharmacologically active substance or a mixture thereof. In this case, when the cells cultured in the upper cell culture layer except for the lowermost cell migrate to the lower layer, it becomes possible to make three-dimensional cell contact with the pharmacologically active substance in the lowermost cell culture layer, A cell reaction can take place.

바람직하게는 상기 약물학적 유효물질로는, 헤파린, 합성 헤파린 동족체(예를 들어 폰다파리눅스), 히루딘, 항트롬빈 III, 드로트레코긴 알파; 피브린 용해성 물질, 예를 들어 알테플라제, 플라스민, 리소키나제, 인자 XIIa, 프로유로키나제, 유로키나제, 아니스트레플라제, 스트렙토키나제; 혈소판 응집 억제제, 예를 들어 아세틸 살리실산, 티클로피딘, 클로피도그렐, 아브식시맵, 덱스트란; 코르티코스테로이드, 예를 들어 알클로메타손, 암시노나이드, 증가된 베타메타손, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소나이드, 코르티손, 클로베타솔, 클로코르톨론, 데수나이트, 데속시메타손, 덱사메타손, 플루시놀론, 플루오시노나이드, 플루란드레놀라이드, 플루니솔라이드, 플루티카손, 할시노나이드, 할로베타솔, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 프레드니카베이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론; 소위 비 스테로이드성 소염 약물, 예를 들어 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살살레이트, 슐린닥, 톨메틴, 셀레콕시브, 로페콕시브; 세포발육억제제, 예를 들어 알칼로이드 및 포도필룸 독소, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴; 알킬란트, 예를 들어 니트로소우레아, 질소 상실 동족체; 세포독성 항생제, 예를 들어 다우노루비신, 독소루비신 및 다른 안트라사이클린 및 관련 물질, 블레오마이신, 마이토마이신; 대사길항 물질, 예를 들어 폴산 동족체, 퓨린 동족체 또는 퓨리미딘 동족체; 패클리탁셀, 도세탁셀, 시롤리무스; 백금 화합물, 예를 들어 카보플라티늄, 시스플라티늄 또는 옥살리플라티늄; 암사크린, 이리노테칸, 이마티니브, 토포테칸, 인터페론-알파 2a, 인터페론-알파 2b, 하이드록시카바미드, 밀테포신, 펜토스타틴, 포르피머, 알데스류킨, 벡사로텐, 트레티노인; 안드로겐 억제 물질 및 에스트로겐 억제 물질; 부정맥 치료 약물, 특히 I 군의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 퀴니딘 유형의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 퀴니딘, 다이소피라미드, 아즈말린, 프라즈말륨 비타르트레이트, 데타즈뮴 비타르트레이트; 리도카인 유형의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 리도카인, 멕실레틴, 페니토인, 토카이니드; IC 군의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 프로파페논, 플레카이나이드(아세테이트); II 군의 부정맥 치료 약물, 베타수용체 차단제, 예를 들어 메토플롤롤, 에스몰롤, 프로프라놀롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 옥스프레놀롤; III 군의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 아미오다론, 소탈롤; IV 군의 부정맥 치료 약물, 예를 들어 딜티아젬, 베라파밀, 갈로파밀; 다른 부정맥 치료 약물, 예를 들어 아데노신, 오르시프레날린, 이프라트로퓸 브로마이드; 심근에서 혈관형성을 자극하는 약제, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 기본적인 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 비-바이러스성 DNA, 바이러스성 DNA, 내피 성장 인자: FGF-1, FGF-2, VEGF, TGF; 항체, 단클론 항체, 안티칼린; 줄기 세포, 내피 선조 세포(EPC); 디지탈리스 글리코사이드, 예를 들어 아세틸 디곡신/메틸디곡신, 디지톡신, 디곡신; 심장 글리코사이드, 예를 들어 오우아바인, 프로칠라리딘; 과다긴장 억제제, 예를 들어 중추적으로 유효한 항아드레날린성 물질, 예를 들어 메틸도파, 이미다졸린 수용체 작용물질; 디하이드로피리딘 유형의 칼슘 채널 차단제, 예를 들어 니페디핀, 니트렌디핀; ACE 억제제: 퀴나프릴레이트, 실라자프릴, 모엑시프릴, 트란돌라프릴, 스피라프릴, 이미다프릴, 트란돌라프릴; 안지오텐신-II-길항물질: 칸데사탄실렉세틸, 발사탄, 텔미사탄, 올메사탄메독소밀, 에프로사탄; 말초적으로 유효한 알파-수용체 차단제, 예를 들어 프라조신, 유라피딜, 독사조신, 부나조신, 테라조신, 인도라민; 혈관확장제, 예를 들어 디하이드랄라진, 디이소프로필 아민 디클로로아세테이트, 미녹시딜, 니트로프루시데-나트륨; 다른 과다긴장 억제제, 예를 들어 인다파미드, 코데르고크린 메실레이트, 디하이드로에르고톡신 메탄 설포네이트, 시클레타닌, 보센탄, 플루드로코르티손; 포스포디에스테라제 억제제, 예를 들어 밀리논, 에녹시몬 및 각성제, 예를들어 특히 아드레날린성 및 도파민작용성 물질, 예를 들어 도부타민, 에피네프린, 에틸레프린, 노르페네프린, 노르에피네프린, 옥실로프린, 도파민, 미도드린, 폴레드린, 아메지늄 메틸; 및 부분 아드레날린 수용체 작용물질, 예를 들어 디하이드로에르고타민; 피브로넥틴, 폴리리신, 에틸렌 비닐 아세테이트, 염증성 사이토카인, 예를 들어 TGFβ, PDGF, VEGF,bFGF, TNFα, NGF, GM-CSF, IGF-a, IL-1, IL-8, IL-6, 성장 호르몬; 뿐만 아니라 점착성 물질, 예를 들어 시아노아크릴레이트, 베릴륨, 실리카; 및 성장 인자, 예를 들어 적혈구 생성인자, 호르몬, 예를 들어 코르티코트로핀, 고나도트로핀, 소마트로핀, 티로트로핀, 데스모프레신, 테를리프레신, 옥시토신, 세트로렐릭스, 코르티코렐린, 류프로렐린, 트립토렐린, 고나도렐린, 가니렐릭스, 부세렐린, 나파렐린, 고세렐린, 뿐만 아니라 조절 펩티드, 예를 들어 소마토스타틴, 옥트레오티드; 뼈 및 연골 자극 펩티드, 뼈 형태발생 단백질(BMP), 특히 재조합 BMP, 예를 들어 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2), 비스포스포네이트(예를 들어 리세드로네이트, 파미드로네이트, 이브안드로네이트, 졸레드론산, 클로드론산, 에티드론산, 알렌드론산, 틸루드론산), 플루오라이드, 예를 들어 이나트륨 플루오로포스페이트, 나트륨 플루오라이드; 칼시토닌, 디하이드로타키스티렌; 성장 인자 및 사이토카인, 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 형질전환 성장 인자-b(TGF-b), 형질전환 성장 인자-a(TGF-a), 적혈구생성인자(Epo), 인슐린형 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린형 성장 인자-II(IGF-II), 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 종양 괴사 인자-a(TNF-a), 종양 괴사 인자-b(TNF-b), 인터페론-g(INF-g), 콜로니 자극 인자(CSF); 단핵구 화학주성 단백질, 섬유아세포 자극 인자 1, 히스타민, 피브린 또는 피브리노겐, 엔도텔린-1, 안지오텐신 II, 콜라겐, 브로모크립틴, 메틸세르자이드, 메토트렉세이트, 카본테트라클로라이드, 티오아세트아미드 및 에탄올; 또한 은(이온), 이산화 티탄, 항생제 및 감염 억제제, 예를 들어 특히 β-락탐 항생제, 예를 들어 β-락타마제-민감성 페니실린, 예를 들어 벤질 페니실린(페니실린 G), 페녹시메틸페니실린(페니실린 V); β-락타마제-내성 페니실린, 예를 들어 아미노페니실린, 예를 들어 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린; 아실아미노페니실린, 예를 들어 메즐로실린, 피페라실린; 카복시페니실린, 세팔로스포린, 예를 들어 세파졸린, 세푸록심, 세폭시틴, 세포티암, 세파클로르, 세파드록실, 세팔렉신, 로라카르베프, 세픽심, 세푸록시막세틸, 세프티부텐, 세프포독심프록세틸, 세프포독심프록세틸; 아즈트레오남, 에르타페넴, 메로페넴; β-락타마제 억제제, 예를 들어 설박탐, 설타미실린토실레이트; 테트라사이클린, 예를 들어 독시사이클린, 미노사이클린, 테트라사이클린, 클로로테트라사이클린, 옥시테트라사이클린; 아미노글리코사이드, 예를 들어 젠타마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 아미카신, 네틸미신, 파로모마이신, 프라마이세틴, 스펙티노마이신; 마크로리드 항생제, 예를 들어 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 스피라마이신, 조사마이신; 린코사미드, 예를 들어 클린다마이신, 린코마이신, 지라제 억제제, 예를 들어 플루오로퀴놀론, 예를 들어 시프로플록사신, 오플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 가티플록사신, 에녹사신, 플레록사신, 레보플록사신; 퀴놀론, 예를 들어 피페미드산; 설폰아미드, 트리메토프림, 설파디아진, 설팔렌; 글리코펩티드 항생제, 예를 들어 반코마이신, 테이코플라닌; 폴리펩티드 항생제, 예를 들어 폴리믹신, 예를 들어 콜리스틴, 폴리믹신-B, 니트로이미다졸 유도체, 예를 들어 메트로니다졸, 티니다졸; 아미노퀴놀론, 예를 들어 클로로퀸, 메플로퀸, 하이드록시클로로퀸; 비구아나이드, 예를 들어 프로구아닐; 퀴닌 알칼로이드 및 디아미노피리미딘, 예를 들어 피리메타민; 암페니콜, 예를 들어 클로람페니콜; 리파부틴, 답손, 푸시딘산, 포스포마이신, 니푸라텔, 텔리트로마이신, 푸사펀진, 포스포마이신, 펜타미딘디이세티오네이트, 리팜피신, 타우롤리딘, 아토바쿠온, 리네졸리드; 바이러스증식 억제제, 예를 들어 아시클로비어, 강시클로비어, 팜시클로비어, 포스카넷, 이노신(디메프라놀-4-아세트아미도벤조에이트), 발강시클로비어, 발라시클로비어, 시도포비어, 브리뷰딘; 레트로바이러스 억제 유효 성분(뉴클레오사이드 동족체 역 전사효소 억제제 및 유도체), 예를 들어 라미뷰딘, 잘시타빈, 디다노신, 지도뷰딘, 테노포비어, 스타뷰딘, 아바카비어; 비 뉴클레오사이드 동족체 역 전사효소 억제제, 예를 들어 암프레나비어, 인디나비어, 사퀴나비어, 로피나비어, 리토나비어, 넬피나비어; 아만타딘, 리바비린, 자나미비어, 오셀타미비어 및 라미뷰딘 및 임의의 목적하는 이들의 조합 및 혼합물 중에서 선택된 유효성분들 또는 유효성분들의 조합을 포함한다. Preferably, the pharmacologically active substance is selected from the group consisting of heparin, a synthetic heparin analogue (for example, Fondaparinux), hirudin, antithrombin III, dorothrecocin alpha; Fibrinolytic substances such as alteplase, plasmin, lysozyme, Factor XIIa, pro-urokinase, urokinase, anisthreoplast, streptokinase; Platelet aggregation inhibitors such as acetylsalicylic acid, ticlopidine, clopidogrel, abciximab, dextran; But are not limited to, corticosteroids such as alclometasone, amcinonide, increased betamethasone, beclomethasone, betamethasone, budesonide, cortisone, clobetasol, cocortolone, dehydrated, dexamethasone, dexamethasone, Fluconolone, fluconolone, flurandrenolide, flunisolide, fluticasone, halcinonide, halobetasol, hydrocortisone, methylprednisolone, mometasone, prednicabate, prednisone, prednisolone, triamcinolone; Called non-steroidal anti-inflammatory drugs such as diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, fluvifropfen, ibuprofen, indomethacin, ketoprofen, ketorolac, , Meloxicam, nabumetone, naproxen, oxaprozin, piroxycam, salsarate, sulindac, tolmetin, celecoxib, rofecoxib; Cell growth inhibitors such as alkaloids and grape filament toxins such as vinblastine, vincristine; Alkylates such as nitroso urea, nitrogen-loss congeners; Cytotoxic