KR101725987B1 - 물방울이 계면에 합쳐지는 과정을 이용하여 2차원 계면상에서 서로 다른 계면활성물질의 섞임을 관찰하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2차원 계면 상에서 서로 다른 두 계면활성물질이 섞이는 과정을 관찰하기 위한 시스템 및 방법에 대한 것이다. 본 발명은 평평한 공기/물 계면(200)을 형성하기 위한 수용부(100), 평평한 공기/물 계면에 형성된 계면활성물질 단일막(300), 물방울(400)을 만들기 위한 유리관(110)과 압력 제어부(120), 물방울의 표면에 형성된 계면활성물질 단일막(500), 물방울을 움직여 평평한 공기/물 계면에 합치기 위한 위치 제어부(130), 이로 인해 형성된 두 계면활성물질 단일막 간의 깔끔한 경계가 섞임으로 인해 불분명해지는 과정을 관찰하기 위한 측정부(140)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

물방울이 계면에 합쳐지는 과정을 이용하여 2차원 계면상에서 서로 다른 계면활성물질의 섞임을 관찰하기 위한 시스템 및 방법 {Measurement of 2D inter-mixing between two different surface active agents using droplet merging process}

본 발명은 2차원 계면상에서 계면활성물질의 섞임을 관찰하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서로 다른 계면활성물질 간의 깔끔한 경계를 형성함으로써 두 계면활성물질 간의 섞임을 2차원 계면상에서 관찰하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

계면활성제는 양친성이라는 독특한 특성으로 인해 세제, 헤어 및 섬유 컨디셔너, 화장품, 식품, 염료, 페인트 등 산업/기술적인 전반적인 분야에서 응용이 활발히 이루어지고 있는 물질이다. 이때, 서로 다른 종류의 계면활성제가 섞이게 되면 단순히 두 계면활성제의 성질을 각각 가지는 것이 아니라 이전에 없던 새로운 기능이 나타나기도 하고, 기능에서 많은 개선이 이루어지기도 하기 때문에 산업적으로 계면활성제 간의 섞임을 이해하는 것은 중요하다. 뿐만 아니라 세포막을 이루고 있는 인지질이나 단백질 또한 이런 계면활성물질에 속하며 다양한 종류의 인지질과 단백질이 공존하고 있는 세포막에 대한 이해를 통해 세포막 관련 질병들의 치료제를 개발하기 위해서도 이런 계면활성물질 간의 섞임을 파악하는 것이 필요하다. 하지만 이러한 계면활성물질이 직접적으로 작용하는 환경은 2차원 계면상임에도 현재 서로 다른 계면활성물질간의 섞임은 그 관찰 시스템 및 방법의 부재로 인해서 3차원에서 거시적인 관찰을 통해서 주로 이루어지고 있는 실정이다. 이런 2차원에서의 계면활성물질간의 섞임을 관찰하는 것이 어려운 이유는 서로 다른 계면활성물질간의 깔끔한 경계를 2차원 상에서 형성하기 힘들기 때문이다. 이에 2차원 계면상에서 서로 다른 계면활성물질간의 깔끔한 경계를 형성하고 그를 통해 두 계면활성물질간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템 및 방법이 필요하다.

한편, 상기 계면활성물질간의 섞임과 관련하여, 계면활성물질의 확산도를 측정할 수 있는 기술들이 개발되어 왔으며, 특히 지질막의 확산도와 관련하여 연구되었다. 지질-기반 막은 단일막 및 이중막으로서, 폐계면활성제(1-3), 지질방울(4, 5), 세포막(6, 7) 및 세포소기관 막(8, 9) 등이 있으며, 신호전달 및 수송(57, 10, 11)과 같은 이들의 기능이 더 중요하게 여겨져 왔다. 세포막에서는, 래프트(raft) 형성에 의해 이들의 기능이 나타난다(6, 10, 11). 지질 래프트의 측면 분리 및 매우 동적인 특성은 세포막의 유동성을 나타낸다(12, 13); 유동성 없이, 지질은 자유롭게 이동할 수 없으며 따라서 래프트를 형성하고 기능을 수행하는 것이 불가능하다. 지질 단일막에서, 폐계면활성제의 유동성이 합성 동물-유래 폐 계면활성제 대체에 있어 중요한 요소일 수 있음이 밝혀졌다(2, 3, 14). 지질막의 유동성은 일반적으로 점성도에 의해 결정된다(3, 15, 16). 점성도가 유동성의 직접적인 척도를 제공하는 것은 아니지만, 이러한 관점에서 확산성이 대안이 될 수 있으며, 점성도 측정이 불가한 경우에 보다 쉬운 측정법이 될 수 있다. 이로써 표면-활성 분자 및 지질막의 확산도를 측정할 수 있는 기술들이 개발되어 왔다(1721). FRAP 는 형광 염료의 물리적 특성을 이용한다: 형광 염료는 고선속의 여기광선에 노출되었을 때 비가역적으로 발광능력을 상실한다. 예상 지역에서 퇴색이 일어나면, 비퇴색 부분의 형광염료는 퇴색된 부분으로 확산되고 결과적으로 화학적 전위구배가 생긴다. 분획강도(fractional intensity)는 다음과 같이 정의되며 f(t) = (F(t) Fi)/(Fo Fi), 상기 F(t), Fi, 및 Fo 는 각각 시간에 따른 퇴색부분의 강도, 퇴색부분의 초기 강도, 비퇴색 부분의 강도를 나타낸다. 상기 분획강도를 다음 수학식 1의 FRAP 방정식(17)으로 fitting 한다.

수학식 1

상기 수학식 1에서 C는 표준화 인자, τ 는 특정 확산 시간, I₀ 및 I₁ 는 변형된 베셀함수(Bessel functions)를 나타내며, 상기 수학식은 확산계수 D = a2/τ와 연관있는 시간상수 τ를 제공하고, a 는 퇴색 부분의 반경(radius)을 나타낸다. 확산(17, 20, 24) 및 동적 반응(22, 23)을 측정하기 위한 기술이 개발되었고, 이러한 기술들은 세포내 물질의 수송 및 막 모델을 포함한 다양한 시스템에 사용되었다. 그러나, FRAP 기술에는 보통 고출력 레이저가 장착된 공초점 현미경이 사용되며, 형광 염료의 퇴색으로 인해 용도가 제한된다.

이에, 본 발명자들은 상술한 FRAP 기술의 단점을 완화시키기 위하여, 유체/유체 계면에서 계면활성 물질의 확산을 측정하기 위한 새로운 기술인 FRAM (fluorescence recovery after merging) 을 개발하였으며, 나아가 현재까지 그 관찰 시스템 및 방법의 부재로 인해서 측정이 제한되어 왔던 서로 다른 계면활성물질 간의 섞임까지 관찰할 수 있는 시스템을 개발하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 2차원 계면상에서 서로 다른 계면활성물질간의 섞임을 관찰하기 위한 새로운 시스템을 구축하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 2차원적 유체/유체 계면 상에서 두 가지 계면활성물질 간의 섞임을 시각적으로 관찰할 수 있는 시스템을 개발하였고, 본 시스템을 이용하여 두 계면활성물질이 2차원 계면에서 어떠한 형태로 섞여 들어가는지 관찰함으로써 두 계면활성물질 간의 상호작용에 대한 정보를 제공할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 광퇴색(photobleaching)이 나타나는 FRAP 기술의 단점을 보완한 새로운 기술인 FRAM (fluorescence recovery after merging)를 개발하였으며, 이를 이용하여 유체/유체 계면에서 표면-활성 물질의 확산을 측정할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태(aspect)에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법을 제공한다:

(a) 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체의 유체 방울 또는 액적(droplet)을 형성하는 단계;

(b) 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 표면에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 인가하는 단계; 및

(c) 상기 제1유체 및 제2유체의 계면(interface)에서 상기 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하는 단계.

본 발명자들은 2차원 계면상에서 서로 다른 계면활성물질간의 섞임을 관찰하기 위한 새로운 시스템을 구축하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원적 유체/유체 계면 상에서 두 가지 계면활성물질 간의 섞임을 관찰할 수 있는 시스템을 개발하였다. 본 발명자들은 본 시스템을 이용하여 두 계면활성물질이 2차원 계면에서 어떠한 형태로 섞여 들어가는지 관찰함으로써 두 계면활성물질 간의 상호작용에 대한 정보를 제공할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 광퇴색(photobleaching)이 나타나는 FRAP 기술의 단점을 보완한 새로운 기술인 FRAM (fluorescence recovery after merging)를 개발하였으며, 이를 이용하여 유체/유체 계면에서 표면-활성 물질의 확산을 측정할 수 있음을 확인하였다.

보다 상세하게는, 본 발명은 2차원 계면상에서 계면활성물질간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템에 관한 것으로, 평평한 공기/물 계면(200)을 형성하기 위한 수조(100), 평평한 공기/물 계면에 형성된 계면활성물질 단일막(300), 물방울(400)을 만들기 위한 유리관(110)과 압력 제어부(120), 물방울의 표면에 형성된 계면활성물질 단일막(500), 물방울을 움직이기 위한 위치 제어부(130), 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 측정부(140)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 수조(100)에 물을 채우게 되면 평평한 공기/물 계면(200)이 형성된다. 이렇게 형성된 평평한 공기/물 계면(200)에 형광물질이 포함된 계면활성물질 단일막(300)을 만든다. 그리고 유리관(110)과 압력 제어부(120)를 이용하여 유리관(110)에 매달려있는 물방울(400)을 형성한다. 이렇게 형성된 물방울(400)의 표면에 형광물질이 포함되지 않은 계면활성물질 단일막(500)을 형성한다. 이후 위치 제어부(130)를 이용하여 물방울(400)을 평평한 공기/물 계면(200)으로 이동시키면 물방울이(400)이 평평한 공기/물 계면(200)에 합쳐지게 된다. 이 과정에서 물방울(400)의 표면에 있는 계면활성물질 단일막(500)이 평평한 공기/물 계면(200)에 있는 계면활성물질 단일막(300) 사이에 삽입되게 된다. 그 결과 서로 다른 두 계면활성물질 단일막이 깔끔한 경계를 두고 2차원 계면상에서 만나고 있는 상태가 만들어진다. 이후 측정부(140)를 통하여 두 계면활성물질 단일막이 서로 섞여 들어가는 과정을 살펴봄으로써 서로 다른 두 계면활성물질이 섞이는 과정을 관찰할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “계면활성물질”과 “표면활성물질”은 동일한 의미로 사용된다. 계면활성물질은 친수성 부분과 소수성 부분으로 이루어진 양쪽 친매성 물질을 의미한다. 상기 계면활성물질은 인지질과 같이 단순히 친수성 부분과 소수성 부분으로 구성된 분자만을 의미하는 것이 아니라, 양친성 단백질, 나노 비드, 마이크로 비드 등 일반적으로 화학적 계면활성제에 해당하지 않는 물질이라도 계면에 존재하고자 하는 성질을 가지고 있는 물질이라면 모두 포함하는 것으로 해석된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 계면활성물질은 인지질(phospholipids), block 코폴리머, 단백질, 나노입자 등을 포함하며, 보다 상세하게는 인지질로서, 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 또는 1,2-올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC) 등 이다. 본 발명에서 사용하는 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질은 동일한 물질일 수도 있고 다른 물질일 수도 있다. 한편, 본 발명에서 상기 계면활성물질의 소수성 부분은 필요에 따라 시그널-표지될 수 있다(예컨대, 형광물질).

본 명세서에서 용어 “유체 방울”과 “액적(droplet)”은 동일한 의미로 사용된다.

이하, 본 발명의 “2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법”에 대하여 상세하게 설명한다:

단계 (a): 제1유체의 액적(droplet) 형성

우선, 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 준비한다.

본 발명에 따르면, 상기 제1유체는 친수성 물질로서, 양쪽 친매성 물질인 계면활성물질과 혼합 시 제1유체의 표면(surface)에는 계면활성물질로 이루어진 막(layers)이 형성된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1유체는 물이고, 상기 제1계면활성물질은 인지질(phospholipids)이다. 상기 제1계면활성물질은 상기 제1유체의 표면에서 단일막(monolayer)을 형성한다.

상기 제1계면활성물질은 선택적으로 시그널-표지된(signal-labeled) 분자를 포함할 수 있다. 상기 시그널 발생물질로서, 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있으며, 예컨대 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 로다민, 플루오레신, 피코에리트린, 리사민, Cy3 및 Cy5), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), 자기입자, 금속 표지(예컨대, 금 및 은) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 시그널 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 형광 시그널이다.

본 발명에 따르면, 상기 시그널 발생물질은 제1계면활성물질 및/또는 제2계면활성물질에 포함될 수 있다. 예컨대, (ⅰ) 제1계면활성물질만이 시그널 발생물질을 포함하는 경우, (ⅱ) 제2계면활성물질만이 시그널 발생물질을 포함하는 경우, 및 (ⅲ) 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질 모두가 시그널 발생물질을 포함하는 경우가 있을 수 있다. 상기 시그널 발생물질에 의해 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질의 섞임을 관찰할 수 있다. (ⅲ)의 경우에는 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질이 서로 다른 시그널 발생물질을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1계면활성물질은 시그널을 발생하는 물질(예컨대, 형광물질)로 표지되어 있지 않고, 제2계면활성물질은 시그널을 발생하는 물질로 표지되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형광표지되지 않은 계면활성물질로 둘러싸인 물방울은 모세관 내부에 압력을 인가하여 모세관 내부의 유체를 외부로 밀어냄으로써 모세관 말단에 유체방울을 형성시키는 방법으로 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 끝을 뾰족하게 만든 유리 파이펫 내부에 인지질(계면활성물질)이 포함되어있는 수용액을 채운 후 마이크로인젝터에 연결한다. 이 후 마이크로인젝터를 이용하여 가해지는 압력과 시간을 조절함으로써 일정 크기의 물방울을 형성시킨다. 이 단계에서 물방울(액적)의 크기를 조절함으로써 이후 물방울이 아래쪽의 물과 병합될 때에 형성되는 검은 영역(dark area)의 크기를 조절할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 액적의 크기는 직경 50 μ내지 300 μ이다.

단계 (b): 제2유체에 액적의 인가

이어, 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 표면에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 인가한다. 액적을 인가하는 방법은, 일정 높이에서 액적을 떨어뜨리거나, 또는 유체의 표면과 가까운 거리에서 액적을 놓아두는 방법으로 수행할 수 있다. 액적을 일정 높이에서 떨어뜨리더라도 액적의 크기가 매우 작아 표면 파장에 의한 영향이 거의 없을 것이나, 유체의 표면과 가까운 거리에서 액적을 인가하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따르면, 상기 제2유체는 친수성 물질로서, 양쪽 친매성 물질인 계면활성물질과 혼합 시 제2유체의 표면(surface)에는 계면활성물질로 이루어진 막(layers)이 형성된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2유체는 물이고, 상기 제2계면활성물질은 인지질(phospholipids)이다. 상기 제2계면활성물질은 상기 제2유체의 표면에서 단일막(monolayer)을 형성한다. 본 발명에서는 제2계면활성물질이 계2유체 상에 형성되는 것으로 기재되어 있지만, 이것은 기재의 편의를 위한 것일 뿐, 제2유체 없이 제2계면활성물질로 이루어진 단일층(monolayer)에 상기 제1유체를 인가하는 것을 배제시키는 것은 아니다. 제2유체없이 제2계면활성물질이 단일층을 형성할 수 있다면, 제2유체를 사용하지 않아도 무관하다. 다시말하면, 본 발명에서는 “제1계면활성물질-코팅된 액적”과 “(시그널 표지된) 제2계면활성물질의 단일층”을 형성할 수 있는 한, 제2유체를 필수적으로 이용하지 않아도 무관하다.

상기 제2계면활성물질은 제1계면활성물질과 마찬가지로, 시그널-표지된(signal-labeled) 분자를 포함할 수 있다. 상기 시그널 발생물질로서, 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있으며, 예컨대 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 로다민, 플루오레신, 피코에리트린, 리사민, Cy3 및 Cy5), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), 자기입자, 금속 표지(예컨대, 금 및 은) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 시그널 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 형광 시그널이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) 또는 단계 (b)에서 상기 제1유체의 액적의 위치를 조절하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 액적을 이동시키는 도구(예컨대, 모세유리관)를 위치 제어장치에 장착하여 액적의 위치를 조정할 수 있다.

단계 (c): 계면활성물질의 섞임 관찰

마지막으로, 제1유체 및 제2유체의 계면(interface)에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰한다.

계면 관찰시에는 제1유체 및 제2유체의 계면을 측면부 및 하부에서 동시 관찰할 수 있다. 본 발명자들은 2 방향에서 계면을 관찰함으로서 계면활성물질의 병합과정에 대한 보다 구체적인 정보를 얻을 수 있었다. 예컨대, 단계 (c)의 측면부 관찰을 통해 액적의 위치, 크기 및 제1유체 및 제2유체의 병합과정을 관찰할 수 있었고; 하부 관찰을 통해 제1유체 및 제2유체의 병합과정 이후 상기 유체의 계면에서 나타나는 시그널 이미지를 분석하여 형광이 복구되는 과정(Fluorescence recovery process)을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 이미지는 형광 이미지이며, 상기 이미지 분석은 형광 이미지를 통하여 형광이 복구되는 과정(Fluorescence recovery process)을 관찰함으로써 유체의 확산도(diffusivity)를 측정하는 것을 의미한다.

본 발명의 중요한 성과 중 하나는 불용성 계면활성제 단일막의 확산계수를 측정하기 위한 새로운 기술인 FRAM (fluorescence recovery after merging)을 개발했다는 것이다. 본 발명의 FRAM 기술은 종래의 FRAP 보다 우수한 장점이 있으며 모든 가용성/불용성 계면활성제 단일막의 확산을 측정하는데 적용될 수 있을 것이다. 본 발명의 기술을 간단히 설명하면 다음과 같다: 계면활성제-코팅된 물방울을 형광 표지된 평면 단일막과 병합시킨다. 병합과정동안, 물방울의 단일막은 평면 단일막에 삽입되며, 형광현미경 하에서는 어두운 부분으로 나타난다. 형광 회복에 따른 분획강도를 측정하고, 확산계수를 산출한다. 본 발명자들은 2가지 가장 일반적인 인지질 단일막 (DPPC 및 DOPC)을 이용하여 이 기술을 검증하였고, 이들 혼합물의 확산을 연구하였다.

도 4 는 본 발명의 FRAM 기술을 모식적으로 나타낸 것이다. 본 발명자들은 평면 공기/물 계면에서 형광염료의 소분획으로 도핑된 인지질 단일막(적색) 및 물방울 표면에 염료가 없는 동일한 인지질 단일막(검은색)을 준비하였다. 물과 물방울이 병합되면서 형광 표지된 단일막으로 둘러싸인 비형광 단일막인 검은 영역이 생겨났다; 이는 광퇴색(photobleaching) 단계가 없는 FRAP 기술의 초기 조건에 해당한다. 이어 형광 염료가 검은 영역에 채워지는 동안 분획강도(fractional intensity)를 측정하였다. FRAP과 같은 방법으로 확산계수를 산출하였다. 가장 일반적인 인지질막인 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 1,2-올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)의 시간에 따른 자가-확산 계수를 측정함으로써 본 발명의 방법을 검증하였다. 또한, 고정된 표면압에서 서로 다른 비율의 DPPC DOPC 혼합물을 측정하여 혼합물의 확산상수가 _DPPC = 0.95가 될 때까지 DPPC의 증가에 따라 천천히 감소하는 것을 밝혔다. 해당 표면압 _DPPC = 0.95 에서는 상 전이(phase transition)가 나타난다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 구성을 포함하며, 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템을 제공한다:

(a) 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체 및 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 계면(interface)을 형성하기 위한 수용부(100);

(b) 상기 제2유체의 표면(surface)에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적(droplet)(400)을 인가하는 액적 도입부(110); 및

(c) 상기 계면에서 상기 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 측정부(140).

본 발명의 시스템은 상술한 본 발명의 “2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법”을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복합성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

이하, 본 발명의 시스템에 대하여 상세하게 설명한다:

구성 (a): 수용부

본 발명의 시스템은 (ⅰ) 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체 및 (ⅱ) 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 계면(interface)을 형성하기 위한 수용부를 포함한다. 상기 수용부는 제1유체 및 제2유체를 내부에 수용하며, 평면적 계면(planar interface)을 형성하기 위한 공간을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 다르면, 상기 수용부는 투명한 재질의 유리 또는 플라스틱으로 구성되며, 수용부가 불투명한 물질로 제작되더라도 특정 시그널을 통과시켜 내부를 관찰할 수 있다면 공지된 어떠한 물질로 구성되어도 무관하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2계면활성물질은 시그널-표지된(signal-labeled) 분자를 포함하며, 예컨대 상기 시그널은 형광 시그널이다. 한편, 상기 계면활성물질은 상기 제1유체 또는 제2유체의 표면에서 단일막(monolayer)을 형성한다. 상술한 바와 같이, 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질은 양쪽 친매성 물질로서, 소수성 부분에 시그널-표지된 물질이 결합될 수 있다. 예컨대, 상기 계면활성물질이 인지질인 경우, 인지질의 소수성 부분(head)이 형광염료로 태깅될 수 있다.

구성 (b): 액적 도입부

본 발명의 시스템은 상기 제2유체의 표면(surface)에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적(droplet)을 인가하는 액적 도입부를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 액적 도입부는 모세관으로서, 상기 모세관은 내부에 제1유체를 수용할 수 있으며, 말단에서 유체 방울 또는 액적(droplet)(400)을 형성시키며, 상기 제2유체에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 접촉시키는 역할을 한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 액적 도입부는 유리 또는 플라스틱으로 구성된 관이다.

한편, 본 발명의 시스템은 상기 모세관 내부에 압력을 인가하여 모세관 말단에 유체방울을 형성시키는 압력 제어부(120)를 추가적으로 포함할 수 있으며, 제2유체에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 접촉시킬 때 상기 제1유체의 액적의 움직임 및 위치를 제어하기 위한 위치 제어부(130)를 추가적으로 포함할 수 있다.

구성 (c): 측정부

본 발명의 시스템은 제1유체-제2유체의 계면에서 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 측정부(140)를 포함한다.

본 발명에서 상기 측정부는 제1유체 및 제2유체의 계면을 수용부의 측면부 및 하부에서 동시관찰 가능하도록 구성된다. 즉, 측면부 관찰을 통해 액적의 위치, 크기 및 제1유체 및 제2유체의 병합과정을 관찰하고; 하부 관찰을 통해 제1유체 및 제2유체의 병합과정 이후 상기 유체의 계면에서 나타나는 시그널 이미지를 관찰하여 분석한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 이미지는 형광 이미지이며, 상기 이미지 분석은 형광 이미지를 통하여 형광이 복구되는 과정(Fluorescence recovery process)을 관찰함으로써 유체의 확산도(diffusivity)를 측정하는 것이다.

본 발명의 시스템은 다양한 요소(element)를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 2차원 계면 상의 형광 이미지를 녹화하기 위한 카메라, 2차원 계면 상에서 관찰된 정보의 저장 데이터베이스, 데이터베이스에 기반한 관련 검색결과를 추출하는 프로세서, 측정부에서 관찰된 형광이미지를 시각화하여 나타내는 프로세서, 측정부에서 관찰된 형광이미지로부터 2차적인 정보(예컨대, 분획강도)를 추출하는 프로세서, 압력 제어부 또는 위치 제어부를 조정하는 프로세서 등을 포함하도록 구축할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 방법을 이용하여 산업적으로 활용 가능한 새로운 계면활성물질 혼합물을 형성하는 데 있어서 두 계면활성물질이 2차원 계면에서 어떤 형태로 섞여 들어가는지를 확인할 수 있으며, 이로써 두 계면활성물질 간의 상호작용에 대한 정보를 얻을 수 있다.

(c) 또한 세포막에 존재하는 다양한 계면활성물질 간의 섞임 특성에 대해 파악할 수 있으므로 세포막에 대한 이해를 높일 수 있고, 이를 통해 세포막 관련 질병의 치료제를 개발하는 것에 활용될 수 있다.

(d) 본 발명의 기술은 같은 계면활성물질간의 섞임을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 나아가 현재까지 측정이 힘들었던 서로 다른 계면활성물질 간의 섞임도 관찰가능하다.

도 1은 본 발명에 따라 2차원상에서 서로 다른 두 계면활성물질이 깔끔한 경계를 이루며 서로 만나있는 상태를 형성하는 과정을 측면에서 본 단면도이다.
도 2는 본 발명에 따라 형성된 서로 다른 계면활성물질 단일막 간의 경계가 섞임으로 인해서 불분명해지는 과정을 위에서 본 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 2차원 계면 상에서 서로 다른 두 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템 구성도이다.
도 4는 FRAM (fluorescence recovery after merging) 기술에 대한 모식도이다. 형광물질로 표지된 지질분자 없이 인지질로 둘러싸인 물방울 및 형광물질 표지된 지질분자로 도핑된(doped with) 평면 인지질 단일막을 준비한다. 물방울의 바닥부분이 합쳐지면서 물방울 상에 있는 단일막이 평면 인지질 단일막으로 옮겨지고, 어두운 비형광 물질은 밝은 형광 인터페이스에 의해 둘러싸여진다. 이러한 과정으로써 초기 화학적 전위 기울기가 형성되고, 형광 염료가 확산되도록 한다. 도립 형광현미경(inverted fluorescence microscope)을 이용한 어두운 부분의 분획강도측정에서, FRAP 방법에서와 같은 방법으로 확산계수(diffusion coefficient)를 산출할 수 있다.
도 5a는 물방울이 합쳐진 후, π_DPPC = 4.3 mN/m에서 시간에 따른 형광 현미경 사진을 나타낸다. 0 분에 나타난 첫 이미지에서는 경계가 분명히 나타났으며 이는 확산이 아직 일어나지 않았음을 의미한다. 시간이 경과함에 따라 형광염료는 확산에 의해 어두운 부분으로 이동되어 어두운 부분의 밝기가 증가한다(scale bar = 200 μm). 도 5b는 병합(merging) 이후 시간에 따른 분획강도(Fractional intensity)를 측정하여 방정식 1에 대입한다. 이는 확산 계수를 산출하기 위한 시간 상수를 제공한다.
도 6a는 19℃에서 DPPC 및 DOPC의 등온선을 측정한 결과이다. DPPC는 팽창된 유체(liquid expanded, LE) 및 응축된 유체(liquid condensed, LC)의 2개의 상을 나타내며, 약 표면압 6 mN/m에서 상 전이가 일어난다. 반대로, DOPC는 모든 표면압에서 LE 상만을 나타낸다. 도 6b는 표면압에 따른 DPPC 및 DOPC의 확산 계수를 나타낸다. LE 상에서는 DPPC (사각형) 및 DOPC (삼각형) 모두 기하급수적으로 감소하였다. 그러나 DPPC 의 상전이가 일어나는 압력에서는 확산이 급격히 감소하였고 이는 측정이 불가하였다. 본 발명의 측정방법은 다양한 기술을 이용하는 이전 측정법을 활용하였다. Peter et al.는 DPPC에 대해 FRAP 기술을 사용하였고, Caruso et al.는 형광 퀀칭을 이용하여 DOPC의 확산계수를 결정하였다.
도 7a는 FRAM 방법에 의해 9 mN/m 표면압에서 DPPC/DOPC 혼합물의 확산계수를 측정한 결과를 나타낸다. DPPC = 0.95 가 될 때까지 DPPC 비율이 증가함에 따라 확산계수가 약간 감소하였고, DPPC ≥ 0.95 에서는 급격한 감소를 나타내었다. DPPC = 0.95에서 부분적인 회복이 나타났으나, DPPC = 1.0 에서는 보이지 안항T다. 도 7b는 DPPC/DOPC 혼합물의 등온 측정결과이다. 혼합물의 상태가 점진적으로 LE 상(순수한 DOPC)에서 공존 상 (DPPC < 0.95)으로 바뀌고, 결과적으로는 π = 9 mN/m에서 LC 상 (DPPC ≥ 0.95)에 도달한 것을 보여준다. 도 7c는 순수 DPPC의 형광 현미경사진은 LC 도메인이 서로 패킹(packing)되어 있음을 나타내며 입자의 경계만 보여준다. DOPC가 첨가됨에 따라 도메인간의 거리가 멀어지고 반면 도메인의 크기는 더 작아지는데, 이는 LC 및 LE 상이 서로 공존함을 의미한다(width = 80 μm).
도 8은 본 발명의 시스템을 모식적으로 나타낸 것이다. ① 측면관찰 현미경(side-view microscope); ② 도립현미경 대물렌즈(inverted microscope objective); ③ 로봇 암에 장착된 유리모세관; ④ Wilhelmy plate; ⑤ EMCCD 카메라; ⑥ 미세조작기(micromanipulator); ⑦ 미세주입기(microinjector); ⑧ 압력 센서 조절기(pressure sensor controller). ⑧ 압력 센서 조절기는 ④의 Wilhelmy plate를 이용하여 측정되는 surface pressure 측정과정에서 offset과 sensitivity를 조절하기 위해 사용된다.
도 9는 소포(vesicle) 흡수를 통한 DOPC 단일막의 표면 압력 조절을 나타낸다(소포내부: PEG 0%, NaCl 100 mM, 소포외부: PEG 10%, NaCl 10 mM; 소포농도 0.1 mg/ml).
도 10에서 (A)는 ‘검은 부분의 명확한 반경보다 작은 반경을 가진 검은색 원’이 있는 참조 이미지 및 ‘검은 부분의 명확한 반경보다 큰 반경을 가진 검은색 원’이 있는 참조 이미지의 컨볼루션 간의 차이를 나타낸다. (B)는 자동산출된 퇴색 부분(실선 원)과 참조이미지를 겹친 이미지이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

본 발명의 실험방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 우선, 유리 모세관 풀러를 이용하여 유리 모세관을 점점 가늘어지게 하여 끝부분의 직경이 10 μm 이내가 되도록 한다. 모세관 내에 수용액을 넣은 후, 마이크로인젝터를 이용하여 양압을 인가하면 직경 50-300 μm의 물방울이 형성된다. 모세관을 조정하는 자동 로봇암은 물방울의 위치를 조정하며, 이로써 정확한 위치 및 병합 시간을 결정하는 것을 가능케 한다. 새로 형성된 물방울을 측면 및 하부에서 2개의 현미경으로 모니터링 한다. 측면 현미경은 물방울의 위치, 크기 및 병합과정을 모니터링한다. EMCCD가 장착된 도립형광현미경(inverted fluorescence microscope)은 병합 후 형광 회복(fluorescence recovery)을 관찰하는데 이용된다. 공기/물 계면에서 나타나는 대류 흐름(convective flow)을 최소화하기 위하여, 측면부에 좁은 채널이 있는 3 mm 직경의 가둠막을 이용하여 지질분자가 자유롭게 출입하지 못하도록 했다.

자세한 실험과정은 다음과 같다.

실험에 사용된 인지질인 DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPC (dioleoylglycerophosphatidylcholine), 로다민-DPPE는 Avanti Polar Lipid에서 구입하였다. 실험에서는 Milli-Q를 이용하여 3차 증류수를 정수하여 사용하였다.

실험의 셋업에 대한 전체적인 모식도와 사진은 도 8에 나타나 있다.유리관(외경 1 mm, 내경 0.78 mm)은 micropipette puller (P-1000, Sutter instrument)를 이용하여 끝이 뾰족하도록 늘여 사용하였다. 끝을 뾰족하게 만든 유리 파이펫에는 실험에 사용된 인지질이 포함되어있는 수용액을 채운 후 마이크로인젝터 (Femtojet, Eppendorf)에 연결하였다. 그 후 마이크로인젝터를 이용하여 가하는 압력과 시간을 조절함으로써 50 μ~ 300 μ를 지름으로 가지는 물방울을 형성하였다. 이 단계에서 물방울의 크기를 조절함으로써 이후 물방울이 아래쪽의 물에 합쳐질 때에 형성되는 어두운 부분의 크기를 조절하였다. 상기 어두운 부분(검은 영역)은 형광물질이 포함되어 있지 않은 단일막이 형광물질이 포함된 단일막 사이에 끼어들어가면서 생기는 어두운 부분을 의미한다. 아래쪽 물/공기 계면의 표면장력/표면압력은 Wilhelmytensiometer (R&K, Germany)를 이용하여 측정하였다. 인지질 분자들이 물방울의 표면에 단일막을 형성하도록 30분 동안 기다린 후 실험하였다(고농도의 DPPC를 사용한 경우 물방울이 유리 파이펫에서 30분이 지나기 전에 떨어지기 때문에 최대한 오래 기다린 후 실험하였다). 유리 파이펫은 로봇 암(Micromanipulator 5171, Eppendorf)에 연결하여 물방울의 위치를 조절하여 물방울이 아래쪽 물과 합쳐지는 정확한 위치와 시간을 조절하였다.

유리 파이펫에 매달려있는 물방울은 아래쪽에서 보는 현미경과 옆에서 보는 현미경을 이용하여 관찰되었다. 직접 제작한 옆에서 보는 현미경으로는 물방울의 위치, 크기, 그리고 물방울이 합쳐지는 과정을 관찰하였으며, 그 동안 직접 제작한 아래에서 보는 현미경으로는 물방울이 합쳐진 이후 형광이 복구되는 과정(Fluorescence recovery process)을 관찰하였다. 머큐리 램프를 이용한 밝은 광원(X-cite 120Q, Lumen Dynamics)은 광섬유를 이용하여 조사되었다. 로다민-DPPE에 알맞은 광학필터 세트(545 nm excitation, 605 nmemission, 565nm Beam splitter)가 사용되었고, EM-CCD카메라(iXon3 897, Andor Technology)를 이용하여 형광 이미지를 촬영하였다.

FRAM 실험으로 형광 이미지들은 얻은 이후 MATLAB을 이용하여 fractional intensity를 계산하였다. 물방울이 합쳐진 이후 형성된 검은 영역과 주변의 밝은 영역 사이에 깔끔한 경계가 보이는 첫 번째 형광 이미지는 참조 이미지로써 사용되었다(도 10의 (A)). 이 참조 이미지로부터 FRAP실험에서 광퇴색(photobleaching)된 영역에 해당하는 검은 영역의 반지름을 설정하였다. 이 과정은 다양한 크기의 원을 이미지에 컨볼루션 함으로써 이루어졌다. 그 후 fractional intensity를 계산하기 위해서 각각의 이미지에서 검은 영역 내부의 밝기와 외부의 밝기를 측정하였고 이렇게 계산된 fractional intensity는 MATLAB의 cftool을 이용하여 fitting하였으며, 그로부터 시간상수를 도출하여 diffusion coefficient를 계산하였다.

실험결과

본 발명은 물방울 병합 이론에 기반한다(2527): 타겟 지질분자로 덮힌 물방울이 공기/물 계면에 형성된 지질 단일막에 병합된다. 물방울이 물 표면에 닿으면 물 표면에서 물 분자에 의해 끌어 당겨진다. 중력 및 표면 장력이 추가로 작용하여 병합 과정을 촉진하며 시스템의 전체적인 에너지를 최소화시킨다. 물방울이 표면에 도달함에 따라, 본 발명의 기하학적 시스템에 의해, 물방울 및 물의 표면 돌출부위에 발데르발스 인력이 작용한다. 고속 카메라를 이용하여 표면에서 물방울 병합을 관찰한 결과, 초기 병합과정은 양쪽 표면의 작은 부분이 열림으로써 시작된다는 것을 확인하였다(26,27). 계면의 작은 분획이 만나면, 물방울과 물 사이에 작은 채널이 형성된다. 물방울의 물이 중력에 의해 채널을 통과하고, 물방울 상의 지질분자가 물 표면상에 있던 지질분자와 합쳐진다.

본 발명자들은 표준 용매 분산방법을 이용하여 공기/물 계면에서 형광 표지된 지질(로다민 DPPE) 의 소형 분획 (<1 mol %) 을 가진 지질 단일막(DOPC, DPPC 또는 이들의 혼합물)을 준비하였다. 형광염료가 없는 지질로 둘러싸인 물방울은 다음의 두 가지 방법으로 형성된다: (1) 지질 소포(Lipid vesicles)는 100 mM NaCl 수용액에서 형성되며, 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 첨가하여 감손력(depletion force)을 제공하여(28), 상기 지질 소포를 공기/물 계면쪽으로 밀어내고 파열시켜 물방울 표면상에서 단일막을 형성시킨다. 이러한 방법의 장점은 곡선으로 이루어진 물방울 표면에서 PEG의 농도 및 반응시간에 따른 지질 단일막의 표면압을 조절할 수 있다는 것이다(도 9). (2) 모세관 팁을 건조 지질로 코팅하고 물방울을 형성시켰을 때, 물방울 표면에서 지질 단일막이 형성된다. 이러한 방법은 표면압을 조절할 수 없지만 지질 소포의 준비단계가 없으므로 보다 간편하다. 상술한 바와 같이, 지질-커버된 물방울이 평면 단일막에 병합될 때 단일막 상에 둥근 비형광 물질이 남고, 이는 형광에 의해 밝은 부분으로 둘러싸여진다. 이어, 형광 표지된 지질분자가 이 구역으로 확산됨에 따라, 어두운 부분의 분획강도를 측정하였다(도 5a 및 도 5b). 상기 측정치를 FRAP 방정식(도 5b의 회색 점선)에 대입하여 확산계수를 산출하였다.

FRAM 가 2D 확산을 측정하기 위한 간단한 방법이지만, 여전히 측정이 까다롭다는 문제점이 존재한다. 예컨대 평면 단일막 및 물방울 단일막 간의 표면압력 차이, 병합시간의 척도 및 병합 이후 평면 단일막의 표면압 변화 등의 문제점이 있다. 이들은 문제가 될 것으로 보이지만 본 발명에서는 해당되지 않는다. 첫째, FRAM 방법은 지질방울의 정확한 표면 압력/장력을 필수적으로 요구하지 않는다. 본 발명의 물방울 형성방법은 정확한 표면 압력/장력을 결정하는 것이 아니므로, 공기/물 계면 상에 물방울이 병합될 때 표면 농도 구배가 있고, 결과적으로 마랑고니 유동(Marangoni flow)을 나타낸다(25). 만약 물방울의 지질 및 평면 표면의 지질 간에 표면 농도 구배(즉, 표면압 차이)가 있다면, 병합과정동안 평형을 이루게 된다. 예컨대, 물방울의 표면 농도가 평면 표면의 농도보다 높은 경우, 병합과정동안 어두운 부분이 팽창된다. 그러나, 물방울의 표면 농도가 더 낮은 경우에는 물방울의 표면압이 평면 단일막의 표면압과 매칭될 때까지 물방울이 줄어든다. 본 발명에서 이러한 압력 평형과정은 보통 10 ms 이내에 일어나며, 이는 어두운 부분의 크기 및 확산율에 의존하는 일반적인 확산 시간(수십 초 내지 수천 초) 보다 훨씬 더 짧다. 따라서, 본 발명자들은 2 부분 간의 압력차가 평형에 이른 후에 형광 분획 강도를 측정한다.

두 번째, 압력 평형이 일어나는 시간이 짧음에도 불구하고 병합 시간이 충분히 길다면, FRAM 방법으로는 정확히 확산을 측정할 수 없을 것이다. 그러나, 물방울이 물에 병합될 때 병합 시간이 약 10 ms 라면(26, 27), 일반적인 확산 시간보다 훨씬 더 빠른 것이다. 실제로, 이러한 병합 시간(압력 평형을 위한 시간척도에 따른)은 본 발명에서의 상한치를 설정한다. 보다 정량적으로는, 100 μm 직경의 어두운 부분이 있다고 가정하자. 확산 시간 척도를 병합 시간 척도와 비교했을 때, 최대확산계수가 (100 μm × 100 μm)/10 ms 10⁶ μm²/s 이다. 측정된 확산계수가 10⁶ μm²/s 보다 작은 경우, 병합과정은 확산 측정에 영향을 주지 않는다.

마지막으로, 물방울 표면의 지질 분자 수가 평면 단일막에서의 지질 분자 수와 비교하여 매우 적기 때문에, 평면 단일막의 압력은 병합 이후에도 눈에 띄게 크게 변하지 않는다. 정량적으로 보았을 때, 본 발명에서는 2000 mm²의 면적을 가진 trough을 이용하였고, 물방울 병합에 의해 생성된 어두운 부분의 면적은 최대 0.3 mm² 였다. 따라서, 만약 확산계수를 측정하기 위한 실험을 수행하는 경우, 단일막의 분자 당 면적은 초기 단일막의 수치에서 약 0.015% 감소될 것이며, 1회 확산측정(즉, 1회 병합)으로 인한 표면압에서의 변화는 0.1% 이하로 나타날 것이다. 이는 표면압 측정의 정확도보다 더 작다.

FRAM 방법을 검증하기 위해, 본 발명자들은 DPPC 및 DOPC 단일막에서 표면압 π 에 따른 자체확산(selfdiffusion) 정도를 측정하였다. 도 6a는 단일막의 압력 대비 면적 등온선(isotherms)을 보여준다: DOPC는 모든 표면압에서 확장된 유체(liquid expanded, LE) 상을 나타내었고, DPPC는 19℃, 약 6 mN/m 근처에서 LE 상에서 LC 상(liquid condensed, LC)으로의 1차 상 전이를 나타내었으며, LC 상 도메인은 응집되어 크기가 커졌다(16, 29). 이러한 서로 다른 상 변화는 다른 기술을 이용하여 이전 측정치와 본 발명의 측정치를 정량적으로 비교할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 6b 는 DPPC 및 DOPC 의 확산계수를 보여준다. DOPC 단일막 (삼각형)에서, 표면압이 π_DOPC = 5.9 mN/m 에서 35.7 mN/m 로 증가함에 따라, 표면 확산계수는 D_DOPC = 79.5 μm²/s 에서 20.5 μm²/s로 기하급수적으로 감소하였고, 이전 측정치와 유사하였다(18). DPPC 단일막 (사각형)에서, 확산계수는 0.3 mN/m 및 8.8 mN/m에서 각각 D_DPPC = 112.5 μm²/s 및 21.2 μm²/s를 나타내었다. LELC 상전이(π_DPPC > 6 mN/m) 이후, DPPC 확산은 매우 적어서 완전히 회복되지 않았다. LE의 DPPC 확산도는 정량적으로 이전 측정치와 동일했고, 이는 상 전이 동안 확산과정의 급격한 감소를 감지할 수 있도록 한다(20).

본 발명에서 측정된 확산계수가 지질 단일막을 형성해야 하는 이전 측정치와 일치하기 때문에, 상술한 결과는 본 발명에서 다중막의 확산보다는 빠른 병합과정에서 형성되는 단일막의 확산을 측정한다는 것을 뒷받침해준다. 예컨대, DOPC 단일막의 확산계수가 10200 μm²/s (18)이고, 이중막 또는 다중막의 확산계수가 110 μm²/s (30)로 서로 다르기 때문에. 본 발명자들은 다중막 대신 단일막일 것이라 결론내렸다.

도 7a 는 9 mN/m 표면압에서 DPPC 몰분획 _DPPC = N_DPPC/(N_DPPC + N_DOPC) 에 따른 DPPC/DOPC 혼합물의 확산도를 나타낸다. DPPC 비율이 증가함에 따라, 확산계수는 _DPPC = 0.9가 될 때 까지 D = 53.2 μm²/s 에서 33.6 μm²/s 로 천천히 감소하였다. 특히, _DPPC ≥ 0.95에서 FRAM 프로파일은 완전히 회복되지 않았고, 확산계수는 급격히 감소하였다. 순수 DPPC (_DPPC = 1) 단일막 확산은 매우 천천히 일어나서 측정할 수 없었다. 이러한 흥미로운 양상은 표면압에서의 혼합물의 상 변화에 의해 설명된다. 도 7b 에서 볼 수 있듯이, 혼합물의 등온선은 _DPPC ≥ 0.95 (LC phase) 및 _DPPC = 0 (LE phase)를 제외하고는 LC 및 LE 상 (LE 상에서의 LC 도메인)이 공존함을 나타낸다. 또한, 계면(interfaces)의 직접적인 관찰로서 혼합물에서 LE 상 내에 LC 도메인이 있음을 확인하였다(도 7c). 염료 분자는 LC 도메인으로 확산되는 것이 아니라 LE 상을 따라 이동하기 때문에, 느린 감소는 LC 도메인이 존재하는 LE 상을 통한 확산을 나타낸다(31). 그러나, ≥ 0.95에서 확산계수의 급격한 감소는 LC 도메인의 침투에 기인한 것이며(도 7c), LE에서 LC로의 상 전이가 나타난다.

응축된 액상에서 순수 DPPC 단일막이 도 7c에서와 같이 나타난다는 것은 알려져 있다(16, 29). 요컨대, 이러한 현상이 나타나는 이유는 각 순수 DPPC의 액정 도메인이 다른 방위각(azimuthal angle)을 가진 계면으로 기울어져 서로 응집될 수 없기 때문이다. 형광염료는 액정 도메인으로부터 제외되었고, 입자 경계에서만 존재할 수 있다. 도 7c의 첫 번째 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, 밝은 선은 LE 상이 아니라 형광 지질을 포함하는 입자의 경계를 나타낸다. 본 발명자들은 본 발명의 DOPC/DPPC 혼합물에서 DPPC 비율이 증가함에 따라 형광 분자의 분획이 LE 상에서 효과적으로 증가함을 인지해야 한다. 상기 염료는 LE 상에서만 존재할 수 있기 때문이다. 형광 염료의 비율증가가 확산 측정에 어떻게 영향을 미치는지는 불명확하지만, DPPC 비율 증가에 따른 염료 분획 증가의 영향은 중요하지 않을 것으로 예상된다. LE 면적분률 감소는 확산 측정치에 직접적으로 반영되고(도 7a), 등온 측정치와 일치하기 때문이다.

본 발명의 중요한 특징은 자가확산을 위한 FRAP 방법을 필수적으로 따른다는 것이다: 농도 구배가 이루어진 후 확산에 의한 형광 회복도를 측정하였다. FRAP 및 FRAM 은 모두 시간에 따른 확산에 의한 형광 회복정도를 측정할 수 있지만, FRAM 은 광퇴색(photobleaching) 대신 물방울 병합(drop coalescence)을 사용하며 FRAP와 구별되는 이점들이 있다. 첫째, FRAM는 파장이 형광 분자의 흡수 밴드를 매칭시키는 고출력 레이저를 사용하지 않는다. FRAP 는 다중 형광 염료를 이용하는 다중 레이저를 이용하지만, 본 발명에서는 형광시그널을 관찰하기 위해 특정 필터를 사용할 뿐이다. 둘째, FRAP 에서는 형광 염료 선정이 제한적이다. 광퇴색에 제한되는 형광 염료를 이용하는 경우, 어떤 시스템이든 광퇴색 시간보다 더 빠르게 확산이 일어난다면 형광 회복을 측정할 수 없다. 이를 보상할 수 있는 방법이 있다고 해도 빠른 퇴색이 일어나는 형광염료는 적합하지 않다(32, 33). 그러나, 본 발명의 방법은 퇴색 과정이 요구되지 않으며 따라서 염료 선정에 있어 자유롭다. 셋째, FRAP에서 광퇴색 면적이 공초점 셋팅에서의 조리개 사이즈 또는 레이저 스캔 사이즈에 의해 변할 수 있지만, 본 발명에서는 액체방울 크기 및 표면압이 변화함에 따라 광범위한 광퇴색 면적을 가질 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 기본적으로 FRAP와 상이하다. 본 발명의 기술은 직접적으로 관찰되는 계면에 의해 2가지 다른 표면 활성 물질이 혼합 또는 상호확산을 연구할 수 있는 간단한 방법을 제공한다. 반면 FRAP 는 단지 혼합물의 자가확산을 측정할 수 있을 뿐이다. 본 발명의 방법은 물방울 단일막 및 평면 단일막의 독립적인 조절방법을 제공하므로 혼합/확산된 2 가지 조성물을 포함하는 단일막의 초기 상태를 셋업할 수 있다. 이 경우, 형광 염료의 확산보다는 2개 서로 다른 표면활성 물질의 상호확산계수를 측정할 수 있다; 형광염료는 단지 계면을 시각적으로 확인하기 위해 사용된다. 상기 혼합/상호확산은 계면활성 혼합물의 운동과정 예컨대, 계면(interface)에서 다중성분 차단 코폴리머의 상-분리 과정 및 새로 합성된 인지질이 세포막에 장착되는 과정 등에 대한 매우 유용한 정보를 제공할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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100 : 수용부(수조)
110 : 액적 도입부(유리관)
120 : 압력 제어부
130 : 위치 제어부
140 : 측정부
200 : 평평한 공기/물 계면
300 : 평평한 공기/물 계면 상의 계면활성물질 단일막
400 : 유리관에 매달린 물방울
500 : 물방울의 표면에 있는 계면활성물질 단일막

Claims (15)

1. 다음 단계를 포함하는 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 방법:
   (a) 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체의 유체 방울 또는 액적(droplet)을 형성하는 단계;
   (b) 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 표면에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 인가하는 단계; 및
   (c) 상기 제1유체 및 제2유체의 계면(interface)에서 상기 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하는 단계로서,
   상기 제1계면활성물질, 제2계면활성물질, 또는 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질은 시그널-표지된(signal-labeled) 분자를 포함하는 방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 계면활성물질은 상기 제1유체 또는 제2유체의 표면에서 단일막(monolayer)을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 모세관 내부에 압력을 인가하여 모세관 내부의 유체를 외부로 밀어냄으로써 모세관 말단에 유체방울을 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 단계 (b)에서 상기 제1유체의 액적의 움직임 또는 위치를 조절하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 제1유체 및 제2유체의 계면을 측면부 및 하부에서 동시 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 측면부 관찰을 통해 액적의 위치, 크기 및 제1유체 및 제2유체의 병합과정을 측정하며, 하부 관찰을 통해 제1유체 및 제2유체의 병합과정 이후 상기 유체의 계면에서 시그널-표지된(signal-labeled) 분자에 의해 나타나는 시그널 이미지를 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 다음의 구성을 포함하며, 2차원 계면 상에서 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 시스템:
   (a) 제1계면활성물질을 포함하는 제1유체 및 제2계면활성물질을 포함하는 제2유체의 계면(interface)을 형성하기 위한 수용부;
   (b) 상기 제2유체의 표면(surface)에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적(droplet)을 인가하는 액적 도입부; 및
   (c) 상기 계면에서 상기 계면활성물질 간의 섞임을 관찰하기 위한 측정부를 포함하고,
   상기 제1계면활성물질, 제2계면활성물질, 또는 제1계면활성물질 및 제2계면활성물질은 시그널-표지된(signal-labeled) 분자를 포함하는 시스템.
   
9. 삭제
10. 제 8 항에 있어서, 상기 계면활성물질은 상기 제1유체 또는 제2유체의 표면에서 단일막(monolayer)을 형성하는 것을 특징으로 하는 시스템.
    
11. 제 8 항에 있어서, 상기 액적 도입부는 내부에 제1유체를 수용할 수 있으며, 말단에서 유체 방울 또는 액적(droplet)을 형성시키며, 상기 제2유체에 상기 제1유체의 유체 방울 또는 액적을 인가하는 모세관인 것을 특징으로 하는 시스템.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 모세관 내부에 압력을 인가하여 모세관 말단에 유체방울을 형성시키는 압력 제어부를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
    
13. 제 8 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 제1유체의 액적의 움직임 또는 위치를 제어하기 위한 위치 제어부를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템
    
14. 제 8 항에 있어서, 상기 측정부는 제1유체 및 제2유체의 계면을 수용부의 측면부 및 하부에서 동시관찰 가능한 것을 특징으로 하는 시스템.
    
15. 제 14 항에 있어서, 상기 측정부는 측면부 관찰을 통해 액적의 위치, 크기 및 제1유체 및 제2유체의 병합과정을 측정하고, 하부 관찰을 통해 제1유체 및 제2유체의 병합과정 이후 상기 유체의 계면에서 시그널-표지된(signal-labeled) 분자에 의해 나타나는 시그널 이미지를 분석하는 것을 특징으로 하는 시스템.

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