KR101727478B1 - 아스코베이트 퍼록시다제 발현량이 증가된 돌연변이 방사무늬 김 Ｐｙ５０１Ｇ 및 이의 제조방법 - Google Patents

아스코베이트 퍼록시다제 발현량이 증가된 돌연변이 방사무늬 김 Ｐｙ５０１Ｇ 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 증가된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 조사하지 않은 방사무늬 김(Porphyra yezoensis)에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 우수한 방사무늬 김 Py501G 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

아스코베이트 퍼록시다제 발현량이 증가된 돌연변이 방사무늬 김 Ｐｙ５０１Ｇ 및 이의 제조방법 {A mutant Porphyra yezoensis Py501G expressing higher level of ascorbate peroxide and preparation method thereof}
본 발명은 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 증가된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 조사하지 않은 방사무늬 김(Porphyra yezoensis)에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 우수한 방사무늬 김 Py501G 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
다양한 환경 스트레스는 식물의 광합성 능력을 감소시킴으로써 생장을 감소시키며 탄소동화율의 감소는 산소(O2)로의 광합성적 전자의 흐름을 증가시켜 활성 산소종(Reative Oxygen Species; ROS)의 생성을 촉진함으로써 식물체에 산화적 스트레스를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 생성된 활성산소종이 제거되지 않을 경우 이들은 높은 산화력으로 단백질, 지질, 색소분자 및 유전자를 파괴하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 식물들은 환경 스트레스에 의해 생성된 ROS에 대해 효소적(superoxide dismutants;SOD, ascorbate peroxidase;APX, monodehydro ascorbate reductase;MDHAR, dehydro ascorbate reductase;DHAR, glutathine reductase;GR), 또는 비효소적(tocopherols, carotenes, ascorbate, glutathione 등) 항산화 방어기작을 체내에 발달시킴으로써 산화적 손상을 회피하고 있다.
이러한 항산화 효소들 중 세포질, 엽록체, 미토콘드리아에 존재하는 SOD는 superoxide anion(O2 -)을 hydrogen peroxide(H2O2)와 산소분자(O2)로 전환하며, 생성된 H2O2의 경우 광합성을 비롯한 다양한 ascorbate-glutathine cycle 효소들(APX, MDHAR, DHAR, GR)에 따라 신속하게 제거되어지게 된다.
식물에 있어서, 이러한 효소들 중에서 APX는 ascorbate-glutathiione cycle의 첫 번째 단계에서 환원된 아스코르브산을 이용하여, H2O2의 탈독작용에 있어 가장 중요한 peroxidase로 건조, 염 및 미네랄원소의 결핍을 비롯한 다양한 스트레스 조건에 반응하여 증가하는 것으로 알려져 있다(Lopez, F.; Vansuyt, G.; Case-Delbart, F. & Fourcroy, P. (1996). Ascorbate peroxidase activity, not the mRNA level, is enhanced in salt stressed Raphanus sativas plants. Physiological Plantarum, Vol.97, pp. 13-20.).
즉, 식물은 항산화 효소인 SOD와 APX 유전자를 엽록체에서 동시에 발현시켜 산화스트레스나 온도 스트레스에 잘 견디도록 환경을 조성해주는 역할을 한다.
이에 본 발명자는 야생형 방사무늬 김의 배양과 품종 개량에 대한 연구하던 중 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 우수한 방사무늬 김(Porphyra yezoensis)을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 제10-2011-0046426호
본 발명의 목적은 일반 야생형 방사무늬 김(P. yesonensis)보다 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 산화적 환경에 대한 저항성 및 항산화 활성특성이 우수한 품종개량된 방사무늬 김을 제공한다.
본 발명은 방사무늬 김에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성 및 항산화 활성특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김을 제공한다.
보다 자세하게는, 본 발명은 방사무늬 김(P. yesonensis)에 방사선을 조사하여 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 제공한다.
상기 방사무늬 김에 방사선을 조사한 후에 생존한 김이 방사선을 조사하지 않은 김에 비해 산화적 환경에 대한 저항성이 높고, 특히, 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 방사무늬 김을 선별하여 이를 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)로 명명하고 2015년 6월 23일 한국생물공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 KCTC 12859BP의 수탁번호로 기탁하였다.