antibiotics such as daunorubicin, doxorubicin and other anthracyclines and related substances, bleomycin, mitomycin; Metabolic antagonists, e. G., Folic analogues, purine analogs or purimidine analogs; Paclitaxel, docetaxel, sirolimus; Platinum compounds such as carboplatin, cisplatinum or oxalylplatin; Interferon-alpha 2a, interferon-alpha 2b, hydroxycarbamides, miltefosine, pentostatin, formicimer, aldethsu leukin, bexarotene, tretinoin, aminoglycoside, aminocrin, irinotecan, imatinib, topotecan, interferon-alpha 2a. Androgen inhibitors and estrogen inhibitors; Arrhythmia therapy medicines, especially Arrhythmia drugs of group I, for example, quinidine-type arrythmia drugs such as quinidine, diiso pyramid, azurin, prasminate bitartrate, demazmitate bitartrate; Lidocaine-type arrhythmic therapy drugs such as lidocaine, mexylin, phenytoin, tocainide; Arrhythmia medicines in the IC group, such as propaphenone, flecainide (acetate); Group II arrhythmia drugs, beta receptor blockers such as metoprolol, esmolol, propranolol, metoprolol, atenolol, oxprenolol; Group III drugs for arrhythmia, such as amiodarone, Sotalol; IV arrhythmia drugs such as diltiazem, verapamil, galopaxil; Other arrhythmia medications such as adenosine, orciprenaline, ipratropium bromide; Vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), non-viral DNA, viral DNA, endothelial growth factors: FGF-1, FGF-2 , VEGF, TGF; Antibodies, monoclonal antibodies, anticalines; Stem cells, endothelial progenitor cells (EPC); Digitalis glycosides, such as acetyl digoxin / methyl digoxin, digoxin, digoxin; Cardiac glycosides, such as ouabain, propylparidine; Hypertension inhibitors, for example, pivotally effective anti-adrenergic agents such as methyldopa, imidazoline receptor agonists; Calcium channel blockers of the dihydropyridine type, such as nifedipine, nitrendipine; ACE inhibitors: quinaprilate, silazapril, moexifril, trandolapril, spirapril, imidapril, trandolapril; Angiotensin-II-antagonistic substances: candesartan cilexetil, valsatan, telmisartan, olmesatin medoxomil, frosatan; Alpha-receptor blockers that are effective in the periphery, such as, for example, prazosin, europilid, doxazosin, cannabisin, terazosin, indolamine; Vasodilators such as dihydralazine, diisopropylamine dichloroacetate, minoxidil, nitroprusside-sodium; Other hypertension inhibitors, such as indapamide, corderocin mesylate, dihydroergocetin methanesulfonate, cyclotannin, bosentan, furodocortisone; Phosphodiesterase inhibitors such as milrinone, enoximone and stimulants such as, in particular, adrenergic and dopaminergic substances such as dobutamine, epinephrine, ethylrefrin, norpheneprine, norepinephrine, Oxyloprine, dopamine, midodrine, poulridin, amethinium methyl; And partial adrenergic receptor agonists such as dihydroergotamine; IGF-a, IL-1, IL-8, IL-6, growth hormone, and other growth factors, such as fibronectin, polylysine, ethylene vinyl acetate, inflammatory cytokines such as TGF ?, PDGF, VEGF, bFGF, TNF ?, NGF, GM- ; As well as tacky materials such as cyanoacrylate, beryllium, silica; And growth factors such as erythropoietic factors such as hormones such as corticotropin, gonadotropin, somatropin, tiotropin, desmopressin, telipressin, oxytocin, setroelelix, cortisone, Corelin, lyoporelin, tryptorelin, ganadorelin, ganilelix, boserelin, napalelin, goserelin, as well as modulating peptides such as somatostatin, octreotide; (BMP), particularly recombinant BMPs such as recombinant human BMP-2 (rhBMP-2), bisphosphonates (such as risedronate, pamidronate, eve andronate, Redronionic acid, clodronic acid, etidronic acid, alendronic acid, and tiludronic acid), fluorides such as disodium fluorophosphate, sodium fluoride; Calcitonin, dihydrotachyestyrene; Growth factors and cytokines such as epithelial growth factor (EGF), platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor-b (TGF- (IGF-I), interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IGF-I), insulin-like growth factor- (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor-a (TNF-a), tumor necrosis factor- INF-g), colony stimulating factor (CSF); Endothelin-1, angiotensin II, collagen, bromocriptine, methylsulfide, methotrexate, carbon tetrachloride, thioacetamide and ethanol; It is also possible to use other antioxidants, such as silver (I), titanium dioxide, antibiotics and infectious inhibitors such as, in particular, beta -lactam antibiotics such as beta-lactamase-sensitive penicillins such as benzylpenicillin (penicillin G), phenoxymethylpenicillin V); beta -lactamase-resistant penicillins, such as aminopenicillins, such as amoxicillin, ampicillin, bacampicillin; Acylaminophenicins, such as meslocillin, piperacillin; Carboxypenicillin, cephalosporin such as cephazoline, cefuroxime, cephoxitin, cell thyam, cepharchlor, cephadoxil, cephalexin, loracarbev, cefixime, cefuroxime macetyl, ceftibuten, Foresin propecetyl, cefpodinsim; Aztreonam, erthapenem, meropenem; beta-lactamase inhibitors, such as sulpham, sulphamylcytosylate; Tetracycline such as doxycycline, minocycline, tetracycline, chlorotetracycline, oxytetracycline; Aminoglycosides such as gentamicin, neomycin, streptomycin, tobramycin, amikacin, nethymicin, paromomycin, pramycetin, spectinomycin; Macrolide antibiotics such as azithromycin, clarithromycin, erythromycin, loxitolemycin, spiramycin, irradomycin; Such as ciprofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, gatifloxacin, enoxacin, feloxacin, eicosamid, eicosamid, eicosamid, , Levofloxacin; Quinolones such as the piperidic acid; Sulfonamide, trimethoprim, sulfadiazine, sulfolane; Glycopeptide antibiotics such as vancomycin, teicoplanin; Polypeptide antibiotics such as polymyxins, e.g., cholestin, polymyxin-B, nitroimidazole derivatives such as metronidazole, thinidazole; Aminoquinolones such as chloroquine, mefloquine, hydroxychloroquine; An acetal such as propanal; Quinine alkaloids and diaminopyrimidines, such as pyrimethamine; Ampenicol, such as chloramphenicol; At least one compound selected from the group consisting of rifabutin, succinate, fosdic acid, phosphomycin, nifuratel, telithromycin, fusafungin, phosphomycin, pentamidine diisethionate, rifampicin, taurolidine, atobakuon, linzolide; Antiviral agents such as acyclovir, river ciclovir, palmcyclovir, foscanet, inosine (dimeprenol-4-acetamidobenzoate), gingivalclovir, valacyclovir, Reviews Dean; Retroviral inhibitory active ingredients (nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors and derivatives), such as lamivudine, zalcitabine, didanosine, mapbuddin, tenofovir, stabudin, avacavir; Non-nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors such as amprenavir, indinavir, saquinavir, lopinavir, ritonavir, nelfinavir; Amantadine, ribavirin, zanamivir, oseltamivir, and lamivudine, and combinations and mixtures of any desired combinations thereof.

