KR101743594B1

KR101743594B1 - 사이클로메탈화 전이금속 착물을 포함하는 항암용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101743594B1
Application number: KR1020160028987A
Authority: KR
Inventors: 권태혁; 이현우; 임미희; 남정승; 강주혜; 강명균; 김현탁
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2017-06-05

Abstract

본 발명은, 사이클로메탈화 전이금속 착물을 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발광성 금속 복합체인 이리듐 또는 로듐계의 사이클로메탈화 전이금속 착물을 이용하여 선택적으로 암세포 내 단백질을 광화학적 가교반응을 유발하여 단백질 변형을 유도하고 암세포의 사멸을 야기할 수 있는, 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

사이클로메탈화 전이금속 착물을 포함하는 항암용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR ANTICANCER CONTAINING CYCLOMETALATED TRANSITION METAL COMPLEX}

소포체 (endoplasmic reticulum, ER)는 세포기관 중 하나로, 단백질 합성, 번역 후 변형 (post-translation modification), 및 프로-아폽토틱 신호 (pro-apoptotic signaling)의 다양한 물질대사 과정을 갖고 있어 큰 관심을 받고 있다. ER에서의 다양한 단백질 합성 과정의 일부 균형이 깨질 경우, 비접힘단백질반응 (unfolded protein response: UPR)과 같은 ER 스트레스 반응이 초래된다. 그러나, 암세포에서의 이러한 ER 스트레스 반응의 과잉발현은, 암세포를 파괴한다. 실제로, 종래 암 치료법은 ER과 미토콘드리아에 대한 집중 전략이 다른 방법들에 비해 효율적인 암 치료법임을 나타내고 있다. 그러므로, 자발적인 ER 셀 이미징과 광역학 치료법의 결합이 효율적인 암세포 치료를 위한 한걸음일 것으로 생각된다: 구체적으로, ER을 실시간으로 시각화하고 일부 광-활성 증감제에 의해 산화 및 응집을 모두 이용하여 ER 스트레스를 유발함에 따라 효율적인 암 치료가 가능할 것으로 예상된다.

ER 가시화를 위한 ER 프로브 및 PDT (photodynamic therapy)를 이끄는 ER 타겟 이미지에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나, 불행하게도, 미토콘드리아, 핵, 리소좀과 같은 다른 세포기관과 비교하여 성공한 ER 타겟 프로브는 많지 않다. 성공한 ER 프로브가 유기 분자들에 기초하여 제시된 바 있지만, 형광성 분자들을 사용했기 때문에, 형광 이미지의 한계는 자동-형광성 (auto-fluorescence), 자기 소광 (self-quenching) 및 낮은 광안정성과 같은 교란을 방지할 수 없었다. 또한, PDT 응용의 대부분이 에오신 Y (Eosin Y) 및 테트라브로모로다민 123 (tetrabromorhodamine 123: TBR)과 같은 몇 가지 시약을 제외하고는 포르피린 (porphyrin) 기반 화학 시약에 제한되어 있기 때문에, 본 발명과 같은 PDT 응용 사례는 거의 없다 [Ethirajan, M., Chen, Y. H., Joshi, P. & Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews 40, 340-362 (2011); Detty, M. R., Gibson, S. L. & Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry 47, 3897-3915 (2004)].

한편, 사이클로메탈화 Ir(III) 복합체는 좋은 활성산소종 생성의 특성에 의해 광역학 치료법으로의 적용에 큰 가능성을 가진다. 이리듐은 강한 스핀 오비탈 커플링을 유도하며, 이는 효율적으로 단일항 산소를 만든다. 상기 단일항 산소는 삼중항-삼중항 에너지 전이에 의해 생성된 유형2의 활성산소종 (ROS)이다. 또한, 유형1의 ROS는 Ir(III) 복합체로부터 초과산화물 라디칼과 같은 산소로의 전자이동을 통해 잘 생성된다. 그러나, ER-타겟 이리듐 프로브 기반의 광역학 치료법은 거의 없다.

Ethirajan, M., Chen, Y. H., Joshi, P. & Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews 40, 340-362 (2011) Detty, M. R., Gibson, S. L. & Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry 47, 3897-3915 (2004)

따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은, 발광성 금속 착물인 이리듐 또는 로듐계의 사이클로메탈화 전이금속 착물을 이용하여 선택적으로 암세포 내 단백질을 광화학적 가교반응을 유발하여 단백질 변형을 유도하고 암세포의 사멸을 야기할 수 있는, 항암용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은, 하기 화학식 1 또는 2로서 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물을 포함하는, 항암용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서,

M은 이리듐 또는 로듐이고,

R¹ 내지 R¹⁶는, 각각 독립적으로, H, F, Cl, Br, I, 히드록시기, 티올기, 알킬티올기, 우레아기, 알킬티올기, 시아노기, 알킬기, 알콕시기, 아릴기, 아릴옥시기, 알릴기, 비닐기, 아실기, 아지도기, 니트로기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 히드록시아미노기, 알킬암모늄, 카르복시기, 카르바모일기, 설파닐기, 설포닐기, 설페이트기, 설포네이트기, 설폰아미드기, 포스페이트기, 포스포네이트기, 및 포스피네이트기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이고,

