KR101738137B1

KR101738137B1 - 과산화효소를 이용한 세포 내 단백질 위치 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101738137B1
Application number: KR1020140179814A
Authority: KR
Inventors: 이현우; 이송이
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2017-05-19
Also published as: KR20160071960A

Abstract

본 발명은 세포 내 목적 단백질의 위치를 확인하는 신규한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게, 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; 및 상기 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 세포 소기관 내 단백질 패턴을 비교하는 단계를 포함하는, 세포 내 목적 단백질의 위치 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

과산화효소를 이용한 세포 내 단백질 위치 정보 제공 방법 {Method for providing information of protein location using peroxidase}

사람 세포에는 18,000여가지의 단백질이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 최근 세포생물학자들의 광학이미징 연구를 통하여 18,000여가지의 단백질들은 서로 다른 세포 소기관에 분포되어 있을 것이라고 밝혀지고 있다.

하지만, 광학이미징을 통한 공간정보는 220nm 의 레졸루션(resolution) 한계로 인하여 이 보다 작은 공간에 대해서는 정확히 단백질이 어디에 존재하는지 밝혀내기 힘든 경우가 많다. 일례로 세포 내 소기관인 미토콘드리아의 경우, 미토콘드리아는 미토콘드리아 내막(Inner mitochondria membrane)과 미토콘드리아 외막(Outer mitochondria membrane)의 두 개의 막 구조로 인하여 각 막에 의해서 또 구분이 되는 세포 소기관 내의 세부 공간(Sub-mitochondrial compartment)를 갖게 된다. 구체적으로 미토콘드리아 내막 안의 공간을 미토콘드리아 기질 (Mitochondrial Matrix) 이라고 부르며 내막과 외막 사이의 공간을 미토콘드리아 이중막 사이 공간(Intermembrane Space of Mitochondria, IMS) 이라고 부른다. 하지만 미토콘드리아의 두께가 50nm정도이기 때문에 광학현미경으로는 특정 단백질이 미토콘드리아의 matrix와 IMS 중 어디에 존재하는지 판단하기 어려운 문제가 있다.

이를 보다 정확히 판단하기 위해서는 광학현미경보다 레졸루션이 좋은 전자현미경을 이용하면 보다 특정 단백질이 미토콘드리아의 어느 세부공간에 존재하는지 알아낼 수 있지만, 이는 전자현미경이라고 하는 고가의 기기를 사용해야 할 뿐만이 아니라 전자현미경 시료 채취, 전자현미경 작동에 관한 매우 복잡한 과정을 수행할 수 있는 노련한 기술자가 필요하기 때문에 모든 과학자들이 쉽게 적용할 수 있는 기술이라고 볼 수 없는 한계점이 있어, 보다 용이하게 세포 내 단백질의 위치를 판단할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

관련 선행문헌으로는, 단백질 코팅된 금속 나노입자를 이용하여 단세포 내 흡수된 단백질의 질량과 위치를 측정하는 방법 및 장치(국내공개특허 제2013-0052995호)가 있으나, 결국 현미경 기술을 이용하여 단백질의 위치를 측정하는 기술이라는 점에서 기존의 기술의 한계를 극복하지 못하였다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 현대 생물학 실험을 수행하는 거의 모든 실험실에서는 쉽게 수행할 수 있는 젤 전기영동기법을 이용하여 특정 단백질이 세포에 어느 위치에 존재하고 있는지를 세포 소기관 및 세포 소기관 하위 세부공간까지 정확하게 맵핑할 수 있는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 세포 내 목적 단백질의 위치를 확인하는 신규한 방법을 제공하는 것으로, 보다 상세하게, (a) 목적 단백질 및 과산화효소(peroxidase)를 세포에 도입하는 단계, 상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계, 상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하는 단계, 상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키는 단계, 및 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; (b) 세포 소기관 내에 과산화효소를 도입하는 단계, 상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계, 상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하는 단계, 상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키는 단계, 및 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함하는, 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계에서 확인한 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 (b) 단계에서 확인한 세포 소기관 내 단백질 패턴을 비교하는 단계를 포함하는, 세포 내 목적 단백질의 위치 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 일예로, (a) 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; (b) 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계에서 확인한 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 (b) 단계에서 확인한 세포 소기관 내 단백질 패턴을 비교하는 단계를 포함하는, 세포 내 목적 단백질의 위치 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

상기 (a) 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계는, 목적 단백질 및 과산화효소를 세포에 도입하는 단계, 상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계, 상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하는 단계, 상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키는 단계, 및 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "목적 단백질"이란, 세포 내의 위치를 확인하고자 하는 단백질을 의미하는 것으로, 세포 내 존재하는 모든 단백질이 그 대상이 될 수 있다. 목적 단백질의 세포 내 위치를 확인하는 것은, 목적 단백질이 존재하는 세포소기관이 무엇인지를 확인하는 것, 또는 목적 단백질이 존재하는 세포소기관 내 하위 세부공간이 어디인지를 확인하는 것을 포함하는 개념이다.