또한 본 발명의 상기 세포배양 구조체는, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성될 수 있다.
In addition, the cell culture construct of the present invention may be a cell culture construct such as polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane Cellulose, and silicone rubber.

상기 본 발명의 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체에서 상기 위층의 세포배양층에 있는 하이브리드 나노섬유 세포지지체에서 세포가 이동되는 정도는 주사전자현미경이나 공초점 현미경으로 관찰할 수 있으며 특히 공초범현미경의 z-stack 방법을 사용함으로써 침윤의 정도를 수치로 비교분석할 수 있다.The degree of cell migration in the hybrid nanofiber cell scaffold in the upper layer cell culture layer in the multi-stage cell culture construct of the three-dimensional structure of the present invention can be observed with a scanning electron microscope or a confocal microscope, By using the z-stack method, the degree of infiltration can be numerically compared and analyzed.

따라서, 본 발명의 제2 측면에 따르면, Therefore, according to the second aspect of the present invention,

기판; 및 Board; And

상기 기판 상에 상기 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 적층하여 형성된 세포배양분석층;을 포함하고, And a cell culture analysis layer formed by laminating the multi-stage cell culture structure having the three-dimensional structure on the substrate,

상기 세포배양 구조체의 세포배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포가 주입되어 부착·배양하되, 배양된 세포의 세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 침윤 또는 이동을 측정· 분석하는 것을 특징으로 하는, 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩이 제공된다. At least one cell is injected into at least one cell culture layer of the cell culture structure and adhered and cultured, and the infiltration or migration is measured or analyzed into the cell support of the cultured cell or the other culture layer of the cultured cell Wherein the microcrystalline cell culture structure has a three-dimensional structure.

바람직하게는, 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. Preferably, the substrate may be any one selected from the group consisting of silicon, quartz, ceramic, alumina, titania, and glass.

상기 에세이칩은 특히, 세포배양 분석층을 형성하는 3차원 구조의 다단 세포배양구조체에 있어서, 상기 세포배양 구조체의 최하단 세포배양층에 아가로즈 층을 함유 또는 코팅하여 다양한 종류의 케모카인, 사이토카인, 성장인자 등을 포함하는 약물학적 유효물질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 경우, 이러한 약물학적 유효물질의 영향에 따른 세포의 이동을 칩 수준에서 측정하는 것이 가능하게 된다.
The above-mentioned assay chip is a multi-stage cell culture construct having a three-dimensional structure for forming a cell culture assay layer, in which an agarose layer is contained or coated on the lowermost cell culture layer of the cell culture structure to produce various kinds of chemokines, cytokines, Growth factors, or the like, or a mixture thereof, it becomes possible to measure the movement of cells depending on the influence of such pharmacologically active substances at the chip level.

또한 본 발명의 제3 측면에 따르면,According to a third aspect of the present invention,

세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 분석방법으로서, An assay method using an assay chip including a cell culture construct,

상기 세포배양 구조체의 세포배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하여 배양하는 제1 단계; 및A first step of injecting at least one cell or a culture solution of the cell into at least one cell culture layer of the cell culture structure and culturing the same; And

세포주입된 배양층 또는 다른 배양층의 세포지지체 내로 상기 배양된 세포의 침윤 또는 이동, 세포의 형태, 세포의 활성, 세포간 연결 또는 세포간 작용을 측정· 분석하는 제2 단계를 포함하고, And a second step of measuring and analyzing the infiltration or migration of the cultured cells, the morphology of the cells, the activity of the cells, the intercellular connection or the intercellular action of the cultured cells into the cell support of the cultured cell layer or other cultured layer,

상기 에세이칩은 상술한 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체인 것을 특징으로 한다. The assay chip is characterized by being a multi-stage cell culture structure having the above-described three-dimensional structure.

상기 본 발명의 세포분석방법에 의하면 상기 제1 단계는, 상기 세포배양 구조체의 세포배양층의 적어도 하나 이상에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하여 배양하는 단계로, 이 단계에서 배양된 세포는 하이브리드 나노섬유 지지체 내에 침윤 또는 이동이 이루어지게 된다. According to the cell analysis method of the present invention, in the first step, at least one cell or a culture medium of the cell is injected into at least one cell culture layer of the cell culture structure and cultured, The cells become infiltrated or migrated into the hybrid nanofiber support.

특히, 상기 에세이칩을 이용한 분석방법에 있어서, 상기 에세이칩에 포함된 3차원 구조의 다단 세포배양구조체 중, 최하단의 세포배양층에 아가로즈 층을 함유 또는 코팅하여 다양한 종류의 케모카인, 사이토카인, 성장인자 등을 포함하는 약물학적 유효물질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 경우, 이러한 약물학적 유효물질의 영향에 따른 세포의 침윤 또는 이동, 세포의 형태, 세포의 활성, 세포간 연결 또는 세포간 작용을 측정 및 분석할 수 있게 된다. Particularly, in the assay method using the assay chip, an agarose layer is contained or coated on the lowermost cell culture layer among three-dimensional cell structure of three-dimensional structure included in the assay chip to produce various kinds of chemokines, cytokines, Growth factors, and the like, or a mixture thereof, it is possible to prevent the infiltration or migration of cells depending on the influence of such pharmacologically active substances, the morphology of the cells, the activity of the cells, the intercellular connection or the intercellular action Measurement and analysis.