고리 A 및 고리 B 는, 각각 독립적으로, 치환 또는 비치환된 5 원 방향족 고리, 치환 또는 비치환된 6 원 방향족 고리, 치환 또는 비치환된 5 원 방향족 헤테로고리, 및 치환 또는 비치환된 6 원 방향족 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나임.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 외생 첨가제 및 추가적인 단백질 아미노산 잔기 변형 없이 이리듐 또는 로듐계의 사이클로메탈화 전이금속 착물만을 이용하여 효율적으로 암세포 내 단백질에서 광화학적 가교결합을 유도하고 단백질 변형을 유발하여, 암세포를 사멸시킬 수 있다. 이때, 외생 첨가제에 의한 독성을 피할 수 있어, 본 발명의 항암용 약학 조성물은 최소화된 세포 독성으로 세포막 내로 투과될 수 있고 국소적인 빛을 가하여 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 UV-vis 흡수/방출 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물로 표지된 U2OS 세포의 1-광자/2-광자 이미지 및 셀 컨디션에 따른 수명에 대한 FLIM 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 PDT 능력을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 2-광자 흡수 및 방출 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 2-광자 여기화로부터의 방출 강도를 나타낸다.
도 6은 sk-ov-3 세포에 대해서의 2-광자 PDT에 의한 세포 형태 변화의 실시간 추적 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 MALDI 질량분석 결과를 나타낸다.
도 8a, 도 8b, 및 도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 활성산소종 생성 능력 및 생체 내/외 광-가교 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 세포 내에서의 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 분포위치를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물에 의한 광-가교를 통한 단백질 변형 경로를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 세포 독성을 나타낸다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 화학식들, 반응식들 및 스켐에서의 원자와 원자 사이의 결합선은 공유결합, 이온결합뿐만 아니라, 비공유전자쌍에 의한 결합, 반데르발스힘, 할로겐결합 등의 약한 비공유 결합을 편의상 알기 쉽게 표시한 것으로, 당업자라면 용이하게 이해할 수 있는 정도로 나타낸 것이다. 특히, 화살표로 나타낸 결합선은 한쪽의 원소에 존재하는 2개의 전자를 다른쪽의 원소에 공여하는 방식으로 결합된 배위결합을 의미하는 것이다. 이러한 결과로, 화학식들, 반응식들 및 스켐에 나타낸 각 원소의 결합선수는 원자가전자수에 맞지 않을 수 있지만, 이는 당업자라면 용이하게 이해할 수 있는 것이다. 아울러, 특별히 표시한 것을 제외하고, 탄소 및 수소의 표기는 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 용어 "방향족 고리" 또는 "아릴" 은 적어도 하나의 방향족 탄화수소기를 포함하는 것을 의미하며, 용어 "방향족 헤테로고리" 는 적어도 하나의 방향족 탄화수소기와 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 것을 의미하는 것으로서, 상기 방향족 탄화수소기의 적어도 하나의 탄소 원자가 헤테로 원자에 의해 치환된 것을 나타낸다. 상기 방향족 고리(아릴) 또는 방향족 헤테로 고리가 복수환을 포함하는 경우, 상기 방향족 고리 또는 상기 방향족 헤테로 고리는, 하나의 방향족 고리를 포함하고 부가적인 고리로서 방향족 고리 또는 비방향족 고리를 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 복수환은 적어도 하나의 방향족 고리와 부가적인 고리가 하나의 원자를 통해 결합된 것 또는 둘 이상의 원자를 통해 융합된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원 명세서 전체에서, 용어 "헤테로"는 탄소 및 수소 원자 이외의 원자를 포함하는 것을 의미하며, 예를 들어, 상기 탄소 및 수소 원자 이외의 원자는 Si, Se, N, O, S, P, As, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원 명세서 전체에서, 용어 "알킬기" 또는 "알킬"은 통상적으로, 1 내지 20 개의 탄소 원자, 1 내지 10 개의 탄소 원자, 1 내지 8 개의 탄소 원자, 1 내지 5 개의 탄소 원자, 또는 1 내지 3 개의 탄소 원자를 갖는, 선형 또는 분지형의 알킬기를 나타내며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵실, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 에이코사닐 또는 이들의 가능한 모든 이성질체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 알킬기가 알킬기로 치환되는 경우, 이는 "분지형의 알킬기"로도 상호교환하여 사용된다. 상기 알킬기에 치환될 수 있는 치환기로는, 할로 (예를 들어, F, Cl, Br, I), 할로알킬 (예를 들어, CC1₃또는 CF₃), 알콕시, 알킬티올, 히드록시, 카르복시 (-C(O)-OH), 알킬옥시카르보닐 (-C(O)-O-R), 알킬카르보닐옥시 (-O-C(O)-R), 아미노 (-NH₂), 카르바모일 (-NHC(O)OR- 또는 -O-C(O)NHR-), 우레아 (-NH-C(O)-NHR-) 및 티올 (-SH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원 명세서 전체에서, 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 주기율표의 17 족에 속하는 할로겐 원자가 작용기의 형태로서 화합물에 포함되어 있는 것을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 염소, 브롬, 불소 또는 요오드일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서,

M은 이리듐 또는 로듐이고,

R¹ 내지 R¹⁶는, 각각 독립적으로, H, F, Cl, Br, I, 히드록시기, 티올기, 알킬티올기, 우레아기, 시아노기, 알킬기, 알콕시기, 아릴기, 아릴옥시기, 알릴기, 비닐기, 아실기, 아지도기, 니트로기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 히드록시아미노기, 알킬암모늄, 카르복시기, 카르바모일기, 설파닐기, 설포닐기, 설페이트기, 설포네이트기, 설폰아미드기, 포스페이트기, 포스포네이트기, 및 포스피네이트기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이고,

상기 M은 이리듐인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 R¹ 내지 R¹⁶, 그리고 고리 A 및 고리 B가 치환된 경우는, 앞선 정의에 기재된 치환기가 F, Cl, Br, I, 히드록시기, 티올기, 알킬티올기, 우레아기, 시아노기, 알킬기, 알콕시기, 아릴기, 아릴옥시기, 알릴기, 비닐기, 아실기, 아지도기, 니트로기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 히드록시아미노기, 알킬암모늄, 카르복시기, 카르바모일기, 설파닐기, 설포닐기, 설페이트기, 설포네이트기, 설폰아미드기, 포스페이트기, 포스포네이트기, 및 포스피네이트기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나로 치환된 것을 의미한다.

상기 항암용 약학 조성물은 소포체, 특히 암세포에서의 소포체를 타겟으로 하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 약학 조성물의 적용 대상이 되는 암세포는 난소암세포주, 유방암세포주, 및 장암세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 항암용 약학 조성물은 빛에 반응하여 단백질 내에서 광화학적 가교결합을 일으켜 단백질을 가교하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 살아있는 세포 내의 단백질을 포함할 수 있다. 상기 항암용 약학 조성물은 광개시제와 같은 외생 첨가제 없이도 광화학적 가교결합을 촉진할 수 있어, 세포 독성이 거의 없으므로, 살아있는 세포의 단백질에서 사용될 수 있다. 상기 항암용 약학 조성물이 갖는 세포 독성은 세포막 투과를 위해 필요한 수준으로 약한 독성이면 충분하다.

이때, 상기 광화학적 가교결합은 단백질의 아미노산 잔기의 인위적인 수정 없이도 가능하며, 예를 들어, 단백질의 친핵성 아미노산 잔기들 사이에서, 특히, 티로신 잔기와 티로신 잔기의 사이에서, 또는 티로신 잔기와 시스테인 잔기의 사이에서, 또는 시스테인 잔기와 시스테인 잔기의 사이에서 진행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 단백질은 소포체 내의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 항암용 약학 조성물에 포함될 수 있는 사이클로메탈화 전이금속 착물은, 이리듐을 중심 금속으로 갖는 착물, 예를 들어, 하기 화학식 7 내지 10의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

본 발명의 일 구현예에 따른 항암용 약학 조성물은 상온에서 빛에 반응하여 인광을 발광하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 약 480 내지 750 nm 파장범위 내에서 인광을 발광하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 7의 화합물을 포함하는 항암용 약학 조성물은 약 480 내지 550 nm 파장범위 내의 청색 인광을 발광할 수 있고, 상기 화학식 8의 화합물을 포함하는 항암용 약학 조성물은 약 500 nm 초과 내지 630 nm 파장범위 내의 녹색 인광을 발광할 수 있고, 상기 화학식 9의 화합물을 포함하는 항암용 약학 조성물은 약 550 nm 내지 650 nm 파장범위 내의 오렌지색 인광을 발광할 수 있고, 상기 화학식 10의 화합물을 포함하는 항암용 약학 조성물은 약 600 nm 초과 내지 750 nm 파장범위 내의 녹색 인광을 발광할 수 있다.