본 발명에서는 목적 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여, 과산화효소를 세포에 도입하는 것을 특징으로 한다. 상기 과산화효소는 과산화수소 또는 유기과산화물에 의한 전자 공여체의 산화반응을 촉매하는 효소로, 페놀, 아스코르브산, 글루타티온, 시토크롬 등을 산화할 수 있다. 본 발명에 있어서, 과산화효소는 예를 들어, 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소(Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소(Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소(Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1(Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM(Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소(Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소(Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2(Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소 등일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 아스코르베이트를 기질로 하여 과산화수소를 탈수화하는 효소로서, 야생형의 아스코르베이트 과산화효소(ascorbate peroxidase)에 비하여 페녹시 라디칼(phenoxyl radical)을 생성하는 능력이 우수하도록 조작된 아스코르베이트 과산화효소로서, 본 발명에 적용되는 과산화효소로서 바람직하다.

구체적으로, 야생형의 아스코르베이트 과산화효소의 아미노산 서열을 일부 변이시킨 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 야생형의 아스코르베이트 과산화효소의 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 라이신이(lysine)이 아스파르트산(aspartic acid)로 변이(K14D)되고, 41번째 아미노산인 트립토판(tryptophan)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이되고(W41F), 112번째 아미노산인 글루탐산(glutamic acid)이 라이신으로 변이된 것이다. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 야생형의 아스코르베이트 과산화효소의 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 라이신이(lysine)이 아스파르트산(aspartic acid)로 변이(K14D)되고, 41번째 아미노산인 트립토판(tryptophan)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이되고(W41F), 112번째 아미노산인 글루탐산(glutamic acid)이 라이신으로 변이되고 134번째 알라닌(alanine)이 프롤린(proline)으로 변이된 것이다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아스코르베이트 과산화효소는 서열번호 2의 염기 서열에 의하여 코딩되고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 아스코르베이트 과산화효소는 서열번호 4의 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

또한, 야생형의 아스코르베이트 과산화효소는 이합체(dimer)로 존재하는 거에 비하여, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 아스코르베이트 과산화효소는 단량체(monomer)로 존재하는 특징이 있다.

본 발명에서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 호스라디쉬 과산화효소(Horseradish Peroxidase, HRP)이다. 상기 호스라디쉬 과산화효소는 산화 환경을 갖춘 분비 경로(Secretory Pathway)에서 활성을 나타내는 것으로, 본 발명에서는 자연적으로 산화환경이 조성되어있는 분비 경로상의 세포 내 공간인 소포체나 골지체 등에서 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 이루어진 아스코르베이트 과산화효소와 동일한 효과를 낼 수 있다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 호스라디쉬 과산화효소는 서열번호 6의 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 과산화효소를 세포에 도입하고 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하면, 세포 안에서 발현된 상기 효소의 작용으로 비오틴이 결합된 페놀류가 비오틴이 결합된 페녹시 라디칼(biotin-phenoxyl radical)로 전환되고, 상기 비오틴이 결합된 페녹시 라디칼은 반경 약 20 내지 50nm 내에 존재하는 단백질들의 표면에 존재하는 타이로신(tyrosine)기와 공유결합을 형성함으로써 상기 단백질들에 비오틴(biotin)이 결합하게 된다. 또한, 생성된 비오틴이 결합된 페녹시 라디칼은 인지질 막을 건널 수 없을만큼 짧은 시간 동안만 존재하기 때문에, 막으로 둘러싸인 각각의 세포 소기관내에서 비오틴이 결합된 페녹시 라디칼이 생성되는 경우 각 세포 소기관내의 고유의 단백질들에만 비오틴이 결합할 수 있게 된다.

상기 비오틴이 결합된 페놀류 화합물은, 예를 들어, 비오틴이 결합된 페놀(Biotin-phenol)일 수 있다.

각 세포 소기관에는 고유의 단백질체가 존재하기 때문에, 상기와 같이 비오틴이 결합되는 단백질들은 세포 소기관 마다 상이하게 되고, 이를 웨스턴 블랏에 적용하는 경우 각 세포 소기관마다 서로 다른 단백질 밴드 패턴을 나타내게 될 수 있다.

단백질 패턴을 확인하기 위한 웨스턴 블랏의 첫번째 단계는, 단백질 시료를 수득하는 것이다. 이를 위하여, 상술한 바와 같이 목적 단백질과 함께 또는 목적 단백질 없이 과산화효소가 도입된 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하여 세포소기관 내 고유의 단백질들에 비오틴을 표지한 이후에, 상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득할 수 있다. 상기 세포 파쇄물은 통상적인 방법으로, 예컨대 세포에 lysis buffer 를 처리하여 파쇄한 후, 원심분리하여 단백질이 포함된 분획(예컨대, 상층액)을 수득한 후 이를 웨스턴 블랏을 위한 단백질 시료로 사용할 수 있다.