본 발명의 일 예로써 상기 방사선 흡수선량이 0.1 내지 2kGy 가 되도록 방사무늬 김에 방사선을 조사하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 예시할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예로써 상기 방사선은 감마선, 전자선, X-선 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 예시할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예로써 상기 방사선 흡수선량이 0.1 내지 2kGy가 되도록 방사무늬 김에 방사선을 조사한 후, 생존한 방사무늬 김 Py501G 중에서 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김에 비해 3배 이상 높은 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 선별하여 이를 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)로 명명하고 KCTC 12859BP의 수탁번호로 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 양태로 방사무늬 김에 방사선을 조사하여 아스코베이트 퍼록시다제(APX)의 발현량이 우수한 돌연변이 방사무늬 김(P. yezoensis Py501G)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 방사무늬 김(P. yesonensis)에 방사선을 조사하는 단계;
상기 조사한 방사무늬 김을 배양하여 생존한 방사무늬 김을 선별하는 단계; 및
선별한 방사무늬 김과 방사선을 조사지 않은 야생형 방사무늬 김을 비교하여 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김을 선별하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 방사무늬 김을 방사선을 조사한 후 해수배지에 옮겨 배양한 다음 생존한 돌연변이 방사무늬 김을 선별하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일 예로써 상기 방사선 흡수선량은 0.1 내지 2kGy로 방사무늬 김에 방사선을 조사하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)의 제조방법을 예시할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 방사선은 감마선, 전자선, X-선 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현특성이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)의 제조방법을 예시할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 제조 시 방사무늬 김에 방사선을 조사한 후 방사무늬 김을 배양하는 배지는 동일한 기술분야에서 사용하는 통상의 배지를 사용할 수 있으나 더욱 좋게는 일반 해수에 MGM(Modified Grund Medium) 배지를 첨가한 해수배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일예로 상기 MGM 배지의 조성은 C10H14O6N2Na·2H2O(Na2 EDTA) 3.72g, FeSO4·7H2O 0.28g, Na2HPO4·12H2O 10.74g, NaNO3 42.5g, MnCl2·7H2O 0.019197g, Vitamin B12(Cyanocobalamin) 1mg을 포함하는 것일 수 있다. 상기 해수배지는 상기 MGM 배지의 조성을 포함하는 멸균된 해수 1L의 해수배지인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 해수는 표층수와 심층수를 1:1의 비율로 혼합한 혼합수를 사용하는 것이 방사무늬 김의 생육에 유리한 영향을 주어 가장 좋다.
상기에서 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 제조 시 방사무늬 김에 방사선을 조사한 김의 배양은 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12:12 Light:Dark cycle, 10 내지 15℃의 온도에서 1 내지 10주 동안 배양하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 온도범위에서 배양하는 것이 김의 엽장과 엽폭의 생장이 가장 좋게 나타내어 가장 좋다.
그 다음으로 상기 방사선 조사 후 생존한 돌연변이 방사무늬 김과 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김을 대비하여 방사능을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김에 비해 방사선 조사 후 생존한 돌연변이 방사무늬 김 중에서 아스코베이트 퍼록시다제(APX)의 발현이 우수한 돌연변이 방사무늬 김을 선별하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G의 total RNA를 추출하여 추출한 RNA를 이용하여 cDAN를 합성하여 cDNA로부터 역전사연쇄중합븐응 및 실시간 연쇄중합반응을 이용하여 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 제조한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G은 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김과 비교 시 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 3배 이상 높은 특성을 가지며, 보다 구체적으로는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 3배 높은 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방사선을 조사한 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G은 야생형 방사무늬 김에 비해 환경적 스트레스에 우수한 저항성을 가지므로 양질의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G를 재배할 수 있는 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로는 상기 제조방법에 따라 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G를 포함하는 조미김을 제공한다.