여기서, 상기 항암용 약학 조성물의 인광 양자효율이 약 0.01 내지 1 일 수 있으며, 예를 들어, 약 0.4 내지 0.99 또는 약 0.5 내지 0.7 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 항암용 약학 조성물의 인광 수명은 약 200 ns 이상일 수 있으며, 예를 들어, 약 400 ns 이상 또는 약 400 내지 1000 ns 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 상기 항암용 약학 조성물은 빛에 반응하여 초과산화물 음이온 라디칼 (superoxide anion radical: O₂ ^-) 및/또는 단일항 산소 (singlet oxygen: ¹O₂)와 같은 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)를 생성할 수 있다. 상기 초과산화물 음이온 라디칼은 유형1 ROS로서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물로부터 산소로의 전자이동을 통해 생성될 수 있고, 상기 단일항 산소는 유형2 ROS로서, 삼중항-삼중항 에너지 전이에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 약학 조성물은 하기 반응식 1 또는 2에 나타낸 바와 같이, 2 단계를 통해 화학식 1 또는 2로서 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물을 형성하는 것을 포함하여 제조될 수 있다:

[반응식 1]

[반응식 2]

상기 식들에서,

M, R¹ 내지 R¹⁶, 고리 A, 및 고리 B는 각각 앞서 정의된 바와 동일함.

구체적으로,

반응식 1은, IrCl₃·nH₂O와 하기 화학식 3으로서 표시되는 출발물질 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로서 표시되는 중간체 착물을 제조하는 단계, 및 상기 중간체 착물과 2,2'-바이피리딘을 반응시켜 하기 화학식 1로서 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물을 형성하는 단계를 포함한다:

[화학식 1]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 식들에서,

M, 및 R⁹ 내지 R¹⁶은 각각 앞서 정의된 바와 동일함.

또한, 반응식 2는, IrCl₃·nH₂O와 하기 화학식 5로서 표시되는 출발물질 화합물을 반응시켜 하기 화학식 6으로서 표시되는 중간체 착물을 제조하는 단계, 및 상기 중간체 착물과 2,2'-바이피리딘을 반응시켜 하기 화학식 2로서 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물을 형성하는 단계를 포함한다:

[화학식 2]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 식들에서,

M, R⁹ 내지 R¹², 고리 A, 및 고리 B는 각각 앞서 정의된 바와 동일함.

예를 들어, 상기 화학식 7 내지 10의 화합물인 이리듐 착물은 전술한 반응식 1 또는 2와 같은 방법에 의해 제조될 수 있으며, 루테늄 착물과 비교했을 때 훨씬 더 강한 금속 유도 스핀-오비탈 상호작용 (spin-orbital coupling)으로 삼중항 상태 (triplet state)의 방사이완 (radiative relaxation)을 가능하게 하는 단일항-삼중항 혼합 (singlet triplet mixing)을 효율적으로 이끌어 상온에서도 인광을 발생할 수 있다. 게다가, 본 발명의 일 구현예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물들은 좋은 전자 전달 (electron transfer) 능력을 가지고 있다.

그 결과 상기 사이클로메탈화 전이금속 착물은 빛에 반응하여 유형1과 유형2의 활성산소종을 굉장히 잘 생성하였으며, 이러한 증진된 활성산소종 생성능력 및 금속 복합체 기반 촉매작용의 상승효과를 통해 외생 첨가제 없이 1 분 안에 단백질의 광화학적 가교작용을 이루어 낼 수 있다.

이러한 상승효과를 이용하여 광화학적 가교결합의 흡광 촉매로서 상기 사이클로메탈화 전이금속 착물을 이용할 경우, 루테늄 금속의 경우보다 광화학적 가교결합을 촉진할 수 있다.

본 발명에 의한 항암용 약학 조성물은 우수한 세포 생존능, 현저하게 높은 인광 양자효율, 및 훌륭한 단일항 산소 양자효율을 가지므로, 다양한 암 세포주: 난소암세포주, 유방암세포주, 및 장암세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에서 세포 사멸을 야기하는 유효광을 만들 수 있으며, 나아가 1-광자 및 2-광자의 광역학 치료제로서 사용될 수 있다.

이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예: 이리듐 기반 사이클로메탈화 전이금속 착물의 합성

이리듐 기반 사이클로메탈화 전이금속 착물 (이하, 이리듐 착물 또는 Ir(III) 착물)의 합성과정은 하기 스켐 (scheme)에 나타낸 바와 같다:

합성 과정에서, 2 당량의 IrCl₃·nH₂O (Strem Chemicals, USA)와 4 당량의 C^N 리간드 (C^N Ligand: Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 염소로 연결된 이리듐 이합체 (중간체 착물)를 제조하였다. 디클로로메탄 (dichloromethane, DCM: 삼전화학, 한국)과 메탄올 (MeOH: 삼전화학, 한국)의 혼합 용매 (DCM:MeOH = 1:1 부피비)에 상기 제조된 염소로 연결된 이리듐 이합체 1 당량과 2,2'-바이피리딘 (Sigma Aldrich, USA) 2 당량을 용해시킨 후, 불활성 기체인 N₂ 분위기에서 12 시간 동안 환류 반응시켰다. 그 후 DCM와 헥세인 (n-hexane: 삼전화학, 한국)을 이용하여 석출을 하였으며, 헥세인을 이용한 추가적인 세척 과정을 통해 화학식 7 (ER-Ir-B로 약칭함), 화학식 8 (ER-Ir-G로 약칭함), 화학식 9 (ER-Ir-O로 약칭함), 화학식 10 (ER-Ir-R로 약칭함)의 화합물을 각각 합성하였다.

상기 2,2'-피리딘 리간드는 양이온성 종을 만들기 위한 보조적인 리간드로서 사용되었다. 이는 수계에서의 높은 용해도, 좋은 양자효율 및 약간의 세포 독성을 유도한다.

실험예 1: 비오틴-페놀 가교에 관한 MALDI-TOF-MS 분석

HEK-293T 또는 U2OS 세포들은 셀 컬쳐 플레이트 (cell culture plate)에서 10% FBS, 50 units/mL 페니실린과 50 mg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 버퍼 (Gibco)에서 온도 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 16 시간 동안 길러진다. 특히, 바이오 이미징 실험을 위해서, 셀 컬쳐링 과정에서 피브로넥틴 (fibronectin)이 코팅되어 진 유리를 사용하였다. 그 후 플라스미드들은 리포펙타민 2000 (Life Technologies)과 함께 길러진 세포에 형질주입 (transfection) 되었다. 형질주입된 세포들은 각 10 μM의 ER-Ir-B, ER-Ir-G, ER-Ir-O 및 ER-Ir-R이 깨끗한 MEM 버퍼에서 각 세포마다 30 분 동안 처리되었다. 그 후 DPBS 버퍼로 3번 씻어준 후, 세포들은 4% 포름알데히드 용액을 15분당 처리하여 고정시켜 주었다. 그리고 DPBS 버퍼를 이용하여 두 번 더 씻어 주었다.