또한 상기 배양시 바람직하게는 상기 하이브리드 나노섬유 지지체 내에 형광염색제를 더 주입함으로써 배양된 세포의 침윤 또는 이동, 세포의 형태, 세포의 활성, 세포간 연결 또는 세포간 작용을 측정· 분석을 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들어, 수지상세포와 같은 활성화된 면역세포는 MHC-II의 항체를 사용하여 면역형광 염색을 할 때 더욱 상세히 관찰할 수 있다.Further, at the time of culturing, preferably, fluorescent stain agent is further injected into the hybrid nanofiber support to easily measure or analyze the infiltration or migration of the cultured cells, the morphology of the cells, the activity of the cells, the intercellular connection or the intercellular action can do. For example, activated immune cells such as dendritic cells can be observed in more detail when immunofluorescence staining using antibodies to MHC-II.

또한 바람직하게는 상기 제1 단계는, 상기 세포배양 구조체의 각 세포배양층에 각기 다른 종류의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하여 배양할 수 있다. 이 경우, 보다 바람직하게는 각기 다른 종류의 세포에 대하여 다른 형광을 나타내는 형광염색제를 더 주입하여 각각의 세포에 대한 세포분석을 수행할 수 있게 된다. Also, preferably, the first step may be performed by injecting different types of cells or a culture solution of the cells into each cell culture layer of the cell culture structure. In this case, more preferably, different types of cells are further injected with fluorescent dyes exhibiting different fluorescence, so that cell analysis for each cell can be performed.

이 때, 바람직하게는 상기 각기 다른 종류의 세포는 적어도 1종의 질환세포 또는 질환이 유도된 세포와 적어도 1종의 면역세포인 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 본 발명에 있어서 세포분석은 질환 세포에 대한 면역세포의 반응, 이동, 세포간 상호작용 및 탐식 정도를 분석하고, 면역세포의 이동 및 활성화를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있게 된다. 즉, 형광염색 등을 이용하여 면역세포의 이동수를 실시간으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 질환 세포에 형광을 붙인 항체 등을 이용하여 질환 세포와의 상호작용을 직접 측정할 수 있게 되는 3차원 면역조직을 모사할 수 있게 된다. Preferably, the different types of cells are at least one disease cell or disease-induced cell and at least one immune cell. That is, in the present invention, the cell analysis can analyze immune cell reaction, migration, intercellular interaction and phagocytosis with respect to diseased cells, and measure and analyze the migration and activation of immune cells in real time. In other words, it is possible to measure the number of immune cell movements in real time using fluorescence staining or the like, as well as to measure the interaction of diseased cells with a fluorescent antibody to the diseased cells, Can be simulated.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포는 호중구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 면역세포는 인간 또는 마우스 유래일 수 있으며 보다 바람직하게는 인간 혈액으로부터 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 면역세포 배양용 배지에서 면역세포로 분화시켜 수득할 수 있다. 구체적인 예로서 본 발명의 일실시예에서 수지상세포를 사용하였고, 상기 수지상세포는 인간 혈액으로부터 수지상세포를 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 수지상세포 배양용 배지에서 GM-CSF 및 IL-4 등의 사이토카인을 처리하여 수지상세포로 분화시켜 얻을 수 있다. 수지상세포 중 성숙형 수지상세포는 LPS를 처리하여 얻으며, 수지상세포의 성숙화는 표면 항원인 CD86이나 MHC-II의 발현 양을 통하여 확인할 수 있다.Preferably, the immunocyte of the present invention is at least one selected from the group consisting of neutrophils, monocytes, macrophages, dendritic cells, NK cells, T cells and B cells. The immune cells may be derived from human or mouse, and more preferably, they may be isolated from human blood or obtained by differentiating bone marrow cells isolated from mouse bone marrow into immune cells in an immune cell culture medium. As a specific example, dendritic cells were used in the example of the present invention, and the dendritic cells were prepared by separating dendritic cells from human blood or separating bone marrow cells isolated from mouse bone marrow from GM-CSF and IL-4 Lt; RTI ID = 0.0 > dendritic < / RTI > cells. Mature dendritic cells in dendritic cells are obtained by treatment with LPS, and maturation of dendritic cells can be confirmed by expression of CD86 or MHC-II surface antigens.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 질환세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. Also preferably, the disease cell according to the present invention is characterized in that the disease-induced cell is included.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 질환은 암인 것을 특징으로 하는 바, 암세포는 간암세포, 대장암세포, 위암세포, 폐암세포, 자궁암세포, 유방암세포, 갑상선암세포 및 췌장암세포 등에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장암세포 및 림프종세포를 이용하였다. Preferably, the disease is cancer. The cancer cell may be at least one selected from liver cancer cells, colon cancer cells, stomach cancer cells, lung cancer cells, uterine cancer cells, breast cancer cells, thyroid cancer cells and pancreatic cancer cells. have. In one embodiment of the present invention, colon cancer cells and lymphoma cells were used.

또한 바람직하게는 상기 배양시, 상기 면역세포의 활성화제 또는 질환세포의 치료제를 상기 지지체 내로 더 주입하여 배양할 수 있다.In addition, preferably, during the culturing, the immune cell activator or the therapeutic agent for the diseased cell may be further injected into the support and cultured.

또한 바람직하게는 상기 질환 세포는 암세포이고, 상기 질환의 치료제는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. Preferably, the disease cell is a cancer cell, and the therapeutic agent for the disease is doxorubicin, etoposide, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin, May be at least one selected from the group consisting of teniposide, amsacrine, epirubicin, merbarone and piroxantrone hydrochloride.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포의 배양액또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포의 배양액은, 상기 면역세포와 반응하여 면역세포의 이동을 촉진하는 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 활성성분으로서 케모카인을 더 포함하도록 함으로써 수지상세포가 활성형으로 전환되어 케모카인에 반응하여 이동을 촉진하도록 하였다.
Preferably, the culture medium for the immune cells according to the present invention is also preferably the culture medium for the immune cells according to the present invention further comprises an active ingredient which accelerates the migration of immune cells by reacting with the immune cells . In one embodiment of the present invention, the dendritic cells are converted to an active form by further including a chemokine as an active ingredient so as to promote migration in response to the chemokine.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. Is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.

<실시예> <Examples>

실시예 1: 전기방사법에 의한 나노섬유의 제작Example 1: Fabrication of nanofibers by electrospinning

본 실시예에서는 전기방사법을 이용하여 전기방사기의 조건을 조절함으로써 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유를 제작하였다. 이를 위해, 나노미터와 마이크로미터 직경의 고분자 섬유가 적절한 비율로 조절되어 있으며 고분자 섬유간 공간이 확보되도록, 기존의 전기방사장치에서 다음과 같은 차이점을 가지도록 하여 제작하였다. In this embodiment, hybrid fibers of nanofiber-microfibers were fabricated by controlling the condition of the electrospinning apparatus by electrospinning. For this purpose, the polymer fibers of nanometer and micrometer diameter are adjusted at an appropriate ratio, and the space between the polymer fibers is secured by making the following differences in the conventional electrospinning apparatus.

즉, 본 실시예에서는 피치크기를 0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 사용하였다. 또한 이 위해 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하였다. 대면적의 고분자 섬유 매트의 제작 및 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 하기 위해 집적판은 지그제그 경로(raster scanning)를 따라 움직였으며, 이때 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 하였다. That is, in this embodiment, a metal mesh plate having a square grid shape with a pitch size of 0.5 to 1 mm is used. For this purpose, a 0.5 ~ 1 mm thick glass plate was coated and the intensity of the electric field was simultaneously controlled, so that the polymer fibers were concentrated around the metal wires constituting the mesh, and the generation rate of the polymer fibers of the micrometer diameter was also increased. In order to make large-scale polymer fiber mats and to assemble them to a relatively uniform thickness, the integrated plate was moved along the raster scanning, and the size of the path was adjusted to the size of the mat to be manufactured .

본 실시예에 따른 나노미터-마이크로미터 하이브리드 나노섬유의 제작 및 특성은 도 3에 도시하였다.
The fabrication and characteristics of the nanometer-micrometer hybrid nanofiber according to this embodiment are shown in FIG.