상기 제조방법에 따라 환경적 스트레스에 대한 우수한 저항성을 가짐으로 인해 양질의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 재배가능함으로써 상기 Py501G를 이용하여 식품학적으로 식용하는 조미김을 제공할 수 있다. 상기 조미김은 아스코베이트 퍼록시다제(APX)의 발현이 기존의 야생형 방사무늬 김으로 만든 조미김에 비해 현저하게 우수하므로 섭취 시에 항산화 효과가 매우 우수한 식품으로 섭취할 수 있어 좋다. 또한 상기 돌연변이 방사무늬 김 Py501G은 환경적 스트레스에 대한 우수한 저항성을 가짐으로 인해 양질의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 대량으로 재배가능함으로써 품질이 우수하면서 경제적인 김을 생산할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기 제조방법에 따라 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G를 포함하는 항산화용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 기존의 방사무늬 김에 비해 현저하게 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G를 포함하는 항산화용 건강식품을 제공하므로써 항산화 또는 항노화 예방 또는 개선용으로 효과적인 항산화용 건강식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G은 야생형 방사무늬 김에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 우수한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G을 제공하며, 상기 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높아 항산화 대응작용이 우수하여 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)보다 환경적 스트레스가 높은 조건에서도 양질의 방사무늬 김의 배양이 가능한 장점을 가진다.
본 발명의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)를 대량 생산함으로써 방사무늬 김의 품종개량하여 품질이 개선된 방사무늬 김을 대량 제공할 수 있다.
도 1은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G) 및 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)의 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량을 측정하기 위한 역전사연쇄중합반응에 이용하는 프라이머(primer) 정보 및 제작표이다.
도 2는 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)과 본 발명의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)의 역전사연쇄중합반응(Reverse transcription PCR)을 통한 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량을 비교실험한 결과이다.
도 3은 야생형 방사무늬 김과 본 발명에서 얻어진 돌연변이 방사무늬 김 Py501G의 실시간 연쇄중합반응(Real-time PCR)을 통한 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량을 비교실험한 그래프이다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G) 제조
방사무늬 김(국립수산과학원 해조류연구센터)은 Plant culture dish(100x40mm)에 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12h:12h(light: dark cycle) 온도 12℃를 유지하면서 5주간 배양하였다. 방사무늬 김(P. yezoensis)의 배양은 1L의 멸균된 해수(심층수:표층수=1:1)에, C10H14O6N2Na·2H2O(Na2 EDTA) 3.72g, FeSO4·7H2O 0.28g, Na2HPO4·12H2O 10.74g, NaNO3 42.5g, MnCl2·7H2O 0.019197g, Vitamin B12(Cyanocobalamin) 1mg 의 조성을 갖는 MGM 배지를 포함한 해수배지를 사용하였다. 방사무늬 김에 방사선의 조사는 상기 해수배지에서 배양중인 방사무늬 김에 코발트-60 조사장치(point source, AECL, IR-79, Nordion, Canada)를 이용하여 각각 0kGy, 0.1kGy, 0.2kGy, 0.5kGy, 1kGy의 흡수선량이 되도록 방사선을 조사하였다. 방사선의 선량측정은 알라닌 선량계(alanine dosimeters, Bruker Instruments,Rheinsetten, Germmany)를 이용하여 Bruker EMS 104 EPR Analyzer로 분석하였다. 방사선이 조사된 각각의 방사무늬 김은 MGM 배지에 옮겨 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12h:12h(light: dark cycle) 온도 12℃를 유지하면서 5주간 배양한 후, 현미경을 통한 cell counting을 통하여 방사무늬 김의 생존율을 분석하였다.
방사선 조사 후 생존한 방사무늬 김은 MGM 배지에 옮겨 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12h:12h(light: dark cycle) 온도 12℃를 유지하면서 5주간 배양하였으며, 포자의 방출은 방사무늬 김의 배양온도를 20℃로 증가시켜 유도하였다. 이렇게 얻어진 포자는 새로운 MGM 배지에서 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12h:12h(light: dark cycle) 온도 12℃를 유지하면서 5주간 재배양하였다.
상기에서 방사선 조사 후 생존한 방사무늬 김은 해수배지에 배양하여 얻은 방사무늬 김 중에서 방사선을 조사하기 전의 방사무늬 김보다 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 높은 방사무늬 김을 선별하여 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)으로 명명하였으며 한국생물공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다.
[실시예 2] 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis) 및 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(P. yezoensis Py501G)의 RNA 추출 및 cDNA 합성
실시예 1에서 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G과 야생형 방사무늬 김의 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현을 비교하기 위해 primer는 Primer 3 프로그램을 사용하여 300bp 이하의 크기의 primer를 제작하였다(도 1). 도 1의 primer를 제작하여 역전사연쇄중합반응 및 실시간연쇄중합반응을 통해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 유전자 수준의 발현을 확인하였다.
(1) 야생형 방사무늬 김 및 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 으로부터 추출
야생형 방사무늬 김과 상기 실시예 1로 얻은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 로부터 RNA 추출을 다음과 같이 준비하였다.
방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김과 실시예 1로 얻은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 각각 100mg을 액체질소로 급냉시켜 막자사발로 잘게 분쇄하였다. RNA purification Kit로는 QIAGEN RNeasy®Mini kit을 사용하였음, 분쇄한 방사무늬 김 샘플을 1.5mL의 micro centrifuge tube에 넣고, 450μL RLT buffer를 넣고, 볼텍싱(vortex)한 후, QIAshredder spin solum에 옮겨 2분간 15000rpm으로 원심분리하였다. 분리된 buffer층에 ethanol을 0.5mL 넣고 RNeasy spin column에 걸어 15초, 8000g으로 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 column에 700μl RW1 buffer로 15초, 8000g로 한번 더 원심분리하여 상층액은 제거한 후, 500μl RPE buffer로 15분과 2분 동안 8000g로 두 번 세척한 후, column을 1.5ml micro centrifuge tube로 옮겨 30~50μl의 RNase-free water로 첨가하여 1분동안 8000g로 원심분리하여 상기 야생형 방사무늬 김과 실시예 1로 얻은 돌연변이 방사무늬 김으로부터 RNA를 추출하였다.
(2) Total RNA 정량
Biodrop을 흡광도 230nm, 280nm의 파장 범위로 설정하고 RNase-free water 2μl를 스팟에 넣고 base를 잡은 후, 상기에서 추출한 RNA sample 2μl을 스팟에 넣고 흡광도 260nm으로 RNA 정량 값을 확인하고 야생형 방사무늬김과 돌연변이 방사무늬 김 Py501G를 각각 2μl로 정량하였다.
(3) cDNA 합성
상기 실시예에서 정량한 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 및 야생형 방사무늬 김의 2μl RNA sample을 transcriptor Fiest Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Germany)를 사용하여 cDNA를 합성시켰다. 정량된 각 RNA sample에 oligo-dT 1μl와 DEPC-water를 이용하여 총 13μl로 맞춰 65℃에서 10분간 incubation 하였다. 처리 후 RT reaction(5x) 4μl, Reverse trascriptase 1μl, RNase inhibitor 0.5μl, dNTP 2μl를 첨가하여 50℃에서 60분, 85℃에서 5분간 incubation하여 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 및 야생형 방사무늬 김의 cDNA를 합성하였다.
[실시예 3] 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 및 야생형 돌연변이 김의 cDNA을 이용한 역전사연쇄중합반응(PCR) 평가
mRNA에 대해 PCR를 적용하기 위한 방법으로 역전사연쇄중합반응은 유전자발현, 즉 mRNA가 발현하고 있는 지를 검색할 뿐만 아니라 mRNA의 정량도 가능하다.
합성된 돌연변이 방사무늬 김 및 야생형 방사무늬 김의 cDNA를 1μl 넣고 AccuPower®PCR PreMix와 gene-specific primer(10pmol/μl) 1 μl와 DEPC-water 7μl 첨가하여 PCR을 수행하였다. 반응조건은 95℃로 5분동안 denaturation반응시키고, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 35cycle 동안 증폭시킨 후 75℃, 7분으로 반응시켜 mRNA 수준의 발현량을 확인하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 것과 같이, 역전사연쇄중합반응(PCR)으로 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현을 비교한 결과 12℃의 온도에서 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김보다 실시예 1로 제조된 돌연변이 방사부늬 김 Py501G의 경우, 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 더 높게 나타남을 확인하였다.
[실시예 4] 돌연변이 방사무늬 김 및 야생형 방사무늬 김의 cDNA를 이용한 실시간연쇄중합반응(real-time PCR) 평가
돌연변이 방사무늬 김의 아스코베이트 퍼록시다제(APX)의 유전자 발현특성을 실시간으로 확인하기 위하여 실시간연쇄중합반응(real-time PCR)을 사용하였다. 실시간연쇄중합반응은 PCR 산물의 양이 각 cycle마다 측정이 가능하여 특히, 증폭이 일어나는 구간에서의 반응을 실시간으로 확인할 수 있으므로 아스코베이트 퍼록시다제(APX)의 유전자의 최초 발현량을 정확하게 확인가능하였다. 상기 실시예에서 얻은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G와 야생형 방사무늬 김 에 대한 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현차이를 비교평가하였다.
상기 Real-time PCR은 QIAGEN QunatiTest SYBR Green PCR kit를 이용하여 수행하였다. 상기 실시예 3에서 합성된 cDNA 1μl과 SYBR Green PCR Kit Master Mix 10μl과 gene-specific primer(10pmol/ml) 1μl와 DEPC-water 7μl을 첨가하여 PCR을 수행하였다. 반응조건은 95℃, 10분동안 denaturation 반응시키고, 95℃에서 10초, 56℃에서 20초, 72℃에서 10초로 40 내지 50cycle 동안 증폭시킨 후, melt curve 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 95℃에서 15초로 반응시켰다. Py18s 유전자의 프라이머(primer)를 이용하여 internal control gene으로 설정하여 각 처리구의 발현량을 비교하였다. 실험의 신뢰도를 높이기 위하여 duplex로 실행하였다. 증폭과정이 종료된 후, 각 시료의 Ct 값을 확인하고, Ct 값을 이용하여 ΔCt 값과 ΔΔCt 값을 확인하였다. ΔCt 값은 각 시료의 평균 Ct 값과 internal control gene(Py18s)의 평균 Ct 값을 구하였다. ΔCt 값은 각 시료의 평균 Ct 값에서 internal control gene(Py18s)의 평균 Ct 값을 뺀 값이다. ΔCt값은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G 값과 야생형 방사무늬 김 각각의 ΔCt값을 구한다. ΔΔCt 값은 각 시료의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G ΔCt값에서 야생형 방사무늬 김의 ΔCt 값을 뺀 값이다. 야생형 방사무늬 김의 발현량을 1로 설정했을 때, 돌연변이 방사무늬 김 Py501G의 상태적 발현향을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서처럼 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G이 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김에 비해 액 3배 정도 높은 값을 가짐을 확인하였다.
이러한 도 3의 결과로부터 본 발명의 돌연변이 방사무늬 김 Py501G는 방사선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 더 높게 유지됨을 나타내었다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12859BP
수탁일자 : 20150623
<110> University Industry Liaison Office of Chonnam National University <120> A mutant Porphyra yezoensis Py501G expressing higher level of ascorbate peroxide and preparation method thereof <130> P15020270142 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX forward primer <400> 1 atcagctacg cggacctcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX reverse primer <400> 2 aagcccatcc ggtaaaagat 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Py18s forward primer <400> 3 cgaccgttta ctgtgaag 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Py18s reverse primer <400> 4 gacaatgaaa tacgaatgcc 20

Claims (9)

  1. 방사무늬 김(P. yezoensis)에 감마선을 조사하면서 배양하여 얻은, 감마선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 방사무늬 김 Py501G는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현이 감마선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)에 비해 3배 이상 높은 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP).
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 감마선 흡수선량이 0.1 내지 1 kGy 가 되도록 방사무늬 김(P. yezoensis)에 감마선을 조사하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP).
  4. 삭제
  5. 방사무늬 김에 감마선을 조사하면서 배양하는 단계;
    상기 배양한 방사무늬 김과 감마선을 조사하지 않은 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)을 비교하여 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김을 선별하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP)의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 선별된 돌연변이 방사무늬 김은 야생형 방사무늬 김(P. yezoensis)에 비해 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 3배 이상인 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP)의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    흡수선량 0.1 내지 1 kGy로 방사무늬 김에 감마선을 조사하는 것을 특징으로 하는 아스코베이트 퍼록시다제(APX) 발현량이 높은 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP)의 제조방법.
  8. 제 5 내지 7항으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 항에 따라 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP)을 포함하는 조미김.
  9. 제 5 내지 7항으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 항에 따라 제조된 돌연변이 방사무늬 김 Py501G(KCTC 12859BP)를 포함하는 항산화용 건강식품.
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