KR101736919B1

KR101736919B1 - 신규 이소프렌 신타아제 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법

Info

Publication number: KR101736919B1
Application number: KR1020160054017A
Authority: KR
Inventors: 정문근; 이상민; 조재훈; 허스코넨 안느; 일멘 마르자; 루오호넨 로라; 코이비스토이넨 오우티
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사; 테크놀로지안 투트키무스케스쿠스 브이티티 오와이
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2017-05-17
Also published as: KR20160054450A

Abstract

본 발명은 신규 이소프렌 신타아제 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 신규 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 각각 도입된 재조합 세포 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 이소프렌 신타아제는 높은 이소프렌 생성능을 가지므로, 이소프렌 생합성 및 이를 이용한 이소프렌 중합체 제조 공정에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 이소프렌 신타아제 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법{Novel Isoprene Synthase and Method of Preparing Isoprene Using Thereof}

본 발명은 신규 이소프렌 신타아제 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 신규 이소프렌 신타아제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 각각 도입된 재조합 세포 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법에 관한 것이다.

이소프레노이드 (Isoprenoid)는 의약품, 기능 식품, 향신료, 향료 및 고무 제품에서 유용한 것으로 여겨지는 이소프렌 중합체이다. 그러나, 천연의 이소프레노이드 공급은 생태계에 대한 염려로 제한되고 있다. 이러한 이유로, 불순물이 적고 더 균일성이 큰 이소프레노이드 조성물을 제공하기 위해서, 종종 고무 등의 이소프레노이드를 합성으로 생산한다. 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 수중에서 불용성이고 알코올에서는 가용성인 휘발성 탄화수소이다. 상업적으로 실행가능한 양의 이소프렌을 석유 C5 크래킹 분획분으로부터의 직접적 단리, 또는 C5 이소알칸 또는 이소알켄의 탈수로 수득할 수 있다 (Weissermel and Arpe, Industrial Organic Chemistry, 4th ed., Wiley-VCH, 117-122, 2003). C5 골격은 또한 더 작은 하부단위로부터 합성될 수도 있다.

그러나 비재생성 자원과는 관계없는 이소프렌의 상업적으로 실행가능한 생성 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다. 이소프렌의 생합성에 의한 생성은 두 가지 별개의 대사 경로에 의해 발생한다 (Julsing et al., Appl Microbiol Biotechnol, 75:1377-1384, 2007). 진핵생물 및 원시생물에서, 이소프렌은 메발로네이트 (MVA) 경로를 통해 형성되는 한편 일부의 유박테리아 및 더 고등한 식물에서는 메틸에리트리톨 포스페이트 (MEP) 경로를 통해 이소프렌을 생성한다. 식물에서의 이소프렌 배출은 빛과 온도에 의존적이어서, 잎 발생과 연계되어 증가한다.

이소프렌-생성 효소인, 이소프렌 신타아제는 사시나무(Aspen)에서 동정되었고 (Silver and Fall, Plant Physiol, 97:1588-1591, 1991; Silver and Fall, J Biol Chem, 270:13010-13016, 1995), 전체 잎에서부터 이소프렌의 생체 내 생성을 담당하고 있다고 여겨진다. 이소프렌의 박테리아 생성도 또한 기술되어 있는데 (Kuzma et al., Curr Microbiol, 30:97-103, 1995; Wilkins, Chemosphere, 32:1427-1434, 1996), 그 생성량은 배양 배지의 영양분 및 박테리아 성장 단계에 따라 다양하다 (US 5,849,970, Wagner et al. J Bacteriol, 181:4700-4703, 1999).

그러나, 선행기술의 박테리아 시스템을 통해 수득 가능한 이소프렌의 수준은 상업적으로 이용하기에는 불충분하며, 이소프렌의 제조의 공급 원료를 제공하는, 유효한 대규모의 박테리아 또는 미생물에 의한 이소프렌 제조방법이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 이소프렌 생성능이 우수한 새로운 이소프렌 신타아제 유전자를 이용한 이소프렌 제조방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 이소프렌 신타아제 유전자를 마이닝하고, Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 이소프렌 신타아제 유전자로 형질전환된 재조합 미생물의 우수한 이소프렌 생성능을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 이소프렌 생성능이 우수한 이소프렌 신타아제 및 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 이소프렌의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열; 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria), 및 상기 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제를 제공한다.

본 발명의 이소프렌 신타아제는 높은 이소프렌 생성능을 가지므로, 이소프렌 생합성 및 이를 이용한 이소프렌 중합체 제조 공정에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 이소프렌 신타아제 후보군들간의 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 이소프렌 신타아제 후보군들의 서열에 대한 다중 서열 얼라이먼트(MSA) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 pETDuet-1 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 10종류((a) P. montana, P. alba, I. batatas; (b) M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis; (c) M. notabilis, M. notabilis-F338, E. grandis; (d) E. grandis-F338, D. pinnata)의 이소프렌 신타아제가 도입된 pETDuet-1 벡터로 형질전환된 대장균 균주의 이소프렌 신타아제 발현을 확인한 것이다. (b)의 M. notabilis와 (c)의 M. notabilis는사이즈만 다른 두개의 클론으로 확인한 것이다.
도 5는 10종류(P. montana, P. alba, I. batatas, M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis, M. notabilis-F338, E. grandis, E. grandis-F338 및 D. pinnata)의 이소프렌 신타아제가 도입된 pETDuet-1 벡터로 형질전환된 대장균 균주의 이소프렌 생성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 10종류(P. montana, P. alba, I. batatas, M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis, M. notabilis-F338, E. grandis, E. grandis-F338 및 D. pinnata)의 이소프렌 신타아제가 도입된 pETDuet-1 벡터로 형질전환된 대장균 균주의 성장저해를 확인한 것이다.
도 7은 S. cerevisiae에서 IspS, IDI 및 HMG-CoA 환원효소(reductase)의 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 8은 P. kudriavzevii에서 IspS 및 IDI의 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 9는 P. kudriavzevii에서 HMG-환원효소의 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 10은 사상균에서 IspS의 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 제1관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열; 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제에 관한 것이다.

이소프렌 신타아제(isoprene synthase)는 테르펜 신타아제(TPS)-B 패밀리에 속하며, "이소프렌 스코어(isoprene score)"라는 이소프렌 신타아제에서 특이하게 보존되는 아미노산서열을 갖는다(Sharkey et al., Evolution, 67: 1026, 2013). 이소프렌 신타아제에서 중요한 아미노산은 Populus alba와 Populus canescens의 이소프렌 신타아제의 아미노산 서열을 기준으로 할 때, F338, S445, F485 및 N505이며, F338 및 F485의 페닐알라닌은 기질 결합 부위의 크기를 감소시켜, geranyl diphosphate, farnesyl diphosphate, geranylgeranyl diphosphate 등의 큰 기질이 효소의 활성 사이트에 들어가지 못하게하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산이다.

본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제는 Elaeocarpus photiniifolius 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 이소프렌 신타아제는 상기 서열번호 1의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 서열번호 7은 서열번호 1의 3번째 아미노산 다음의 위치에 삽입되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 제2관점에서, 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터; 및 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 시아노박테리아(cyanobacteria) 이외에, 대장균, 바실러스 속 균주, 효모 및 사상균으로 구성된 군에서 선택되는 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 원래의 유전자로부터 인트론이 제거될 수 있다. 본 발명에서, "폴리 뉴클레오티드" 라는 용어는 원래의 유전자 또는 변형 형태, 또는 원래 유전자나 변형 형태의 코딩서열에 사용된다.

본 발명에서의 코돈 최적화는 상기 미생물에 대하여 평균 코돈 출현빈도(codon frequency)가 12% 미만인 코돈을 평균 코돈 출현빈도가 12% 이상의 코돈으로 치환하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2의 이소프렌 신타아제 유전자를 대상으로, 일차적으로 시아노박테리아(cyanobacteria)인 Synechocystis sp. PCC6803에 대하여 코돈 최적화를 수행하였고, 이차적으로 대장균에 대하여 코돈 최적화를 수행하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 2에 서열번호 8의 염기서열이 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 서열번호 8은 서열번호 2의 3번째 코돈(9번째 염기) 다음의 위치에 삽입되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 재조합 벡터에 포함되는 프로모터는 이에 제한되는 것은 아니나, 시아노박테리아(cyanobacteria)에서의 발현을 위하여 psbA2, trc rbcL, petJ, psaA, psaB, tac, cpcB, petC 또는 lac 프로모터를 사용할 수 있고, 효모에서의 발현을 위하여 PGK1, TPI1, TDH, PDC1, FBA1, ENO1, ENO2, PYK1, ADH1 또는 TEF1 프로모터를 사용할 수 있으며 (더욱 바람직하게는 PGK1, TPI1 또는 TEF1을 사용할 수 있다), 사상균에서의 발현을 위하여 cbh1, gpdA, glaA, pdc 또는 exlA 프로모터를 사용할 수 있고, 식물세포에서의 발현을 위하여 CMV35S 프로모터를 사용할 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결 (operably linked)된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 폴리뉴클레오티드 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 폴리뉴클레오티드 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 핵산은 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, '작동가능하게 연결된'은 연결된 핵산서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명은 제3관점에서, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드, 상기 서열번호 2에 서열번호 8의 염기서열이 삽입되어 있는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드를 함유하는 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 세포; 및 상기 숙주세포인 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 플라스미드 내에 함유된다. 다른 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈에 혼입된다.

일부 구현예에서, 숙주는 그람-양성박테리아 세포, 그람-음성 박테리아 세포, 사상 진균 세포, 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이로 제한되지는 않는다.