질량 분석을 위한 샘플들은 비오틴-페놀 (1 mM), ER-Ir-O (10 μM), Ru(bpy)₃ (10 μM) 그리고 과황산암모늄 (250 μM) 의 각 최종농도에 맞게 섞어서 준비되었다. Ru(bpy)₃ (Sigma Aldrich, USA)와 ER-Ir-O는 각각 DMSO (SAMCHUN Chemicals, Republic of Korea)에 녹여 1 mM의 농도가 되게 준비하고, 과황산암모늄은 증류수에 25 mM의 농도가 되도록 녹여 고농도 저장용액을 준비하고, 비오틴페놀은 물에 녹여 1 mM 농도 수용액이 되도록 준비되었다. 그 후, 1 mM 비오틴페놀 용액에 과황산 암모늄, Ru(bpy)₃ 또는 ER-Ir-O 고농도 저장용액을 섞어, 비오틴페놀 용액에서 각 물질들의 농도가 최종농도가 되도록 맞추었다. 또한 최종 샘플들은 증류수와 DMSO의 최종 부피비가 99:1이 되게 준비되었다. 각 비오틴페놀 샘플들은 샘플과 동일한 양의 매트릭스 용액과 함께 섞은 뒤, 타겟 플레이트 (target plate)에 로딩되었다. 매트릭스 물질로는 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (Sigma Aldrich, USA)가 사용되었다. 매트릭스 물질은 40% 아세토니트릴 (Acetonitrile)과 2% trifluoroacetic acid에 녹임으로써 5 mg/mL로 맞추었다. MALDI-MS 타겟 플레이트에 샘플을 완전히 건조시킨 후에 Ultraflex III time-of-flight mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany)를 이용하여 각 샘플들에 상응하는 MALDI-MS 스펙트럼을 얻었다. 질량 분석 스펙트럼들은 매트릭스 효과 억제 없이 0 - 1000 m/z 범위에서 얻어졌다.

실험예 2: SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법/웨스턴블럿

SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴 블랏을 통한 가교결합 분석

형질주입된 세포들은 1 mL의 깨끗한 MEM 버퍼 (Gibco)에 ER-Ir-B, ER-Ir-G, ER-Ir-O와 ER-Ir-R 각각 물질의 농도를 2 μM로 맞춘 용액으로 30 분 동안 처리되었다. 그리고 DPBS 버퍼 (Gibco)를 이용하여 3번 씻어주었다. 광화학적 가교결합은 100 mW cm^-1 세기의 빛으로 1분 동안 빛을 조사하여 유도되었다. 그 후 셀들은 DPBS 버퍼로 두 번 씻어주었다. 세포들의 용해는 protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, USA)와 PMSF를 포함하는 RIPA 용해 버퍼 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Triton X-100)를 이용하였다. 세포 단백질들은 원심분리 (16000g, 10 min, 4℃)에 의해 얻어졌으며, SDS-PAGE를 통해 분리되었다. 뒤 따르는 웨스턴 블랏 처리를 위해 겔에 있는 분리된 단백질들은 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨졌다. 그 막에 있는 단백질들은 blocking 용액 (2% BSA and 0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline)으로 1 시간 동안 막아 주었으며, 1 시간 동안 상온에서 anti-GFP (Santa cruz biotechnology, USA) 를 1:1000으로 희석한 blocking 용액을 이용하여 처리되었다. GFP에 붙지 않은 anti-GFP는 TBST 버퍼를 이용하여 5 분 동안 4번 씻어 제거되었다. 세척 후에 막들은 2차 antibody (anti-rabbit HRP, Bio-Rad, 1:3000 dilution)를 1:3000 으로 희석한 blocking 용액을 이용하여 상온에서 30 분 동안 처리되었다. 막들은 다시 TBST 버퍼로 5 분 동안 4번 세척되었으며, Clarity reagent (Bio-Rad) 처리 뒤 LAS 4000 (GE Health care)으로 이미지화되었다.

실험예 3: 오비트랩 질량분석

오비트랩 질량 분석을 이용한 산화 분석

HEK-293T 세포들 (한국세포주은행)은 10% FBS, 50 units/mL 페니실린과 50 mg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 버퍼 (Gibco)에서 온도 37℃ 5% CO₂ 조건으로 36 시간 동안 길러졌다. 그리고 나서, 깨끗한 MEM 버퍼에 2 μM 농도로 맞추어 진 ER-Ir-O 용액을 30 분 동안 셀에 처리하였고, 그 후 DPBS 버퍼 (Gibco)를 이용하여 세 번 씻어주었다. 단백질들의 산화는 100 mW cm^-2 세기의 빛으로 1 분 동안 조사하여 유도되었고 그 뒤에 DPBS 버퍼를 이용하여 두 번 더 씻어 주었다. 셀의 용해는 앞에서 언급된 RIPA 버퍼를 이용하여 진행되었으며, 그 후 단백질들은 Amicon filter (Merck Millipore, UFC801096)를 이용하여 농축되었다. 뒤 이어 4℃에서 20 분 동안 7500 × g (g: 중력가속도)로 원심분리를 하였다. 50 μg의 단백질들이 SDS-PAGE에 로딩되었으며, 겔의 시작점으로부터 1 cm 까지 분리하였다. 단백질들을 포함하는 겔은 1 mm 사각형으로 잘라내었고, 이를 Eppendorf 튜브들에 각각 옮겨 담았다. 겔들은 3차 증류수를 이용하여 3번 5 분 동안 셰이커를 이용하여 세척되었다. 세척한 증류수를 제거한 뒤 100 mM 탄화수소암모늄 (Ammonium Bicarbonate, ABC)을 각 튜브에 넣어준 뒤 5 분 동안 흔들어 주며 배양하였다. 100 mM ABC와 100% 아세토니트릴을 1:1로 섞은 용액을 이용하여 셰이커 위에 있는 각 튜브에 들어 있는 용액을 갈아주는 과정을 5 분 간 2번 진행하였으며, 그 후 100% 아세토니트릴을 튜브에 대체해서 넣어주었다. 이 또한 앞서 진행한 과정과 같이 2번 반복 진행하였다. 마지막으로, 다시한번 아세토니트릴을 새로 갈아주었다. 셰이커를 이용해 5 분간 흔들어 준 뒤 처음 ABC를 이용한 과정으로부터 현재까지의 과정을 다시한번 반복해 주었다. 피펫을 이용하여 아세토니트릴을 제거한 후 남아 있는 용매들은 저온진공건조시스템 (speed-vac: LABCONCO)을 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 시스테인 아미노산의 이황산결합을 제거하기 위해 100 mM ABC에 녹아 있는 10 mM DTT (dithiothreitol)을 넣고 Thermomixer (Eppendorf)를 이용하여 56℃에서 800 rpm으로 1 시간 동안 섞어주었다. 반응이 끝난 후 DTT 용액을 제거하고 300 mM의 idoacetamide가 들어있는 100 mM의 ABC 용액을 이용하여 Alkylation을 진행하였다. 이 반응을 진행할 때, 빛을 차단한 상태에서 800 rpm으로 상온에서 30 분 동안 반응을 진행하였다. 버퍼를 제거한 후에, 100 mM ABC를 튜브 안에 넣어준 뒤 5 분 동안 shake 위에서 유지시켜 주었다. 100 mM ABC와 100% 아세토 니트릴을 1:1로 섞은 용액을 셰이커 위에 있는 튜브들에 대체하여 넣어주는 과정을 5 분 동안 2번 반복하였다. 그리고 100% 아세토니트릴로 다시 대체하여 넣어주었다. 5 분 동안 셰이커를 이용하여 흔들어 준 뒤에, ABC 과정에서부터 지금까지를 다시한번 반복하였다. 남아있는 용매는 다시 저온진공건조시스템 (speed-vac)을 이용하여 제거해 주었다. 그리고 나서 25 ng/μL 농도의 트립신 골드 (trypsin gold)를 포함하는 50 mM의 ABC (Promega, V5280) 용액을 첨가해준 뒤에 37℃에서 400 rpm으로 흔들어 주며 하룻밤 인큐베이션 시켜주었다. 인큐베이션 후에, 튜브들은 5 분 동안 vortex로 흔들어 주었으며 표면에 뜨는 상층액을 새 Eppendorf 튜브들에 각각 옮겼다. 남겨진 겔들은 아세토니트릴 과 5% 포름산의 2:1 혼합 용액으로 씻겨 주었으며 그 뒤에 다른 튜브에 옮겨두었던 상층액을 다시 같은 튜브로 옮겨 담았다. 상층액들은 저온진공건조시스템 (speed-vac)을 통해 건조되었으며, 그 뒤에 바로 각 샘플들은 nanoelectrospray ion source를 가지고 있는 LTQ-Orbitrap 질량분석기 (Thermo, Bremen, Germany)를 이용하여 분석되다.