실시예 2: 하이브리드 나노섬유 세포지지체 기반 다단 세포배양 구조체 제작Example 2: Fabrication of hybrid nanofiber cell support-based multi-cell culture construct

본 실시예에서는 나노섬유 지지체에 여러 종류의 세포를 부착 및 배양한 후, 3차원 공간을 가지는 나노섬유 지지체를 통해서 다른 분획으로 세포가 이동되는 것을 관찰하기 위한 모형을 제작하고 세포분석을 실시하였다. In this example, various kinds of cells were attached to and cultured on a nanofiber support, and a model for observing the migration of cells to other fractions through a nanofiber support having a three-dimensional space was prepared and a cell analysis was performed.

본 실시예에 따른 에세이칩의 제조공정을 도 1a에 모식화하여 나타내었다. A process for producing an assay chip according to this embodiment is illustrated in FIG. 1A.

먼저 폴리스티렌 세포배양 접시에 PDMS로 코팅하고 PDMS에 하이브리드 나노섬유 지지체를 부착하여 아래층 세포배양 지지체를 만든다. 구멍이 있는 폴리스티렌 세포배양 접시에 PDMS로 코팅하고 PDMS에 하이브리드 나노섬유 지지체를 부착하여 위층 세포배양 지지체를 만든다. 각각의 층에 세포를 부착시키고 24시간 정도 배양한 후 위층의 지지체를 붙인 배양 접시를 아래층의 지지체를 부착시킨 배양접시에 중첩을 한 후 세포배양액을 첨가하고 일정시간 배양하였다. 배양상태의 에세이칩의 종단면을 도 1b, c에 나타내었고, 도 2에 본 실시예에 따른 에세이칩의 실제모형을 나타내었다.
First, PDMS is coated on a polystyrene cell culture dish, and a hybrid nanofiber support is attached to PDMS to form a cell culture support on the lower layer. A porous polystyrene cell culture dish with holes is coated with PDMS and a hybrid nanofilm support is attached to PDMS to form a supernatant cell culture support. Cells were adhered to each layer and cultured for about 24 hours. Then, a culture dish with a supporter on the upper layer was superimposed on a culture dish with a supporter on the lower layer, and then a cell culture solution was added and cultured for a certain period of time. The longitudinal section of the assay chip in the cultured state is shown in Figs. 1B and 2C, and an actual model of the assay chip according to the present embodiment is shown in Fig.

실시예 3: 다단 세포배양 구조체에서 마우스 복강 호중구 이동 정도에 대한 공초점 현미경 측정Example 3 Confocal Microscopy of Peritoneal Mobility of Mouse Peritoneum in Multistage Cell Culture Structures

염증세포인 호중구는 염증반응이 일어날 경우 가장 먼저 동원되는 백혈구이다. 본 실시예에서는 이러한 호중구가 하이브리드 나노섬유 세포지지체 공간에서 이동하는가를 측정하였는 바, 호중구는 5-6주령의 마우스 복강에 5% thioglycollate를 주입하고 5시간 후 복강액을 뽑은 후 복강액 내 존재하는 호중구를 Gr-1 항체를 사용하여 분리한 후 사용하였다. Neutrophils, which are inflammatory cells, are the earliest mobilized leukocytes when an inflammatory reaction occurs. In this example, 5% thioglycollate was injected into the mouse abdominal cavity at 5-6 weeks of age and the abdominal cavity was withdrawn after 5 hours, Neutrophils were isolated using Gr-1 antibody and used.

또한 호중구는 케모카인 IL-8에 의해 잘 이동한다고 보고가 되어있는 바, 호중구의 이동을 위하여 호중구에 대한 화학주성인자(chemoattractant)인 IL-8을 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 적시거나 콜라겐에 섞거나 1% 아가로스에 녹인 후 나노섬유 지지체에 부어서 굳인 후 사용하였다. CFSE 녹색형광으로 염색한 호중구가 아래층의 나노섬유 지지체로 이동한 것을 형광현미경으로 관찰하고 그 수를 측정하였다.In addition, it has been reported that neutrophils are well migrated by chemokine IL-8. IL-8, a chemoattractant for neutrophils, is submerged in the hybrid nanofiber cell support of the lower layer or mixed with collagen Or dissolved in 1% agarose, and then poured into a nanofiber support to be hardened. The number of neutrophils stained with CFSE green fluorescence was observed with a fluorescent microscope and the number of neutrophils was measured.

도 4를 참고하면 녹색형광으로 염색한 마우스 복강 호중구가 케모카인인 interleukin-8 (IL-8)이 있는 쪽으로 이동하는 것을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 4, it can be seen that mouse peritoneal neutrophils stained with green fluorescence migrate toward chemokine interleukin-8 (IL-8).

또한, 도 5는 다양한 조건에서 케모카인인 IL-8의 반응에 의하여 아래층의 나노섬유 지지체로 이동을 한 호중구의 수를 나타낸 것으로, 케모카인을 묻힌 나노섬유 지지체에서는 많은 양의 호중구가 이동을 했고, 콜라겐에 포함시킨 경우에는 호중구가 거의 이동하지 않았고, 아가로스에 포함시킨 경우에는 약간 이동했음을 확인할 수 있었다.
FIG. 5 also shows the number of neutrophils migrated to the lower nanofiber support by the reaction of chemokine IL-8 under various conditions. In the nanofiber support loaded with chemokine, a large amount of neutrophils migrated, collagen , Neutrophils were hardly migrated, and when they were included in agarose, it was confirmed that they were slightly migrated.

실시예 4: 다단 세포배양 구조체에서 활성화된 수지상세포의 이동 정도에 대한 공초점 현미경 측정Example 4: Confocal microscopy of the degree of migration of dendritic cells activated in a multi-cell culture construct

수지상세포는 말초조직에서 항원을 외부 항원이나 자가항원 등을 획득한 후 활성형으로 전환되면 세포막에 케모카인 수용체의 발현이 증가되고 케모카인에 반응하여 림프조직 등으로 이동을 한다. 이에 본 실시예에서는 수지상세포가 케모카인에 반응하여 3차원 나노섬유 지지체를 통하여 이동하는 가를 측정하였다. In dendritic cells, when the antigen is converted into an active form after acquiring an external antigen or an autoantigen, the expression of the chemokine receptor is increased in the cell membrane, and it migrates to the lymphoid tissue in response to the chemokine. Thus, in this Example, it was determined whether dendritic cells migrate through the three-dimensional nanofibrous scaffold in response to chemokine.

5~6 주령의 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수세포를 분리하였다. 분리된 골수세포(1×106cells/ml)는 10% 소 태아 혈청과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 10%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기로 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. Bone marrow cells were isolated from the thighs and calves of mice 5 to 6 weeks of age. The separated bone marrow cells (1 × 10 6 cells / ml ) with 10% fetal bovine serum and 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml 37 ℃ that streptomycin is of 10% in RPMI-1640 medium containing CO 2 is fed (GM-CSF) and 15 ng / ml of interleukin-4 (IL-4) were co-cultured for 7 days to induce differentiation into dendritic cells.

분화된 수지상세포는 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c 및 MHC-class Ⅱ를 이용하여 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분리하였다.Differentiated dendritic cells were separated using CD11c and MHC-class II, which are specific protein surface factors, and CD11c microbeads, respectively.

분화된 수지상세포(1×105cells/100μl)에 lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml)을 처리하여 수지상세포의 성숙화를 유도하였다. 성숙화의 유도 확인은 수지상세포의 단백질 표면인자인 CD86가 세포 면에 발현되는 정도를 항체를 이용하여 확인하였다. Dendritic cells (1 × 10 5 cells / 100 μl) were treated with lipopolysaccharide (LPS, 100 ng / ml) to induce maturation of dendritic cells. The expression of CD86, a surface protein of dendritic cells, on the cell surface was confirmed using an antibody.

활성형 수지상세포의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL21( 200 ng/ml)을 아래층의 나노섬유 지지체에 적시고 12시간 방치하여 말린 후 위층에는 LPS로 처리하여 활성화된 GM-DC를 1×104개로 부착시켰다.Known to increase the migration of activated dendritic cell chemokine CCL21 (200 ng / ml) for damping the nanofiber support the lower layer after dried is allowed to stand 12 hours upstairs the activated GM-DC treated with LPS 1 × 10 4 pieces Respectively.

PKH67 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 아래층의 나노섬유 지지체로 이동한 것을 형광현미경으로 관찰하고 그 수를 측정하였다.Fluorescent microscopic observation of the migration of dendritic cells stained with PKH67 green fluorescence to the nanofiber scaffolds in the lower layer was performed and the number was measured.