다음으로, 상기 시료에 젤 전기영동을 적용하여 시료 내 단백질들을 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게, 상기 젤 전기영동은 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)일 수 있고, 이를 통해 각 세포 소기관 마다 존재하는 고유의 단백질들이 크기별로 분리될 수 있다. 젤 안에 분리된 단백질들은 단백질 이전용 막에 이전시킨 후 패턴을 확인할 수 있다.

단백질 이전용 막은, 예를 들어, 니트로셀룰로스 막, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 또는 나일론 막일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다음으로, 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하여 확인할 수 있다.

비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 방법으로는, 일예로, 비오틴과 스트렙타아비딘이 결합하는 성질을 이용하는 것으로, 예컨대 호스라디쉬 과산화효소가 표지된 스트렙타아비딘 (streptavidin-Horseradishperoxidase, Streptavidin-HRP)을 처리하여, 비오틴이 결합된 단백질에 호스라디쉬 과산화효소가 표지된 스트렙타아비딘을 결합시킬 수 있다. 여기에, 호스라디쉬 과산화효소의 발색 기질을 처리하면 호스라디쉬 과산화효소와 기질 간의 발색 반응을 통하여 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 독특한 단백질 패턴을 이미지화할 수 있다. 이러한 발색 기질로는, 예를 들어, 3,3'-디아미노벤지딘(DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(ABTS), o-페닐렌디아민(OPD), 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC), 5-아미노살리실산(5-AS), 4-클로로-1-나프톨, o-디아니시딘(ODIA), 또는 3,3-디메톡시벤지딘 포함 용액 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이렇게 Streptavidin-HRP에 의해서 현상된 각기 다른 세포 소기관의 비오틴이 결합된 단백질 패턴은 마치 슈퍼마켓에 물건에 붙은 바코드와 같이 고유의 패턴을 나타내게 되고, 이와 같은 방법을 통하여, 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 고유의 단백질 패턴을 확인하는 것이 가능하다.

비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 방법의 다른 예는, 전기영동 후 막으로 이전시킨 단백질들에 대하여 비오틴에 결합하는 1차 항체 및 상기 1차 항체에 결합하며 호스라디쉬 과산화효소가 표지된 2차 항체를 처리하는 것으로, 여기에 호스라디쉬 과산화효소의 발색 기질을 처리하면 호스라디쉬 과산화효소와 기질 간의 발색 반응을 통하여 비오틴이 결합된 단백질들의 패턴을 이미지화할 수 있다.

또한, 상기 (b) 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계는 (a) 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계와 유사하게 수행할 수 있는데, 구체적으로, 세포 소기관 내에 과산화효소를 도입하는 단계, 상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계, 상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하는 단계, 상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키는 단계, 및 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "세포 소기관(organelle)"이란, 세포의 내부에 존재하며 세포의 여러 가지 기능을 분업으로 하고 있는 구조단위를 의미한다. 바람직하게, 본 발명에 있어서 세포 소기관은 세포 내막에 싸인 구조체로, 다른 공간과는 구획한 세포 내 구획을 형성하고 있으며 고유의 미세환경을 갖는 소기관을 의미한다. 이러한 세포 소기관은 고유의 기능을 가지며, 예를 들어, 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질, 골지체, 리소솜, 파고솜, 퍼옥시솜 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 식물세포의 경우 엽록체, 액포 등을 포함할 수 있다.

일 구현예로, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 비오틴이 결합된 페놀류 화합물을 처리하는 것은, 비오틴이 결합된 페놀류 화합물을 0.1 uM 내지 1mM 로 처리하고 10분 내지 60분 동안 수행하는 것일 수 있다.

또 다른 구현예로, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 과산화수소를 처리하는 것은, 과산화수소를 0.1mM 내지 2mM로 처리하고 1분 내지 10분 동안 수행하는 것일 수 있다.

본 발명은, 상기 (a) 단계에서 확인한 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 (b) 단계에서 확인한 세포 소기관 내 단백질 패턴을 비교하여 세포 내 목적 단백질의 위치 정보를 알 수 있다.

상기 설명한 바와 같이, 각 세포 소기관에는 고유의 단백질체가 존재하고, 그에 따라 각기 다른 세포 소기관에서 본 발명의 효소에서 비롯된 비오틴이 결합된 단백질 패턴은 고유의 패턴을 나타내게 되므로, 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 각 세포 소기관 내 고유의 단백질 패턴을 비교하여 목적 단백질이 어느 세포 소기관에 위치하고 있는지 알 수 있다.