일부 바람직한 구현예에서, 숙주는 에스케리키아 종 (E. coli), 판테오아 종(판테오아 시트레아), 바실러스 종 (바실러스 서브틸리스), 야로위아 종 (야로위아 리포리티카), 및 트리코데르마 (트리코데르마 리세이) 으로부터 선택되나 이로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CO₂, 바이카보네이트, 글루코오스, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 효모추출물, 바이오매스, molasses, 슈크로오스, 갈락토오스, 소르보스, 소르비톨, 자일로오스, 아라비노즈, 셀룰로오스, 자일란, 락토오스 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이로 제한되지 않는 탄소원을 포함하는 배지에서 배양된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 숙주세포는 시아노박테리아(cyanobacteria), 효모, 사상균 또는 식물세포일 수 있다.

바람직하게는, 상기 시아노박테리아는 단세포 시아노박테리아 또는 다세포 시아노박테리아일 수 있다. 상기 단세포 시아노박테리아는 Synechocystis 속 또는 Synechococcus 속 균주일 수 있으며, 상기 다세포 시아노박테리아는 Gloeocapsa 속 또는 사상체 시아노박테리아(filamentous Cyanobacteria)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 사상체 사아노박테리아(filamentous Cyanobacteria)는 Nostoc 속, Anabaena 속 또는 Arthospira 속일 수 있으며, 상기 효모는 Saccharomyces 속, Pichia 속, Candida 속, Kazachstania 속, Kluyveromyces 속, Hansenula 속, Rhodosporidium속, Cryptococcus 속 또는 Yarrowia 속일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 사상균은 Trichoderma 속, Mucor 속, Mortierella 속, Neurospora 속 또는 Aspergillus 속일 수 있으며, 상기 식물세포는 Nicotiana 속, Catharantus 속 또는 Hyroscyamus 속 식물의 세포일 수 있다.

본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포의 게놈상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 비바이러스 전달 방법은 전지천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질: 핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, Transfectam^TM및 Lipofectin^TM이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO 91/17424 및 WO 91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 전달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그들의 조합 바이러스를 포함한다 (Buchscher et al., J. Virol., 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol., 66:1635-1640 1992; Sommerfelt et al., Virol., 176:58-59, 1990; Wilson et al., J. Virol., 63:2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol., 65:2220-2224, 1991).

수크로오스 포스포릴라아제 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에는 아데노바이러스 기반 시스템을 더욱 많이 이용하며, 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포들에서 고효율로 형질도입을 일으키지만 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터를 이용하면 높은 역가와 높은 수준의 발현을 얻을 수 있고, 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 또한 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 표적 핵산을 가진 세포로 형질도입하는데 이용되는데, 예를 들면 생체 외 상에서 핵산과 펩티드의 생산 및 생체 내 및 생체 외 상에서 유전자 치료에 이용되며 (West et al., Virology., 160:38-47, 1987; 미국특허 제4,797,368호; WO93/24641; Kotin, Human Gene Therapy., 5:793-801, 1994; Muzyczka, J. Clin. Invest., 94:1351, 1994), 재조합 AAV 벡터의 구성은 이미 알려져 있다 (미국특허 제 5,173,414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251-3260, 1985; Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol., 4:20722081, 1984; Hermonat & Muzyczka, PNAS., 81:6466-6470, 1984; Samulski et al., J Virol., 63:038223828, 1989). 임상 실험에서는 적어도 6개의 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 방법이 이용되고 있는데 형질도입제를 생성하는 도움 세포 라인에 유전자를 삽입함으로써 결함이 있는 벡터를 보완하는 접근법이다. pLASN과 MFG-S는 임상 실험에서 사용되고 있는 레트로바이러스의 예이고 (Dunbar et al., Blood., 85:3048-305, 1995; Kohn et al., Nat. Med., 1:1017-102, 1995; Malech et al., PNAS., 94:(22)12133-12138, 1997), PA317/pLASN는 유전자 치료에 사용된 최초의 치료 벡터로 (Blaese et al., Science., 270:475-480, 1995) MFG-S 포장 벡터의 형질전환 효율은 50% 또는 그 이상을 보였다 (Ellem et al., Immunol Immunother., 44(1):10-20, 1997; Dranoff et al., Hum. Gene Ther., 1:111-2, 1997).

재조합 아데노 연관 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 있고 비병원성인 제2형 파르보바이러스 아데노 연관 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트 측면에 위치하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복을 보유한 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스젠 전달은 상기 벡터 시스템의 큰 장점이다 (Wagner et al., Lancet., 351:9117-17023, 1998; Kearns et al., Gene Ther., 9:748-55, 1996).

본 발명은 제4관점에서, (a) 상기 재조합 세포 또는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 (a) 단계의 배양은 CO₂, 바이카보네이트, 글루코오스, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 효모추출물, 바이오매스, molasses, 슈크로오스, 갈락토오스, 소르보스, 소르비톨, 자일로오스, 아라비노즈, 셀룰로오스, 자일란, 락토오스 및 오일(oil)로 구성된 군에서 선택되는 탄소원을 함유하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 제5관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제에 관한 것이다.

본 발명의 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 신타아제는 Mangifera indica 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 제6관점에서, 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터; 및 상기 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 대장균, 바실러스 속 균주, 시아노박테리아(cyanobacteria), 효모 및 사상균으로 구성된 군에서 선택되는 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 원래의 유전자로부터 인트론이 제거될 수 있다. 본 발명에서, "폴리 뉴클레오티드" 라는 용어는 원래의 유전자 또는 변형 형태, 또는 원래 유전자나 변형 형태의 코딩서열에 사용된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 4의 이소프렌 신타아제 유전자를 대상으로, 일차적으로 시아노박테리아(cyanobacteria)인 Synechocystis sp. PCC6803에 대하여 코돈 최적화를 수행하였고, 이차적으로 대장균에 대하여 코돈 최적화를 수행하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다..

본 발명은 제7관점에서, 상기 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 세포; 및 상기 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 사상체 시아노박테리아(filamentous Cyanobacteria)은 Nostoc 속, Anabaena 속 또는 Arthospira 속일 수 있으며, 상기 효모는 Saccharomyces 속, Pichia 속, Candida 속, Kazachstania 속, Kluyveromyces 속, Hansenula 속, Rhodosporidium 속, Cryptococcus 속 또는 Yarrowia 속일 수 있다.

본 발명은 제8관점에서, (a) 상기 재조합 세포 또는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법에 관한 것이다.

달리 지시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당기술 범위에 있는, 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA에서 통상 사용되는 종래 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 수많은 문헌 및 참조문헌들에 기술되어 있다 (참고로, 예를 들면: Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989; 및 Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," 1987).

달리 본원에서 정의하지 않는 한 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 적용되는 분야에서 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 예를 들어, [Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); 및 Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]은 당업자에게 본원에서 사용되는 용어 대부분의 일반적인 사전의미를 제공한다. 본원에서 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질들이 본 발명의 현장에서 유용하다는 점이 발견되었으나, 바람직한 방법 및 기술을 본원에서는 기술한다. 따라서, 바로 직후에 정의한 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조할 때 훨씬 더 충분히 기술된다.

본 발명에서 사용되는 용어 2-메틸-1,3-부타디엔 (CAS# 78-79-5) ("이소프렌")은 3,3-디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP) 로부터의 피로포스페이트의 제거로 인한 직접 및 최종적인 휘발성 C5 탄화수소 생성물을 지칭하며, 이는 [하나의] IPP 분자(들)의 [하나의] DMAPP 분자(들)로의 결합 또는 중합화를 포함하지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "이소프렌 신타아제" 및 "IspS" 는 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)로부터 피로포스페이트의 제거를 촉매작용하여 이소프렌을 형성하는 효소를 지칭한다.

일부 구현예에서, 용어 "IspS"는 천연 발생하는 성숙한 효소 또는 그의 일부를 지칭한다. 본 발명에서는 고구마 유래 이소프렌 신타아제의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하며, 이는 "변이체 단백질"을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체 단백질은 모체 단백질 (예, SEQ ID NO: 1에 제시한 IspS)과 소수의 아미노산 잔기에서 서로 상이하다. 상이한 아미노산 잔기의 개수는 하나 이상, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 이를 초과하는 아미노산 개수의 잔기이다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체간 상이한 아미노산의 개수는 1~10이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 관련 단백질 및 특히 변이체 단백질은 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 포함한다. 게다가, 본원에서 사용되는 바와 같은 관련 단백질 또는 변이체 단백질은 또 다른 관련 단백질 또는 모체 단백질과 돌출 영역의 개수에서 차이나는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 단백질은 모체 단백질과 상이한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10 개의 상응하는 돌출 영역을 갖는다.

본 발명에서 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 이소프렌 신타아제와 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 site-saturation mutagenesis, 스캐닝 돌연변이유발, 삽입 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발, 부위-특이적 (site-directed) 돌연변이유발 및 방향적 진화 (directed-evolution) 및 각종 기타 재조합 접근법으로 제작할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 적합한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유전자"란 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예, DNA 분절)을 지칭하며, 이에는 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐 아니라 개별 코딩 분절 (엑손) 사이의 개개 서열 (인트론)도 포함된다. 숙주세포로 도입되는 폴리뉴클레오티드는 인트론이 없는 코딩 부위를 포함하고, 원래 유전자의 전, 후 부위를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에 사용되는 용어 "상동성" 이란, 서열의 유사성 또는 동일성을 지칭하며, 동일성이 바람직하다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 표준 기술을 이용해 측정된다 (참고, 예, Smith and Waterman, Adv Appl Math, 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J Mol Biol, 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI 에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 Devereux et al., Nucl Acid Res, 12:387-395, 1984).

본 발명에서 사용되는 용어 "유사 서열" 이란 폴리뉴클레오티드의 기능이 본질적으로 Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 이소프렌 신타아제 (IspS)를 기준으로 하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 것이다. 추가적으로, 유사 폴리뉴클레오티드는 Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 이소프렌 신타아제의 서열과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 특징들 중 하나 초과가 이 서열에 적용된다. 유사 서열은 서열 정렬의 공지된 방법으로 측정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST이나, 상하에 지시된 바와 같이 서열 정렬화에서 유용한 기타 방법들도 존재한다.

따라서, "핵산 서열 동일성 퍼센트 (%)" 는 출발 서열 (즉, 관심있는 서열) 의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오티드 잔기의 % 로서 정의된다. 바람직한 방법은 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 디폴트 파라미터에 맞추는데 사용되고, 오버랩 범위 및 오버랩 분획은 각각 1 및 0.125로 맞추어진다.

본 발명에서 사용되는 용어 "재조합체"는 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 해서 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 즉, 다르게 비정상적으로 발현되는 본래의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 어셈블리로서, 이러한 어셈블리는 키메라 유전자를 산출한다.

본 발명에서 사용된 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭"은, 증폭된 폴리뉴클레오티드가 게놈에 처음에 존재하던 것보다 높은 카피 수로 존재하게 되는 식으로 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 불균형되게 복제되는 방법을 의미한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제제)의 존재하에서의 성장에 의한 세포의 선별은, 상기 약물의 존재 하의 성장에 필요한 유전자 생성물을 인코딩하는 내인성 유전자의 증폭, 또는 상기 유전자 생성물을 인코딩하는 외인성 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 둘 다를 도모한다.

"증폭"은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이것은 비(非)-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존하지 않는 복제)와는 대조적인 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제 충성도 (즉, 적합한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 "표적" 특이성의 관점에서 빈번히 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 선별해내기 위해 탐색된다는 의미에서 "표적들"이다. 증폭 기술은 일차적으로는 이 선별을 위해 고안되어 왔다.

본 발명에서 사용된 용어 "증폭가능 마커," "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터"는 적합한 성장 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 증폭을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동 서열"은 비교를 위해 최적으로 정렬되었을 때 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 상동 서열은 85% 내지 100% 서열 동일성을 갖고, 다른 구현예에서 90% 내지 100% 서열 동일성이 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서는, 95% 내지 100% 서열 동일성이 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 의미한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에서 사용된 용어 "이종 단백질"은 숙주세포에서 자연 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이종 단백질의 예에는 이소프렌 신타아제와 같은 효소가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질을 인코딩하는 유전자는 자연 발생적인 유전자인 반면, 다른 구현예에서는 돌연변이된 및/또는 합성의 유전자가 사용된다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동 단백질"은 천연형 또는 세포에서 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 그람-음성 세포이고, 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 에스케리키아 숙주 세포이다.

효소는, 상기 효소가 세포 내에서 대응 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 발현될 경우 숙주세포 내에서 "과발현"이다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)]에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 축퇴성으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것은 자명하다.

단백질 또는 펩티드의 용어 "성숙한" 형태란, 단백질 또는 펩티드의 최종 기능적 형태를 지칭한다. 예시로, Elaeocarpus photiniifolius 유래 이소프렌 신타아제의 성숙한 형태는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하며, Mangifera indica 유래 이소프렌 신타아제의 성숙한 형태는 SEQ ID NO:3 의 아미노산 서열을 포함한다.

단백질 또는 펩티드의 용어 "전구체" 형태란, 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열 (prosequence)을 갖는 단백질의 성숙한 형태를 지칭한다. 전구체는 또한 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호 서열"을 가질 수도 있다. 상기 전구체는 또한 번역 후 활성에 관여하는 부가적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 를 가질 수 있다.

"자연 발생 효소"는 자연에서 발견되는 것과 동일한 변형되지 않은 아미노산 서열을 가진 효소를 지칭한다. 자연 발생 효소들은 본래적 효소들, 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견되는 효소들을 포함한다.

용어 "최적 정렬"은 가장 높은 퍼센트 동일성 점수를 주는 정렬을 지칭한다. 2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 서열들 (적절한 경우) 에 대하여 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 아미노산 서열 동일성", "퍼센트 유전자 서열 동일성" 및/또는 "퍼센트 핵산/폴리뉴클레오티드 서열 동일성"은, 상기 서열들이 최적으로 정렬시 2개 서열들 내의 동일한 잔기들의 백분율을 지칭한다. 따라서, 80% 아미노산 서열 동일성은 최적으로 정렬된 2개의 폴리펩티드 서열 내에서 80% 의 아미노산들이 동일하다는 것을 의미한다. 2개 의 핵산 또는 폴리펩티드들의 맥락에서 "실질적으로 동일한" 이라는 어구는, 따라서, 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예컨대, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 기준 서열과 비교시 서열 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상 및 바람직하게는 99% 이상인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 2 개의 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다는 한가지 표시는, 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드에 대하여 면역학적으로 교차-반응성이 있는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 다른 폴리펩티드들은 면역학적 교차-반응성이 있다. 따라서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 2개 펩티드들이 보존적 치환에 의해서만 다른 경우, 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열들이 실질적으로 동일한 또 다른 표시는, 상기 두 분자들이 엄격한 조건들 (예컨대, 중간 내지 높은 엄격성의 범위 내) 하에서 서로 혼성화하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 표현 "~ 와 상응하는" 이란, 단백질 또는 펩티드 내 열거된 위치에서의 잔기, 또는 단백질 또는 펩티드 내 열거된 잔기와 유사, 상동 또는 등가인 잔기를 지칭한다. 본 발명에서 사용된 용어 "상응 영역" 이란, 일반적으로 관련 단백질 또는 모체 단백질에서 유사 위치를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 "다중 서열 정렬" 및 "MSA"은 알고리즘 (예를 들어, Clustal W)을 사용하여 정렬된 출발 유전자의 다수의 상동체 서열을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열"은 관심 대상 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체들이 비교되는 전형적인 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 용어는 또한 관심 대상 DNA 서열 내에 가장 흔히 존재하는 뉴클레오티드들을 나타내는 서열을 지칭한다. 유전자의 각 위치에 있어서, 상기 보존 서열은 MSA 내 상기 위치에서 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "보존 돌연변이화"는 출발 유전자 및 보존 서열의 서열간 차이를 의미한다. 보존 돌연변이는 MSA로부터 수득된 출발 유전자 및 보존 서열의 서열을 비교하여 동정된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이가 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한 출발 유전자 중의 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서 출발 유전자 중의 아미노산이 MSA에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변경되는 아미노산 변경이 포함된다. 그러므로, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 중의 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변경을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "상부공간" 이란, 밀봉된 용기 내 고체 또는 액체 샘플 위에 가두어진 증기/공기 혼합물을 지칭한다.

달리 언급되지 않는 한, 모든 성분 또는 조성물 수준은 그 성분 또는 조성물의 활성 수준과 관련되며, 불순물, 예를 들면 시판 중 공급원으로 존재할 수 있는 잔류 용매 또는 부산물은 제외된다.

효소 성분 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 모든 백분율 및 비율은 달리 지시되지 않는 한 중량으로 산출된다. 모든 백분율 및 비율은 다르게 언급되지 않는 한 총 조성물을 기준으로 산출된다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 신규 이소프렌 신타아제 유전자 탐색을 위한 게놈 마이닝(Genome Mining)

이소프렌 신타아제(isoprene synthase)는 테르펜 신타아제(TPS)-B 패밀리에 속하며, "이소프렌 스코어(isoprene score)"라는 이소프렌 신타아제에서 특이하게 보존되는 아미노산을 갖는다 (Sharkey et al., Evolution, 67:1026, 2013). 이소프렌 신타아제에서 중요한 아미노산은 공지된 Populus alba와 Populus canescens의 이소프렌 신타아제의 아미노산 서열을 기준으로 할 때, F338, S445, F485 및 N505이며, F338 및 F485의 페닐알라닌은 기질 결합 부위의 크기를 감소시켜, geranyl diphosphate, farnesyl diphosphate, geranylgeranyl diphosphate 등의 큰 기질이 효소의 활성 사이트에 들어가지 못하게 하는데 중요한 역할을 하는 아미노산이다.

F485는 다른 이소프렌 신타아제에 비하여 활성이 낮은 Humulus lupulus의 bi-functional myrcene synthase에서는 결여되어 있다. N505는 테르펜 신타아제들의 이온 요구성을을 결정하는데 결정적 역할을 하며, 이온 요구성이 없는 테르펜 신타아제는 상기 505 위치에 양이온을 띄는 리신(lysine)이나 세린(serine) 또는 아스파라긴(asparageine)이 위치한다. S445는 트리플 세린 모티프의 첫번째 위치에 존재하며, 다른 TPS-b 단백질에서는 보통 트리플 세린 모티프의 중간에 발린(Val)이나 이소류신(Ile)을 가지나, S445는 트리플 세린 모티프의 첫번째 위치는 거의 모든 Tps-b 패밀리에서 보전되고 있으며, 트리플 세린 모티프의 가운데 위치하는 S446은 이소프렌 생산에 있어서 중요하지 않은 것으로 판단된다.

덧붙여, 거의 모든 TPS 패밀리 서열에 존재하는 아미노산인 W317과 Y565는 기질 바인딩 포켓의 사이즈를 결정하는데 필수적이다.

이소프렌 신타아제 후보군을 결정하기 위하여, 상동성 기반 데이터베이스 서치를 수행하였다. Query 서열로 사용한 이소프렌 신타아제 서열은 다음과 같다.

1) Populus alba(white poplar, Uniport: Q50L36), Populus canescens (grey poplar, Uniprot: Q9AR86, PDB: 3N0G) 및 Pueraria montana var. lobata (kudzu wine, Uniprot: Q6EJ97);

2) WO 2013/166,320A1 유래의 Arachis hypogaea (peanut, SEQ ID 3), Glycine max (soybean, SEQ ID 5 and SEQ ID 7), Mucuna pruriens (velvet bean, SEQ ID 9), Cajanus cajans (pigeon pea, SEQ ID 11) and Quercus petraea (oak, SEQ ID 13);

3) Sharkey 리스트(Sharkey et al., Evolution, 67: 1026, 2013) 유래의 Wisteria sp. (GenBank: AEK70969), Robinia pseudoacacia (GenBank: AEK70968), Melaleuca alternifolia (GenBank: AAP40638), Eucalyptus globulus (GenBank: BAF02831), Salix sp. (GenBank: AEK70970) 및 a myrcene synthase from Humulus lupulus (GenBank: ACI32638); 및

4) Pinus sabiniana 유래의 2-methyl-3-buten-2-ol (MBO) synthase (GenBank: AEB53064)(Gray et al., J Biol Chem, 286: 20582, 2011)

추가적으로, 포플러 속 유래의 몇몇 서열을 레퍼런스로 포함시켰다.

상동성 기반 서치는 Uniport(SwissProt and TrEMBL)과 blastp를 사용하여 GenBank protein databases (nr, pat and env_nr)에서 수행하고, tblastn을 사용하여 GenBank nucleotide databases (tsa_nt, env_nt and pat) 에서 수행하였으며, E-value가 1e-30 보다 작은 경우를 추출하였다.

추가적으로, isoerpene synthase, metal binding domain protein family (PFAM: PF03936, Interpro: IPR005630)에 대해서도 Uniprot/SwissProt를 기반으로 한 InterPro domain annotations을 수행하였다.

검색된 염기서열은 GeneWise 프로그램으로 아미노산 서열로 번역하였다.

Transcriptomic 연구를 통한 cDNA 서열을 포함하는 데이타베이스인 tsa_nt (GenBank TSA1) 또한 쿼리 데이타베이스에 포함시켰으며, 사용가능한 식물 게놈 데이터의 커버리지를 높이기 위하여, 현재까지 서열이 결정된 식물 게놈에 대하여도, transcriptomic 데이타도 포함시켰다.

총 9123개 서열이 검색되었으며, Uniprot/SwissProt에서 278개 서열, Uniprot/TrEMBL에서 1,989개 서열, GenBank nucleotide databases에서 3,953개 서열 및 GenBank protein databases에서 2,905개 서열이 검색되었다. 중복되는 서열을 제거하기 위하여, 서로 80%의 상동성을 가지는 서열을 클러스터화 하였다.

검색된 테르펜 신타아제간의 기능 다양성을 확인하기 위하여, 유닉스(unix) 환경에서 스크립트를 사용하여 MSA(multiple sequence alignment)와 계통수(phylogenetic tree)를 제작하였다. 단백질 패밀리의 PFAM 도메인(PF03936)에 대하여 서열을 배열하였으며 FASTTREE 프로그램을 사용하여 MSA에 기반하여 계통수를 작성하였다.

Populus canescens IpsS (PDB: 3n0g)의 구조를 기반으로 하여 결정한 이소프렌 신타아제의 활성부위는 MSA로 표시하였다. 서열은 ClustalW 를 이용하여 얼라이하였고, 보존적 계통수는 Genious tree builder를 사용하여 100개의 resampling으로 구축하였다.

최종적으로 F485 및 F338 위치의 아미노산을 가지고 있는, 식물 유래 서열 후보로 Elaeocarpus photiniifolius 유래 서열 및 Mangifera indica 유래 서열이 결정되었다.

추가 신규 후보군이었던 Medicago sativa, Fragaria vesca subsp. Vesca, Morus notabilis, Populus trichocarpa, Dahlia pinnata, Sesamum indicum 및 Eucalyptus grandis는 F338 위치(Populus alba 이소프렌 신타아제의 아미노산 순서 기준)의 아미노산이 결여되어 있었다.

레퍼런스 이소프렌 신타아제 서열과 이소프렌 신타아제가 아닌 4개의 서열(tricyclene 또는 beta-ocimene synthase)도 레퍼런스로 포함되어 있으며, 상기 서열들의 identity %를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, 레퍼런스 이소프렌 신타아제는 빨강으로 나타내었고, 이와 유사한 서열은 밝은 빨강, 기존 문헌에 공지된 후보들은 오렌지색으로 나타내었다. 이소프렌 스코어가 4점인 이소프렌 신타아제 후보(Ipomoea batatas 및 Elaeocarpus photiniifolius)는 녹색으로 나타내었다. 새로운 후보서열은 보라색으로 나타내었고, F388을 가지고 있는 이소프렌 스코어가 3점인 후보(Mangifera indica)는 진한 보라색으로 나타내었다. 다른 기능이 밝혀진 서열에 대하여는 회색으로 나타내었다. 계통수는 EC 넘버, 생물학적 이름 및 Blast E-value를 함께 기재하였고, Blast E-value는 Geneious software를 사용하여 가시화 하였다 (도 1).

실시예 2: 선별된 이소프렌 신타아제 후보 유전자의 클로닝

실시예 1에서 선별된 Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 폴리뉴클레오티드는 공지된 이소프렌 신타아제와는 낮은 상동성을 가지고 있으므로, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해서 발현되는 단백질의 효소활성을 측정하기 위하여, 상기 폴리뉴클레오티드를 클로닝하였다.

상기 후보 폴리뉴클레오티드들을 대장균에서 발현시켜, 배양 배지에서 생산되는 이소프렌을 측정하여, 이소프렌 신타아제 활성을 확인하였으며, 공지된 이소프렌 신타아제 유전자(P. alba 및 P. montana 유래 이소프렌 신타아제 유전자)를 대조군으로 대장균에서 발현시켰다. 시아노박테리아를 이용한 클로닝 및 배양은 작업시간이 많이 걸리기 때문에 대장균을 선택하여 수행하였다.

클로닝을 위한 유전자는 N-말단 서열을 코딩하는 부분(E. photiniifolius의 N-말단 40 aa 및 M. indica의 42aa)을 제거하고 합성되었다. 또한, E. photiniifolius의 N-말단에는 서열번호 7(WSHPQFEK)로 표시되는 strep 태그를 코딩하는 서열 (서열번호 8: TGGTCCCACCCACAATTTGAAAAG)을 추가하였으며, F338 위치(Populus alba 이소프렌 신타아제의 아미노산 순서 기준)의 아미노산이 발린(Val) 또는 트레오닌(Thr)으로 돌연변이되어 있는 M. notabilis 및 E. grandis는 notabilis-F338 및 E. grandis-F338로 제작하였다. .

모든 유전자는 GenScript를 이용하여, 먼저 Synechocystis sp. PCC6803에 대하여 코돈최적화를 수행하였으며, 다음으로, 대장균에 대하여 코돈최적화를 수행하였다.

pETDuet-1를 벡터로 사용하는 경우, I. batatas, E. photiniifolius, P. alba, P. montana, M. indica, M. notabilis, E. grandis 및 D. pinnata 유래 이소프렌 신타아제 유전자에서 모두 클로닝되어, 최종적으로 P. montana, P. alba, I. batatas, M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis, M. notabilis-F338, E. grandis, E. grandis-F338 및 D. pinnata의 10종류 유전자가 클로닝되었다.

실시예 3: 이소프렌 신타아제 후보 유전자를 함유한 재조합 미생물에서의 이소프렌의 생산

3-1: 형질전환 및 배양

실시예 2에서 클로닝된 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드 후보를 함유하는 플라스미드를 대장균 BL21에 형질전환시킨 후, 이소프렌 신타아제의 발현을 확인하였다.

선별된 형질전환 균주와 모균주를 100㎍/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 액체배지에 접종하여, 30℃(또는 37℃)에서 하룻밤 배양하고, 배양액을 1:50으로 희석한 후 30℃에서 OD600 수치가 0.6~0.7이 될때까지 배양하고, 최종농도 0.5mM이 되도록 IPTG을 처리하여 효소 발현을 유도하였다. 배양은 밀폐한 20mL 상부공간 보틀(head-space bottle)을 사용하여 24시간동안 수행하였으며, 2mL/보틀로 배양액을 접종하여 수행하였다. 이와 동시에, Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 단백질 분석을 위한 배양을 수행하였다.

3-2: 이소프렌의 검출 및 정량

이소프렌 신타아제로 클로닝된 대장균 균주에서 생산되는 이소프렌의 분석은 고체상 마이크로추출법(Solid-phase microexrction, SPME)으로 측정하였다. 0.002%의 4-tert-butylcatechcol을 안정화제로 포함하는 이소프렌 표준물질(Fluka nr529240 CAS 78-79-5)을 사용하였으며, DVB/CAR/PDMS (divinylbenzene/carboxen/PDMS) fiber (2 cm)를 사용하여 분석하였다. CTC Combi PAL system (CTC Analytics, 스위스)를 샘플러로 사용하였으며, Agilent 7890A gas chromatograph (GC, Agilent 사, 미국) 및 a5975C mass selective detector (MSD, Agilent사, 미국)을 결합하여 사용하였다. 배양시에 생성되는 휘발물인 에탄올로부터 이소프렌을 분리하기 위하여, HP-5, HP-35 (30 m) 및 BPX5 (60 m) 칼럼을 사용하였으며, Lipodex (50 m) 및 HP-Innowax (60 m)으로 이소프렌을 용출시켰다.

용출 시간은 20 분이고, desorption time은 8 분이며, GC 오븐의 온도 프로그램은 40℃(4 분)에서 70℃ (5℃/분)이었으며, 총 런 타임은 16.3분이었다. 인젝터의 온도는 250℃이고, MS 데이타는 m/z 35~350에서 수집되었으며, 이소프렌은 mass spectrum을 NIST08 라이브러리에서 비교하여 확인하였다.

기본 피크는 m/z 67, mass peak m/z 68이었고, 다른 주요 단편은 m/z 53, 40 and 39이었다. Calibration curves는 3가지 다른 배지 타입(LB, BG11 및 BG11 without Na₂CO₃)에서 이소프렌을 스파이크하여 측정하였다. 농도 면적은 2~85ng/2 mL 배지였으며, 샘플은 동일한 양의 에탄올(10㎕/bottle)로도 스파이크하였다. 샘플은 배양 및 분석시에 모두 사용되는 20mL 상부공간 보틀에 담아 분석을 수행하였다. 본 방법의 정량 한계는 0.5 ng/ml이었으며, 검출한계는 이보다 낮았다.

실시예 2에서 제작한, pETDuet-1 벡터를 이용한 10종류(P. montana, P. alba, I. batatas, M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis, M. notabilis-F338, E. grandis, E. grandis-F338 및 D. pinnata)의 이소프렌 신타아제 클론의 이소프렌 신타아제 발현을 확인한 결과, 도 4 나타난 바와 같이, 유도 후 24시간 경과하였을 때, 재조합 P. montana, P alba, I. batatas, M. indica, E. photiniifolius_tag, M. notabilis, M. notabilis-F338, D. pinnata에서 이소프렌 신타아제의 뚜렷한 생산을 확인하였다.

상기 10종류의 재조합 대장균의 유도 후 24시간 경과하였을 때의 이소프렌 생성능을 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군인 P. montana, P. alba 외에 I. batatas (KR 10-2014-0095972), E. photiniifolius 및 M. indica 유래 이소프렌 신타아제에서 높은 이소프렌 생성능이 나타났다.

또한, 각 재조합 대장균 균주의 성장을 OD600 값으로 확인한 결과, IPTG 유도처리에 의해 이소프렌 신타아제 재조합 효소를 발현하는 균주의 성장이 감소하는 것을 확인하였다(도 6). .

실시예 4: 이소프렌 신타아제 유전자를 발현하는 Synechocystis sp. 세포

Synechocystis sp. PCC6803를 모균주로 사용하였고, 이를 야생형 균주(wt)라 하였다. 야생형 균주와 형질전환 균주는 BG-11 아가배지와 Hepes 버퍼로 pH 7.5로 유지된 BG-11 액체 배지에서 배양하였으며, 10 mM bicarbonate와 항생제로 kanamycin, spectinomycin 또는 chloramphenicol을 적절히 첨가하였다. Bicarbonate를 첨가하는 대신에는, 탄소원을 첨가하여 CO₂ 풍부 배양조건을 사용한다. Synechocystis sp.는 30℃, 명 (10-300 μmol photons m^-2 s^-1)조건에서 배양하였다.

Synechocystis sp.는 자연 형질전환(natural transformation)으로 형질전환하였다. 형질전환 DNA의 유무는 PCR로 확인하였다.

시아노박테리아에서 이소프렌 신타아제 발현시키기 위하여 구조물(construct)을 디자인하였다. 이소프렌 신타아제는 시아노박테리아에서 이소프렌 신타아제가 발현할 수 있도록 대장균 또는 Synechocystis 프로모터의 전사 조절하에서 발현시켰다. 일례로, 대장균의 trc 또는 lac 프로모터 또는 Synechocystis sp. psbA 프로모터 및 Synechocystis 터미네이터 또는 대장균 rrnB 터미네이터, 또는 파아지 T7 터미네이터가 사용된다.

Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 유래 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드 (서열번호 2 및 4)를 Synechocystis sp. PCC6803에서 코돈 최적화시키고, GenScript (Piscataway, NJ, USA)에서 합성하였다. 이소프렌 신타아제와 항생물질 저항성 마커에 대한 발현 카세트는 상동성 재조합에 의하여 형질전환 DNA가 게놈으로 잘 삽입되도록 하기 위하여, Synechocystis sp. 게놈의 중립위치와 상동성 서열의 옆에 위치시켰다.

중립위치는 예를 들면, Synechocystis sp. PCC6803 게놈의 slr0168 및 slr0338 사이가 이소프렌 신타아제를 도입하기 위한 적절한 타겟 loci가 될 수 있다. 다른 타겟 사이트는 원하는 산물 및 이의 전구체의 생산을 방해할 가능성이 있는 유전자를 넉아웃시키기 위하여 선택될 수 있다. 저장물질의 생합성에 필요한 유전자들로는 글리코겐 생합성에 관여하는 glgA 또는 glgC 등과 같은 유전자를 들 수 있다.

실시예 5: Mevalonate 경로의 하나 이상의 효소를 발현하는 Synechocystis sp.

이소프렌 신타아제 발현과 함께 이소프렌 합성에 기여하는 다른 유전자들을 Synechocystis에 도입하였다. 예를 들면, IPP(isopentenyl diphosphate)가 이소프렌 신타아제의 기질인 DMAPP(dimethylallyl diphosphate)로 전환되는 것을 촉진하는 isopentenyl-diphosphate delta-isomerase (EC 5.3.3.2)를 코딩하는 idi 유전자를 도입하였다. Mevalonate 경로를 구성하는 mevalonate kinase (EC2.7.1.36), phosphomevalonate kinase (EC2.7.4.2), pyrophoshomevalonate decarboxylase (EC 4.1.1.33), acetoacetyl-CoA thiolase (EC2.3.1.9), HMG-CoA synthase (EC2.3.3.10) 또는 HMG-CoA reductase (EC1.1.1.34) 중 하나 이상의 유전자가 대장균 또는 Synechocystis 프로모터 하에서 클로닝되어 시아노박테리아에서 발현될 수 있다.

둘 이상의 유전자가 대장균 또는 Synechocystis 프로모터의 전사조절 하에서 전사융합(transcriptional fusion)으로 발현되었다. 각 open reading frame은 리보솜 결합 부위(RBS)에 의하여 먼저, 독립적으로 폴리펩타이드 전사가 수행되었다. 상기 기재된 폴리뉴클레오티드들과 항생제 저항성 마커 유전자는 Synechocystis sp. 에서 선택된 타겟 구역에 대응하는 상동성 서열의 옆에 위치하여, 형질전환 구조물(construct)이 게놈에 삽입되도록 하였다.

실시예 6: non-mevalonate 경로의 하나 이상의 폴리펩타이드를 과발현하는 Synechocystis sp.

시아노박테리아가 이소프레노이드 전구체를 합성하는 non-mevalonate 경로를 가지고 있지만, homologous 또는 heterologous 소스로부터 선택된 경로 구성요소를 과발현시키는 것은 이소프렌 합성에 있어서 유익할 것이다. 구조물은 non-mevalonate 경로의 유전자인deoxyxylulose-5-phosphate synthase (DXP synthase; EC2.2.1.7), DXP reductioisomerase (EC1.1.1.267), MEP-cytidyltransferase (EC2.7.7.60), CPD-ME-kinase (EC2.7.1.148), MECDP synthase (1.17.7.1), HMBDP synthase (EC1.17.7.1), HMBDP reductase (EC1.17.1.2) 및 isopentenyl-diphosphate delta-isomerase (EC 5.3.3.2)가 Synechocystis sp. 에서 과발현되도록 mevalonate 경로 유전자에서 기술한 것과 동일한 이론으로 디자인하였다. 상기 하나 이상의 non-mevalonate 경로 유전자는 Synechocystis sp.에 도입되어, 이소프렌 신타아제 발현과 조합되었다.

실시예 7: 이소프렌 신타아제를 발현하는 재조합 Synechocystis 에 의한 이소프렌 생산

이소프렌 신타아제와 선택적인 다른 유전적인 변형을 발현시키는 Synechocystis 형질전환 균주는 in vivo 어세이를 사용하여 이소프렌의 생산을 확인하였다. 야생형 세포는 대조군으로 유사하게 실험되었다. 예를 들면, 세포는 탄소원으로 bicarbonate가 첨가되고, 적절한 항생제가 첨가된 BG11 액체배지에서, 30℃에서 100rpm의 진탕 조건 및 빛 조건으로 4일간 배양하였다. 20mL 배양액의 세포를 원심분리로 수득하고, 기밀(air-tihgt)된 20mL GC-MS 보틀에서, bicarbonate와 적절한 항생제가 첨가된 8mL의 BG11 배지에 현탁시켰다.

이소프렌 신타아제는 IPTG로 유도되는 프로모의 조절하여 발현되며, 배지에 0.5mM IPTG를 첨가하면 이소프렌 합성이 유도된다. IPTG로 유도하지 않은 배양도 수행되었다. 상기 보틀을 30℃에서 100rpm으로 240시간 진탕배양시켰다. 배양시간 동안 일정한 간격으로 샘플을 채취하였다. 정해진 각 시간에 보틀을 빼내어 배양액을 40℃로 가열하고, 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 보틀의 상부공간으로부터 이소프렌을 측정하였다.

Synechocystis의 호기성 배양에서의 배지로의 이소프렌 생산도 분석하였다. 배양배지는 주기적으로 샘플링하였으며, 상기 샘플은 GC-MS 바이알로 옮겨 40℃로 가열하고, 보틀의 상부공간으로부터 오프라인된 이소프렌을 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 측정하였다.

실시예 8: 생물반응기에서 재조합 Synechocystis sp.에 의한 이소프렌 생산

생물반응기 배양을 위한 종균은 탄소원으로 bicarbonate와 적절한 항생제가 첨가된 BG11 액체배지에서 30℃, 100 rpm, 명조건에서 배양하였다. 상기 종균은 광생물반응기(photobioreactor)의 BG11 배지로 접종되었다. 탄소원으로는 bicarbonate 또는 CO₂ 가스를 사용하였다. 광생물반응기는 빛을 조절하는 장비와 가스의 주입과 배출을 조절하는 장비를 갖추고 있다. 세포는 30℃에서 배양하고, 배양액은 교반 또는 가스버블링으로 혼합시켰다. 이소프렌 생산은 오프라인 분석을 수행하였다. 배양액은 주기적으로 샘플링하였고, 상기 샘플은 GC-MS 바이알로 옮겨 40℃로 가열하고, 보틀의 상부공간으로부터 오프라인된 이소프렌을 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 측정하였다. CO₂ 가스와 함께 광생물반응기로부터 흘러나오는 이소프렌을 수득하였다(Bentley and Melis, 2012, Biotechnol Bioeng 109:100-109).

실시예 9: 이소프렌 생산 Saccharomyces cerevisiae 균주 제작

S. cerevisiae에서 신타아제를 발현하기 위한 구조물을 디자인하였다. 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드는 2-마이크론 복제 원점 또는 ARS 서열을 포함하는 자기 복제 다카피 벡터, 중심절 벡터(centromeric vector)에서 발현되거나, 하나 이상의 카피로 게놈에 도입된다. 선택적인 다른 유전자 변형 예를 들어, IDI (isopentenyl-diphosphate delta-isomerase)의 과발현 또는 메발로네이트 경로 (mevalonate pathway) 또는 비-메발로네이트 경로 구성성분이 S. cerevisiae에 또한 도입된다. 구조물은 종래 클로닝 방법 또는 재조합 클로닝에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, S. cerevisiae strain FY834는 재조합 클로닝(Winston, Dollard and Ricupero-Hovasse, 1995)을 위해 사용된다. S. cerevisiae strain H2798 (ura-)는 모균주로, ispS 이소프렌 생산을 위해 사용된다.

SP17 명칭의 벡터가 사용되며, pRS426 플라스미드에 클로닝된 3개의 S. cerevisiae 프로모터-터미네이터 쌍이 포함된다. 절단된 Hmg-CoA 환원효소 (Polakowski et al. 1998, Appl Microbiol Biotechnol. 49:66-71)를 올리고뉴클레오티드 TAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAACTCGAGTAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTG (서열번호 5) 및 CCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTGTCGACGGATTTAATGCAGGTGAC (서열번호 6) GG를 이용하여 PCR 증폭시키고, SP17 벡터의 예를 들어 TEF1 프로모터와 ADH1 터미네이터 사이에 상동 재조합을 통해 클로닝하였다(도 7).

Elaeocarpus photiniifolius (서열번호 2) 및 Mangifera indica (서열번호 4)의 IspS 폴리뉴클레오티드는 S. cerevisiae에서 발현시키기 위해 코돈 최적화하였고, GenScript로 합성하였으며, PCR에 의해 증폭시키고 예를 들어 PGK1 프로모터와 PGK1 터미네이터 사이에 삽입하였다. IDI 폴리뉴클레오티드는 PCR로 증폭시키고, 예를 들어 TPI1 프로모터와 CYC1 터미네이터 사이에 상동 재조합을 통해 클로닝하였다. 구조물에 대한 모식도를 도 10에 도시하였다. LiAc/PEG법(Gietz and Woods, 2002, Methods in Enzymology 350: 87-96)을 사용하여 S. cerevisiae를 형질전환한다. 그 결과 제조된 플라스미드는 S. cerevisiae 균주에 형질전환시키고, SCD-Ura (synthetic complete medium lacking uracil)에서 선별하였다. 형질전환 DNA의 존재는 PCR로 확인하였다.

S.cerevisiae IspS 형질전환 균주는 30℃에서 글루코스, 갈락토오스 또는 글리세롤을 탄소원으로 포함하는 SC-Ura 배지에서 250 rpm으로 쉐이킹하여 호기적으로 전파하여, 이소프렌 생산을 위한 바이오매스를 생산한다. 이소프렌 생산을 위해, 전배양체(preculture)의 시료(aliquot)를 단단히 밀봉한 플라스크에 담긴 글루코스, 갈락토오스 또는 글리세롤을 포함하는 신선한 SC-Ura 배지로 옮기는데, 이는 이소프렌 수확을 가능하게 한다. 보틀을 96h까지 250 rpm 쉐이킹하여 30℃에서 인큐베이션한다. 배양 동안 일정 간격으로 샘플을 채취한다. 각 시점에서 보틀을 제거하고, 배양액을 40℃로 가열하여 앞서 언급된 E. coli에 대한 GC-MS법을 사용하여 보틀의 상부공간으로부터 이소프렌을 측정한다.

실시예 10: 이소프렌 생산 Pichia kudriavzevii 균주 제작

합성 Elaeocarpus photiniifolius IspS 및 Mangifera indica IspS 유전자는 S. cerevisiae에서 발현하기 위해 최적화되었고, GenScript (Piscataway, NJ, USA)에서 입수한다. IspS 폴리뉴클레오티드를 P. kudriavzevii의 PGK1 또는 TDH1 프로모터 하에서 IDI (isopentenyl-diphosphate delta-isomerase) 유전자와 함께 P. kudriavzevii 균주 ATCC32196에 도입한다. P. kudriavzevii PGK1 프로모터 및 S. cerevisiae MEL5 터미네이터는 형질전환 균주의 선별을 위해 사용되는 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 마커의 발현을 조절한다. Pk 프로모터는 US 2009/0226989 A1에 기술된 바와 같이 필수적으로 P. kudriavzevii 균주 ATCC32196의 게놈 DNA로부터 증폭된다. S. cerevisiae 및 P. kudriavzevii 유래의 터미네이터가 사용된다. 마커 카세트는 loxP 사이트 측면에 위치하여 마커의 제거 및 재사용이 가능하도록 한다. 이소프렌 신타아제 및 마커 발현 카세트는 P. kudriavzevii GPD1 유전자좌에 상응하는 상동 서열의 측면에 위치하여 GPD1 유전자좌로 도입되는 것이 가능하도록 한다. 제조된 구조물은 P.k. GPD1 5'측위 영역 (flanking region)- P.k. PGK1 프로모터 - MEL5 또는 하이그로마이신 마커-MEL5 터미네이터-P.k. 프로모터-이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드-P.k. 또는 S.c. 터미네이터 - P.k. 프로모터- IDI-P.k. 또는 S.c.- P.k. GPD1 3'측위 영역을 포함한다 (도 8).

HMG-CoA 환원효소 (Polakowski et al. 1998, Appl Microbiol Biotechnol. 49:66-71)는 P. kudriavzevii 프로모터의 조절하에서 P. kudriavzevii 중 이소프렌 신타아제와 함께 공동 발현된다. 제조된 구조물은 P.k. PDC1 3'측위 영역- P.k. 프로모터-MEL5 또는 하이그로마이신 마커 - MEL5 터미네이터 - P.k. 프로모터 - HMG -CoA 환원효소 뉴클레오티드 서열 - P.k. 터미네이터 - P.k. PDC1 5'측위 영역 (도 9).

제조된 구조물은 T. reesei cbh1 5'측위 영역- cbh1 프로모터- 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드 - A. nidulans gpdA 프로모터 하이그로마이신 저항 마커 (hph) 및 A. nidulans trpC 터미네이터 - T. reesei cbh1 터미네이터 및 3'측위 영역을 포함한다. 제조된 구조물은 PEG-매개 원형질 형질전환 (protoplast transformation)을 사용하여 T. reesei로 형질전환된다. 형질전환 균주는 하이그로마이신 저항성에 기반하여 선별된다. Hph 대신에, acetamidase A. nidulans amdS 유전자를 선별 마커로 사용할 수 있고, 형질전환 균주는 아세트아마이드를 유일한 질소원으로 사용할 능력에 기반하여 선별된다. 경우에 따라서, 이소프렌 신타아제 유전자는 A. nidulans gpdA 프로모터하에서 발현된다. 코돈 최적화된 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드는 A. nidulans trpC 터미네이터 - A. nidulans gpdA 프로모터 하이그로마이신 저항 마커 (hph) 및 A. nidulans trpC 터미네이터를 포함하는 발현 벡터로 클로닝된다. 형질전환에 사용된 플라스미드에 대한 모식도를 도 16에 나타내었다. 형질전환 균주를 단일 포자에서 기원한 콜로니에서 정제하고, 발현 카세트가 게놈으로 도입되는 것을 발현 카세트의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 유전자는 cbh1 유전자좌로 도입되거나, T. reesei 게놈에서 비상동 부위에 도입된다.

ispS 유전자를 포함하는 T. reesei 형질전환 균주를 쉐이크 플라스크 중 배지에서 배양하고, 배지는 7.6 g/L (NH₄)₂SO₄ 15.0 g/L KH₂PO₄, 2.4 mM MgSO·H₂O, 4.1 mM CaCl₂.H₂O, 3.7 mg/L CoCl₂, 5 mg/L FeSO_4·H₂0, 1.4 mg/L ZnSO₄.7H₂O, 1.6 mg/L MnSO₄·H₂O, 및 10 g/L 탄소원 또는 셀룰로오스, 자일란, 글루코스, 락토오스, 글리세롤, 갈락토오스, 소르보스 (sorbose), 솔비톨, 자일로스, 아라비노스 또는 0.7 mM 소포로스 (sophorose)로부터 선택된 탄소원의 혼합물을 포함한다. 배지의 pH는 KOH를 추가하여 4.8로 조정한다. 배양액을 8x10⁷ spores/200 ml 배지에 접종하고, 250 rpm에서 쉐이킹하면서 28℃로 원추형 플라스크에서 7일 이내 동안 성장시켰다. 배양 배지는 주기적으로 샘플링하고 샘플을 GC-MS 바이알로 옮겨, 40℃로 가열하며, 보틀의 상부공간으로부터 오프라인된 이소프렌을 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 측정하였다.

경우에 따라서, 배양액의 시료는 단단히 밀봉된 보틀 내의 신선한 배지로 옮겨진다. 보틀은 96h까지 250 rpm 쉐이킹하여 28℃에서 인큐베이션한다. 배양 동안 일정 간격으로 샘플을 채취한다. 각 시점에서 보틀을 제거하고, 배양액을 40℃로 가열하여 앞서 언급된 E. coli에 대한 GC-MS법을 사용하여 보틀의 상부공간으로부터 이소프렌을 측정한다.

실시예 11: 이소프렌 생산을 위해 이소프렌 신타아제를 과발현하는 Trichoderma reesei 균주의 제작

합성 Elaeocarpus photiniifolius IspS 및 Mangifera indica IspS 유전자는 T. reesei에서 발현을 위해 최적화되었으며, GenScript (Piscataway, NJ, USA)에서 입수한다. 코돈 최적화된 IspS 폴리뉴클레오티드를 Aspergillus nidulans의 gpdA 프로모터 또는 T. reesei의 cbh1 프로모터의 조절하에서 T. reesei 균주 Rut-30에 도입한다.

실시예 12: 이소프렌 생산을 위해 이소프렌 신타아제를 과발현하는 Aspergillus niger 균주의 제작

실시예 3의 코돈 최적화된 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드를 발현벡터에 클로닝하였으며, 발현벡터는 A. nidulans gpdA 프로모터 - 이소프렌 신타아제 유전자 - A. nidulans trpC 터미네이터 - A. nidulans gpdA 프로모터 하이그로마이신 저항성 마커 (hph) 및 A. nidulans trpC 터미네이터 (도 10)를 포함한다. 제조된 구조물을 A. niger로 형질전환한다. 형질전환은 PEG 매개 원형질 형질전환을 사용하여 수행한다. 형질전환 균주는 하이그로마이신 저항에 기초하여 선별된다. 형질전환된 DNA의 존재는 PCR에 의해 확인된다.

A. niger는 생산 배지 (The defined medium of Vogel described by Mojzita et al., 2010, 탄소원으로 20g/L 글루코스 또는 자일로스 포함)에서 성장한다. 전배양체는 10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤 및 30 g/L 젤라틴 (50 ml medium in 250 ml flasks)을 포함하는 배지에서 성장한다. 50 ml 배양액에서 균사체를 여과로 수집하고, 무균 H₂O로 수세한 다음 250 ml 플라스크에서 생산 배지 20 ml 중에 다시 서스펜션한다. 배양액은 30℃, 250 rpm에서 인큐베이션한다. 배양액은 주기적으로 샘플링하고, 샘플은 GC-MS 바이알로 옮겨져 40℃로 가열하고 보틀의 상부공간으로부터 오프라인된 이소프렌을 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 측정하였다. 경우에 따라서, 이소프렌 생산을 위해, 배양액의 시료는 단단히 밀봉된 보틀 내의 신선한 배지로 옮겨진다. 보틀은 96h까지 250 rpm 쉐이킹하여 30℃에서 인큐베이션한다. 배양 동안 일정 간격으로 샘플을 채취한다. 각 시점에서 보틀을 제거하고, 배양액을 40℃로 가열하여 앞서 언급된 E. coli에 대한 GC-MS법을 사용하여 보틀의 상부공간으로부터 이소프렌을 측정한다.

실시예 13: 식물세포에서 Elaeocarpus photiniifolius IspS 및 Mangifera indica IspS 의 발현

Elaeocarpus photiniifolius 및 Mangifera indica 이소프렌 신타아제 폴리뉴클레오티드를 식물세포에서의 발현을위하여 CaMV35S 프로모터의 조절하에서 여러 식물종에서 기능하는 과발현벡터에 클로닝시켰다. 상기 발현벡터는 형질전환 균주의 선택을 위하여 hygromycin 또는 kanamycin 저항성 마커를 가지고 있다. Nicotiana tabacum bright yellow (BY-2) 세포는 현탁배양 또는 모상근(hairy root) 배양으로 배양하였으며, 이소프렌 신타아제 발현 컨스트럭트는 형질전환은 Hakinen의 방법(Hakinen et al., Phytochemistry 68:2773~785, 2007)방법으로 수행하였다. 형질전환 균주는 항생제 내성을 기초로 하여 선택하였다. 형질전환 DNA의 존재유무는 PCR로 확인하였다. 이소프렌 축척분석을 위하여, 모상근을 카제인이 없는 변형된 Gamborg B5 배지(Jouhikainen et al., Planta 208: 545~51, 1999)로 100ml 진탕플라스크의 20ml 배지에서 rotary shaker (70 rpm, 24℃)로 28일까지 배양하였다. 배양배지는 주기적으로 샘플링하였고, 샘플은 GC-MS 바이알로 옮겨 40℃로 가열하고, 보틀의 상부공간으로부터 오프라인된 이소프렌을 상기 대장균에서 기재한 GC-MS 법으로 측정하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SK inovation VTT TECHNICAL RESEARCH CENTRE OF FINLAND <120> Novel Isoprene Synthase and Method of Preparing Isoprene Using <130> P16-B143 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 542 <212> PRT <213> Elaeocarpus photiniifolius <400> 1 Met Ala Ser Ala Gly Arg Gln Ser Ala Asn Phe Gln Pro Thr Ile Trp 1 5 10 15 Ser Tyr Asn Phe Val Gln Ser Leu Lys Thr His Tyr Thr Asp Glu Leu 20 25 30 Phe Lys Asp Arg Ala Glu Lys Leu Glu Glu Glu Val Arg Ser Met Ile 35 40 45 Asn Val Glu Tyr Val Glu Leu Leu Thr Ile Leu Glu Leu Ile Asp Asp 50 55 60 Ile Gln Arg Leu Gly Leu Gly His Arg Phe Glu Lys Asp Ile Lys Lys 65 70 75 80 Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr Ile Asp Arg Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Leu His Ala Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His 100 105 110 Gly Tyr Lys Val Ser Gln Asp Val Phe Lys Ser Phe Lys Asp Tyr Asn 115 120 125 Gly Asp Phe Lys Thr Cys Val Arg Glu Asp Val Lys Gly Met Leu Ser 130 135 140 Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Ala Phe Glu Gly Glu Asn Ile Leu Asp 145 150 155 160 Glu Ala Ala Thr Phe Thr Ser Ile His Leu Lys Asn Leu Glu Lys Asn 165 170 175 Pro Asp Lys Ser Leu Ala Glu Leu Val Ser Tyr Glu Leu Glu Leu Pro 180 185 190 Leu His Arg Arg Met Leu Arg Gln Glu Ala Arg Trp Tyr Ile Glu Ala 195 200 205 Tyr Ala Arg Arg Lys Asp Phe Asn Asn Val Leu Leu Glu Leu Ala Lys 210 215 220 Leu Asp Phe Asn Met Val Gln Ser Val Leu Gln Thr Asp Leu Lys Asp 225 230 235 240 Met Ala Arg Trp Trp Lys Asp Met Gly Leu Ala Asn Lys Leu Asn Phe 245 250 255 Ala Arg Asp Arg Leu Met Glu Ser Phe Phe Trp Ser Val Gly Met Ala 260 265 270 Phe Glu Pro Gln Phe Ser Ser Cys Arg Lys Gly Val Thr Lys Ala Phe 275 280 285 Ala Leu Ile Thr Thr Ile Asp Asp Val Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu 290 295 300 Asp Glu Leu Val Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Val Asn 305 310 315 320 Ala Val Ser Asn Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu Ala Leu 325 330 335 Tyr Asn Thr Ile Asn Glu Met Ala Tyr Asp Ser Leu Arg Glu Gln Gly 340 345 350 Glu Asn Ile Ile Pro Phe Leu Lys Lys Ala Trp Ala Asp Leu Cys Lys 355 360 365 Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Lys Gln Asn Lys Tyr Ile Pro Pro 370 375 380 Phe Asn Asp Tyr Leu Glu Asn Ala Trp Gln Ser Val Ser Gly Ala Val 385 390 395 400 Leu Leu Ile His Ala Tyr Phe Ser Val Asn Gln Ser Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Tyr His Asp Leu Leu Arg Trp Pro Ser 420 425 430 Ile Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Gly Thr Ser Ser Ala Glu Leu 435 440 445 Glu Arg Gly Glu Leu Ala Asn Ser Ile Ser Cys Tyr Met His Glu Thr 450 455 460 Gly Leu Ser Glu Glu Leu Ala Arg Arg His Ile Ser Asp Leu Ile Asp 465 470 475 480 Gln Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Tyr Leu Val Asp Asp Ser Leu Phe 485 490 495 Ala Lys Pro Phe Val Gly Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Ile Ser Gln 500 505 510 Cys Thr Tyr Gln Tyr Gly Asp Ala His Gly Asp Pro Asp Asp Arg Ala 515 520 525 Lys Asn Arg Val Leu Ser Ile Ile Val Glu Pro Ile Ser Leu 530 535 540 <210> 2 <211> 1629 <212> DNA <213> Elaeocarpus photiniifolius <400> 2 atggcttctg cggggcggca gtcagcgaac ttccaaccta ctatctggtc ctataacttt 60 gtgcagtcct tgaaaaccca ttacaccgac 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ttgaacggtg ggacgtgaat 960 gcggttagta acttacccga ttatatgaaa ctgtgttttc tggccttgta taataccatt 1020 aacgaaatgg cgtacgattc cttgcgtgaa cagggcgaaa atattatccc ctttctgaag 1080 aaagcctggg cggatttatg caaagctttc ctgcaggaag caaaatggaa acaaaacaaa 1140 tacattcccc cgttcaacga ttacctggaa aacgcttggc aaagtgtgtc cggtgctgtt 1200 ctgttgattc atgcatactt ctcagtgaac cagtctgttt caaaacaagc gttagaaagt 1260 ctgattaact accacgattt actgcggtgg ccttccatta tctttcgctt atgtaatgac 1320 ctggggacct caagcgctga attggaacgc ggcgaattag caaacagcat tagttgctat 1380 atgcatgaaa ccggtttgtc cgaagaatta gcccgtcggc acatttctga tctgatcgac 1440 caaacttgga agaaaatgaa taaatacctg gtggatgata gcttgtttgc caaaccgttc 1500 gttgggaccg ccattaacct ggcgcgtatc agccagtgta cttatcaata cggcgatgcg 1560 cacggcgatc ccgacgaccg tgcgaaaaac cgcgtgttga gcatcattgt tgaaccgatt 1620 agcctttag 1629 <210> 3 <211> 555 <212> PRT <213> Mangifera indica <400> 3 Met Ala Thr Thr Gln Asn Ser Gln Leu Thr Ile Asn Arg Arg Ser Ala 1 5 10 15 Asn Phe Gln Pro Thr Thr Trp Asn Tyr Asp Thr Leu Gln Ser Leu Thr 20 25 30 Asn Ala Gln Leu Asp Glu Glu Tyr Glu Ser Arg Gly Lys Lys Leu Glu 35 40 45 Glu Lys Val Arg Gly Met Leu Asn Asn Glu Lys Thr Glu Leu Leu Ser 50 55 60 Ile Leu Glu Leu Ile Asp Asp Ile Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg 65 70 75 80 Phe Lys Lys Asp Ile Lys Lys Ala Leu Asp Arg Ile Asp Met Ser Trp 85 90 95 Asp Asp Asn Val Lys Glu Glu Asn Arg Leu His Ala Thr Ala Leu Arg 100 105 110 Phe Arg Leu Phe Arg Gln His Gly Tyr Asn Ile Ser Gln Asp Val Phe 115 120 125 Lys Thr Phe Val Asp His Glu Gly Asn Tyr Met Pro Cys Phe Lys Lys 130 135 140 Asp Val Lys Gly Leu Ile Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Ala Phe 145 150 155 160 Glu Gly Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Ala Gln Lys Phe Ala Lys Thr His 165 170 175 Leu Ile Glu Leu Lys Thr Asn Thr Asp Pro Val Thr Ser Glu Leu Ile 180 185 190 Thr Gln Thr Leu Gly Leu Pro Leu Gln Arg Lys Ile Glu Arg Leu Glu 195 200 205 Ala Arg Phe Tyr Ile Glu Ser Tyr Ser Lys Arg Tyr Asp Ala Asn Tyr 210 215 220 Leu Leu Val Glu Leu Ser Gln Leu Asp Phe Asn Arg Val Gln Ser Ile 225 230 235 240 Tyr Gln Lys Asp Ala Lys Asp Met Thr Arg Trp Trp Lys Glu Val Asp 245 250 255 Leu Ala Ser Lys Leu Thr Phe Ala Arg Asp Arg Leu Met Glu Cys Tyr 260 265 270 Phe Trp Ala Val Gly Met Ala Pro Glu Pro Gln Phe Arg Asn Cys Arg 275 280 285 Lys Val Val Thr Lys Met Phe Ala Phe Val Thr Thr Ile Asp Asp Ile 290 295 300 Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Lys Ala 305 310 315 320 Val Glu Arg Trp Asp Leu Asn Cys Val Asn Glu Leu Pro Asp Tyr Met 325 330 335 Arg Leu Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Val Asn Glu Met Gly Tyr 340 345 350 Glu Thr Leu Lys Glu Tyr Gly Val Asn Ser Ile Pro Tyr Leu Thr Lys 355 360 365 Ala Trp Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Ile 370 375 380 Tyr Asn Lys Tyr Thr Pro Thr Phe Glu Glu Tyr Leu Asp Asn Ala Trp 385 390 395 400 Arg Ser Ser Ser Gly Pro Leu Leu Leu Val His Ser Tyr Phe Ser Leu 405 410 415 Asn Lys Ser Ile Thr Lys Glu Gly Leu Asp Tyr Val Glu Lys Tyr His 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Trp Pro Ser Ile Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu 435 440 445 Ser Thr Ser Lys Asp Glu Leu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Ser Ser Ile 450 455 460 Leu Cys Tyr Met Lys Glu Thr Gly Ala Ser Glu Glu Leu Ala Cys Glu 465 470 475 480 Glu Ile Trp Lys Leu Ile Asp Lys Thr Trp Arg Glu Met Asn Lys Asp 485 490 495 Ala Thr Asp Lys Pro Pro Leu Pro Glu Ala Phe Val Glu Thr Ala Ile 500 505 510 Asn Leu Ala Arg Ile Ser His Cys Gln Tyr Gln His Gly Asp Gly His 515 520 525 Gly Ala Pro Asp Gly Thr Ala Lys Asn Arg Val Leu Ser Ile Ile Ile 530 535 540 Asn Pro Ile Ser Val Leu Glu Pro Lys Val Ala 545 550 555 <210> 4 <211> 1668 <212> DNA <213> Mangifera indica <400> 4 atggcaacca cccaaaatag ccaattaacc atcaatcgcc gctccgcaaa ctttcagccc 60 actacctgga actacgacac cttacagtct ttgaccaatg ctcagttaga tgaagaatac 120 gaatcacgtg gtaaaaaatt agaagaaaaa gtgcggggga tgctgaataa cgaaaaaacc 180 gaactgttga gcattttaga actgattgat gacatccaac gcttgggctt aggttaccgt 240 ttcaagaaag atattaagaa agccctggat cgtatcgaca tgagttggga tgacaatgtg 300 aaagaagaaa accgcctgca tgccaccgcg ttgcgctttc gtttattccg 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cgtagcagtt ccggtccact gttgttagtg cattcatact ttagcctgaa caaatccatt 1260 accaaagaag ggttggatta tgttgaaaaa taccacaatc tgctgcggtg gccgtctatt 1320 atctttcgct tatgcaacga tctgtccacc tctaaagacg aattagaacg cggggaaact 1380 gcctcttcaa ttctgtgtta tatgaaagaa accggcgctt ctgaagaatt ggcatgcgaa 1440 gaaatctgga aattgatcga taaaacctgg cgtgaaatga ataaagatgc tactgacaaa 1500 ccgcccctgc ccgaagcatt tgtggaaacc gctattaacc tggcacgcat cagccattgc 1560 cagtatcaac atggggatgg ccacggtgcc ccggacggca ccgcgaaaaa tcgcgtgctg 1620 tccatcatca tcaatcccat tagcgtgctg gaaccgaaag tggcctag 1668 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer5 <400> 5 tagcaatcta atctaagttt taattacaaa ctcgagtaaa atggaccaat tggtgaaaac 60 tg 62 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer6 <400> 6 ccaaacctct ggcgaagaag tccaaagctg tcgacggatt taatgcaggt gac 53 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag-a <400> 7 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag-n <400> 8 tggtcccacc cacaatttga aaag 24

Claims

서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 이소프렌 신타아제.
제1항에 있어서, Mangifera indica 유래인 것을 특징으로 하는 이소프렌 신타아제.
제1항의 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 대장균, 바실러스 속 균주, 시아노박테리아(cyanobacteria), 효모, 사상균 및 식물세포로 구성된 군에서 선택되는 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서, 코돈 최적화는 상기 미생물에 대하여 평균 코돈 출현빈도(codon frequency)가 12% 미만인 코돈이 평균 코돈 출현빈도가 12% 이상의 코돈으로 치환되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서, 시아노박테리아(cyanobacteria)에 대하여 코돈 최적화된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 이소프렌 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 상기 프로모터는 psbA2, trc, rbcL, petJ, psaA, psaB , tac, cpcB , petC 및 lac으로 구성된 군에서 선택되는 시아노박테리아(cyanobacteria)에서의 발현을 위한 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 상기 프로모터는 PGK1 , TPI1 , TDH , PDC1 , FBA1 , ENO1 , ENO2 , PYK1 , AD 및 TEF1으로 구성된 군에서 선택되는 효모에서의 발현을 위한 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 상기 프로모터는 cbh1, gpdA , glaA , pdc 및 exlA로 구성된 군에서 선택되는 사상균에서의 발현을 위한 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 상기 프로모터는 식물세포에서의 발현을 위한 CMV35S 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제14항에 있어서, psbA2, trc rbcL, petJ, psaA, psaB , tac, cpcB , petC 및 lac으로 구성된 군에서 선택되는 시아노박테리아(cyanobacteria)에서의 발현을 위한 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제3항의 폴리뉴클레오티드 또는 제8항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 세포.
제16항에 있어서, 상기 숙주세포는 단세포 시아노박테리아(cyanobacteria), 다세포 시아노박테리아, 효모, 사상균 및 식물세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
삭제
제17항에 있어서, 단세포 시아노박테리아는 Synechocystis 속 또는 Synechococcus 속인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제17항에 있어서, 다세포 시아노박테리아는 Gloeocapsa 속 또는 사상체 시아노박테리아(filamentous Cyanobacteria)인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제20항에 있어서, 사상체 시아노박테리아(filamentous Cyanobacteria)은 Nostoc 속, Anabaena 속 또는 Arthospira 속인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제17항에 있어서, 효모는 Saccharomyces 속, Pichia 속, Candida 속, kazachstania 속, Kluyveromyces 속, Hansenula 속, Rhodosporidium 속, Cryptococcus 속 및 Yarrowia 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제17항에 있어서, 사상균은 Trichoderma 속, Mucor 속, Mortierella 속, Neurospora 속 및 Aspergillus 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제17항에 있어서, 식물세포는 Nicotiana 속, Catharantus 속 및 Hyroscyamus 속으로 구성된 군에서 선택되는 식물의 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제7항의 폴리뉴클레오티드 또는 제14항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria).
다음 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법:
(a) 제16항의 재조합 세포를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계.
제26항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 CO₂, 바이카보네이트, 글루코오스, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 효모추출물, 바이오매스, molasses, 슈크로오스, 갈락토오스, 소르보스, 소르비톨, 자일로오스, 아라비노즈, 셀룰로오스, 자일란, 락토오스 및 오일로 구성된 군에서 선택되는 탄소원을 함유하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 이소프렌의 제조방법:
(a) 제25항의 재조합 시아노박테리아(cyanobacteria)를 배양하여 이소프렌을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 이소프렌을 수득하는 단계.