도 6을 참고하면, 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에서 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포 지지체로, 활성형 수지상세포가 케모카인인 CCL21에 반응하여 이동한 것을 확인할 수 있고, 도 7에 이동한 수를 측정한 결과를 그래프로 나타내었는바, 시간이 경과함에 따라 수지상 세포가 점점 이동한 것을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 6, it can be confirmed that the active dendritic cells migrate from the hybrid nanofiber cell support of the upper layer to the hybrid nanofiber cell support of the lower layer in response to the chemokine CCL21. As a result, the dendritic cells gradually migrate with the lapse of time.

도 8은 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있는 케모카인 CCL21의 분획으로 이동하는 수지상세포의 모양을 분석한 z-stack 결과로, 수지상세포의 액틴이 아래쪽으로 향하는 세포 염색을 보임으로써 세포가 3차원 공간을 통하여 아래쪽으로 이동함을 확인할 수 있다.
Figure 8 shows z-stack results of analysis of the dendritic cell morphology of chemokine CCL21 in the hybrid nanofiber cell support of the lower layer. Actin in dendritic cells showed downward cell staining, It can be seen that it moves downward.

실시예Example 5: 다단 세포배양 구조체에서 두 종류의 세포 배양 및 이동 측정  5: Two types of cell culture and migration measurement in a multi-cell culture construct

본 실시예에서는 나노섬유에 암세포 및 면역세포를 부착 및 배양한 후, 암세포 구획으로 면역세포가 이동하는 것을 관찰하였다. 구체적으로, 상기에서 제작된 샌드위치형 배양챔버에 각기 다른 파장을 갖는 PKH67과 PKH26으로 형광 염색한 면역세포(수지상세포)와 암세포를 나노섬유에 부착하고, 상기 암세포에만 항암제인 mitoxanthrone(MXT)를 처리하였다. In this example, after attaching and culturing cancer cells and immune cells to the nanofibers, migration of immune cells into the cancer cell compartment was observed. Specifically, immune cells (dendritic cells) and cancer cells fluorescently stained with PKH67 and PKH26 having different wavelengths were attached to the nanofibers, and mitoxanthrone (MXT), which is an anticancer agent, was treated only on the cancer cells. Respectively.

도 9는 상기 PKH67으로 녹색형광으로 형광염색한 수지상세포를 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 부착 배양하고 PKH26으로 적색형광으로 염색한 대장암 세포를 1시간 동안 약물처리하고 약물을 세척한 후 다시 18시간 배양 후 나노섬유에 부착한 후 배양하여 두 층을 다단으로 조립하였다. 조립 후 24시간이나 48시간 후 아래층의 암세포 구획으로 이동한 수지상세포의 수를 측정할 수 있었다. 도 9를 참고하면, 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있는 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있는 적색형광으로 염색한 후 항암제인 mitoxanthrone (MXT)를 처리한 마우스 대장암세포(CT26) 쪽으로 이동하는 것을 확인할 수 있다.FIG. 9 shows that dendritic cells stained with green fluorescence with PKH67 were adhered and incubated on the supernatant hybrid nanofiber cell supernatant, colon cancer cells stained with PKH26 were stained with 1 hour of drug treatment, washed with 18 After incubation for a time, they were attached to nanofibers and cultured, and the two layers were assembled in multiple stages. The number of dendritic cells migrated to the cancer cell compartment in the lower layer 24 hours or 48 hours after assembly could be measured. 9, dendritic cells stained with green fluorescence in the hybrid nanofiber cell supernatant of the upper layer were stained with red fluorescence on the hybrid nanofiber cell support of the lower layer, and then treated with mitoxanthrone (MXT), an anticancer agent, (CT26). &Lt; / RTI &gt;

또한 도 10을 참고하면, 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있던 수지상세포가 아래층의 대장암암세포 분획으로 이동하여 이들 세포들이 섞여 있는 것을 확인할 수 있다. Also, referring to FIG. 10, it can be confirmed that the dendritic cells in the supernatant hybrid nanofiber cell supporter migrate to the colon cancer cell fraction of the lower layer, and these cells are mixed.

또한 항암제를 처리한 대장암세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도 11을 참고하면, 수지상세포가 이동하는 정도는 위층과 아래층의 형광염색으로 나타나는 세포의 수로 비교분석할 수 있다. 11, which is a graph showing the results of measurement of the number of cells in which dendritic cells have migrated into colon cancer cells treated with an anticancer agent, the degree of migration of dendritic cells is comparatively analyzed by the number of cells showing fluorescence staining in the upper and lower layers .

도 12 및 13은 림프종세포를 항암제로 처리하였을 때도 샌드위치형 나노섬유 지지체를 통하여 수지상세포가 이동하는 것을 측정 가능하다는 것을 보여주고 있는 것으로, 도 12을 참고하면, 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있는 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있는 적색형광으로 염색한 후 항암제인 MXT를 처리한 마우스 림프종세포(A20) 쪽으로 이동하는 것을 확인할 수 있다. FIGS. 12 and 13 show that dendritic cells can be measured through the sandwich-type nanofiber support even when the lymphoma cells are treated with an anticancer agent. Referring to FIG. 12, Green fluorescence-stained dendritic cells were stained with red fluorescence in the hybrid nanofiber cell support of the lower layer and then migrated to the lymphoma cell line (A20) treated with the anticancer agent MXT.

또한 도 13은 항암제를 처리한 림프종세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 데이터로서 아래층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에서 측정된 세포수가 항암제 처리에 의하여 증가하는 것을 확인할 수 있다.
FIG. 13 is a graph showing the number of cells in which dendritic cells migrated into lymphoma cells treated with anticancer drugs, and it can be seen that the number of cells measured in the hybrid nanofiber cell support of the lower layer is increased by treatment with anticancer agents.

실시예 6: 다단 세포배양 구조체에서 이동한 세포의 활성 및 세포간 연결에 대한 공초점 현미경 측정Example 6 Confocal Microscopy for the Activity and Intercellular Connectivity of Cells Moved from Multistage Cell Culture Structure

본 실시예에서는, 나노섬유 지지체를 통과하여 암세포 분획으로 이동한 면역세포와 암세포 에 대한 세포특이 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색을 함으로써 종양조직으로 이동한 면역세포와 암세포간의 연결 및 상호작용을 측정하는 것이 가능한가를 시험하였다. 면역세포가 이동한 아래쪽 나노섬유지지체를 분리하여 수지상세포의 활성정도는 PE 형광이 결합된 MHC-II에 대한 항체를 사용하였으며 항암제를 처리한 대장암세포는 FITC 형광이 결합된 calreticulin (CRT)에 대한 항체를 사용하여 염색을 하였다. In this example, the immunological cells that have passed through the nanofiber support and migrated to the cancer cell fraction and the antibody against the cell specific protein against the cancer cells are stained to measure the connection and interaction between the immune cells that have migrated to the tumor tissue and the cancer cells To be tested. The degree of dendritic cell activity was determined by using an antibody against MHC-II conjugated with PE fluorescence, and the colorectal cancer cells treated with anticancer drug were treated with calreticulin (CRT) conjugated with FITC fluorescence Antibodies were used to stain.

그 결과 도 14를 참고하면, 위층의 하이브리드 나노섬유 세포지지체에 있던 수지상세포가 아래층의 림프종세포 분획으로 이동한 후 수지상세포가 림프종세포를 탐식하여 두 가지 형광이 겹쳐서 나오는 것을 확인할 수 있었는바, 암세포와 면역세포가 하이브리드 나노섬유 세포지지체에서 다양한 형태로 존재하며 특히 면역세포가 대장암세포 쪽으로 이동하거나 세포들간의 접촉 혹은 탐식하는 세포들도 확인이 되었다.As a result, referring to FIG. 14, it was confirmed that the dendritic cells in the upper layer of the hybrid nanofiber cell support migrate to the lymphoma cell fraction in the lower layer, and then the dendritic cells digest lymphoma cells, And immune cells are present in various forms in hybrid nanofiber cell scaffolds. Especially, immune cells migrate to colon cancer cells, or cells that contact or digest between cells are also identified.