실험예 4: 세포 독성

세포 독성 분석을 위하여, HEK-293라는 인간 배아신장 세포 (human embryonic kidney: 한국세포주은행)를 사용하였다. 모든 세포들은 5% (v/v) FBS (Sigma Aldrich)와 1% (v/v) 페니실린 (penicillin: GIBCO)이 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium: GIBCO) 배양액에서 37℃와 5% CO₂환경에서 길러졌다. 화학식 7 내지 10의 각 이리듐 착물들과 이들 착물의 구조에서 Cl^- 음이온 대신에 PF₆ ^- 음이온을 각각 가지는 이리듐 착물들의 세포 생존능력 (Cell viability)은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석을 통해 확인되었다.

셀들은 96 well 판에 각각 심어지며 (150,000 cells in 100 mL per well), 그 후 각 농도별 (1, 5, 10 μM; final 1% v/v DMSO)로 이리듐 착물을 각각 로딩하였다. 빛이 차단된 상태로 37℃에서 24 시간 동안 배양한 뒤, 25 mL MTT (바이오세상, 한국) [바이오세상, 한국: PBS (phosphate buffered saline) 중 5 mg/mL의 농도, pH 7.4; GIBCO]를 각 well에 처리하였다. 처리 후에 또 다시 빛이 차단된 상태로 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 셀에 의해서 생성된 포르마잔 (formazan)이 상온에서 DMF (N,N-dimethylformamide: 50% v/v 수용액, pH 4.5) 와 SDS (sodium dodecyl sulfate: 20% w/v)를 포함하는 가용화 완충제의 첨가에 의해 하룻밤 동안 용해되었다. 용해된 포르마잔의 흡광은 SpectraMax M5 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 측정되었다. 분석을 위한 샘플링 과정에서 세포에 소량의 빛이 가해질 수 있지만, 셀이 빛에 최대한 노출되지 않도록 주의하였다. 세포 생존 능력은 동일한 양의 DMSO (dimethylsulfoxide)를 포함하는 셀과 비교군으로 놓고 결정되었다. 오차 막대는 세 개의 독립적인 실험들로부터의 표준오차로서 계산되었다. 이리듐 착물들 중 화학식 9의 화합물 (Cl^- 양이온 함유)과 하기 화학식 11의 화합물과 같이 PF₆ ^- 음이온이 배위되어 있는 이리듐 착물을 각각 HEK-293에 처리했을 때의 세포 생존능력을 확인하여 도 10에 나타내었다:

[화학식 11]

<결과 및 분석>

4개의 ER 타겟 이리듐 (III) 착물의 합성 및 광화학적 분석

실시예를 통해 화학식 7 내지 10의 화합물들, 4개의 사이클로메탈화된 Ir(III) 착물을 제조하였으며, 이들 4개 Ir(III) 착물이 타겟 ER에 가능성을 가진 적합한 발광 물질인지 확인하기 위해 연구되었다.

도 1은 UV-vis 형광계를 통한 광화학적 분석 결과를 보여주며, 이를 수치화하여 표 1에 나타내었다. 4개의 Ir(III) 착물의 UV-vis 흡수/방출 스펙트럼은 H₂O 용액에서 측정되었다.

도 1 및 표 1을 참조하면, 4개의 Ir(III) 착물들은 350 nm 이하에서 중심 전이 금속의 스핀-허용 π-π 리간드에 대한 강한 피크를 보였다. 350 nm에서 450 nm 사이의 약한 흡수 피크는 단일항 및 삼중항 금속-대-리간드 전하이동 (¹MLCT 및 ³MLCT)에 대응된다: ER-Ir-B 354 nm, ER-Ir-G 374 nm, ER-Ir-O 432 nm, ER-Ir-R 437 nm. 강한 스핀-오비탈 커플링에 의한 삼중항 상태 (triplet state)의 방사이완 (radiative relaxation)으로부터의 방출 피크가 531 nm, 590 nm, 562 nm 및 592 nm에서 나타났다. Ir(III) 착물은 자기 소광이 방지되어 130 nm를 초과하는 큰 스토크 시프트를 보였다. 그 외에, 인광에 대한 양자효율은 ER-Ir-O (0.58), ER-Ir-B (0.43), ER-Ir-R (0.097) 및 ER-Ir-G (0.011)의 순서로 나타났다. 결과적으로, 주요 리간드 교환에 대한 색 조정 효과가 확인되었다.

U2OS 세포 중 수명을 확인하기 위한 ER 이미징 및 형광 수명 이미징 현미경 (fluorescence lifetime imaging microscope: FLIM) 분석

도 2는 ER-Ir-O (10 μM, 0.5 시간)로 표지된 U2OS 세포의 1-광자/2-광자 이미지 및 셀 컨디션에 따른 수명에 대한 FLIM 분석 결과를 나타낸다: a, ER-Ir-O의 1-광자 여기 이미지 (U2OS 세포 내 이리듐 분포가 적색으로 표지됨: RFP Channel (560 ~ 615 nm)); b, ER-Ir-O의 2-광자 여기 이미지 (U2OS 세포 내 이리듐 분포가 적색으로 표지됨: λ_ex=860 nm, RFP Channel); c, 형질주입된 (transfected) KDEL-BFP 이미지 (U2OS 세포 내 BFP의 분포가 청색으로 표지됨: DAPI Channel (417 ~ 477 nm)); d, ER-Ir-O의 1-광자 여기 이미지와 KDEL-BFP 이미지 (공존화)의 이미지 오버랩 (이리듐과 BFP의 동일한 위치에서의 공존이 보라색으로 표지됨); e, mCherry (핵)로 형질주입되고 연속하여 ER-Ir-O (ER)로 처리된 공초점 레이저 현미경 (Confocal laser scanning microscope: CLSM) 이미지 ; f, mCherry (형광) 및 ER-Ir-O (인광) 로 결합된 FLIM 이미지로, mCherry에 대한 형광은 핵에 위치하고 있으며, ER-Ir-O에 대한 인광은 소포체에 위치하고 있음.