예를 들어, 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 가장 유사한 세포 소기관 내 단백질 패턴을 나타내는 세포 소기관에 목적 단백질이 위치하는 것으로 결정할 수 있다. 본 발명의 일예에서는, 이러한 방법을 통하여 TRMT61B 단백질이 미토콘드리아 기질공간 (mitochondrial matrix)에 존재하는 단백질임을 명확하게 확인하였다(실험결과 2 및 도 2).

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 제한이 없고, 모든 동물 세포, 식물 세포, 미생물 등을 포함할 수 있다. 예를 들어,형질 감염(transfection)이 가능한 동물 세포(mammalian cell)일 수 있다. 구체적인 예로, 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막세포, 말초혈액단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 동물 세포는 신장세포(hek293T 세포, hek293 세포 등), 암 세포(hela 세포 등), 원숭이 콩팥 세포(Cos-7 세포 등), 골육종 세포(U2OS 세포 등), 피부세포(NIH3T3 세포 등), 난소 세포(CHO 세포 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 각 세포 소기관은 고유의 단백질체를 갖고 있고, 그에 따라 과산화효소에 의하여 비오틴이 결합된 단백질들을 젤 전기영동하는 경우 세포 소기관 마다 고유의 패턴을 나타낸다는 것을 기반으로, 기존의 접근이 어려운 전자 현미경을 통하여 확인하였던 세포 내 단백질의 위치 정보를 대부분의 생물 실험실에서 수행할 수 있는 전기영동 기법을 통하여 목적 단백질이 세포의 어느 공간에 위치하고 있는지 손쉽고 정확하게 확인할 수 있고, 이러한 단백질의 세포 내 공간 정보는 생명공학기술, 질병진단, 프로테오믹스, 의약품 스크리닝, 단백질 제재 의약품 개발 등에 다양하게 응용되고 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 각각 세포 소기관에 발현시켰을 때 각각 다른 고유의 단백질 패턴을 생성해냄을 보여주고 있다. "cytosol"은 세포질, "nuclear"는 세포 핵, "mito"는 미토콘드리아, "ER"은 소포체(endoplasmic reticulum), "Golgi"는 골지체를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 TRMT61B 단백질에 달았을 때 생성시키는 단백질 패턴을 나타낸다. 제일 왼쪽 lane은 사이즈 marker, "TRMT61B"는 TRMT61B 단백질이 존재하는 세포 소기관에서의 단백질 패턴, "Mitomatrix"는 미토콘드리아 기질에 존재하는 단백질 패턴, "Sco1(IMS)"는 미토콘드리아 이중막사이공간에 존재하는 단백질 패턴, "Tom20(OMM)"는 미토콘드리아 외막에 존재하는 단백질 패턴, "Untransfect"는 형질감염되지 않은 세포가 만들어내는 단배질 패턴을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 APEX로 명명하고, APEX는 미국 addgene에서 구입하여 사용하였다(www.addgene.org).

실시예 1. APEX 을 이용한 세포 소기관의 단백질 패턴 확인

ATCC에서 구입한 HEK293T 세포(cell)를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)이 함유된 MEM(Minimum Essential Medium) 배지(media)에 36℃로 16 내지 24시간동안 CO₂ incubator 에서 배양하였다.

각기 다른 세포 소기관(예. 미토콘드리아 기질 공간(mitochondria matrix), 미토콘드리아 이중막 사이 공간(Intermembrane Space of Mitochondrial, IMS), 미토콘드리아의 외막 공간(outer mitochondrial membrane, OMM), 소포체, 핵, 세포질, 골지체 등)에 APEX를 도입하기 위하여, 각 세포 소기관으로 타겟팅하는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자와 APEX의 유전자 서열이 연결된 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 벡터를 리포펙타민(Lipofectamine) transfection reagent를 사용하여 상기 배양된 HEK293T 세포에 도입시켰다. 상기 벡터는 타겟팅하고자 하는 세포 소기관에 따라 다르게 사용하였으며, 본 발명에서 사용한 벡터들의 구성 및 특징을 아래 표 1에 정리하였다.

플라스미드	특징	Promoter / Vector	세부사항
mito - APEX	NotI-mito-BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI 미토콘드리아 기질 발현	CMV/pCDNA3	mito matrix targeting sequence: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH V5: GKPIPNPLLGLDST
APEX - NES	NotI-Flag-APEX-NES-Stop-XhoI 세포질 발현	CMV/pCDNA3	NES: LQLPPLERLTLD
IMS - APEX	NotI-LACTB_(1-68)-BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI 미토콘드리아 이중 막 사이 공간 발현	CMV/pCDNA3	LACTB_(1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
APEX - NLS	NotI-Flag-APEX-EcoRI-NLS-Stop-XhoI 핵 발현	CMV/pCDNA3	NLS: PKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV
APEX - TM	EcoRI-ss-HA-ApaI-APEX-SacII-myc-TM-Stop-NotI 세포외막 발현	CMV/pDisplay	ss: Igk chain signal sequence in pDisplay (Invitrogen). HA: YPYDVPDYA myc: EQKLISEEDL TM: transmembrane domain of PDGF receptor from pDisplay (Invitrogen)
APEX - KDEL	EcoRI-ss-BglII-APEX-V5-KDEL-Stop-NotI 소포체 내막 발현	CMV/pDisplay	KDEL: ER retention motif
C1 _(1-29) - APEX	HindIII-C1_(1-29)-NotI-APEX-V5-Stop-XhoI 소포체 외막 발현	CMV/pCDNA3	C1_(1-29):MDPVVVLGLCLSCLLLLSLWKQSYGGGKL (endoplasmic reticulum membrane anchor)
^W41A APX - CAAX	NotI -Flag- ^W41AAPX- EcoRI -CAAX-Stop- XhoI 세포내막 발현	CMV/pCDNA3	CAAX: RSKLNPPDESGPGCMSCKCVLS
HRP - TM	EcoRI-ss-HA-ApaI-HRP-SacII-myc-TM-Stop-NotI 세포외막 발현	CMV/pDisplay	The HRP gene was a gift from Frances Arnold (Caltech)
HRP - KDEL	EcoRI-ss-BglII-HRP-V5-KDEL-Stop-NotI 소포체 내막 발현	CMV/pDisplay

APEX를 HEK293T 세포에 도입시키고 12 내지 24 시간 후, Biotin-phenol을 500uM의 농도로 하여 37℃에서 30분동안 incubation하였다. 그 후, H₂O₂를 1mM의 농도가 되도록 넣고, 1분후 quencher용액이 들어있는 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3번 씻어주었다. DPBS로 1500g에서 5분간 원심분리 하여 세포 pellet을 걷은 후, 상층액(Supernatant)은 버리고, Protease inhibitor cocktail과 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), quencher solution이 첨가된 RIPA(radio immunoprecipitation assay) lysis buffer로 세포를 모두 용해(lysis)하였다. 그 후, 20,000 RPM 에서 4℃로 10분간 원심부리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액 중의 10ul는 SDS-PAGE gel에 loading 한 후 150V에서 1시간가량 내려주었다. 나이트로셀룰로스 막(Nitrocellulose membrane)에 transfer한 후, ponceau staining을 통해 전체 단백질 양을 확인하였다. TBST용액으로 ponceau를 제거하고, 2%의 투석(dialysis)된 BSA 용액으로 1시간동안 상온에서 교반하였다. 이 후, 2%의 투석된 BSA 용액에 Streptavidin-Horseradishperoxidase (SA-HRP) 를 10000:1로 희석하여 1시간동안 상온에서 교반하였다. 1번당 5분씩 총 4회 TBST로 membrane을 씻어주었다. Developing solution (Biorad사의 Clarity ECL 제품)으로 developing을 한 후, GE-LAS 4000을 이용하여 이미징하고 SA-HRP 패턴을 관찰 및 기록하였다. 이렇게 기록된 SA-HRP pattern은 후에 특정단백질에 달린 APEX가 만들어내는 패턴을 비교할 수 있는 중요한 Standard pattern으로 작용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. APEX 을 이용한 목적 단백질이 발현된 세포 소기관의 단백질 패턴 확인

ATCC에서 구입한 HEK293T 세포를 소태아혈청이 함유된 MEM 배지에 36℃로 16 내지 24시간동안 CO₂ incubator 에서 배양하였다.

상기 배양된 HEK293T 세포에 리포펙타민 transfection reagent를 사용하여 목적 단백질인 TRMT61B(mitochondrial tRNA (adenine(58)-N(1))-methyltransferase)의 유전자 서열 후에 APEX 유전자 서열이 연결된 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 벡터를 도입시켰다.

상기 벡터는 다음과 같은 방법에 따라 제작하였다. 우선, TRMT61B(목적 단백질) 주형 유전자를 PCR을 통하여 100배 이상 증폭시킨 이후에 NotI과 NheI 이라는 제한효소(New England biolab에서 구입)를 각각 1ul씩 사용하여 37℃에서 1시간동안 증폭된 유전자 DNA(~1ug)의 양끝을 digestion한 이후에 역시 같은 효소로서 37℃에서 한 시간 digestion한 APEX가 삽입되어있는 벡터와 섞은 후에 T4 DNA ligase(New England biolab에서 구입)를 1ul씩 처리하여 실온에서 1시간 ligation 반응을 수행하였다. 이후에 Top10 E. coli cell (Invitrogen에서 구입)에 42℃에서 40초간 heat shot transformation을 시킨 후 Ampicilin-Agar plate에서 밤 새 배양(overnight incubation)하여 해당 벡터를 함유하고 있는 콜로니만 분리하여 플라스미드 DNA를 추출함으로서 TRMT61B-APEX 플라스미드 DNA를 얻었다. 이와 같이 제조된 TRMT61B-APEX 플라스미드 DNA를 서열번호 7에 나타내었다.

상기 제조된 벡터를 세포에 도입시키고 12 내지 24 시간 후, Biotin-phenol을 500uM의 농도로 하여 37℃에서 30분동안 incubation하였다. 그 후, H₂O₂를 1mM의 농도가 되도록 넣고, 1분후 quencher용액이 들어있는 DPBS로 3번 씻어주었다. DPBS로 1500g에서 5분간 원심분리 하여 세포 pellet을 걷은 후, 상층액은 버리고, Protease inhibitor cocktail과 PMSF, quencher solution이 첨가된 RIPA lysis buffer로 세포를 모두 용해(lysis)하였다. 그 후, 20,000 RPM 에서 4℃로 10분간 원심부리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액 중의 10ul는 SDS-PAGE gel에 loading 한 후 150V에서 1시간가량 내려주었다. 나이트로셀룰로스 막에 transfer한 후, ponceau staining을 통해 전체 단백질 양을 확인하였다. TBST용액으로 ponceau를 제거하고, 2%의 투석(dialysis)된 BSA 용액으로 1시간동안 상온에서 교반하였다. 이 후, 2%의 투석된 BSA 용액에 Streptavidin-Horseradishperoxidase (SA-HRP) 를 10000:1로 희석하여 1시간동안 상온에서 교반하였다. 1번당 5분씩 총 4회 TBST로 membrane을 씻어주었다. Developing solution (Biorad사의 Clarity ECL 제품)으로 developing을 한 후, GE-LAS 4000을 이용하여 이미징하고 SA-HRP 패턴을 관찰 및 기록하였다.

실험결과 1. APEX 을 이용한 서로 다른 세포소기관 단백질체 패턴의 상이성 확인

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 서로 다른 세포 소기관에 발현된 APEX가 생성한 비오틴이 결합된 단백질의 상이한 패턴을 Western blot상에서 확인할 수 있었다. 각 패턴은 후에 공간정보가 알려져있지 않은 단백질에 APEX가 만들어내는 패턴의 중요한 대조군 샘플로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실험결과 2. APEX 을 이용한 특정 단백질의 세포소기관 내 공간위치 정보 확인

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, TRMT51B-APEX 가 생성한 비오틴이 결합된 단백질의 패턴을 Western blot상에서 확인할 수 있었고 이 패턴이 Sco1-APEX 라고 하는 미토콘드리아 이중막사이공간에 발현된 APEX가 만들어내는 패턴보다 Mito-APEX라고 하는 미토콘드리아 기질에서 발현된 APEX가 만들어내는 패턴에 훨씬 가깝기 때문에 TRMT61B는 미토콘드리아 기질 공간에 존재하는 단백질임을 입증하였다.

이와 같이, 본 발명에서는 세포 내에서 목적 단백질이 발현되는 공간을 전기영동을 통하여 간단하면서도 구체적으로 확인할 수 있음을 입증하였다.

<110> UNIST ACADEMY-INDUSTRY RESEARCH CORPORATION <120> Method for providing information of protein location using peroxidase <130> DPP20146250KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase(APEX) <400> 1 Met Gly Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Ala Asp Tyr Gln Asp Ala Val 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Gly Phe Ile Ala Glu Lys Arg Cys 20 25 30 Ala Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Phe His Ser Ala Gly Thr Phe Asp 35 40 45 Lys Gly Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Ile Lys His Pro Ala 50 55 60 Glu Leu Ala His Ser Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Leu 65 70 75 80 Leu Glu Pro Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp Phe 85 90 95 Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Lys 100 105 110 Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Pro Glu 115 120 125 Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp Val 130 135 140 Phe Gly Lys Ala Met Gly Leu Thr Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu Ser 145 150 155 160 Gly Gly His Thr Ile Gly Ala Ala His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu 165 170 175 Gly Pro Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Thr 180 185 190 Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp 195 200 205 Lys Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Asp Lys Tyr 210 215 220 Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Gln 225 230 235 240 Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala 245 250 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase(APEX) <400> 2 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 aagaagctca gaggcttcat cgctgagaag agatgcgctc ctctaatgct ccgtttggca 120 ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatg ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 3 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 3 Met Gly Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Ala Asp Tyr Gln Asp Ala Val 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Gly Phe Ile Ala Glu Lys Arg Cys 20 25 30 Ala Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Phe His Ser Ala Gly Thr Phe Asp 35 40 45 Lys Gly Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Ile Lys His Pro Ala 50 55 60 Glu Leu Ala His Ser Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Leu 65 70 75 80 Leu Glu Pro Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp Phe 85 90 95 Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Lys 100 105 110 Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Pro Glu 115 120 125 Gly Arg Leu Pro Asp Pro Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp Val 130 135 140 Phe Gly Lys Ala Met Gly Leu Thr Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu Ser 145 150 155 160 Gly Gly His Thr Ile Gly Ala Ala His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu 165 170 175 Gly Pro Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Thr 180 185 190 Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp 195 200 205 Lys Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Asp Lys Tyr 210 215 220 Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Gln 225 230 235 240 Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala 245 250 <210> 4 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 4 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 aagaagctca gaggcttcat cgctgagaag agatgcgctc ctctaatgct ccgtttggca 120 ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatc ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 5 <211> 309 <212> PRT <213> Horseradish peroxidase <400> 5 Met Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser 1 5 10 15 Asn Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg 20 25 30 Ile Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn 35 40 45 Gly Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr 50 55 60 Glu Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val 65 70 75 80 Ile Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val 85 90 95 Ser Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu 100 105 110 Ala Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu 115 120 125 Gln Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe 130 135 140 Thr Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg 145 150 155 160 Ser Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn 165 170 175 Gln Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly 180 185 190 Leu Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly 195 200 205 Leu Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu 225 230 235 240 Gln Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn 245 250 255 Ala Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln 260 265 270 Thr Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile 275 280 285 Thr Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val 290 295 300 Val Asn Ser Asn Ser 305 <210> 6 <211> 927 <212> DNA <213> gene of Horseradish peroxidase <400> 6 atgcagttaa cccctacatt ctacgacaat agctgtccca acgtgtccaa catcgttcgc 60 gacacaatcg tcaacgagct cagatccgat cccaggatcg ctgcttcaat attacgtctg 120 cacttccatg actgcttcgt gaatggttgc gacgctagca tattactgga caacaccacc 180 agtttccgca ctgaaaagga tgcattcggg aacgctaaca gcgccagggg ctttccagtg 240 atcgatcgca tgaaggctgc cgttgagtca gcatgcccac gaacagtcag ttgtgcagac 300 ctgctgacta tagctgcgca acagagcgtg actcttgcag gcggaccgtc ctggagagtg 360 ccgctcggtc gacgtgactc cctacaggca ttcctagatc tggccaacgc caacttgcct 420 gctccattct tcaccctgcc ccagctgaag gatagcttta gaaacgtggg tctgaatcgc 480 tcgagtgacc ttgtggctct gtccggagga cacacatttg gaaagaacca gtgtaggttc 540 atcatggata ggctctacaa tttcagcaac actgggttac ctgaccccac gctgaacact 600 acgtatctcc agacactgag aggcttgtgc ccactgaatg gcaacctcag tgcactagtg 660 gactttgatc tgcggacccc aaccatcttc gataacaagt actatgtgaa tctagaggag 720 cagaaaggcc tgatacagag tgatcaagaa ctgtttagca gtccaaacgc cactgacacc 780 atcccactgg tgagaagttt tgctaactct actcaaacct tctttaacgc cttcgtggaa 840 gccatggacc gtatgggtaa cattacccct ctgacgggta cccaaggcca gattcgtctg 900 aactgcagag tggtcaacag caactct 927 <210> 7 <211> 2241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRMT61B-APEX vector <400> 7 atgctaatgg catggtgccg cggtcctgtc ttgctgtgcc tgcggcaggg gctcggaacc 60 aattcattcc tgcacggcct ggggcaggag cccttcgagg gagctcggtc actgtgttgc 120 aggtcctcgc ctagagacct gcgagatgga gaaagagagc acgaggcggc acaaaggaaa 180 gccccaggag cagagtcttg cccatctctc cctctgagca tctcggacat tgggactgga 240 tgtctttcgt cactggaaaa cctcagactg ccgacgctgc gggaagagtc atcacctcga 300 gagctcgagg actcgagcgg agaccagggc cggtgcggtc ccacacacca gggatccgag 360 gatccttcga tgctctcgca ggcccagtcc gctaccgagg tcgaagagcg tcacgtctcc 420 ccttcttgtt caacttccag agagagaccc tttcaggctg gggagctgat tttagctgag 480 actggggagg gagaaacaaa atttaagaaa ttatttaggt tgaacaactt cggactctta 540 aatagtaact ggggggcagt cccgttcggc aagatcgtgg ggaagttccc cggccagata 600 ctgaggagtt ccttcggtaa gcagtacatg ctgaggaggc cagccttgga agactatgta 660 gtattgatga aaagagggac tgccataaca ttcccaaagg atattaatat gattctctca 720 atgatggata tcaacccagg tgatactgtt ttggaagctg gctcaggctc tggtggaatg 780 agcttatttt tatccaaagc agttggatca caaggacgag tcataagttt tgaggtacga 840 aaagaccacc atgatctggc taagaagaat tacaaacact ggcgtgattc atggaaatta 900 agtcatgtag aagagtggcc agacaatgtg gattttattc ataaggacat ttcaggagca 960 accgaagaca taaaatcttt aacatttgac gcagtagctt tggatatgtt aaatcctcat 1020 gttactttgc ctgtttttta cccacatctt aagcatggtg gtgtatgtgc tgtatatgta 1080 gtaaacatca cacaggttat tgaactttta gatggaattc gcacctgtga acttgctctt 1140 tcatgtgaaa agataagcga ggtcattgtc agagattggt tggtttgcct tgcaaaacag 1200 aaaaatggaa ttttagctca aaaagtagaa tctaaaatca acacagatgt acaactagat 1260 tctcaagaga aaattggagt taaaggtgag ctgtttcaag aggatgacca tgaagaatcg 1320 cattctgatt ttccatatgg atcatttccc tatgttgcta gaccagtaca ctggcaacct 1380 ggtcatacag cttttcttgt caagttgagg aaggtcaaac cacaacttaa caagctagca 1440 ggcaagccca tccccaaccc cctgctgggc ctggacagca ccggaaagtc ttacccaact 1500 gtgagtgctg attaccagga cgccgttgag aaggcgaaga agaagctcag aggcttcatc 1560 gctgagaaga gatgcgctcc tctaatgctc cgtttggcat tccactctgc tggaaccttt 1620 gacaagggca cgaagaccgg tggacccttc ggaaccatca agcaccctgc cgaactggct 1680 cacagcgcta acaacggtct tgacatcgct gttaggcttt tggagccact caaggcggag 1740 ttccctattt tgagctacgc cgatttctac cagttggctg gcgttgttgc cgttgaggtc 1800 acgggtggac ctaaggttcc attccaccct ggaagagagg acaagcctga gccaccacca 1860 gagggtcgct tgcccgatcc cactaagggt tctgaccatt tgagagatgt gtttggcaaa 1920 gctatggggc ttactgacca agatatcgtt gctctatctg ggggtcacac tattggagct 1980 gcacacaagg agcgttctgg atttgagggt ccctggacct ctaatcctct tattttcgac 2040 aactcatact tcacggagtt gttgagtggt gagaaggaag gtctccttca gctaccttct 2100 gacaaggctc ttttgtctga ccctgtattc cgccctctcg ttgataaata tgcagcggac 2160 gaagatgcct tctttgctga ttacgctgag gctcaccaaa agctttccga gcttgggttt 2220 gctgatgcct aatgactcga g 2241

Claims

(a) 세포 내의 위치를 확인하고자 하는 단백질인 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴을 확인하는 단계로서,
상기 단계는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자가 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제조하고,
상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하고,
상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하고,
상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하고,
상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키고, 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함하며,
(b) 각 세포 소기관별 단백질 패턴을 확인하는 단계로서,
상기 단계는
각 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자가 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제조하고,
상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하고,
상기 세포에 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 및 과산화수소를 처리하고,
상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하고,
상기 세포 파쇄물을 전기영동하여 단백질을 분리한 후 분리된 단백질들을 막으로 이전시키고, 상기 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴을 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계를 포함하며,
(c) 상기 단계(a)에서 얻어진 목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴과 단계(b) 에서 얻어진 각 세포 소기관별 단백질 패턴을 비교하는 단계, 및
(d) 상기 단계(a)와 단백질 패턴의 유사도가 가장 높은 세포 소기관에 목적 단백질이 위치하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는,
목적 단백질이 발현된 세포 소기관 내 단백질 패턴를 이용하여, 세포 내 목적 단백질의 위치 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)에서 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소(Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소(Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소(Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1(Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM(Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소(Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소(Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2(Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 소기관은 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질 및 골지체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)에서 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계는, 상기 막으로 이전된 단백질에 호스라디쉬 과산화효소가 표지된 스트렙타아비딘(streptavidin-Horseradish peroxidase)를 처리한 후 호스라디쉬 과산화효소의 발색기질을 처리하여 수행되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)에서 막으로 이전된 단백질들로부터 비오틴 표지를 검출하여 단백질 패턴을 이미지화하는 단계는, 비오틴에 결합하는 1차 항체, 및 상기 1차 항체에 결합하며 호스라디쉬 과산화효소가 표지된 2차 항체를 처리한 후 호스라디쉬 과산화효소의 발색기질을 처리하여 수행되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 비오틴이 결합된 페놀류 화합물 처리하는 것은, 비오틴이 결합된 페놀류 화합물을 0.1uM 내지 1 mM로 처리하고 10 내지 60분 동안 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 과산화수소를 처리하는 것은, 과산화수소를 0.1 내지 2mM로 처리하고 1 내지 10분 동안 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b) 각 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자에는 미토콘드리아 기질 발현 유전자, 세포질 발현 유전자, 미토콘드리아 이중막 사이 공간 발현 유전자, 핵 발현 유전자, 세포 외막 발현 유전자, 소포체 내막 발현 유전자, 소포체 외막 발현 유전자, 또는 세포 내막 발현 유전자인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막세포, 말초혈액단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포인, 방법.