또한 도 15를 참고하면, PKH26으로 염색한 후 항암제를 처리한 A20 림프종세포가 이동한 수지상세포에 의하여 탐식되는 것도 측정이 되었다. Also, referring to FIG. 15, it was also measured that the A20 lymphoma cells treated with the anti-cancer agent after staining with PKH26 were digested by the migrated dendritic cells.


Claims (17)

제1 배양 구조체의 상부에 제2 배양 구조체가 적층되어 형성되는 2단 세포배양 구조체를 포함하되,
상기 제1 배양 구조체는, 기판과, 기판 상에 형성된 폴리머층 및 상기 폴리머층 상에 형성된 3차원 구조의 균일한 두께를 갖는 매트형상의 세포배양용 고분자 섬유지지체로 형성되는 지지체층으로 이루어지고,
상기 제2 배양 구조체는, 구멍이 형성된 기판과, 기판 상에 형성된 폴리머층 및 상기 폴리머층 상에 형성된 3차원 구조의 균일한 두께를 갖는 매트형상의 세포배양용 고분자 섬유지지체로 형성되는 지지체층으로 이루어지며,
상기 각 지지체층을 구성하는 고분자섬유 지지체는 100~999 nm의 직경을 가지는 고분자섬유 55~85 중량%와 1~1.5 ㎛의 직경을 가지는 고분자섬유 15~45 중량%로 이루어지는 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체이고,
상기 지지체층에 적어도 1종 이상의 세포를 배양하여 세포의 침윤 또는 이동을 측정· 분석하는 것을 특징으로 하는,
나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.A two-stage cell culture construct comprising a first culture structure and a second culture structure stacked on top of the first culture structure,
Wherein the first culture structure comprises a substrate, a polymer layer formed on the polymer layer, and a support layer formed of a polymeric fibrous support for cell culture having a uniform thickness of a three-dimensional structure formed on the polymer layer,
The second culturing structure comprises a porous substrate, a polymer layer formed on the substrate, and a support layer formed of a polymeric fibrous support for cell culture having a uniform thickness of a three-dimensional structure formed on the polymer layer Lt; / RTI &gt;
The polymeric fiber scaffold constituting each of the support layers is composed of 55 to 85% by weight of polymer fibers having a diameter of 100 to 999 nm and 15 to 45% by weight of polymer fibers having a diameter of 1 to 1.5 탆. The nano-microhybrid polymer fibers / RTI &gt;
Characterized in that at least one or more kinds of cells are cultured in the support layer to measure or analyze the infiltration or migration of the cells,
Nano - microhybrid hybrid polymeric fiber scaffold based assay chip for cell analysis. 제 1 항에 있어서,
상기 고분자섬유 지지체는, 집적판으로서 그리드 형상 금속메쉬판을 포함하는 전기방사장치를 이용하여 고분자용액을 전기방사함으로써 메쉬를 구성하는 금속선의 주변으로 고분자섬유를 집적시켜, 3차원 구조의 균일한 두께를 갖는 매트 형상으로 형성된 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.The method according to claim 1,
The polymer fiber scaffold can be produced by electrospinning a polymer solution using an electrospinning device including a grid-like metal mesh plate as an integrated plate to integrate the polymer fibers around the metal wires constituting the mesh, Wherein the nano-microhybrid polymer scaffold is formed in a mat shape having a plurality of microcapsules. 제 1 항에 있어서,
상기 지지체층의 두께는 70~100 ㎛의 균일한 두께를 갖는 3차원 구조의 매트 형상인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.The method according to claim 1,
Characterized in that the thickness of the support layer is a mat shape of a three-dimensional structure having a uniform thickness of 70 to 100 占 퐉. 제 1 항에 있어서,
상기 고분자섬유 지지체는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩. The method according to claim 1,
The polymeric fibrous scaffold may be selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate) (PHBV), polydioxanone (PDO), poly Poly (ethylene-co-propylene), poly [(L-lactide) -co- (caprolactone)], poly (ester urethane) (PEUU) At least one biocompatible polymer selected from the group consisting of polyvinyl alcohol (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline (PAN) , A copolymer thereof, or a mixture thereof. The nano-microhybrid polymer fiber support-based cell analysis Essay chip. 제 1 항에 있어서,
상기 폴리머층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.The method according to claim 1,
The polymer layer may be formed of a material selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethylmethacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose and silicone rubber Wherein the nano-microhybrid polymer scaffold is formed from at least one selected from the group consisting of: 제 1 항에 있어서,
상기 제1 배양 구조체의 지지체층에는 약물학적 유효물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.The method according to claim 1,
Wherein the support layer of the first cultured structure further comprises a pharmacologically active substance. 2. The nano-microhybrid polymer scaffold according to claim 1, 제 1 항에 있어서,
상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.The method according to claim 1,
Wherein the substrate is any one selected from the group consisting of silicon, quartz, ceramic, alumina, titania and glass. The nano-micro hybrid polymeric fiber support based cell analysis Essay chip for. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법으로서,
상기 제2 배양 구조체의 지지체층에 적어도 1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하고 배양함으로써, 상기 제2 배양 구조체의 지지체층 또는 상기 제1 배양 구조체의 지지체을 형성하는 고분자섬유 지지체 내에 상기 세포를 부착·배양하는 제1 단계; 및
상기 제1 단계에서 배양된 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 측정·분석하는 제2 단계;를 포함하고,
상기 분석은 세포의 손상, 사멸, 증식, 활성 또는 세포간 상호작용을 분석하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법. An assay method using an assay chip for analyzing a nano-microhybrid polymer fiber support-based cell according to any one of claims 1 to 7,
At least one cell or a culture medium of the cell is injected into the support layer of the second culture structure and cultured to grow the cells in the support layer of the second culture structure or in the polymer fiber support forming the support of the first culture structure A first step of attaching and culturing; And
And a second step of measuring and analyzing the infiltration and attachment of cells cultured in the first step, the morphology of the cells, the intercellular junction or the intercellular movement,
Wherein said assay is for analyzing cell damage, death, proliferation, activity, or intercellular interactions. 제 8 항에 있어서,
상기 제1 단계는, 상기 제1 배양 구조체의 지지체층에 상기 제2 배양구조체의 지지체층에 주입된 세포와 다른 종류의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 주입하고 배양함으로써, 상기 제1 배양 구조체의 지지체층을 형성하는 고분자섬유 지지체 내에 상기 세포를 부착·배양하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법. 9. The method of claim 8,
The first step may include injecting and culturing a different type of cells or a culture medium of the cells injected into the support layer of the second culture structure into the support layer of the first culture structure and culturing the support, Wherein the method further comprises attaching and culturing the cells in a polymer fiber support forming a layer on the surface of the nano-microhybrid polymer scaffold. 제 9 항에 있어서,
상기 제1 단계는,
상기 제1 배양 구조체의 지지체층에 질환세포 또는 질환세포의 배양액을 주입하여 배양하고; 상기 제2 배양 구조체의 지지체층에 면역세포 또는 상기 면역세포의 배양액을 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.10. The method of claim 9,
In the first step,
Injecting a culture solution of diseased cells or diseased cells into the support layer of the first cultured structure and culturing; Wherein the culture medium of the immune cells or the immune cells is injected into the support layer of the second culture structure and cultured. 제 10 항에 있어서,
상기 제1 단계는, 상기 제2 배양 구조체의 지지체층에 면역세포의 활성화제를 더 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.11. The method of claim 10,
Wherein the first step comprises culturing the support layer of the second culture structure by further injecting an activator of an immune cell into the support layer, and culturing the nano-microhybrid polymer scaffold based cell assay kit. 제 10 항에 있어서,
상기 제1 단계는, 상기 제1 배양 구조체의 지지체층에 질환세포의 치료제를 더 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.11. The method of claim 10,
The method according to claim 1, wherein the first step further comprises injecting a therapeutic agent for a disease cell into the support layer of the first cultured structure and culturing the cultured cell. 제 10 항에 있어서,
상기 면역세포는 호중구, 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.11. The method of claim 10,
Wherein the immune cells are at least one selected from the group consisting of neutrophils, macrophages, dendritic cells, NK cells, T cells, and B cells, and an assay using an assay chip for analyzing cells based on nano-microhybrid polymer scaffolds Way. 제 10 항에 있어서,
상기 질환세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.11. The method of claim 10,
Wherein the disease cell comprises a disease-induced cell. The method according to claim 1, wherein the disease cell comprises a cell derived from a nano-microhybrid polymer scaffold. 제 10 항에 있어서,
상기 질환세포는 암세포인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩을 이용한 분석방법.11. The method of claim 10,
Wherein the disease cells are cancer cells. The method according to claim 1, wherein the disease cells are cancer cells. 삭제delete 삭제delete
KR1020140040205A 2014-04-03 2014-04-03 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell KR101458425B1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140040205A KR101458425B1 (en) 2014-04-03 2014-04-03 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell
PCT/KR2015/003179 WO2015152612A1 (en) 2014-04-03 2015-03-31 Three-dimensional multi-layer cell culture structure, assay chip comprising same and cell analyzing method using assay chip