4개의 사이클로메탈화 Ir(III) 착물은 U2OS 세포주로 처리된 다음, 그 세포 이미지가 1-광자/2-광자 현미경을 이용하여 수집되었다 (도 2의 a~b). 상이한 주요 리간드를 가지는 제안된 Ir(III) 착물의 타겟팅 모션 (targeting motion)은 청색 형광성 단백질 (BFP)을 ER에 위치시켜 주는 KDEL 테트라펩타이드 시퀀스로 연결된 BFP을 사용하여 U2OS 세포 중에서의 공존화 (co-localization)에 의해서 설명되었다. Ir(III) 착물의 공존화 결과는 염색된 장소를 보여준다. 공존화 결과에서 Ir(III) 착물의 타겟팅 모션은 1-광자 및 2-광자 현미경 모두에서 동일했다. ER에 대한 4개의 화합물의 타겟팅 모션에 대하여 확인한 후, 인광과 형광 사이의 구별을 통해 명확한 인광성 이미지가 밝혀졌다. 핵에 표적화된 H2B-mCherry 융합 단백질과 ER의 ER-Ir-O가 이 설명을 위해 이용되었다. H2B-mCherry 및 ER-Ir-O는 각각 형광 및 인광을 방출한다. H2B-mCherry 및 ER-Ir-O를 이용한 심플 셀 이미지에 있어, 색 유사성 때문에 세포의 환경에서 형광과 인광 사이의 구별이 어렵다는 점이 주요 문제점이다 (도 2e). 그러므로, 인광의 긴 수명에 의해 주위의 형광 간섭을 차단할 수 있다는 것이 형광 수명 현미경 (FLIM) 분석을 통해 관찰되었다. FLIM을 통한 수명의 가시화는 세포 이미지에서 형광 (1.571 ns, 청색 영역) 및 인광 (498.575 ns, 황색 영역)을 특징적으로 나타냈다 (도 2f). 이러한 498.575 ns 수명은 약 40-180 ns 수명을 나타내는 기존에 보고된 이리듐 기반의 리소좀 트레커 (Iridium based lysosome tracker)와 비교하여 광화학 성질의 약 4 배 상승을 보인다. 또한, 이러한 상승은 광 안정성의 향상을 야기할 것이다. 결과적으로, 대응된 수명에 따라 입증된 인광 이미지를 제공했다.

Ir(III) 착물을 이용한 PDT 및 2-광자 인-시추 관찰

우수한 ROS 생성, 무산소 환경에 대한 민감도 및 광 민감도와 같은 유리한 조건 때문에, Ir(III) 착물 기반의 광역학 치료법에 대해 종래 많은 연구가 이루어졌다. 본 실험예에서는 ER-Ir-B에서 ER-Ir-R까지의 4개의 화합물, Ru(bpy)₃ 및 시스플라틴 (cisplatin)의 PDT 능력이 난소암 세포 sk-ov-3, 유방암 세포 MCF-7 및 장암 세포 Caco-2에 대해 평가되었으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로메탈화 전이금속 착물의 PDT 능력을 나타낸다 [a: 난소암 세포 sk-ov-3에 대한 PDT 능력, b: 유방암 세포 MCF-7에 대한 PDT 능력, c: 장암 세포 Caco-2에 대한 PDT 능력]. 도 3을 참조하면, 4개의 화합물 중 ER-Ir-O 및 ER-Ir-R은 각 암 세포주에 대해 높은 PDT　효능을 보였다. 그에 반해, Ru(bpy)₃ 및 시스플라틴의 PDT 활성도는 낮은 효능으로 인해 각 암세포가 계속적으로 살아 있음을 MTT-assay를 통해 확인하였다. 요점은, 본 발명에서 기보고된 Ir(III) 착물 기반의 광역학 치료법과 비교하여 사용된 에너지가 훨씬 적은, 단지 1 분 (1 Jcm^-2) 동안 100 mWcm^-2 의 빛을 사용했다는 것이다. 이러한 낮은 에너지의 빛이 사용되었음에도 불구하고, 각 셀은 이리듐 착물에 의해서 빠른 속도 (60 초 이내) 로 약화되었으며 (세포 생존율 30% 이하), ER-Ir-O 및 ER-Ir-R 모두 sk-ov-3 및 MCF-7 세포에 대하여 훨씬 더 효과적인 것으로 나타났다.

더불어, Ir(III) 착물들 중 ER-Ir-O는 1-광자 기반의 PDT 뿐만 아니라, 2-광자 기반의 치료 효과도 관찰되었다. 2-광자 기반의 PDT 처리가 적용되기에 앞서, 최적의 2-광자 액티브 포인트가 발견되었다. 세포가 열적 에너지에 의해 영향을 받지 않는 근적외선 범위인 670 nm에서 950 nm까지 스캐닝하여 2-광자 여기 스펙트럼이 제공되었다 (도 4). 도 4는 Ir(III) 착물의 2-광자 여기 스펙트럼을 나타낸다 [a-1: 4개 Ir(III) 착물의 정상화된 (normalized) 2-광자 흡수 스펙트럼, a-2: 4개 Ir(III) 착물의 2-광자 흡수 강도 스펙트럼, b: 810 nm에서 950 nm까지의 레이저 파장을 이용한 흡수에 따른 ER-Ir-O의 방출 강도 변화].

여기서, 요점은, 여기 스펙트럼이 MLCT 라인을 포함하는 유사한 그래프 형태였다는 것이다. 여기화 공정은 선형 및 비선형 공정으로 인해 다름에도 불구하고, 각 파장에 따른 1-광자 여기화에 대한 흡수의 가능성 (probability)의 분포가 2-광자 여기화에서도 유지되었다. 2-광자 여기화로부터의 방출 강도는 2-광자 공정에 합당한 레이저 파워의 2의 제곱에 비례했으며 이는 본 2-광자 여기화에 대한 타당성을 입증한다 (도 5).

이러한 스펙트럼에 기초하여, 최적화된 2-광자 여기화 파장 860 nm에서의 암세포에 대한 치료 효과를 실시간으로 추척하였다. 타겟 암 세포로, PDT 효과가 뚜렷했던 sk-ov-3가 사용되었다. ER-Ir-O이 없는 상태에서, 전체 세포 환경은 파괴되지 않았고 2-광자 인가 시간이 경과함에 따라 미세하게 유지되었다 (도 6의 a-c). 그러나, 세포 사멸은 ER-Ir-O의 광-유발 세포 독성으로부터 치료 효과에 의해 극적으로 가속되었으며, 이는 심각한 형태 변화로 나타났다 (도 6의 d-f). 이때, 도 6은 sk-ov-3 세포에 대해서의 2-광자 PDT에 의한 세포 형태 변화의 실시간 추적 결과를 나타낸다 [a-f, ER-Ir-O (20 mM)이 처리되거나 처리되지 않은 (λ_laser = 860 nm, 30 초) 조건 하에서의 세포 형태 관찰되었으며, 각 이미지는 0 분 (a 및 d), 30 분 (b 및 e), 50 분 (c 및 f)에 획득되었음].

또한, Ir(III) 착물을 사용한 경우, 우수한 PDT 효능이 1-광자 및 2-광자 인가에 의해 관찰되었다. 이러한 우수한 효능에 대한 이유가 ROS 생성에 기초한 직접적인 세포 고사로만 고려되었지만, 본 발명자들은, ROS 생성 속도와 광-가교에 의한 단백질 응집 및 Ir(III) 착물의 심각한 비가역 산화반응 기반의 광-활성화 공정에 초점을 맞춰, Ir(III) 착물들이 PDT에 대해 왜 우월한 효능을 갖는 것인지 몇 가지 이유들을 조사하기 위해 노력했다.

Ir(III) 착물들의 ROS 생성 속도 및 광-가교 분석

사전에, 본 발명자들은, 광-활성화 기반의 단백질 변형 가능성을 확인하기 위해, Ir(III) 착물들의 ROS 생성 속도를 조사하였다. ROS 생성 능력의 측정은 세 가지 분석법, 산소 ??칭 정도, 디하이드로로다민 123 (dihydrorhodamine 123) 어세이 분석 및 9,10-안트라센디일-비스(메틸렌)말론산 [9,10-anthracenediyl-bis(methylene) malonic acid, ABDA] 어세이 분석으로 제시되었다. 우선, 산소 ??칭 정도는 Ir(III) 착물의 산소 상호작용 능력을 실험적으로 시사하며, 이는 산소 분자에 의한 삼중항-상태의 소광 (quenching)이 단일항 산소 형성 효율 및 삼중항 상태 및 산소 간의 전하전달 상호작용에 강하게 의존하기 때문이다. 삼중항 상태 ??칭 속도의 순서는 ER-Ir-O, ER-Ir-R, ER-Ir-B 및 ER-Ir-G 순이다. 산소 또는 다른 종으로의 전자전달을 통한 촉매 성질이 다른 임의의 종보다도 ER-Ir-O에 대해 훨씬 더 효과적임을 의미한다. 또한, 초과산화물 음이온 라디칼의 양은 디하이드로로다민 123에서 로다민 123으로의 변환을 통한 형광성 증강으로 평가되었다. ER-Ir-O의 초과산화물 음이온 라디칼 생성 속도는 최고였다. 마지막으로, ¹O₂ 생산에 대한 양자효율은 ABDA의 흡수도 쇠약 (absorbance attenuation)을 관찰하고, 이어서 Ru(bpy)₃를 대조하여 산출되었다 (H₂O 용매 중의 Φ_s 는 0.22임). ER-Ir-O는 이중에서도 최고의 ¹O₂ 양자효율 Φ_s 은 0.81을 보였다. ROS 생성에 대한 3개의 분석 결과를 고려하면, ER-Ir-O는 다른 임의의 종에 비해 우월했다. 이로 인해, ER-Ir-O이 최고 성능의 광-활성화를 만들어 낼 것으로 예상된다.

이러한 ROS 생성 분석에 이어, Ir(III) 착물들이 공유 결합을 만드는 단백질-단밸질 상호작용 활용 가능성을 보였기 때문에, 효율적인 세포 사멸을 위한 응집을 유도하기 위한 Ir(III) 착물 기반의 광-가교 시스템이 평가되었다. 종래 금속 기반의 광-가교는 가교 경로 개시에 전자 억셉터로 역할하는 Ru(bpy)₃ 및 APS와 같은 다른 외생 첨가제를 이용하여 진행되었다. 이러한 외생 물질들은 인-비보 적용에 대한 장애물 중 하나이다. 그러므로, 다른 부작용이 없는, 빠르고 효율적인 무첨가제 광-가교 발판이 필수적이다. 이러한 관점에서, Ir(III) 착물 기반의 광-가교가 우수한 ROS 생성에 기초하여 확인되었다.

ER-Ir-O의 좋은 성질로 인해 우수한 결과가 기대되기 때문에, 광-가교가 달성되었다 (도 6의 a). 웨스턴 블록 데이터에 나타난 바와 같이, 4번 줄에서 7번 줄의 4개의 Ir(III) 착물들은 임의의 첨가제 없이 1분 조사 시 (1 SUN, 100 mW/cm²) 능률적으로 가교된 단백질을 만든다. 주요 요점은 ER-Ir-O 및 ER-Ir-R은 180 kD 이상의 높은 수준의 가교를 달성하였다 (6번 줄 및 7번 줄). ER-Ir-O 및 ER-Ir-R이 Ir(III) 착물들 및 Ru(bpy)₃중에서 우수한 ¹O₂ 양자효율, 우수한 전자전달 능력을 가지기 때문이다. 이로 인하여, ¹O₂ 생성 및 효과적인 전자전달 공정으로부터의 산화반응은 광-가교 증대를 위한 2개의 주요 인자인 것으로 추정된다. 8번 줄의 Ru(bpy)₃의 경우, 과황산암모늄 (ammonium persulfate: APS)의 부재로 인해 광-가교를 가속하지 못한 결과일 것이다.

광-가교는 티로신의 위치에서 발생하고 다른 티로신 또는 시스테인 같은 친핵성 잔기에 의해 지지되는 것으로 알려져 있다. 그것은 티로신 잔기를 갖는 비오틴-페놀이 광-가교에 의한 이량체화를 확인하기 위해 이용된 이유이다. 비오틴-페놀의 이량체화는 MALDI-MS로 관찰되었다. 비교로서, Ru(bpy)₃ 은 APS와 광조사가 적용되었거나 적용되지 않은 여부에 따라 사용되었다 (도 7). ER-Ir-O에 대하여, 전체 4개의 조건들이 산소 및 빛이 존재하거나 존재하지 않은 조건에 따라 적용되었다 (도 6의 b-e). 두 조건 중 하나, 산소 또는 빛이 제거된다면, 광-가교는 발생하지 않았다. 이는 O₂ 및 빛 소스가 광-가교 경로에서 핵심 요인일 것임을 암시한다. 그러나, 주요 요점은 Ir(III) 착물 기반의 광-가교 발판은 APS와 같은 독성 첨가제의 사용을 필요로 하지 않는다는 것이다. APS와 같은 외생 물질들은 그의 독성 때문에, 실제 인-비보 바이오 응용에 대한 적용에 제한을 받는다. 그러므로, 단백질 응집을 유도하기 위해 여기서 최초 보고된 Ir(III) 기반의 광-가교 시스템은 종래 사용된 Ru(bpy)₃와 비교했을 때, 치료제로서의 가능성을 보여준다.

도 8a, 도 8b, 및 도 8c는 ER-Ir-B, ER-Ir-G, ER-Ir-O, ER-Ir-R과 Ru(bpy)₃의 활성산소종 생성 능력 및 ER-Ir-O 및 Ru(bpy)₃를 이용한 생체 내/외 광-가교 분석 결과를 나타낸다: 도 8a의 위 그래프, 광조사 후 ABDA의 흡수도 변화 (DA = AsAf) 라인 성향은 단일항 산소(¹O₂) 생성의 절대적인 양과 일치함; 도 8a의 아래 그래프, 과산화물 음이온 (O₂ ^-) 생성 어세이 분석은 디하이드로로다민 123이 로다민 123으로 변환되었을 때의 방출 변화에 의해 나타남; 도 8b, KDEL 테트라펩타이트 시퀀스에 의해 ER에 타겟화된 eGFP를 가지는 HEK293T 세포에서 광-가교 분석; 도 8c, 티로신 잔기를 가지는 비오틴-페놀 (BP)의 이량체화는 ER-Ir-O에 의한 BP 광-가교의 결과로서 MALDI-TOF-MS를 통해 보여줌, (1) 무산소 조건 하에서 광조사 시, (2) 산소 조건 하에서 미-광조사 시, (3) 산소 조건 하에서 300 초동안 광조사 시, (4) 산소 조건 하에서 600 초 동안 광조사 시.

ER-Ir-O에 의한 산화반응과 깊이 연관된 다양한 단백질의 검출을 위한 오비트랩 질량분석

본 발명자들은 ROS가 발생함에 따라 Ir(III) 착물이 세포 내 단백질을 산화시키는지 알아보기 위해 오비트랩을 통하여 분석을 하였다. 실험군으로는 세포에 Ir(III) 착물을 처리한 후, 빛을 쬐어주었고; 대조군으로는 세포에 Ir(III) 착물을 넣지 않거나, 빛을 쬐어주지 않거나, 둘 다 하지 않은 3가지 경우로 진행하였다. Group I은 실험군에서만 산화가 검출된 세포를 모은 그룹이며, Group II는 실험군과 대조군 두 경우 모두에서 산화가 검출된 세포를 모은 그룹이며, 마지막으로 Group III는 대조군에서만 산화가 검출된 세포를 모은 그룹이다. 오비트랩 질량분석에서 세포 내 총 단백질 (total protein) 중 산화된 단백질만을 검출해 내기 위하여 델타 질량 (delta mass) 값을 주어 분석을 하였고, 그 결과 20 가지 아미노산들 중 실험군의 일산화 메티오닌 (mono-oxidzed methionine) 아미노산이 대조군에 비해 많이 발견되었다. 실험군은 총 3번 반복된 샘플로 진행하였고, 그 결과 101개의 단백질이 대조군에 비해 추가적으로 더 산화된 것으로 확인되었다. 그 중 43개의 단백질이 미토콘드리아에 분포하였고, 20개의 단백질이 소포체에 분포하였다 (도 9). 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 실시예에서 제조된 이리듐 착물이 소포체에 위치하고 있다는 결과를 통해, 소포체에 분포하는 단백질이 많이 산화된 이유를 알 수 있으며; 또한 도 2의 a 내지 d와 마찬가지로, 미토콘드리아 단백질의 경우에는 미토콘드리아와 소포체가 가까이서 상호작용 한다는 기존 연구 결과로 뒷받침 할 수 있다. 위와 같은 결과를 통해 많은 미토콘드리아와 소포체에 있는 중요한 단백질들이 산화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 산화과정이 계속하여 반복되게 되면 단백질들은 구조적으로 변형이 일어나기 때문에 제 기능을 하지 못하게 된다. 이러한 사실은 Ir(III) 착물이 세포를 죽이는 것을 뒷받침하게 된다. 또한 단백질 자료 은행 (PDB, protein data bank)에서 얻은 단백질의 크리스탈 구조 (crystal structure)를 통해 산화된 위치를 확인하였고, 주로 단백질의 표면에서 산화가 일어난 것을 확인할 수 있엇다.

또한, 본 발명자들은 광-가교의 기초가 되는 단백질 변형 반응 경로 및 단백질 산화반응의 결과를 제시한다 (도 10: 도 10의 a는 Ir(III) 착물의 촉매적 성질로부터의 전자전달에 의한 광-가교 메카니즘임; b는 설파이트와 설폰 산화된 작용기로 변환되는 메티오닌 잔기의 산화반응에 의한 다른 광-가교 메카니즘임). 단백질 응집은 산화된 상태의 이리듐 착물 (예를 들어, Ir(IV) 착물) 및 티로신 잔기의 오르토-위치 사이의 촉매적 1 전자 공정에 의해 개시된 높은 수준의 가교에 의해 유도되었다. 이러한 단백질 기능장애에 대한 두 개의 명백한 경로는 이리듐 기반의 화학 시약의 가능성을 보이는 뛰어난 PDT 효능을 증명한다.

세포 독성

도 11을 참조하면, 이리듐 착물에 배위된 음이온의 종류에 따라 세포 독성에 차이가 있음을 확인할 수 있으며, PF₆ ^- 음이온이 배위되어 있는 이리듐 착물에 비해 본 실시예에서 제조된 화합물들과 같이 Cl^- 양이온이 배위된 이리듐 착물을 처리했을 때 세포의 생존율이 더 높다는 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예에서 제조된 이리듐 착물은 빛이 없는 조건에서 세포 독성이 거의 없으며, 빛을 쪼여줄 경우에만 광화학적 가교반응에 기초한 세포 사멸을 유도할 수 있으므로, 세포막 내로 이리듐 착물을 투과시킬 때는 빛을 차단하여 세포 독성을 최소화하고, 이리듐 착물이 암세포 내에 흡수된 후에는 국소적인 빛을 가하여 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.

종합해보면, 본 실시예에 따른 화학식 7 내지 10의 화합물인 이리듐 착물이 생체 내에 존재하는 단백질에 대해서 광화학적 가교결합을 일으킬 경우, 앞서 서술한 것처럼 이리듐에 의해 활성화된 산소 (ROS)의 작용과 빛에 의해 활성화된 이리듐 착물의 촉매적 작용, 이 두 가지의 동시다발적인 작용이 광화학적 가교에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 가교결합이 이루어지는 부분은 단백질의 타이로신 잔기가 주된 부분이고, 그 이외에도 시스테인 잔기도 친핵체로서 작용하여 반응에 참여할 수 있는 것으로 확인되었으며, 본 실시예에 따른 이리듐 착물은 Cl^- 음이온이 결합되어 있어 세포 독성이 거의 없으므로 살아있는 세포 내 적용이 가능하다.

ROS 생성, 긴 수명 및 양자효율에 대해 훌륭한 성질을 갖는 이리듐 기반의 인광성 Ir(III) 착물은, 최초로 PDT에 적용될 수 있을 것으로 예상된다. 특히, 세포 사멸을 위한 중요한 네트워크를 가지는 ER 및 미토콘드리아의 주위의 단백질들이 본 발명의 일 실시예에 따른 Ir(III) 착물에 의해 가교 및 산화되기 때문에, ER에 대한 타겟팅 모션이 Ir(III) 기반의 PDT에 효율적임을 알 수 있다. 또한, 인-시추 2-광자 적용은 이리듐 기반의 항암제로의 적용에 대한 유효 가능성을 보여주었다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1, 11 또는 12로서 표시되는 사이클로메탈화 전이금속 착물을 포함하는, 항암용 약학 조성물:
[화학식 1]

[화학식 11]

[화학식 12]

상기 화학식 1, 11 및 12에서,
M은 이리듐 또는 로듐이고,
R¹ 내지 R¹⁶는, 각각 독립적으로, F, Cl, Br, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 하나임.
제 1 항에 있어서,
상기 M은 이리듐인 것을 특징으로 하는, 항암용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
소포체를 타겟으로 하는, 항암용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물이 단백질 내에서 광화학적 가교결합을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 항암용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 광화학적 가교결합은 단백질의 친핵성 아미노산 잔기들 사이에 진행되는 것인, 항암용 약학 조성물.