KR101737476B1 - Method for estimating Post-mortem interval, strip and kit comprising same for estimating Post-mortem interval - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사후경과 시간 추정용 바이오마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 사후경과시간 추정용 키트와 이를 이용한 사후경과 시간 추정 방법 및 사후경과 시간 검출용 스트립에 관한 것이다. 본 발명의 상기 사후경과 시간 추정용 바이오 마커는 사후경과시간에 진행에 따라 발현수준이 감소(degradation)하는 효과가 있어, 사후경과 시간 추정용 키트, 사후경과 시간 추정 방법 및 사후경과 시간 추정용 스트립에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a kit for estimating a post-elapsed time including a mRNA of a biomarker gene for estimating a post-elapsed time or a protein expression level thereof, and a post-elapsed time estimation method and a post-elapsed time detection strip. The biomarker for estimating the post-elapsed time of the present invention has an effect of degrading the expression level as the post-elapsed time progresses. Therefore, the kit for estimating the post-elapsed time, the method of estimating the post-elapsed time, . ≪ / RTI >

Description

사후경과시간 추정방법, 스트립 및 이를 포함하는 키트{Method for estimating Post-mortem interval, strip and kit comprising same for estimating Post-mortem interval}[0001] The present invention relates to a post-mortem interval estimating method, a strip, and a kit including the same,

본 발명은 사후경과시간 추정방법, 스트립 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a post-elapsed time estimation method, a strip, and a kit including the same.

살인사건 수사에서 사후경과시간(Post-mortem interval, PMI)추정은 수사 대상 및 범위 설정 측면에서 가장 중요한 초동 수사 정보 중 하나이며, 간접적으로는 수사 기간, 수사관 투입 인원, 수사 예산 등에 영향을 미치는 요소이기도 하다.
Estimation of post-mortem interval (PMI) in the murder investigation is one of the most important primary investigation information in terms of investigation subject and scope setting. Indirectly, the factor affecting investigative period, investigator input, It is also.

수많은 법의학자들이 과거 1세기 이상 이에 대한 연구를 계속하여 왔으나 아직 사후경과시간을 결정할 수 있는 정확한 방법이 소개되지 않고 있으며, 아직도 법의학 분야의 커다란 과제로 남아있는 실정이다. 따라서 사후경과시간은 아직도 ‘추정한다’고 이야기하고 있으며, 이 사후경과시간의 추정을 위해 여러 가지 방법이 연구되고 사용되어 왔다.
Numerous forensic scientists have been studying this for more than a century, but there is no accurate way to determine the elapsed time, and it remains a major challenge for forensic science. Therefore, the post-elapsed time is still 'estimating', and various methods have been studied and used to estimate the post-elapsed time.

일반적으로 사후경과시간의 추정은 사람이 사망한 후 보이는 여러 가지 시체현상, 즉 사후 시체의 체온하강 정도, 시체 강직의 발현 여부, 시반(혈액 침하), 위 내용물의 소화상태, 부패의 진행 정도 등이 보편적으로 사용되어 왔으며, 이 이외에도 사후 1일 내지 2일 내에 사용할 수 있는 실험적인 방법들로 근육의 전기적 흥분도, 눈의 변화(망막변화, 약물에 대한 홍채의 반응), 안방수의 화학적 변화, 혈액, 심낭, 뇌척수 액의 화학적 변화, 골수의 세포학적 변화 등이 소개되고 있기는 하나 아직 그 어떠한 것도 정확하다고 보기는 어렵다. 또 여러 가지 시체현상이나 인체 화학성분의 변화에 영향을 미치는 다양한 외적 요인들 때문에 그 정확도는 더욱 떨어진다.
In general, the estimation of post-elapsed time is based on various body phenomena seen after a person's death, ie, the degree of post-mortem body temperature drop, the manifestation of body rigidity, timed (blood subsidence), digestion of stomach contents, In addition to this, experimental methods that can be used within 1 to 2 days after the death are used to measure the electrical stimulation of muscles, eye changes (retinal changes, iris responses to drugs), chemical changes , Blood, pericardium, chemical change of cerebrospinal fluid, cytologic changes of bone marrow are introduced, but it is difficult to say anything yet. It is also less accurate due to the various external factors that affect various body phenomena and changes in chemical composition.

또한, 최근 위의 단점을 해결하기 위해, 모델동물의 세포내 DNA의 파편화(fragmentation) 정도를 측정하여 사후경과시간을 추정하는 연구가 진행되고 있고, RNA의 분해(Degradation)을 측정하여 사후경과시간을 추정하는 연구도 진행되고 있다. 다만, DNA는 온도, 산도 등 환경에 의한 영향을 크게 받는바 정확한 추정이 어렵고, RNA의 경우, 사후 12시간 이내에 대부분 분해(Degradation)되어 그 이상의 사후경과시간 추정에 어려움이 있다.
Recently, in order to solve the above disadvantages, studies have been carried out to estimate the post-elapsed time by measuring the degree of fragmentation of intracellular DNA in a model animal. Degradation of RNA is measured, Is also under study. However, it is difficult to estimate DNA accurately due to environmental influences such as temperature and acidity. In the case of RNA, it is mostly degraded within 12 hours after post-injection, making it difficult to estimate post-elapsed time.

이에, 본 발명자들은 모델동물 조직에서 사후경과시간을 효과적으로 추정할 수 있는 바이오마커를 찾기위해 노력한 결과, 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)의 발현수준을 측정하여, 사후경과시간에 따라 감소하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
As a result of efforts to find a biomarker capable of effectively estimating the post-elapsed time in a model animal tissue, the present inventors have found that Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β (Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β) Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ) p53, AMP-activated protein kinase alpha, AMPKa, and beta-catenin, and then decreased according to the elapsed time, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 사후경과시간을 효과적으로 추정할 수 있는 바이오 마커인 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 사후경과시간 추정용 키트를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a biomarker capable of effectively estimating the post-elapsed time, such as Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-active protein kinase α AMP-activated protein kinase alpha, AMPK alpha) and beta-catenin (beta-catenin), or an agent for measuring the protein level of the mRNA of any one or more genes selected from the group consisting of .

본 발명의 또 다른 목적은 (1) 생물학적 시료로부터 상기 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 단계 (1)의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 사후경과 시간 추정 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for detecting a protein comprising the steps of: (1) measuring the expression level or protein expression level of any one or more genes selected from the group consisting of the marker from a biological sample; And (2) comparing the expression level of the gene of step (1) or the expression level of the protein with a normal control sample.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커의 항체를 포함하는 사후 경과시간 검출용 스트립을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a strip for detecting an after-elapsed time comprising an antibody of the marker.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모델동물 조직에 존재하는 사후경과시간 추정용 바이오 마커인 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르 알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 사후경과시간 추정용 키트를 제공한다.
In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a biomarker for estimating the post-elapsed time in a model animal tissue, which comprises Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, 3 (Caspase 3), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ) A prolonged time comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of any one or more genes selected from the group consisting of AMP-activated protein kinase alpha (AMPK alpha) and beta-catenin And provides an estimation kit.

또한 본 발명은 (1) 생물학적 시료로부터 상기 바이오마커부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (1) measuring the expression level or protein expression level of any one or more genes selected from the biomarker from the biological sample; And

(2) 상기 단계 (1)의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 사후경과 시간 추정 방법을 제공한다.
(2) comparing the expression level of the gene of step (1) or the expression level of the protein with a normal control sample.

또한 본 발명은 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); The present invention also relates to a sample pad in which a sample is absorbed;

시료 내의 상기 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); A conjugate pad that binds to the protein in the sample;

상기 단백질의 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);A reaction membrane on which a test line and a control line containing the antibody of the protein are treated;

잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및An absorption pad on which a sample of the remaining amount is absorbed; And

지지대(support pad)를 포함하는 사후 경과시간 검출용 스트립을 제공한다.
There is provided a strip for detecting a later elapsed time including a support pad.

본 발명은 사후경과시간 추정용 바이오 마커를 이용한 사후경과시간 추정방법, 스트립 및 이를 포함하는 키트를 제공함으로서, 모델동물 조직에서 상기 마커의 시간경과에 따른 감소(degradation)를 측정 및 분석하여 사후경과시간을 기존의 방식보다 객관적이고 정확하게 추정할 수 있다. 또한 다양한 종류의 사후경과시간 추정 마커를 동시 분석할 수 있는 바, 범죄현장 등에서 유용하게 사용될 수 있다.
The present invention provides a post-elapsed time estimation method, a strip, and a kit including the same, which uses a biomarker for estimating post-elapsed time, thereby measuring and analyzing the degradation of the marker over time in a model animal tissue, Time can be estimated more objectively and accurately than existing methods. In addition, it is possible to simultaneously analyze various types of post-elapsed time estimation markers, which can be useful in crime scenes and the like.

도 1a는 대조군 랫(rat)의 신장조직에서 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 개체간 변이를 웨스턴 블랏(Westeren blot)을 통해 도식화한 도이고,
도 1b는 대조군 랫(rat)의 근육조직에서 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 개체간 변이를 웨스턴 블랏(Westeren blot)을 통해 도식화한 도이다.
도 2a는 신장조직에서 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 사후경과시간에 따른 발현수준 변화를 웨스턴 블랏(Westeren blot)을 통해 도식화한 도이고,
도 2b는 도 2a에서 확인된 바이오마커의 발현수준 변화를 실선 그래프로 도식화한 도이다.
도 3a는 근육조직에서 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 사후경과시간에 따른 발현수준 변화를 웨스턴 블랏(Westeren blot)을 통해 도식화한 도이고,
도 3b는 도 3a에서 확인된 바이오마커의 발현수준 변화를 실선 그래프로 도식화한 도이다.
도 4a는 신장조직에서 글리코겐 신타아제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3)의 발현수준 변화를 면역조직화학 염색법을 통해 도식화한 도이고(상단), 면역조직화학 염색법을 통해 확인된 발현수준 변화를 실선 그래프로 도식화한 도이다(하단).
도 4b는 근육조직에서 글리코겐 신타아제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3)의 발현수준 변화를 면역조직화학 염색법을 통해 도식화한 도이고(상단), 면역조직화학 염색법을 통해 확인된 발현수준 변화를 실선 그래프로 도식화한 도이다(하단).
도 5는 GAPDH가 측방유동분석 방법에 적합한지 여부를 확인하기 위해, 샌드위치 엘라이자(sandwich ELISA)를 한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 측방유동 분석 방식을 이용한 사후경과 시간 검측용 스트랩을 도식화한 도이고,
도 7은 사후경과 시간 추정용 스트랩을 이용하여 사후경과 시간을 검측하는 모습을 보인 도이다(T:반응선, C: 대조선).FIG. 1A is a schematic diagram showing the inter-individual variation of the biomarker for estimating the post-elapsed time in the kidney tissue of a control rat through a westeren blot,
FIG. 1B is a diagram showing the inter-individual variation of the biomarker for estimating the post-elapsed time in the muscle tissue of the control rats through Western blotting.
FIG. 2A is a diagram showing the expression level change of the biomarker for estimating the post-transit time in the kidney tissue according to the post-transit time through Western blot,
FIG. 2B is a graph showing a change in the expression level of the biomarker identified in FIG.
FIG. 3A is a diagram showing a change in expression level of a biomarker for estimating the post-transit time in muscle tissue according to the post-transit time, through a westeren blot,
FIG. 3B is a graph showing a change in the expression level of the biomarker identified in FIG. 3A by a solid line graph.
FIG. 4A is a graph showing changes in expression levels of Glycogen synthase and Caspase 3 in renal tissue through immunohistochemical staining (top), expression level confirmed by immunohistochemical staining It is a diagram plotted with a solid line graph (bottom).
FIG. 4B is a graph showing changes in the expression levels of Glycogen synthase and Caspase 3 in muscle tissue through immunohistochemical staining (top), expression levels confirmed by immunohistochemical staining It is a diagram plotted with a solid line graph (bottom).
Figure 5 shows the results of a sandwich ELISA to determine if GAPDH is suitable for the lateral flow analysis method.
6 is a schematic diagram of a post-elapsed time detection strap using a lateral flow analysis method,
FIG. 7 is a diagram showing a state in which a post-elapsed time is detected using a strap for estimating a post-elapsed time (T: a response line, and C: a contrast line).

이하, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.
Hereinafter, terms used in the present invention will be described.

본 발명에 사용된 용어 “mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정”이란, 사후경과 시간을 추정하기 위하여 생물학적 시료에서 사후경과시간 추정용 바이오마커인 단백질 및 그 mRNA의 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA 또는 이의 단백질의 양을 측정한다.
As used herein, the term " measuring mRNA or its protein expression level " refers to a process of determining the degree of expression of a protein and its mRNA, which is a biomarker for estimating the post-elapsed time in a biological sample, And the amount of the protein thereof is measured.

또한, 본 발명에 사용된 용어 “유전자의 발현수준 측정”이란, 생물학적 시료에서 사후경과시간 추정용 바이오마커인 단백질의 유전자의 발현 정도를 확인하는 과정으로 유전자의 양을 측정한다.
The term " gene expression level measurement " used in the present invention refers to the step of determining the expression level of a protein as a biomarker for estimating the post-elapsed time in a biological sample.

또한, 본 발명에 사용된 용어 “항체”는 항원성 부위에 대해여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르 알데히드-3-인산 디히드로게나아제 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
The term " antibody " as used herein also refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purpose of the present invention, the use of glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα), and β -Catenin (beta-catenin). ≪ / RTI >

또한, 본 발명에 사용되는 용어 “면역조직화학 염색법”은 항원에 대한 일차 항체를 반응시켜 붙인 다음 직접 효소가 붙은 이차 항체를 붙이고 효소의 기질액을 반응시켜 발색을 시키거나, 바이오틴(biotin)이 붙은 이차항체를 반응시키고 이후에 바이오틴과 강력하게 붙는 성질이 있는 아비딘(avidin)에 효소가 달라 붙어있는 시약을 반응시키고 (예를 들어, ABC 법) 이후에 이 효소에 대한 기질액을 반응시켜서 색깔을 발색시켜 현미경하에서 원래 항원의 존재를 관찰하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 아비딘-바이오틴 외에 폴리머를 이용하여 많은 수의 효소를 이차항체에 부착시킨 것을 할 수도 있다.
The term " immunohistochemical staining method " used in the present invention refers to a method in which a primary antibody to an antigen is reacted, and then a secondary antibody with a direct enzyme is attached thereto, followed by reaction with a substrate solution of the enzyme, (For example, ABC method), and then reacted with the substrate solution for the enzyme to react with the color of the color And then the presence of the original antigen is observed under a microscope. In addition to avidin-biotin, a large number of enzymes may be attached to the secondary antibody using a polymer.

아울러, 본 발명에 사용되는 용어 “측방유동분석”이란, 면역크로마토그라피 분석법의 대표적인 타입인데, 면역크로마토그라피 분석법은 피검 시료 중에 피검 물질이 존재하는 경우, 피검 물질과 결합할 수 있는 특이적 결합 물질을 고정화한 고정상에, 상기 피검 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합물질 및 표식성을 가지는 표지 복합체가 피검 물질과 복합체를 형성하고, 고정상에 결합한 표지체를 검출하는 것에 의해 피검 시료 중의 피검 물질의 존재를 확인할 수 있다.
As used herein, the term " lateral flow analysis " is a representative type of immunochromatography assay. In the case of presence of a test substance in a test sample, a specific binding substance capable of binding to the test substance A specific binding substance capable of specifically binding to the test substance and a labeled complex having a marking property form a complex with the substance to be tested and detecting the labeled substance bound to the fixed phase, The presence of the test substance can be confirmed.

또한, 본 발명에 사용되는 용어 “엘라이자(ELISA)”란, 일반적으로 효소를 표식자로 하여 항원-항체 반응을 이용한 항원 또는 항체량 측정 방법을 의미한다. 그중 샌드위치 엘라이자 방법은, 항체가 코팅된 플레이트에 단백질을 넣는데, 이때 플레이트에 코팅된 항체는 넣고자 하는 단백질을 항원으로 가진다. 그리고 2차 항체를 넣는데, 이 항체 역시 넣고자 하는 단백질을 항원으로 가지지만 단백질의 다른 부위에 결합한다. 2차 항체에는 효소가 있어서 항체가 결합한 상태에서 효소의 기질을 넣어주면 색깔이 변하는데, 이 색깔의 진하기를 측정한다.
The term " ELISA " used in the present invention refers to a method of measuring an amount of an antigen or an antibody using an antigen-antibody reaction using an enzyme as a marker. Among them, the sandwich ELISA method involves placing a protein on a plate coated with an antibody, wherein the antibody coated on the plate has a protein as an antigen. The second antibody, which also has the antigen as the target protein, binds to other parts of the protein. Secondary antibody has an enzyme. When enzyme is attached to the antibody, the color changes when the enzyme is added. Measure the color of the secondary antibody.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 사후경과시간 추정용 키트를 제공한다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, Glyceraldehyde-3 (AMP-activated protein kinase alpha, AMPKa) and beta -catenin (PPAR-gamma), p53, and peroxisome proliferator-activated receptor β-catenin) or an agent for measuring the level of expression of the mRNA of the at least one gene selected from the group consisting of β-catenin.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프루브 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, 상기 유전자들의 핵산정보가 GenBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프루브를 디자인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Since the agent for measuring the mRNA level of the gene is a primer, a probe, or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene, and the nucleic acid information of the genes is known in GenBank or the like, those skilled in the art will recognize specific regions of these genes Primers or probes may be designed for amplification, but are not limited thereto.

또한, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In addition, the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to the protein, but is not limited thereto.

또한, 상기 사후경과 시간 추정용 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immnosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid)키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)키트 등이 있으며, 이에 한정되지 않고, mRNA 또는 단백질에 상보적으로 결합하는 방식을 이용한다면 당업자에게 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
The kit may further comprise at least one of a reverse transcription polymerase chain reaction kit (RT-PCR), a DNA chip kit, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a sandwich ELISA kit, a protein chip kit, And a multiple reaction monitoring (MRM) kit. However, the present invention is not limited thereto, and it can be accomplished through any known method known to those skilled in the art, using a complementary binding method to mRNA or protein.

또한, 본 발명은 In addition,

(1) 생물학적 시료로부터 글리코겐 신타제 (Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β), 카스파제 3 (Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (1) Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3?, GSK-3?, Caspase 3, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα), and β - beta-catenin, or an expression level of the protein; And

(2) 상기 단계 (1)의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 사후경과 시간 추정 방법을 제공한다.
(2) comparing the expression level of the gene of step (1) or the expression level of the protein with a normal control sample.

본 발명의 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The expression level of the gene of the present invention includes, but is not limited to, mRNA expression level of the gene.

또한, 본 발명의 상기 mRNA 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등에 의해 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The mRNA level of the present invention can be measured by a reverse transcriptase polymerase, a competitive reverse transcriptase polymerase, a real-time reverse transcriptase polymerase, an RNase protection assay, northern blotting or a DNA chip, but is not limited thereto .

또한, 본 발명의 단백질 발현 수준 측정은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In addition, the measurement of the protein expression level of the present invention can be performed using an antibody that specifically binds to the protein, but is not limited thereto.

또한 본 발명의 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 및 샌드위치 ELISA로 구성된 군으로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The protein expression level of the present invention can be measured by protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption / Flock Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radial immunodiffusion, Oucheronin immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation, two-dimensional electrophoresis, liquid chromatography- But are not limited to, mass spectrometry, LC-MS, liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry, Western blot, enzyme linked immunosorbent assay and sandwich ELISA.

또한 본 발명에 이용되는 생물학적 시료는 신장조직 또는 근육조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The biological sample used in the present invention may be, but is not limited to, kidney tissue or muscle tissue.

또한, 글리코겐 신타제 (Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin) 의 각 대조군과 비교하여 상기 각 단백질의 발현수준이 40％ 내지 60％인 시간을 판정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
In addition, it is also known that Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα) and β-catenin -catenin) to determine the time at which the expression level of each protein is 40% to 60%.

구체적으로 글리코겐 신타제(Glycogen synthase)는 14 내지 24시간, 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)는 20 내지 24시간, 카스파제 3(Caspase 3)는 18 내지 30시간, 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)는 46 내지 60시간, 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ)는 54 내지 62시간인 시간을 판정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
Specifically, glycogen synthase is used for 14 to 24 hours, Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) is used for 20 to 24 hours, caspase 3 is used for 18 to 30 hours, glycogen synthase kinase 3β (GAPDH) for 46 to 60 hours, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-gamma) for 54 to 62 hours, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase But it is not so limited.

또한 본 발명의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계는 상기 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준의 50％ 인 지점을 측정하는 것을 포함한다.
Also, comparing the expression level of the gene of the present invention or the expression level of the protein with the normal control sample includes measuring a point that is 50% of the protein expression level of the normal control sample.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 사후경과 시간 추정용 바이오마커를 검출하기 위해 대조군에서 개체변이 분석을 수행하였다. 구체적으로,밀폐된 CO2 환경에서 질식사한 랫(rat)으로부터 추출된 신장조직 및 근육조직을 파쇄하여, 사후경과 시간 추정용 바이오마커 후보군들을 웨스턴 블랏 측정하였는데, 신장조직에서는 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르 알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PRAR-γ), p53 가 10％ 내외의 개체변이를 보였다.
In a specific example of the present invention, the inventors performed individual mutation analysis in a control group to detect a biomarker for post-elapsed time estimation. Specifically, kidney tissues and muscle tissues extracted from roasted rats in a closed CO 2 environment were disrupted and Western blot analysis was performed for biomarker candidates for estimation of post-elapsed time. Glycogen synthase ), Glycogen synthase kinase 3?, GSK-3?, Caspase 3, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxy Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PRAR-γ) and p53 showed individual variation of about 10%.

또한, 근육조직에서는 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 카스파제 3 (Caspase 3), 글리세르 알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)가 10％ 내외의 개체변이를 보여서 사후경과 시간 추정용 바이오마커로 적합함을 확인하였다(도1a, 도1b ).
In addition, in muscle tissue, Glycogen synthase, Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), AMP-active protein kinase a AMP-activated protein kinase alpha, AMPK alpha) and beta -catenin (about 10%) were found to be suitable as biomarkers for estimating post-transit time (FIGS. 1A and 1B).

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 실제 사후 경과시간 추정을 위하여, 희생된 랫(rat)을 0시간 부터 96시간 상온에서 방치한 후, 12시간 간격으로 희생된 랫(rat)의 신장조직과 근육조직을 추출하여 사후경과 시간 추정용 바이오 마커인 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β (Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)의 사후경과 시간에 따른 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정(도2a, 도3a)하였고, 그 결과 신장조직(도 2b), 근육조직(도 3b)에서 직선형 그래프를 얻을 수 있었다.
In a specific example of the present invention, the inventors of the present invention have found that, in order to estimate the actual post-elapsed time, the sacrificed rats are allowed to stand at room temperature from 0 hours to 96 hours, Glycogen synthase kinase 3β (Glycogen synthase kinase 3β), Caspase 3, glyceraldehyde (Glycogen synthase kinase 3β), which are biomarkers for estimating post-elapsed time, are extracted from tissues and muscle tissues 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMP- (Fig. 2 (a), (b), and (c) of FIG. 2) were measured by Western blotting according to the post-elapsed time of activated protein kinase alpha, AMPK alpha and beta -catenin, In the tissue (Figure 3b), a linear graph The could.

또한, 본 발명자들은 실제 사후 경과시간 추정을 위해, 대조군에서 상기 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 사후경과 시간에 따른 단백질 수준과, 희생된 랫(rat)의 조직에서의 상기 바이오마커의 단백질 수준을 비교하여, 사후 경과시간을 추정할 수 있었다.
In order to estimate the actual post-elapsed time, the inventors of the present invention measured the protein level according to the post-elapsed time of the biomarker for estimating the post-elapsed time in the control group and the protein level of the biomarker in the tissue of the sacrificed rat And the post-elapsed time can be estimated.

또한, 본 발명자들은 상기 사후경과 시간 추정용 바이오 마커의 발현수준을 측정하기 위해 면역조직화학 분석을 한 결과, 신장조직 및 근육조직에서 Glycogen synthase, Caspase 3 의 사후경과 시간에 따른 발현수준이, 웨스턴 블랏을 이용하여 측정한 결과와 일치함을 알 수 있었다(도 4a, 도4b).
As a result of immunohistochemical analysis to measure the expression level of the biomarker for estimating the post-elapsed time, the present inventors have found that expression levels of Glycogen synthase and Caspase 3 in the kidney tissue and muscle tissue with respect to the post- (Fig. 4 (a) and Fig. 4 (b)).

따라서, 본 발명의 상기 바이오 마커는 사후경과 시간의 진행에 따라 발현수준이 감소하는 효과가 있어, 사후경과 시간 추정용 키트 또는 사후경과 시간 추정 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the biomarker of the present invention has an effect of reducing the expression level according to the progress of the post-elapsed time, and thus can be usefully used in a kit for estimating the post-elapsed time or a method of estimating the post-elapsed time.

또한, 본 발명은In addition,

생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); A sample pad on which the biological sample is absorbed;

시료 내의 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)와 결합하는 결합 패드(conjugate pad); Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3 beta, Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the sample, phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα) and β-catenin a conjugate pad that combines with a -catenin;

상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane); A reaction membrane on which a test line and a control line containing each antibody of the protein are treated;

잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 지지대를 포함하는 사후경과 시간 추정용 스트립을 제공한다.
An absorption pad on which a sample of the remaining amount is absorbed; And a strip for estimating a post-elapsed time.

이러한 상기 스트립의 구체적인 구조는 도 6에 도시되어 있다.
The specific structure of such a strip is shown in Fig.

본 발명의 생물학적 시료는 신장조직 또는 근육조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The biological sample of the present invention may be, but is not limited to, kidney tissue or muscle tissue.

샘플패드는 시료, 즉 상기 언급된 생물학적 시료를 점적 등에 의해 적용시켜 스트립 내로 흡수시키는 것이며, 흡수된 시료는 모세관 현상에 의하여 결합패드를 통과하고 반응막을 따라 이동하게 된다. 상기 흡수된 시료는 반응막을 따라 이동하면서 상기 단백질의 각 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속 진행한다. 항원-항체 결합체는 이동하면서 포획항체와 한번더 반응하여 샌드위치 형태의 결합체를 만든다. 또한, 잔량의 시료는 흡수패드에 의해 흡수된다.
The sample pad is a sample, that is, the above-mentioned biological sample is applied by dripping or the like so as to be absorbed into the strip, and the absorbed sample passes through the bonding pad and moves along the reaction membrane by capillary phenomenon. The absorbed sample moves along the reaction membrane and reacts with each antibody of the protein to proceed in the form of an antigen-antibody complex. The antigen-antibody complex moves and reacts once more with the capture antibody to form a sandwich-like complex. In addition, the remaining amount of sample is absorbed by the absorbing pad.

본 발명의 반응막은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly ethylene terephthalate), PES(polyethersufone), 유리섬유 또는 나일론일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The reaction membrane of the present invention may be, but is not limited to, nitrocellulose, cellulose, poly ethylene terephthalate (PVDF), polyethersufone (PES), glass fiber or nylon.

또한, 본 발명의 흡수패드는 셀룰로오스, 무명 또는 친수다공성 폴리머인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니고, 당업자에게 자명한 모세관 현상을 이용하는 물질을 포함할 수 있다.
In addition, the absorbent pad of the present invention is characterized by being a cellulose, an anionic or a hydrophilic porous polymer. However, it is not limited thereto and may include a material which utilizes a capillary phenomenon which is obvious to a person skilled in the art.

또한, 본 발명의 지지대는 스트립의 구성요소들을 지지하기 위한 것으로서 바람직하게는 플라스틱일 수 있다.
In addition, the support of the present invention is for supporting the elements of the strip and may preferably be plastic.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 스트립의 구동 원리인 측방유동분석(Lateral flow assay) 방법(도 6)에 적당한 사후경과 시간 추정용 바이오마커를 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA를 수행하였다(Sandwich ELISA).In a specific embodiment of the present invention, a sandwich ELISA was performed to identify biomarkers for post-elapsed time estimation suitable for the lateral flow assay method (FIG. 6), which is the driving principle of strips (Sandwich ELISA) .

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명자들은 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 이하 GAPDH) 항체에 대한 농도별 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA) 를 수행하여, GAPDH가 측방유동분석 방식에 적합함을 확인하였다(도5).In one embodiment of the present invention, the present inventors performed a sandwich ELISA (sandwich ELISA) by concentration for Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Fig. 5).

또한, 본 발명자들은 상기 사후경과 시간 추정용 스트립을 이용하여, 사후경과 시간이 96시간 경과이전인 경우, GAPDH가 검출되고, 96시간을 경과한 경우는 GAPDH 가 검출되지 않았으므로, 96시간의 사후경과 시간 경과여부를 확인할 수 있었다(도 7).
In addition, when the post-elapsed time is before the elapsed time of 96 hours, GAPDH is detected using the strip for estimating the post-elapsed time, and since the GAPDH is not detected when 96 hours have elapsed, And whether the elapsed time has elapsed can be confirmed (Fig. 7).

따라서 본 발명의 상기 사후경과 시간 추정용 바이오 마커는, 96시간의 사후경과 시간을 전후로 검출(96시간 경과전) 또는 미검출(96시간 경과후) 되는 효과가 있어, 사후경과 시간 추정용 스트립에 사용될 수 있다.Therefore, the biomarker for estimating the post-elapsed time of the present invention has the effect of detecting (after 96 hours elapsed) or not detecting (after 96 hours elapsing) the post-elapsed time of 96 hours, Can be used.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

<실시예 1> 사후경과 시간 추정용 바이오마커의 대조군에서 개체변이 분석<Example 1> Individual mutation analysis in a control group of biomarkers for estimating post-elapsed time

본 발명자들은, 사후경과시간 추정용 바이오마커를 검출하기위해, 웨스턴 블랏을 통해 대조군에서 개체변이 분석을 수행하였다.
The present inventors conducted individual mutation analysis in a control group through Western blotting to detect a biomarker for estimating post-elapsed time.

<실시예 1-1> 모델동물로부터 조직의 적출 &Lt; Example 1-1 > Extraction of tissue from model animals

사후경과시간 추정용 바이오마커를 검출할 조직을 추출하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.The following experiments were conducted to extract tissues to detect biomarkers for estimating post-elapsed time.

구체적으로, 8주령의 랫(rat;Sprague Dawley)을 밀폐된 CO2 환경에서 질식사시킨다. 상기 랫(rat)은 표준 식품 사료 및 물을 임의로 제공받았다. 상기 랫(rat)의 체중은 250±30 g (mean±SD)이었다. 상기 대조군 랫(rat)은 9마리를 희생하였고, 동시에 희생하여 모델동물의 신장 및 근육조직을 적출 후, 초저온 냉동고에 보관하였다.
Specifically, 8-week-old rats (Sprague Dawley) are suffocated in a closed CO 2 environment. The rats were randomly provided with standard food feeds and water. The body weight of the rat was 250 ± 30 g (mean ± SD). The control rats were sacrificed at 9, sacrificed at the same time, kidneys and muscle tissues of model animals were extracted and stored in a cryogenic freezer.

<실시예 1-2> 신장조직의 개체변이 분석<Example 1-2> Individual mutation analysis of kidney tissue

본 발명자들은, 개체간 변이가 작은 사후경과시간 추정용 마커를 발굴하기 위해 상기 적출된 신장조직에서 사후경과시간 추정 바이오마커 후보군 단백질들을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
The inventors of the present invention confirmed by Western blotting that the post-elapsed time estimating biomarker candidate proteins in the extracted kidney tissues were identified in order to identify markers for post-elapsed time estimation with small inter-individual variation.

구체적으로, 상기 <실시예1-1> 에서 적출된 신장조직은 액체질소로 냉동하여 막자사발로 곱게 파쇄하였다. 상기 파쇄된 신장조직 100 ㎎ 과 1 ㎖ 의 단백질 추출 버퍼를 사용하여, 단백질을 추출하였다. 상기 단백질 추출 버퍼로는 인트론바이오테크놀로지의 ProPrep(ProPrep, iNtRoN Biotechnology) 를 사용하였다.Specifically, the kidney tissues extracted from the <Example 1-1> were frozen in liquid nitrogen and finely crushed with a mortar. Proteins were extracted using 100 mg of the above elongated kidney tissue and 1 ml of protein extraction buffer. As the protein extraction buffer, Intron Biotechnology ProPrep (ProPrep, iNtRoN Biotechnology) was used.

상기 추출된 단백질은 Bradford assay 로 정량하였으며, 정량 후 동일한 양(30 ㎍)의 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodesyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)을 이용하여 분리하였다.The extracted protein was quantified by Bradford assay. After the quantification, the same amount (30 μg) of the protein was separated by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis).

이후, 상기의 사후경과시간 추정용 바이오마커 후보군을 웨스턴 블랏을 이용하여 검출하였다.Then, the biomarker candidates for estimating the post-elapsed time were detected using a Western blot.

동일량의 단백질(30μg)을 12％ SDS-PAGE gel에서 전기영동을 수행하였다. 사이즈 별로 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 막(Nitrocellulose, 공극 크기; 0.45 μm)에 이동시킨 후 0.05％ Tween 20와 5% 탈지유를 함유한 TBS(Tris-buffered Saline; 10 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl)용액으로 1시간 동안 비특이적인 반응을 차단하였다. 항원을 인식하는 1차 항체를 4℃에서 16시간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 TBST(0.05％ Tween 20이 포함된 TBS)용액으로 3번 세척을 하였다. 1차 항체화의 특이적인 반응을 위해, horseradish peroxidase 가 부착된 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 TBST 용액으로 3번 세척 하였다. Enhanced chemiluminescence Western blotting detection reagents(Millipore)를 이용하여 2차 항체의 발색을 유도 하였으며, ImageQuant LAS-4000 mini(GE Healthcare)를 이용하여 항원-항체반응 신호를 검출 하였다. The same amount of protein (30 μg) was electrophoresed on a 12% SDS-PAGE gel. The proteins separated by size were transferred to a nitrocellulose membrane (pore size: 0.45 μm), washed with TBS (Tris-buffered saline; 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) solution for 1 hour. The primary antibody recognizing the antigen was reacted at 4 ° C for 16 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with TBST (0.05% Tween 20 in TBS) solution. For the specific reaction of primary antibody, secondary antibody with horseradish peroxidase was reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with TBST solution. Enhanced chemiluminescence The secondary antibody was induced by Western blotting detection reagents (Millipore). Antigen-antibody response signals were detected using ImageQuant LAS-4000 mini (GE Healthcare).

상기 실험은 5회 반복하였다.
The experiment was repeated 5 times.

그 결과, 신장조직에서 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53 가 10％ 내외의 개체간 변이를 보여, 사후경과시간 추정용 바이오마커로 적합함을 확인하였다.(도 1a)
As a result, the expression of Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), and p53 were present in about 10% of the subjects. The biomarkers were used to estimate post-transit time (Figure 1a). &Lt; RTI ID = 0.0 &gt;

<실시예 1-3> 근육조직의 개체변이 분석<Example 1-3> Individual mutation analysis of muscle tissue

본 발명자들은, 개체간 변이가 작은 사후경과시간 추정용 마커를 발굴하기 위해 상기 적출된 근육조직에서 <실시예 1-2>에서와 같이 사후경과시간 추정 바이오마커 후보군 단백질들을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
In order to identify markers for post-elapsed time estimation with small inter-individual variation, the present inventors identified western blotted proteins in the extracted muscle tissue as in Example 1-2, .

그 결과, 근육조직에서 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin) 가 10％ 내외의 개체간 변이를 보여, 사후경과시간 추정용 바이오마커로 적합함을 확인하였다.(도 1b)
As a result, it was found that the expression of Glycogen synthase, Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), AMP-active protein kinase alpha (AMP-activated protein kinase α, AMPKα) and β-catenin (about 10%) were found to be suitable as biomarkers for estimating the post-elapsed time (FIG. 1b)

<실시예 2> 사후경과시간의 추정&Lt; Example 2 > Estimation of post-elapsed time

본 발명자들은, 실제 사후경과시간을 추정하기 위해 희생된 모델동물로부터 신장조직 및 근육조직을 적출하여, 사후경과시간에 따른 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준 변화(degradation)를 측정하였다.
The present inventors measured the degree of degradation of the biomarker for estimating the post-elapsed time according to the post-elapsed time by extracting kidney tissue and muscle tissue from the sacrificed model animal to estimate the actual post-elapsed time.

<실시예 2-1> 신장조직에서 사후경과시간 추정용 바이오마커의 분석<Example 2-1> Analysis of biomarkers for estimating post-elapsed time in renal tissue

본 발명자들은, 신장조직에 존재하는 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준 변화 확인을 통해 사후경과시간을 추정하기 위하여, 상기 바이오마커에 대한 웨스턴 블랏 실험을 수행하였다.
The present inventors conducted Western blotting experiments on the biomarkers in order to estimate the post-elapsed time through confirmation of changes in the expression levels of the biomarkers for estimating the post-elapsed time in the kidney tissue.

구체적으로, 밀폐된 CO2 환경에서 질식사한 랫(rat)을 0시간부터 96시간 방치하였으며. 사후 24시간부터 12시간 간격으로 신장조직을 적출한 후, 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준 변화를 측정하였다. 신장조직은 막자사발을 이용하여 액체질소로 냉동하여 곱게 파쇄하였다. 상기 파쇄된 신장조직 100 ㎎ 과 1 ㎖ 의 단백질 추출 버퍼를 사용하여, 단백질을 추출하였다. 상기 단백질 추출 버퍼로는 인트론바이오테크놀로지의 ProPrep(ProPrep, iNtRoN Biotechnology)을 사용하였다. 상기 추출된 단백질은 Bradford assay(Bio-Rad)로 정량하였으며, 정량 후 동일한 양의 단백질(30 μg)은 12％ SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 사이즈 별로 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 막(Nitrocellulose, 공극 크기; 0.45 μm)에 이동시킨 후 0.05％ Tween 20와 5％ 탈지유를 함유한 TBS(10 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl)용액으로 1시간 동안 비특이적인 반응을 차단하였다. 항원을 인식하는 1차 항체를 4℃에서 16시간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 TBST(0.05％ Tween 20이 포함된 TBS)용액으로 3번 세척을 하였다. 1차 항체화의 특이적인 반응을 위해, horseradish peroxidase 가 부착된 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며, 반응 후 TBST 용액으로 3번 세척 하였다. Enhanced chemiluminescence Western blotting detection reagents (Millipore)를 이용하여 2차 항체의 발색을 유도 하였으며, ImageQuant LAS-4000 mini(GE Healthcare)를 이용하여 항원-항체반응 신호를 검출 하였다.
Specifically, in a closed CO 2 environment, the rat was left to stand for 96 hours from 0 hours. After the kidney tissue was removed at intervals of 12 hours from 24 hours post-hoc, the change in the expression level of the biomarker for estimating the post-elapsed time was measured. The kidney tissue was frozen in liquid nitrogen using a mortar bowl and finely crushed. Proteins were extracted using 100 mg of the above elongated kidney tissue and 1 ml of protein extraction buffer. As the protein extraction buffer, Intron Biotechnology ProPrep (ProPrep, iNtRoN Biotechnology) was used. The extracted protein was quantitated by Bradford assay (Bio-Rad). After quantification, the same amount of protein (30 μg) was separated by 12% SDS-PAGE. The proteins separated by size were transferred to a nitrocellulose membrane (pore size 0.45 μm) and then washed with TBS (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) solution containing 0.05% Tween 20 and 5% Nonspecific reactions were blocked for 1 hour. The primary antibody recognizing the antigen was reacted at 4 ° C for 16 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with TBST (0.05% Tween 20 in TBS) solution. For the specific reaction of primary antibody, horseradish peroxidase conjugated secondary antibody was reacted at room temperature for 2 hours and then washed three times with TBST solution. Enhanced chemiluminescence The secondary antibody was induced by Western blotting detection reagents (Millipore). Antigen-antibody response signals were detected using ImageQuant LAS-4000 mini (GE Healthcare).

그 결과, 도 2 와 같이 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준이 감소함을 알수 있었고, 각 마커의 사후경과시간에 따른 직선형 그래프를 얻을 수 있었다.
As a result, it was found that the expression level of the biomarker for estimating the post-elapsed time was decreased as shown in FIG. 2, and a linear graph according to the post-elapsed time of each marker was obtained.

또한, 상기 바이오마커의 발현수준이 최초 수준의 50％가 되는 시간을 측정하여 이를 Post-mortem interval50 (PMI50) 으로 명명하였다.(도 2b)
Also, the time at which the expression level of the biomarker reached 50% of the initial level was measured and named as Post-mortem interval 50 (PMI 50 ) (Fig. 2b)

<실시예 2-2> 근육조직에서 사후경과시간 추정용 바이오마커의 분석<Example 2-2> Analysis of biomarkers for estimating post-elapsed time in muscle tissue

본 발명자들은, 근육조직에 존재하는 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준 변화 확인을 통해 사후경과시간을 추정하기 위하여, 상기 <실시예 2-1>과 동일한 실험을 수행하였다.
The present inventors conducted the same experiment as in <Example 2-1> to estimate the post-transit time through confirmation of changes in the expression level of the biomarker for estimating the post-transit time in muscle tissue.

그 결과, 도 3b와 같이 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준이 감소함을 알수 있었고, 각 마커의 사후경과시간에 따른 직선형 그래프를 얻을 수 있었다.
As a result, it was found that the expression level of the biomarker for estimating the post-elapsed time was decreased as shown in FIG. 3B, and a linear graph according to the post-elapsed time of each marker was obtained.

특히, 상기 바이오마커의 양이 최초 수준의 50％가 되는 시간을 측정하여 이를 PMI50 으로 명명하였다.
In particular, the time at which the amount of the biomarker was 50% of the initial level was measured and designated PMI 50 .

<실시예 3> 면역조직화학 염색법을 통한 사후경과시간 추정<Example 3> Estimation of post-elapsed time by immunohistochemistry

상기 <실시예 2>에서 얻은 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발현수준 변화를 재차 확인하기 위해 면역조직화학 염색실험을 실시하였다.Immunohistochemical staining experiments were conducted to confirm the change in the expression level of the biomarker for estimating the post-elapsed time obtained in Example 2 above.

구체적으로, 사후 0, 24, 48 및 96시간이 경과한 신장 및 근육조직을 면역조직화학 염색실험을 실시하였다. 조직 적출 후 4％ formaldehyde 에 넣어 고정 시킨 후 파라핀 블록(block)을 제조하였다. 파라핀 블럭을 5 μm 두께로 절편하여 슬라이드글라스에 부착하였다. Histostain-Plus 3rd Gen IHC Detection Kit (Invitrogen)을 이용하여 다음과 같은 순서로 면역조직화학 염색를 진행하였다. 65 ℃에서 15분간 배양 한 후, 자일렌(Xylene), 에탄올 (99％, 95％, 90％, 80％, 70％) 증류수 순으로 3분씩 배양하여 슬라이드에 남아있는 파라핀을 제거하였다. 3％ H2O2 용액을 15분 처리와 0.01 M Citric acid 용액을 10분 동안 처리하여 파라핀에 의해 활성이 억제되었던 단백질이 활성을 띄게 하는 반응을 진행하였다. 다음으로 3％ Bovine serum albumin (BSA) 으로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 간섭을 차단시켜 준 후 1차 항체 (글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3))를 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 바이오틴 (Biotin)이 결합 된 2차 항체를 상온에서 25분간 반응 시킨 후, horseradish peroxidase가 결합된 스트렙타비딘 (Streptavidin)을 25분간 반응 시켰다. 3,3'-Diaminobenzidine 용약을 30초간 반응시켜 2차 항체 발색을 유도 하였다. 핵을 염색하는 시약인 Hematoxylin을 5초 동안 반응시키고 TissueFAXS(TissueGnostics)를 이용하여 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3)의 발현수준을 관찰 하였다.Specifically, immunohistochemical staining experiments were performed on kidney and muscle tissues after 0, 24, 48, and 96 hours postmortem. After excision, paraffin blocks were prepared by immersing them in 4% formaldehyde. The paraffin block was cut into a thickness of 5 μm and attached to a slide glass. Immunohistochemical staining was performed using the Histostain-Plus 3 rd Gen IHC Detection Kit (Invitrogen) in the following order. After incubation at 65 ° C for 15 minutes, xylene, ethanol (99%, 95%, 90%, 80%, 70%) and distilled water were incubated for 3 minutes in order. 3% H 2 O 2 solution was treated for 15 min and 0.01 M citric acid solution was treated for 10 min, and the protein which was inhibited by paraffin was activated. Then, primary antibody (Glycogen synthase, Caspase 3) was incubated with 4% Bovine serum albumin (BSA) at 4 ° C for 1 hour at room temperature to block nonspecific interference. Lt; / RTI &gt; Subsequently, the secondary antibody conjugated with biotin was reacted at room temperature for 25 minutes, and horseradish peroxidase-conjugated streptavidin was reacted for 25 minutes. 3,3'-Diaminobenzidine was reacted for 30 seconds to induce secondary antibody color development. Hematoxylin, a reagent for staining nuclei, was reacted for 5 seconds and the expression levels of glycogen synthase and Caspase 3 were observed using TissueFAXS (TissueGnostics).

그 결과, 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 카스파제 3(Caspase 3)는 상기 <실시예 2>에서 얻은 결과와 유사한 발현수준변화를 보였다.
As a result, Glycogen synthase and Caspase 3 showed similar expression levels as those obtained in Example 2 above.

<실시예 4> 측방유동방식에 적당한 사후경과시간 추정용 바이오마커의 발굴Example 4: Detection of biomarkers for estimating the post-elapsed time suitable for the lateral flow system

측방유동분석법에 적당한 사후경과시간 추정용 바이오마커를 찾기위해, 샌드위치법(Sandwich ELISA) 을 수행하였다.A sandwich ELISA was performed to find a suitable biomarker for post-elapsed time estimation in the lateral flow analysis.

구체적으로, 2 /㎖의 마우스 단일클론 GAPDH 항체 50 ㎕를 미세적정 플레이트에 각각 넣어주고 4 ℃에서 항체를 플레이트 바닥에 부착하였다. 플레이트를 0.05％ Tween 20이 포함된 TBS 용액을 이용(TBST)하여 세척하고 1％ Bovine serum albumin(BSA) 200 ㎕ 를 이용하여 2시간 동안 상온에서 비특이적 간섭을 차단하였다. 그리고 사후 0 시간의 신장 조직에서 추출한 단백질을 단계적 희석을 통하여 플레이트에 첨가 한 후 37 ℃에서 1시간 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 TBST 용액을 이용하여 3번 세척을 하고, 부착된 GAPDH에 감지 항체를 반응 시켰다. 감지 항체는 염소 다중클론 GAPDH 항체를 사용 하였으며 상온에서 2시간 동안 반응 시켰다. TBST 용액을 이용하여 4번 세척을 하고 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체를 사용하여 GAPDH에 부착된 감지 항체에 부착 시켰다. 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine(TMB) 기질을 통해 horseradish peroxidase와 반응 시켜 마이크플레이트 리더기(SunriseTM, TECAN)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 농도 의존적인 반응에 대한 상관관계를 살펴보았다.Specifically, 50 μl of 2 / ml mouse monoclonal GAPDH antibody was added to each microtiter plate, and the antibody was attached to the bottom of the plate at 4 ° C. Plates were washed with TBS solution containing 0.05% Tween 20 (TBST) and blocked with 200 μl of 1% Bovine serum albumin (BSA) for 2 hours at room temperature for nonspecific interference. Then, the proteins extracted from the kidney tissues of 0 hour post-mortem were added to the plates through a stepwise dilution and reacted at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. After the reaction was completed, the cells were washed 3 times with TBST solution, and the detected antibody was reacted with the attached GAPDH. The detection antibody was a chlorine polyclonal GAPDH antibody and reacted at room temperature for 2 hours. The cells were washed 4 times with TBST solution and attached to a detection antibody attached to GAPDH using secondary antibody with horseradish peroxidase. The absorbance was measured at 450 nm through a microwave plate reader (Sunrise ™ , TECAN) by reacting with horseradish peroxidase through a 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substrate, I looked at it.

그 결과, GAPDH 가 측방유동분석법에 적당한 바이오마커임을 확인하였다(도 5).
As a result, it was confirmed that GAPDH was a suitable biomarker for the lateral flow analysis (FIG. 5).

<실시예 5> 측방유동분석 및 이를 이용한 사후경과 시간 검출용 스트립<Example 5> Lateral flow analysis and strip for detecting elapsed time using the same

사후경과 시간이 96시간을 경과했는지 여부를 추정하기 위하여, 측방유동분석을 이용한 사후경과 시간 검출용 스트립을 통해 GAPDH 검출 여부를 확인하였다. In order to estimate whether or not the post - elapsed time had passed over 96 hours, the presence of GAPDH was confirmed through a strip for post - elapsed time detection using lateral flow analysis.

측방유동분석 스트립은 총 5가지 구성성분으로 이루어져있는데, 구체적으로 시료가 흡수되는 샘플패드(Sample pad), 검정 마이크로스피어(black microsphere)가 유동형 다중클론항체와 부착되어 대상물질과 반응시 육안으로 식별 가능하게 해주는 결합패드(Conjugate pad), 신호를 육안으로 구분할 수 있게 해주는 고정형 단일클론항체가 위치하게 되는 반응막(Test membrane), 그리고 모세관 현상을 유도하는데 도움을 주는 흡수패드(absorption pad), 이러한 구성성분들을 지지해주는 접착식 폴리염화비닐 지지대(Polyvinyl chloride support pad)가 있다. Lateral flow analysis strips consist of five components. Specifically, a sample pad and a black microsphere, to which a sample is absorbed, are adhered to a flow type polyclonal antibody and are visually identified A conjugate pad to allow the signal to be visualized, a test membrane to place a fixed monoclonal antibody that allows the signal to be distinguished by the naked eye, and an absorption pad to help guide the capillary phenomenon, There is an adhesive polyvinyl chloride support pad to support the components.

반응막에는 분석하고자 하는 시료를 고정시키는 반응선(T)과 시료가 부착되지 않은 유동형 다중클론 항체를 고정시키는 대조선(C)으로 이루어져있다. 샘플패드는 5％ sucrose와 0.05 ％ Tween 20에 흡수패드를 반응시킨 후 건조 하여 사용하였으며, 흡수패드는 다른 처리를 하지 않고 사용하였다. 결합패드는 20 nm size의 검정 마이크로스피어 (black microsphere)와 다중클론 GAPDH 항체를 상온에서 부착한 후 유리섬유막 (Glass fiber membrane)에 올려놓고 37 ℃에서 완전 건조하여 사용하였으며, 반응막은 반응선(T)과 대조선(T)에 각각 단일클론 GAPDH 항체와 2차 항체를 부착하여 사용하였다. 구성성분들을 접착식 지지대 위에 시료패트, 결합패트, 반응막, 흡수패드 순으로 부착을 시킨 후, 시료를 시료패트의 투입구에 넣어 주어 반응을 시켰다. The reaction membrane consists of a reaction line (T) to immobilize the sample to be analyzed and a control line (C) to immobilize the fluid type polyclonal antibody to which the sample is not attached. The sample pad was used after reacting the absorbent pad with 5% sucrose and 0.05% Tween 20, and the absorbent pad was used without any other treatment. Binding pads were prepared by attaching black microspheres of 20 nm size and polyclonal GAPDH antibodies at room temperature and then placing them on a glass fiber membrane and drying at 37 ° C. ) And a control (T), respectively, with a single clone GAPDH antibody and a secondary antibody. The components were adhered on the adhesive support in the order of sample pad, bonding pad, reaction membrane, and absorption pad, and the sample was put into the inlet of the sample pad to react.

그 결과, 사후경과 시간이 96시간을 경과하지 않은 경우에는 GAPDH 가 검출되었으나, 96시간을 경과한 경우에는 GAPDH가 검출되지 않았다(도 7).
As a result, GAPDH was detected when the post-elapsed time did not exceed 96 hours, but GAPDH was not detected after 96 hours (FIG. 7).

Claims (14)

글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PRAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)의 모든 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 사후경과시간 추정용 키트.
Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β, Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Glycogen synthase kinase 3β) , GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PRAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α, AMPKα and β-catenin ) Of the mRNA of all the genes of the present invention or an expression level of the mRNA thereof.
제 1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프루브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 사후경과시간 추정용 키트.
2. The kit according to claim 1, wherein the agent for measuring mRNA expression level of the gene is a primer, a probe, or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene.
제 1항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 사후경과 시간 추정용 키트.
The kit according to claim 1, wherein the agent for measuring the protein expression level is an antibody that specifically binds to the protein.
제 1항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)키트, qPCR(Quantivative real time polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immnosorbent assay)키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid)키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)키트인 것을 특징으로 하는 사후경과 시간 추정용 키트.
2. The kit according to claim 1, wherein the kit comprises a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a qPCR kit, a DNA chip kit, an enzyme-linked immnosorbent assay (ELISA) kit, a sandwich ELISA kit, A protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
(1) 생물학적 시료로부터 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β (Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PRAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin)의 모든 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 사후경과 시간 추정 방법.
(1) Glycogen synthase, Glycogen synthase kinase 3?, GSK-3?, Caspase 3, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PRAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα), and β-glucuronidase-3-phosphate dehydrogenase Measuring the expression levels of all genes or protein expression levels of? -Catenin; And
(2) comparing the expression level of the gene of step (1) or the expression level of the protein with a normal control sample.
제 5항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 사후경과 시간 추정 방법.
6. The method of claim 5, wherein the expression level of the gene is an mRNA expression level of the gene.
제 6항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 사후경과 시간 추정 방법.
The method according to claim 6, wherein the measurement of the mRNA expression level is performed by a reverse transcriptase polymerase, a competitive reverse transcriptase polymerase, a real-time reverse transcriptase polymerase, an RNase protection assay, a Northern blotting or a DNA chip Way.
제 5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 사후경과 시간 추정 방법.
6. The method of claim 5, wherein the protein expression level measurement utilizes an antibody that specifically binds to the protein.
제 5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 및 샌드위치 ELISA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 사후경과 시간 추정 방법.
6. The method of claim 5, wherein the protein expression level is measured by protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-enhanced laser desorption / ionization Time of Flight Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radial immunodiffusion, Oucheroton immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS / MS), western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and sandwich ELISA. Way.
제 5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 근육조직 또는 신장조직인 것을 특징으로 하는 사후경과 시간 추정 방법.
6. The method of claim 5, wherein the biological sample is muscle tissue or kidney tissue.
생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
시료 내의 글리코겐 신타제(Glycogen synthase), 글리코겐 신타제 키나아제 3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β), 카스파제 3(Caspase 3), 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 페록시솜 확산-활성 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ), p53, AMP-활성 단백질 키나아제 α(AMP-activated protein kinase α, AMPKα) 및 β-카테닌(β-catenin) 모두와 각각 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
지지대(support pad)를 포함하는 사후경과 시간 추정용 스트립.
A sample pad on which the biological sample is absorbed;
Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3 beta, Caspase 3, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the sample, phosphate dehydrogenase (GAPDH), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-γ), p53, AMP-activated protein kinase α (AMPKα) and β-catenin a conjugate pad that binds to all of the proteins;
A reaction membrane on which a test line and a control line containing each antibody of the protein are treated;
An absorption pad on which a sample of the remaining amount is absorbed; And
A strip for post-elapsed time estimation comprising a support pad.
제 11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 근육조직 또는 신장조직인 것을 특징으로 하는 사후경과 시간 추정용 스트립.
12. The strip for estimating the post-elapsed time according to claim 11, wherein the biological sample is muscle tissue or kidney tissue.
제 11항에 있어서, 상기 반응막은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly ethylene terephthalate), PES(polyethersufone), 유리섬유 또는 나일론인 것을 특징으로 하는 사후경과 시간 추정용 스트립.
The strip according to claim 11, wherein the reaction membrane is nitrocellulose, cellulose, poly ethylene terephthalate (PVDF), polyethersufone (PES), glass fiber or nylon.
제 11항에 있어서, 상기 흡수패드는 셀룰로오스, 무명 또는 친수다공성 폴리머인 것을 특징으로 하는 사후경과 시간 추정용 스트립.
12. The strip of claim 11, wherein the absorbent pad is a cellulose, an anionic or hydrophilic porous polymer.
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