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140040205A KR101458425B1 (en) 2014-04-03 2014-04-03 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101458425B1 true KR101458425B1 (en) 2014-11-07

Family

ID=52287123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140040205A KR101458425B1 (en) 2014-04-03 2014-04-03 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101458425B1 (en)
WO (1) WO2015152612A1 (en)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170089020A (en) * 2014-12-18 2017-08-02 울산과학기술원 Device and method for single cell screening based on inter-cellular communication
WO2018105980A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 한국생산기술연구원 Fiber-filled three-dimensional support and manufacturing method therefor
KR101877892B1 (en) * 2016-07-25 2018-07-12 주식회사 메디팹 Preparing method of cell culturing scaffold with double crosslinking
WO2019013519A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 주식회사 아모라이프사이언스 Multi-layered fabric for cell culture support
KR20190011894A (en) 2017-07-26 2019-02-08 강원대학교산학협력단 3 Dimensional Cell Culture Microchip Containing Nano-porous Membrane And Manufacturing Method Thereof
KR20190035524A (en) * 2017-09-25 2019-04-03 아주대학교산학협력단 Long-term three dimensional culturing system of primary hepatocyte using nanofiber and culturing method
WO2019059702A3 (en) * 2017-09-25 2019-08-08 아주대학교산학협력단 Nanofiber-based long-term primary hepatocyte three-dimensional culture system and culturing method
CN112063510A (en) * 2020-07-29 2020-12-11 北京大学 Structure of high-flux cell culture chip and manufacturing and using method thereof

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202007699RA (en) * 2018-02-12 2020-09-29 Corning Inc Remote monitoring system for cell culture
US11518971B2 (en) 2018-11-27 2022-12-06 Research Triangle Institute Method and apparatus for spatial control of cellular growth
CN111665304A (en) * 2020-06-02 2020-09-15 南京融康博生物科技有限公司 Tumor cell culture information analysis method
CN111718853B (en) * 2020-07-03 2022-08-02 中山大学 Preparation method of 2D and 3D integrated tumor organ culture chip for drug screening
US11713441B2 (en) 2020-12-31 2023-08-01 Academia Sinica Cell culture substrates, methods and uses thereof
EP4100479A4 (en) * 2020-12-31 2023-09-13 Academia Sinica Cell culture systems, methods and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040214313A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Weihua Zhang Cell interaction culture system and uses thereof
KR100621569B1 (en) * 2003-10-28 2006-09-13 이승진 Nano-microfibrous scaffold for enhanced tissue regeneration and method for preparing the same
KR20060127399A (en) * 2003-11-05 2006-12-12 미시간 스테이트 유니버시티 Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
KR20120097948A (en) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 Nano/micro hybrid fiber non-woven fabric using biodegradable polymers and method for preparing the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040214313A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Weihua Zhang Cell interaction culture system and uses thereof
KR100621569B1 (en) * 2003-10-28 2006-09-13 이승진 Nano-microfibrous scaffold for enhanced tissue regeneration and method for preparing the same
KR20060127399A (en) * 2003-11-05 2006-12-12 미시간 스테이트 유니버시티 Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
KR20120097948A (en) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 Nano/micro hybrid fiber non-woven fabric using biodegradable polymers and method for preparing the same

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170089020A (en) * 2014-12-18 2017-08-02 울산과학기술원 Device and method for single cell screening based on inter-cellular communication
KR101961459B1 (en) 2014-12-18 2019-03-22 울산과학기술원 Device and method for single cell screening based on inter-cellular communication
US10385306B2 (en) 2014-12-18 2019-08-20 Unist(Ulsan National Institute Of Science And Technology) Device and method for single cell screening based on inter-cellular communication
KR101877892B1 (en) * 2016-07-25 2018-07-12 주식회사 메디팹 Preparing method of cell culturing scaffold with double crosslinking
WO2018105980A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 한국생산기술연구원 Fiber-filled three-dimensional support and manufacturing method therefor
WO2019013519A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 주식회사 아모라이프사이언스 Multi-layered fabric for cell culture support
KR20190011894A (en) 2017-07-26 2019-02-08 강원대학교산학협력단 3 Dimensional Cell Culture Microchip Containing Nano-porous Membrane And Manufacturing Method Thereof
KR20190035524A (en) * 2017-09-25 2019-04-03 아주대학교산학협력단 Long-term three dimensional culturing system of primary hepatocyte using nanofiber and culturing method
WO2019059702A3 (en) * 2017-09-25 2019-08-08 아주대학교산학협력단 Nanofiber-based long-term primary hepatocyte three-dimensional culture system and culturing method
KR102062465B1 (en) * 2017-09-25 2020-01-03 아주대학교산학협력단 Long-term three dimensional culturing system of primary hepatocyte using nanofiber and culturing method
US11685900B2 (en) 2017-09-25 2023-06-27 NANOFAENTECH CO., Ltd. Nanofiber-based long-term primary hepatocyte three-dimensional culture system and culturing method
CN112063510A (en) * 2020-07-29 2020-12-11 北京大学 Structure of high-flux cell culture chip and manufacturing and using method thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015152612A1 (en) 2015-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101458425B1 (en) 3d multi-layer cell culture structure, assay chip comprising the same, and method for analyzing cell
AU2019203265B2 (en) Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same
US10307514B2 (en) Gradient porous scaffolds
JP6462897B2 (en) Compositions for cell-based three-dimensional printing
KR101453796B1 (en) Nano-micro hybridfiber-based cell culture construct and assay chip comprising the same
CN106039407B (en) Biobrick comprising MSC and use thereof
Tan et al. Layer-by-layer microfluidics for biomimetic three-dimensional structures
Zhang et al. Inverse opal scaffolds for applications in regenerative medicine
EP2756073B1 (en) Engineered tissues for in vitro research uses, arrays thereof, and methods of making the same
Pampaloni et al. Three-dimensional tissue models for drug discovery and toxicology
Lagonegro et al. A cytotoxicity study of silicon oxycarbide nanowires as cell scaffold for biomedical applications
Yeo et al. Cell-printed hierarchical scaffolds consisting of micro-sized polycaprolactone (PCL) and electrospun PCL nanofibers/cell-laden alginate struts for tissue regeneration
Zhou et al. Chitosan microspheres with an extracellular matrix-mimicking nanofibrous structure as cell-carrier building blocks for bottom-up cartilage tissue engineering
EP2422003A1 (en) Interactive microenvironment system
EP2861270A1 (en) Engineered three-dimensional connective tissue constructs and methods of making the same
Liu et al. Control of cell proliferation in E-jet 3D-printed scaffolds for tissue engineering applications: the influence of the cell alignment angle
US10688223B2 (en) Smart release system for growth factor delivery and combined bone and vascular growth
Zeng et al. Layer-by-layer assembly of nanofilms to control cell functions
KR101446687B1 (en) Nanofiber-based nanostructures for cell culture and assay chip comprising the same
KR101744385B1 (en) Hydrogel Micro-pattern on Nanoporous Membrane, Manufacturing Method Thereof and Cell Floating Culture Device Using The Same
KR101477106B1 (en) Culture method and analyses of immature dendritic cells in nano-micro hybrid nanofiber-based
Lee et al. Microfabricated cell culture system for the live cell observation of the multilayered proliferation of undifferentiated HT-29 cells
Heo et al. 3D bioprinting of co-cultured osteogenic spheroids for bone tissue fabrication
Bian et al. Immune micro-environment around biomaterials implanted in soft tissues: emerging analytical techniques and advancements in modulation
Wang et al. Xiaoxue Ren1†, Xiaoting Gao1, 2†, Yicheng Cheng3*, Lingxia Xie1, Liping Tong1, Wei Li1*, Paul K. Chu4 and Huaiyu Wang1

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee