KR101717585B1 - 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 내층 및 외층(또는 코어-쉘)이 상호 다른 공극률(또는 밀도)를 갖도록 함으로써, 내층 및 외층의 서로 다른 팽창비와 분해율을 이용하여 로딩된 약물의 방출을 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 외피층에도 약물을 탑재하여 약물을 방출하고 외과적 의료 용도로 용이하게 사용할 수 있는 방출 조절이 가능한 스캐폴드에 관한 기술을 제공한다.

Description

약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드{Scaffold with function of drug delivery control}
본 발명은 스캐폴드(scaffold)에 관한 기술로서, 더욱 구체적으로는 본 발명의 스캐폴드는 약물 방출 시간 및 약물 종류의 조절이 가능할 뿐만 아니라, 다중 약물 방출 조절이 가능한 신규한 구조의 스캐폴드에 관한 기술이다. 본 발명의 스캐폴드는 통상의 스캐폴드 용도 이외에 약물 전달체 또는 약물 지지체, 지혈제 등의 용도로도 사용 가능하다.
본 발명은 약물 전달용 지지체로 사용 가능한 스캐폴드에 관한 기술이다. 조직공학은 일반적으로 이식에 적합한 스캐폴드 표면 및/또는 내부에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것으로서 정의된다. 스캐폴드는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 스캐폴드에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 또한, 스캐폴드는 생분해성이 있어야 한다. 이러한 스캐폴드에 약물을 담지하는 경우 스캐폴드는 약물 전달용 지지체로서도 사용 가능하다.
예를 들어, 외과적 수술 후 혹은 염증, 출혈, 감염, 창상 등으로 조직손상이 발생하면 상처의 치유 과정에서 혈액이 유출되어 응고하고, 이에 의해 주변 조직과 비정상적 접합이 일어나는 유착(adhesion) 현상이 발생하는데, 여기에 세포가 침투하면 더욱 강한 유착현상이 발생한다. 일반적으로, 개복수술 후 60% 이상의 빈도로 유착이 발생하며, 통증과 장폐색 등을 유발할 수 있고 장기 또는 조직의 기능장애에 의한 유착을 제거하기 위한 재수술이 필요하게 된다. 이러한 조직 유착 현상은 장폐색증을 유발하고, 특히 이비인후과 수술의 주요 실패 원인이 되어 왔다.
따라서 이러한 유착을 방지하는 방법이 필연적으로 마련되어야 하며, 그 방법으로는 수술시 상처를 최소화하거나, 항염제의 사용 및 물리적 배리어(barrier) 또는 패킹(packing)을 사용하는 방법이 개발되어 사용되고 있다. 이 중에서 패킹을 위해 사용되는 재료는 체내에서 상처가 치유되는 기간 동안만 패킹으로서의 역할을 해주고, 이후에는 분해되어야 하며 재료 자체의 독성이 없을 뿐만 아니라, 분해ㆍ대사를 통한 배출 물질 역시 인체에 무해해야 한다는 기능성을 가져야 한다. 예를 들어, 약물 치료에 반응하지 않는 만성 부비동염의 경우 우선적인 치료 방법으로 내시경적 부비동 수술이 권장되고 있으며, 이러한 수술을 포함한 이비인후과 수술의 경우 수술 후 비강 내에 유착방지, 지혈 및 상처보호를 위하여 종래의 방법으로 거즈나 창상 피복재를 삽입하게 되는데 이러한 기존의 거즈나 비흡수성 창상피복재의 경우 매일 또는 이틀에 한 번씩 병원을 방문하여 교환해 주어야 하는 번거로움과 거즈나 창상 피복재의 교체시 환자들에게 상당한 고통이 수반된다.
따라서 현재, 이러한 문제점을 해소하기 위해 패킹 물질이 사용되어 지고 있는데, 구체적으로 수술 후 비강 내의 패킹은 점막 출혈(mucosal bleeding)을 최소화하고 창상 치유를 돕기 때문에 필수적으로 시행하며, 다양한 패킹 물질이 사용되고 있고 수술자의 선호도와 경험에 따라 선택되고 있으나, 기존의 비강 패킹 물질은 환자에게 통증 및 여러 가지 불편감의 원인이 됨에 따라 최근에는 흡수가능한 생체물질(absorbable biomaterials)을 주로 선택하여 사용하고 있는데, 이러한 물질로 된 패킹은 그 제거가 필요하지 않아 환자의 통증과 불편감을 많이 감소시켰으며, 현재 비과 영역에서 나소포(Nasopore) 물질을 가장 많이 사용하고 있으며, 이는 생체 분해가능한 합성 폴리우레탄 폼(polyurethane foam)으로, 가격이 고가라서 환자의 코 내부 전체를 패킹하기에는 경제적인 부담으로 작용할 수 있는 실정이며, 이에 따라 종래의 나소포를 대체할 수 있는 패킹 물질을 모색하고 있으나 만족할만한 제품은 아직 개발되지 않고 있다.
상기한 패킹 물질에 진통제와 같은 약물을 탑재하여 전달하는 방법이 강구될 수 있는데, 이러한 것에 대해서는 아직 구체적인 제시가 없으며, 다만 예를 들어, 특허공개 제2010-0063111호에서는 "치료 약제의 서방성 약물 코어"라는 명칭으로, 임플란트 내부에 배치되는 약물 인서트로서, 상기 임플란트는 체내 강, 조직, 관 또는 체액 내부에 또는 근처에 배치가능하며, 상기 인서트는 약물 코어와 상기 약물 코어를 부분적으로 덮고 있는 외피 바디(sheath body)를 포함하며, 상기 약물 코어는 치료 약제와 폴리머를 함유하는 매트릭스를 포함하며, 외피 바디가 약물 코어의 일부분 위에 배치되어 있어, 상기 임플란트를 환자에게 삽입하였을 때 상기 약제를 조직, 관, 체액 또는 이들의 임의 조합으로 방출할 수 있는 상기 약물 코어의 하나 이상의 노출면을 형성하고 상기 약물 코어의 상기 일부분으로부터의 약제 방출을 저해하며, 상기 약물 코어의 체적부내 치료 약제의 양은 상기 약물 코어의 임의의 다른 동등한 체적부내 치료 약제의 양과 유사한 것을 특징으로 하는 약물 인서트를 개시하고 있다. 또한, 특허공개 제2011-0025867호에서는 "귀 질환 치료를 위한 제어 방출형 아폽토시스 조절 조성물 및 방법"이라는 명칭으로, 다중입자 아폽토시스 억제제 및 폴리옥시프로필렌과 폴리옥시에틸렌의 중합체를 포함하는 귀에 허용되는 열가역적 수성젤을 포함하여 상기 아폽토시스 억제제가 5일 이상의 기간 동안 와우각 내로 지속 방출되는 것인 무균 약학 조성물을 개시하고 있다.
또한, 상기 특허문헌 외에 본 발명자 등이 인지하고 있는 약물전달 시스템의 연구 동향은 생분해성 고분자를 이용하는 것이 주를 이루는데, 이는 생체 내 또는 자연 환경 하에서 스스로 분해되는 고분자를 통칭하는 것으로, 주로 의료용 목적으로 생체 내에서 분해되는 생분해성 고분자 소재 시스템으로는 최근 각광을 받고 있는 조직 재생용 소재를 비롯한 봉합사, 정형외과용 플라스틱에 사용되는 고분자 등을 들 수 있고, 생체 내에서 분해되는 고분자의 경우, 그 분해 부산물이 자연적으로 몸 밖으로 배출될 수 있거나 또는 조직 내에 흡수되어도 안전한 물질이어야 하며, 전 세계적으로 현재 FDA 승인을 받은 생분해성 합성 고분자로는 PLA(Poly lactic acid), PLGA(Poly lactic-glycolic acid), PGA(Poly glycolic acid) 등의 고분자들이 있으나, 이들 고분자들의 생분해 부산물들이 부분적으로 강산성을 나타낼 수 있다는 보고로 인해 그 실질적 사용은 점차 감소하고 있는 추세이고, 또한 최근에는 다양한 종류의 생분해성 물질들을 다차원적 구조로 디자인하여 약물 방출의 시기와 방출유지 시간 등을 조절하며 동시에 특정 자극에만 반응하여 약물을 방출하는 하이브리드 시스템 등이 연구 및 개발되고 있는 추세이나, 현재까지의 개발 기술로는 생체적합성, 생분해성, 항유착성 등에서 패킹 물질의 용도, 특히 비강이나 귀의 내부와 같은 탄성이 요하는 조직에 대한 적절한 패킹 물질로 효과적인 물질을 제시하지 못하고 있는 실정이다.
따라서 상기한 실정 하에서, 외과적 수술 후, 특히 내시경적 부비동 수술과 같은 이비인후과 수술 후에, 다중 약물을 탑재할 수 있으면서도 로딩된 약물의 방출을 용이하게 조절할 수 있고, 패킹으로서 기능을 제공할 수 있는 경제적인 부담이 없는 패킹 물질과 이를 사용한 약물 전달 시스템에 사용되는 방출 조절이 가능한 스캐폴드가 필요한 실정이다.
전술한 이비인후과 이외의 다른 의료 및 의약 분야에서도 이러한 약물의 방출 조절이 가능한 스캐폴드가 필요함은 당연하다.
대한민국 공개특허 제2010-0063111호 (2010년 06월 10일 공개) 대한민국 공개특허 제2011-0025867호 (2011년 03월 11일 공개)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 본 발명은 약물 전달 속도를 제어할 수 있는 신규한 구조의 스캐폴드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 약물의 방출 속도의 제어가 가능하고, 다양한 종류의 약물을 로딩할 수 있을 뿐만 아니라, 로딩된 각 약물의 방출 속도를 원하는 속도로 설계할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항균성 펩타이드(antimicrobial peptide) 및 소염 진통효과가 있는 약물을 동시에 방출할 수 있는 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명은 생체적합성 고분자를 포함하여 이루지는 다공성 구조의 내층; 및 상기 내층의 일부 또는 전부를 커버하도록 구성되되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는 다공성 구조의 외층을 포함하여 이루어지고, 상기 내층 및 외층에는 각각 1종 이상의 약물이 담지되어 있고, 상기 내층 및 외층은 서로 공극률이 상이하여 상기 공극률 차에 의하여 담지된 약물의 방출 속도의 제어가 가능한 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다.
특히, 상기 생체적합성 고분자는 하이드로젤이 바람직하다.
특히, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알긴산, 아가로스, 셀룰로스, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤, PLA(polylactic acid), PLGA(poly lactic-co-glycolic acid), 폴리아크릴산계 하이드로젤, 폴리에틸렌옥사이드계 하이드로젤, 폴리비닐알코올계 하이드로젤 또는 폴리포스파젠계 하이드로젤이 바람직하다. 또한, 상기 성분들의 혼합 사용도 가능하다.
특히, 상기 내층 및 외층은, 내층을 중심으로 상하 양 층에 외층을 갖는 적층형 구조일 수 있다.
특히, 상기 내층 및 외층은 실린더형일 수 있다.
특히, 상기 내층은 코어(core)이고, 상기 외층은 상기 코어를 외부에서 감싸는 쉘(shell) 구조일 수 있다.
특히, 상기 코어는 실린더형이며, 상기 쉘은 상기 코어를 외부에서 감싸는 실린더형일 수 있다.
특히, 상기 코어는 구형이며, 상기 쉘은 상기 구형의 코어를 외부에서 감싸는 구형일 수 있다.
특히, 상기 내층 및 외층 중 어느 하나 이상에는 약물이 담지된 마이크로 비드 또는 나노 비드를 더 포함할 수 있다.
특히, 상기 내층 및 외층을 감싸는 외피층을 더 포함하되, 상기 외피층은 스폰지형 또는 섬유형의 다공성 구조이며, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.
특히, 상기 외피층에는 약물이 더 담지될 수 있다.
특히, 상기 외피층에는 약물이 담지된 마이크로 비드 또는 나노 비드를 더 포함할 수 있다.
특히, 상기 외피층은 부직포(non woven) 구조의 다공성 구조일 수 있다.
특히, 상기 약물은 진통제 및/또는 항균성 펩타이드일 수 있다.
특히, 상기 진통제는 리도카인일 수 있다.
특히, 상기 항균성 펩타이드는 디펜신(defensin) 또는 카텔리시딘(cathelicidine)일 수 있다.
특히, 상기 외피층의 공극률이 내층 및 외층의 공극률에 비하여 더 큰 것이 바람직하다.
특히, 상기 외피층은 2개 이상으로 분리되며, 상기 외피층의 내부에는 상기 내층 및 외층이 삽입될 수 있는 공간을 가질 수 있다.
상기와 같이 구성되는 본 발명에 따른 방출 조절이 가능한 스캐폴드에 의하면, 다른 공극률을 갖는 내층 및 외층의 팽창비 및 분해율을 이용하여 로딩된 약물의 방출 시간을 용이하게 조절할 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기 내층 및 외층을 감싸는 외피층에도 약물을 탑재하여 약물을 방출하고 외과적 의료 용도에 사용이 용이한 효과도 있어, 상기 내층, 외층 및 외피층을 통해 최소한 3가지 이상의 다른 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라, 각 층의 공극률을 달리함으로써 약물의 방출 속도를 원하는 패턴으로 제어할 수 있다. 또한, 외피층을 더 갖는 본 발명의 스캐폴드의 경우 외피층으로 인하여 내층 및 외층에 담지된 약물의 최대 방출 기간을 종래보다 월등히 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 다층 구조일 뿐만 아니라, 각 층의 공극률 설계에 의하여, 상당히 지속된 기간 동안 일정하게 약효를 유지 및 조절할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 소염 진통제 및 항생제를 동시에 담지함으로써, 수술 후 환자의 창상 치유 효과를 극대화하며 더불어 환자의 통증을 최소화할 수 있는 장점도 있다.
또한, 본 발명의 스캐폴드는 통상의 스캐폴드 역할뿐만 아니라, 약물 전달체로서의 역할을 동시에 수행 가능한 효과를 갖는다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 바람직한 제 1 실시예에 의한 스캐폴드의 사시도, 단면도 및 비드를 더 갖는 경우의 단면도이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 바람직한 제 2 실시예에 의한 스캐폴드의 사시도, 단면도 및 비드를 더 갖는 경우의 단면도이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 바람직한 제 3 실시예에 의한 스캐폴드의 사시도, 단면도 및 비드를 더 갖는 경우의 단면도이다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 바람직한 제 4 실시예에 의한 스캐폴드의 도면들로서, 도 4a는 외피층 안에 1개의 내층 및 외층 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도, 도 4b는 전기 방사를 이용한 외피층의 제조 방법을 설명하는 도면, 도 4c는 외피층 안에 3개의 내층 및 외층 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도, 도 4d는 도 4c와는 달리 외피층이 실린더형인 경우의 사시도이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 바람직한 제 5 실시예에 의한 스캐폴드의 도면들로서, 도 5a는 외피층 안에 1개의 실린더형 코어-쉘 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도이며, 도 5b는 외피층 안에 3개의 실린더형 코어-쉘 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 바람직한 제 6 실시예에 의한 스캐폴드의 도면들로서, 도 6a는 외피층 안에 1개의 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도이며, 도 6b는 외피층 안에 2개의 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드를 갖는 경우의 사시도이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 바람직한 제 7 실시예에 의한 스캐폴드의 도면들로서, 도 7a는 상하 외피층의 결합 전, 도 7b는 상하 외피층의 결합 후의 사시도이다.
도 8은 실시예 1 및 2, 비교예 1 및 2의 제조 방법을 설명하는 도면이다.
도 9는 도 8의 방법으로 제조된 실시예 1 및 2, 비교예 1 및 2 스캐폴드 샘플의 SEM 측정 사진이다.
도 10은 실험예 1-1의 팽창 실험 결과 그래프이다.
도 11은 실험예 1-2의 콜라게나제를 이용한 스캐폴드의 효소 분해 실험 결과 그래프이다.
도 12a 내지 12d는 실험예 1-3의 결과로서, 도 12a는 스캐폴드에 세포 부착하는 과정을 설명하는 도면, 도 12b는 스캐폴드에 부착된 세포수 측정 그래프, 도 12c는 증식된 세포수 측정 그래프, 도 12d는 1, 4, 7일 차에서의 증식률 그래프이다.
도 13a 및 13b는 실험예 1-4의 결과로서, 비교예 1 및 비교예 2 스캐폴드에 대한 세포생존율 실험 결과이며, 도 13b는 실시예 1 및 실시예 2 스캐폴드에 대한 세포생존율 실험 결과이다.
도 14는 실험예 2-1에서 실험한 스캐폴드들의 SEM 측정 사진이다.
도 15는 실험예 2-2의 팽창 실험 결과 그래프이다.
도 16은 실험예 2-3의 효소 분해 실험 결과 그래프이다.
도 17은 실험예 2-5의 약물 누적 방출 거동 실험 결과 그래프이다.
도 18a는 실험예 2-6의 약물 방출 실험 결과 그래프이며, 도 18b는 도 18a에서 GTA2와 GTA4의 결과만을 발췌한 그래프, 도 18c는 도 18a에서 GTA2, GTA4, GTA22 및 GTA44의 결과만을 발췌한 그래프, 도 18d는 도 18a에서 GTA22, GTA44, GTA24 및 GTA42의 결과만을 발췌한 그래프이다.
도 19는 실험예 2-7의 세포 증식 실험 결과 그래프이다.
도 20a는 실험예 3의 GTA24, GTA224 및 GTA424를 대상으로 한 약물 방출 실험 결과이며, 도 20b는 GTA44, GTA244 및 GTA444를 대상으로 한 약물 방출 실험 결과이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 대하여 설명하기로 하되, 편의상 후술하는 내층, 외층 및 외피층의 공극 형상은 도면에 표시하지 않았으나, 내층, 외층 및 외피층은 다공성 구조임을 명시한다.
본 발명의 스캐폴드는 약물의 방출 제어가 가능할 뿐만 아니라, 다양한 약물의 담지(loading)가 가능한 스캐폴드를 제공하기 위하여, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루지는 다공성 구조의 내층; 및 상기 내층의 일부 또는 전부를 커버하도록 구성되되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는 다공성 구조의 외층을 포함하여 이루어지고, 상기 내층 및 외층에는 각각 1종 이상의 약물이 담지되어 있고, 상기 내층 및 외층은 서로 공극률이 상이하여 상기 공극률 차에 의하여 담지된 약물의 방출 속도의 제어가 가능한 것을 특징으로 하는 스캐폴드(scaffold)를 제공한다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 기준으로 본 발명에 대하여 설명하기로 한다. 특히, 하기의 실시예는 내층 및 외층의 다양한 실시예와, 외피층을 더 갖는 실시예에 대하여 설명하기로 한다.
제 1 실시예 : 실린더 상하 적층 구조
도 1a는 본 발명의 바람직한 제 1 실시예에 따른 스캐폴드(10)의 사시도이며, 도 1b는 그 단면도이다.
본 발명의 바람직한 제 1 실시예의 스캐폴드(10)의 내층(11) 및 외층(12)은 실린더 형상(또는 어느 정도 두께를 갖는 원판 형상)이며, 내층(11)의 상하로 외층(12)이 각각 1개씩 적층된 구조의 소위 실린더 상하 적층 구조이다. 제 1 실시예에서는 외층(12)이 내층(11)의 상하면만을 커버하기 때문에, 내층(11)의 측단면은 노출된다.
상기 내층(11)과 상하의 외층(12)은 모두 생체적합성 및 생분해성을 갖는 고분자를 이용하여 제조함은 종래 스캐폴드와 동일하다. 예를 들어, 생체적합성 고분자의 예로 생체적합성 고분자 하이드로젤(hydrogel)이 바람직하다. 하이드로젤(hydrogel)은 일반적으로 공지된 바와 같이 물에 팽윤할 수 있는 친수성 고분자가 3차원 망상구조를 가지며, 물리적 또는 화학적으로 가교된 것으로서 가교 농도 즉, 밀도에 의해 수용액 및 수성환경하에서 용해되지는 않으나 구성하는 물질이 가진 고유한 친수성으로 인해 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤한다. 이러한 하이드로젤을 가교 후 수분을 제거하는 동결건조에 의하여 다공성 구조로 쉽게 제조할 수 있는바, 본 발명에서 내층(11) 및 외층(12)의 재질로서 하이드로젤이 바람직하다. 특히, 하이드로젤 수용액상에서 하이드로젤 성분의 함량 또는 가교 정도를 조절함으로써 최종적으로 동결건조에 의해 제조되는 내층(11) 및 외층(12)의 공극률을 원하는 수치로 제어하기 용이한 장점이 있다.
또한, 상기 하이드로젤로 사용가능한 고분자는 천연고분자와 합성고분자로 나눌 수 있는데, 대표적인 천연고분자 하이드로젤의 예로는, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알긴산, 아가로스, 셀룰로스, 히알루론산 또는 키토산 등이 있으며, 합성고분자 하이드로젤의 예로는 PLA(polylactic acid), PLGA(poly lactic-co-glycolic acid), 폴리카프로락톤, 폴리아크릴산계, 폴리에틸렌옥사이드계, 폴리비닐알코올계 또는 폴리포스파젠계 등이 있으며, 상기 고분자 물질들의 혼합 조성물도 사용이 가능하다. 후술하는 실험예에서는 상기 천연고분자 하이드로젤 중에서 젤라틴을 예로 하여 실험하였다.
내층(11) 및 외층(12)에 담지(loading)되는 약물은 사용되는 스캐폴드의 용도에 맞게 다양한 유효 성분의 약물이 모두 가능하다. 예를 들어, 비강 내 지혈 목적으로 사용되는 스캐폴드의 경우 소염 진통제, 항균성 펩타이드 등을 약물로 사용할 수 있다. 상기 소염 진통제로는 리도카인이 대표적이나 이에 한정된 것은 아니며, 상기 항균성 펩타이드는 디펜신(defensin), 카텔리시딘(cathelicidin) 이외에 다양한 항균성 펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명에서 내층(11) 및 외층(12)은 동일한 하이드로젤 성분으로부터 동결 건조와 같은 방법으로 제조될 수 있으나 상이해도 상관없다. 젤라틴의 농도차 또는 젤라틴을 가교하기 위한 가교제의 농도차에 의하여 동결 건조 후 생성되는 내층(11) 및 외층(12)의 공극률을 원하는 수치로 제어할 수 있다. 예를 들어, 가교제의 농도가 높으면 생성되는 내층(11) 및 외층(12)의 밀도가 높으며, 상대적으로 공극률이 낮다. 즉 밀도와 공극률은 상호 반대 수치를 보이게 된다.
예를 들어, 5% 젤라틴 수용액을 준비한 후, 글루타알데하이드와 같은 가교제를 첨가하여 젤라틴을 가교한 후, 페트리디쉬에 상기 가교된 젤라틴을 붓고 저온(예를 들어, 4℃)에서 보관하여, 바닥면의 외층(12)을 제조한 후, 10% 젤라틴 수용액에 가교제로 글루타알데하이드가 첨가하여 가교시킨 후 상기 4℃에서 보관 중인 외층(12) 위에 부어 내층(11)을 제조한 후, 상기 내층(11) 위에 상기 바닥면의 외층(12)을 제조한 방법과 같은 방법으로 5% 젤라틴 수용액을 이용하여 상부면 외층(12)을 하나 더 적층한 후 4℃에서 보관한 후, 동결건조기에서 동결건조함으로써, 도 1a와 같은 내층(11, 10% 젤라틴 수용액의 가교) 및 외층(12, 5% 젤라틴 수용액의 가교)의 공극률이 다른 스캐폴드를 제조할 수 있다.
상기 방법과는 달리 젤라틴의 농도가 다른 수용액이 아닌, 가교제의 농도가 다르게 함으로써 젤라틴의 가교 정도를 조절함으로써 내층(11) 및 외층(12)의 공극률을 조절할 수도 있다.
도 1c는 제 1 실시예의 스캐폴드(10)에 있어서, 내층(11) 및/또는 외층(12)에 약물이 담지된 마이크로 및/또는 나노 사이즈의 비드(13)를 더 갖는 스캐폴드 예를 보여주는 단면도이다. 비드(13)의 표면 또는 내부에는 유효한 약물이 담지되어 있으며, 마이크로 크기 또는 나노 크기 단독의 비드, 또는 마이크로와 나노 크기 비드가 혼합되어 있을 수 있다. 이러한 비드(13) 내의 약물은 내외층(11, 12)에 담지된 약물과 동일할 수도 있으나, 상이한 종류의 약물일 수 있다. 또한, 도 1c는 편의상 내외층(11, 12) 모두에 비드(13)가 있도록 도시하였으나, 내층(11) 또는 외층(12)의 어느 하나의 층에만 비드(13)가 있을 수 있다. 또한, 본 발명에서 비드는 약물이 담지되는 캡슐을 포함하는 포괄적인 의미로 사용됨을 명시한다.
제 2 실시예 : 실린더 코어-쉘 구조
도 2a 및 2b는 본 발명의 바람직한 제 2 실시예의 스캐폴드(20)로서, 내층(21)으로 실린더형의 코어(21), 외층(22)으로 상기 실린더형의 코어(21)를 외부에서 감싸는 실린더형의 쉘(22)을 구조를 갖는 소위 "실린더 코어-쉘" 구조의 스캐폴드(20)의 사시도 및 단면도이다.
본 발명의 바람직한 제 2 실시예에서 내층인 코어(21)와 외층인 쉘(22)은 서로 공극률이 상이함은 전술한 제 1 실시예와 같으며, 이러한 공극률 차이로 인하여 담지된 약물의 방출 속도가 상이하게 함으로써, 방출 속도를 설계할 수 있을 뿐만 아니라, 코어(21)와 쉘(22)에 담지된 약물을 달리함으로써 방출 속도의 제어뿐만 아니라, 약물의 종류를 다양하게 사용할 수 있음은 전술한 제 1 실시예의 설명과 같다.
또한, 이러한 코어-쉘 구조의 내층(21) 및 외층(22) 구조는 전술한 실린더 상하 적층 구조의 스캐폴드(10)의 제조 방법과 마찬가지로 젤라틴의 농도를 코어(21)와 쉘(22)에서 서로 달리하여 가교하거나, 동일한 젤라틴의 농도하에서 가교제의 양을 달리하여 가교 정도를 달리함으로써 코어(21)와 쉘(22)의 공극률을 다르게 제조할 수 있다. 또한, 실린더형 구조의 코어-쉘 형상을 제조하기 위하여 제 1 실시예에서 페트리디쉬를 사용한 것과는 달리 실린더형 피펫 등을 이용하여 가교시킨 후 이를 실린더형으로 잘라 코어(21)를 만든 후, 상기 코어(21)보다 직경이 큰 피펫에 상기 코어(21)를 넣고 쉘을 형성하고, 동결건조한 후 원하는 크기로 절단함으로써, 도 2a 및 2b 구조의 실린더 코어-쉘 구조의 스캐폴드(20)를 제조할 수 있다.
도 2c는 제2실시예의 스캐폴드(20)의 내층(21) 및 외층(22)에 마이크로 크기 및/또는 나노 크기의 비드(23)를 더 담지한 실시예로서, 전술한 도 1c의 제 1 실시예와 마찬가지로 상기 비드(23)에는 내층(21) 및 외층(22)에 담지된 약물과 별도로 비드(23) 표면 또는 내부에 약물이 담지되어 있다. 상기 비드(23)에 담지된 약물은 코어(21) 및 쉘(22)에 담지된 약물과 다른 약물을 담지할 수도 있으며, 동일한 약물을 담지할 수도 있다. 또한, 1개의 비드(23)에 1종 이상의 약물이 담지되어 있거나, 비드(23)에 따라서 서로 다른 약물이 담지할 수 있다.
제 3 실시예 : 구형 코어-쉘 구조
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 제 3 실시예에 의한 스캐폴드(30)의 사시도 및 단면도로서, 내층은 구형의 코어(31), 상기 구형의 코어(31)를 감싸는 직경이 큰 구형의 쉘(32)로 이루어진 소위 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드이다. 제 2 실시예와는 달리 실린더형이 아닌 내층으로 구형의 코어(31) 및 외층으로 구형의 쉘(32)이라는 점에서만 차이가 있으며, 나머지는 동일하므로 중복되는 설명을 생략하기로 한다.
한편, 제 1 실시예 및 제 2 실시예에서 약물이 담지된 마이크로 또는 나노 크기 비드(33)를 더 포함하는 것과 마찬가지로, 도 3c와 같이 제 3 실시예의 구형 코어-쉘 구조에서도 약물이 담지된 비드(33)를 내층인 코어(31) 및/또는 외층인 쉘(32)에 더 가질 수 있다.
상기 제 1 실시예 내지 제 3 실시예를 통해 다양한 형상의 내층(11, 21, 31) 및 외층(12, 22, 32) 구조를 가지는 본 발명의 스캐폴드(10, 20, 30)에 대하여 설명하였으나, 이하에서는 상기 스캐폴드(10, 20, 30)의 내층 및 외층을 모두 감싸는 외피층(50)을 더 가지는 스캐폴드에 대하여 설명하기로 한다.
제 4 실시예 : 실린더 상하 적층 + 외피층 구조
도 4a는 본 발명의 바람직한 제 4 실시예에 의한 외피층(50)을 더 가지는 스캐폴드(100)의 사시도이다. 내층(11) 및 외층(12)이 상하로 적층된 제 1 실시예의 스캐폴드(10)를 내부에 위치시키고, 상기 제 1 실시예의 스캐폴드(10) 외부에 형성되는 외피층(50)은 스폰지형 또는 섬유형의 다공성 구조이며, 내층(11) 및 외층(12)과 마찬가지로 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어진다.
여기서, 외피층(50)은 도 4a에서는 육면체 형상으로 도시하였으나, 구형, 실린더형(도 4c 참조), 다각형 기둥형 등 내층 및 외층만으로 이루어진 스캐폴드(예를 들어, 제 1 실시예 내지 제 3 실시예)를 바깥쪽에서 감싸는 형상이라면 그 구체적인 형상에 한정되지 않는다.
상기 외피층(50)은 전술한 내층 및 외층의 재질과 마찬가지로 스캐폴드의 일 구성으로 사용되므로 당연히 생체적합성 고분자, 예를 들어, 하이드로젤을 이용하여 제조되되, 하이드로젤을 포함하는 수용액을 가교 동결건조하여 스폰지형으로 내부에 다공성이 되도록 할 수 있으며, 섬유형(직포 또는 부직포)으로 섬유를 엮어서 섬유와 섬유 사이의 공극이 유도될 수 있도록 가공할 수 있다.
이러한 생체적합성 고분자 용액을 이용하여 스폰지형 또는 섬유형으로 외피층(50)을 제조하는 기술은 공지 기술이므로 자세한 설명을 생략하기로 하나, 대표적인 방법인 전기 방사의 방법을 이용한 부직포 구조의 외피층(50) 형성 방법에 대하여 도 4b를 참고하여 설명하기로 한다. 도 4b는 전기 방사 장치(1000)를 이용하여 내층(11)과 외층(12)이 상하로 적층된 바람직한 제 1 실시예의 스캐폴드(10)에 외피층(50)을 부직포 형상으로 형성시키는 방법을 도식화한 것이다. 특히, 외피층(50)을 형성하기 위한 생체적합성 고분자 용액 내에 디펜신, 카텔리씨딘과 같은 항균성 펩타이드를 포함시켜 외피층(50)으로 부직포로 제작할 수 있다. 물론 상기 항균성 펩타이드 이외의 약물, 예를 들어, 리도카인과 같은 소염 진통제를 추가할 수도 있으며, 기타 유효 약물을 추가할 수 있다.
도 4c는 1개의 외피층(50)에 다수 개, 예를 들어, 3개의 제 1 실시예의 스캐폴드(10)가 내부에 들어있는 스캐폴드(100)의 예이다. 하나의 외피층(50) 안에 다수 개의 내층 및 외층 구조의 스캐폴드(10)가 포함되는 경우, 각 스캐폴드(10) 마다 다른 약물을 내층 및 외층에 담지하거나, 각 스캐폴드(10)마다 다른 약물 방출 속도를 갖도록 설계할 수 있는 장점이 있다. 즉, 각 스캐폴드(10) 내에서 내층(11)과 외층(12)의 공극률 차를 둠으로써 약물의 방출 속도나 약물의 종류를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 스캐폴드(10)들 사이에서도 서로 다른 약물 방출 속도나 약물의 종류를 달리할 수 있도록 설계함으로써 무수한 조합의 약물 및 방출 속도 제어가 가능한 것을 특징으로 한다.
도 4d는 외피층(50)이 육면체 형상이 아닌 실린더 형상의 스캐폴드(100)의 실시예로서, 전술한 바와 같이 외피층(50)은 내층(11) 및 외층(12)의 스캐폴드(10)를 외부에서 덮는 구조이면, 구체적인 형상에 한정되지 않는다.
제 5 실시예 : 실린더 코어-쉘 + 외피층 구조
도 5a는 실린더형 코어-쉘 구조의 스캐폴드(20)를 감싸는 외피층(50)을 더 갖는 제 5 실시예의 스캐폴드(200)의 사시도이다. 도 5a의 스캐폴드(200)에서는 도 4a의 외피층(50)을 갖는 스캐폴드(100)와는 달리 도 2a의 내층(21) 및 외층(22)의 실린더형 코어-쉘 구조의 제 2 실시예의 스캐폴드(20)를 내부에 포함하고, 이를 감싸는 외피층(50)을 더 갖는 스캐폴드(200) 구조이다. 여기서 외피층(50)은 육면체 형상으로 도시되었으나, 구형, 실린더형, 다각형 기둥형 등이 모두 가능하다.
도 5b는 실린더형 코어-쉘 구조의 3개의 스캐폴드(20)가 1개의 외피층(50) 내에 존재하는 구조로서, 이는 도 4b에서 설명한 것과 마찬가지로, 각 스캐폴드(20) 마다 다른 약물 또는 동일한 약물을 담지할 수 있으며, 각 스캐폴드(20), 구체적으로는 각 스캐폴드마다 약물 방출률이 조기 방출형, 서방형 등의 조합으로 다양하게 조합할 수 있도록 구성함으로써, 약물의 방출이 지속적으로 장기간 이루어질 수 있도록 구성할 수 있는 장점이 있다. 또한, 치료에 따라 초기에 약물이 집중적으로 방출되도록 각 스캐폴드의 공극률을 조절하는 등 다양한 변형이 가능하다.
제 6 실시예 : 구형 코어-쉘 + 외피층 구조
도 6a는 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드(30)를 감싸는 외피층(50)을 더 갖는 제 6 실시예의 스캐폴드(300)의 단면도이다. 도 6a와 같이 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드(30)에도 외피층(50)을 적용하여 스캐폴드(300)를 제조할 수 있으며, 그 목적 및 효과는 전술한 제 4 실시예 및 제 5 실시예와 동일하기 때문에 설명을 생략하기로 한다.
한편, 도 6b는 도 4b 및 도 5b의 실시예와 대응되는 것으로서, 구형 코어-쉘 구조의 스캐폴드(30) 다수 개, 예를 들어, 2개를 1개의 외피층(50)에 포함하도록 할 수 있다.
제 7 실시예 : 외피층 분리형 구조
도 7a 및 7b는 본 발명의 바람직한 제 7 실시예에 의한 외피층(50)이 2개로 분리되는 구조의 스캐폴드(400)의 분해사시도 및 결합도이다. 설명의 편의상 외피층(50)은 육면체 형상이며, 상기 외피층(50)에 삽입되는 내층 및 외층 구조의 스캐폴드로는 제 1 실시예의 실린더형 내층 및 외층 구조의 스캐폴드(10)를 예로 설명하나, 상기 외피층(50)은 전술한 바와 같이 다양한 형상으로 변형 가능하며, 상기 실린더형 내층 및 외층 구조의 스캐폴드(10) 대신 다양한 형상의 스캐폴드(20, 30)가 가능하며, 스캐폴드(10)는 3개 삽입된 형상으로 표현하였으나, 1개 또는 2개 이상의 다수의 스캐폴드(10)를 삽입할 수 있다.
외피층(50) 분리형 스캐폴드(400)의 경우 외피층(50)이 제1외피층(50-1)과 제2외피층(50-2)로 분리되며, 상기 제1외피층(50-1)의 내부에는 제1공간부(51a)가 형성되어 있으며, 상기 제2외피층(50-2)의 내부에도 상기 제1공간부(51a)와 대응되는 위치에 제2공간부(51b)가 형성되어 있다. 도 7b의 결합도를 참고하면, 제1외피층(50-1)과 제2외피층(50-2)을 접합(별도의 생분해성 접합제 등의 공지의 기술을 사용하여 접합)할 수 있으며, 상기 접합 전에 상기 제1공간부(51a)와 이에 대응하는 제2공간부(51b)의 결합으로 형성되는 공간에 내층 및 외층 구조의 스캐폴드(10)가 삽입 후, 제1외피층(50-1)과 제2외피층(50-2)을 접합한다.
상기와 같이 외피층(50)이 분리형으로 구성함으로써, 사용자, 특히, 의사가 필요하다고 판단되는 스캐폴드(10, 20, 30)를 선택하여 외피층(50) 내에 삽입하여 스캐폴드(400)를 구현할 수 있어, 제조자뿐만 아니라 사용자의 선택에 의해 다양한 변형이 가능한 DIY형 스캐폴드(400)를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위를 이들 실시예에 한정하기 위한 것이 아님은 물론이다.
실시예
실시예 1 : 실린더 적층형 내층-외층 구조
도 8은 실린더 적층 구조의 내층 및 외층 구조의 스캐폴드인 실시예 1 및 2와 비교예 1 및 2의 스캐폴드의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 8의 3번째 도면을 참고하여 본 발명의 실시예 1의 스캐폴드(첨부도면에서는 MG5/10/5라 표기함)의 제조 방법에 대하여 설명하기로 한다. 각각 5%, 10% 농도의 젤라틴을 물에 녹이고 60℃, 150rpm의 핫플레이트(hotplate) (Labnet International, Oakham, UK)에서 교반해준 후, 가교제로 사용된 2.5%로 희석한 글루타알데하이드를 젤라틴 용액에 첨가하여 젤라틴을 가교하였다. 사용된 글루타알데하이드의 부피는 각 젤라틴 1g 당 500㎕이다. 단일 층 젤라틴 스캐폴드를 준비하기 위해, 젤라틴 용액을 페트리 디쉬(petri dish)에 부었다. 다층 젤라틴을 준비하기 위해, 2.5% 글루타알데하이드가 첨가된 5% 젤라틴 용액을 첫 번째 층을 위해 페트리 디쉬에 붓고, 빠르게 4℃에 보관하였다. 이렇게 제조된 첫 번째 층이 하부의 외층이 된다.
두 번째 층을 위해 2.5% 글루타알데하이드가 첨가된 10% 젤라틴 용액을 첫 번째 층 위에 붓고 빠르게 4℃에 보관한다. 두 번째 층이 본 발명의 내층에 해당하며, 젤라틴 수용액 1ml 당 3mg의 BSA를 젤라틴 용액을 첨가하여 약물이 로딩된 내층을 제조하였다.
마지막으로, 세 번째 층을 위해 2.5% 글루타알데하이드가 첨가된 5% 젤라틴 용액을 두 번째 층 위에 붓고 빠르게 4℃에 12시간 보관하였다. 지름 15mm, 두께 4mm의 스캐폴드는 원통형으로 찍어냈고, 동결건조기(Christ, Osterode am Harz, Germany)에서 48시간 동안 동결건조하여 도 8의 세 번째에 도시된 바와 같은 단면의 하이드로젤 다층 구조의 제형(MG5/10/5)을 제조하였다. 실시예 1의 스캐폴드에서는 내층에만 약물인 BSA를 포함하도록 제조하였다.
반응하지 않은 글루타알데하이드를 제거하기 위해 0.1M 글리신 용액에 넣고 37℃에서 1시간 두었고, 물로 3번 세척하였다. 젤라틴 스캐폴드의 공극 구조와 공극분포는 SEM(S-3400N, Hitachi, Tokyo, Japan)을 통해 관찰하였으며, 그 결과는 도 9에 나타냈다. 도 9에 도시된 바와 같이, 본 실시예 1에서는 내층보다 외층의 공극이 큰 것을 알 수 있었다.
실시예 2 : 실린더 적층형 내층-외층 구조
도 8의 네 번째에 도시된 바와 같은 10%, 5%, 10% 하이드로젤 순으로 하는 외에는 실시예 1의 스캐폴드 샘플과 동일하게 하여 다층 구조의 스캐폴드(첨부도면에서 MG10/5/10로 표기함)를 제조하였다. 도 9의 SEM 측정 사진과 같이, 본 실시예 2에서는 외층보다 내층의 공극이 큰 것을 알 수 있었다. 실시예 2의 스캐폴드 역시 내층에만 약물인 BSA를 포함하였다.
실시예 3 : 실린더 코어-쉘 구조
실린더형 코어-외피 구조를 갖는 스캐폴드의 제조를 위해, 5% 농도의 젤라틴을 물에 녹이고 50℃, 200rpm의 핫플레이트(Labnet International, Oakham, UK)에서 교반 해주었다. 2.5%로 희석한 글루타알데하이드는 젤라틴 가교를 위해 젤라틴 용액에 첨가하였다.
BSA를 저장한 코어-쉘 타입의 하이드로젤 스캐폴드를 제조하기 위해, 코어층은 6mm 지름의 실리콘 튜브를 사용하여 합성하였다. 젤라틴 1g 당 4ml의 글루타알데하이드가 용해된 젤라틴 용액을 실리콘 튜브에 붓고, 완전한 가교를 위해 4℃에서 12시간 보관하였다. 그 후, 가교된 코어부는 1mm 간격으로 잘랐다. 상기 코어층 제조시 젤라틴 용액에는 1ml 당 3 mg의 BSA가 약물로 로딩하였다.
젤라틴 용액(젤라틴 1g 당 2ml의 글루타알데히드가 용해된 젤라틴 용액) 0.11ml를 48-well 플레이트에 붓고 빠르게 4℃에서 30분 동안 보관했다. 살짝 가교된 후, 미리 준비된 코어부를 웰(well)의 중심부에 위치시켰다. 그리고 젤라틴 용액 0.18ml을 코어부위에 부은 다음 완전한 가교를 위해 4℃에서 24시간 보관하였다. 가교된 후, 가교된 하이드로젤 지지구조체를 실린더(실린더) 형상으로 찍어냈다.
반응하지 않은 글루타알데하이드를 제거하기 위해 0.1M 글리신 용액에 넣고 37℃에서 1시간 두었고, 물로 3번 세척하였다. 세척단계 후, 동결건조기(Christ, Osterode am Harz, Germany)에서 48시간 동안 동결건조하였다.
이하 첨부도면에서 실시예 3의 스캐폴드를 GTA24로 표기하였다. 또한, 상기 제조 방법에서 살펴본 바와 같이 실시예 3의 스캐폴드에서 내층인 코어에만 약물인 BSA를 포함하고 있다.
실시예 4 : 실린더 코어-쉘 구조
상기 실시예 3과는 달리 코어는 젤라틴 1g 당 2ml의 글루타알데하이드 용액으로 가교하였으며, 쉘은 젤라틴 1g 당 4ml로 글루타알데하이드 용액으로 가교하여 코어-쉘 구조의 스캐폴드를 제조하였다는 점을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다. 이하 첨부도면에서 GTA42로 표기하였다. 또한, 또한, 실시예 4에서 코어에만 약물인 BSA를 포함하고 있음은 실시예 3의 스캐폴드 샘플과 동일하다.
실시예 5 : 실린더 코어-쉘- 외피층 구조
실시예 3의 스캐폴드(GTA24)의 실린더 코어-쉘 구조의 스캐폴드 외부에 외피층으로 GTA2층을 전기 방사를 이용하여 부직포 형상으로 제조하였으며, 이하 도면에서 GTA224로 표기하였다. 또한, 실시예 5에서는 GTA2 외피층을 제외하고 코어 및 쉘에 약물 BSA를 포함하였다.
실시예 6 : 실린더 코어-쉘- 외피층 구조
실시예 3의 스캐폴드(GTA24) 위에 다시 외피층으로 GTA4층을 전기 방사를 이용하여 부직포 형상으로 제조하였으며, 이하 도면에서 GTA424로 표기하였다. 또한, 실시예 6에서는 외피층을 제외하고 코어 및 쉘에 약물 BSA를 포함하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서 하이드로젤 스캐폴드인 제형을 5% 농도의 젤라틴만을 사용하여 단층으로 제조하여 도 8의 첫 번째에 도시된 바와 같은 단일 층 구조의 하이드로젤 약물 전달 제형을 제조하였다. 스캐폴드의 공극 구조와 공극분포는 도 9와 같았다. 이하 도면에서 SG5로 표기하였다.
비교예 2
상기 비교예 1에서 하이드로젤 스캐폴드인 제형을 10% 농도의 젤라틴만을 사용하여 단층으로 제조한 것을 제외하고 동일하게 하여 도 8의 두 번째에 도시된 바와 같은 단일 층 구조의 스캐폴드를 제조하였다. 스캐폴드의 공극 구조와 공극분포는 도 9에 같았다. 이하 도면에서 SG10이라 표기하였다. 비교예 1에 비하여 비교예 2의 공극률이 더 작았는데 이는 10% 젤라틴 용액으로 젤라틴의 함량이 많기 때문에 같은 농도의 가교제를 사용하여도 가교가 더 많이 이루어지고, 그만큼 공극률 및 밀도가 증가할 수밖에 없기 때문이다.
비교예 3
5% 농도의 젤라틴을 물에 녹이고 50℃, 200rpm의 핫플레이트에서 교반하였다. 2.5%로 희석한 글루타알데하이드는 젤라틴 가교를 위해 젤라틴 용액에 첨가하였다. BSA를 저장한 단일타입(단일가교 농도) 하이드로젤 스캐폴드를 준비하기 위해, 1ml 당 3mg의 BSA를 젤라틴 용액에 넣었다. 여기서 글루타알데하이드는 젤라틴 1g 당 2ml로 사용되었다. 가교 및 동결건조에 의하여 단일체 형상의 실린더형 스캐폴드를 제조하였으며, 첨부 도면에서 GTA2로 표기하였다.
비교예 4
5% 농도의 젤라틴을 물에 녹이고 50℃, 200rpm의 핫플레이트(Labnet International, Oakham, UK)에서 교반하였다. 2.5%로 희석한 글루타알데하이드를 젤라틴 가교를 위해 상기 젤라틴 용액에 첨가하였다. 약물로서 상기 젤라틴 용액 1ml 당 3mg의 BSA를 젤라틴 용액에 넣었다. 여기서 글루타알데하이드는 젤라틴 1g 당 4ml로 사용되었다. 가교 및 동결건조에 의하여 단일체 형상의 실린더형 스캐폴드를 제조하였으며, 첨부 도면에서 GTA4로 표기하였다.
비교예 3에 비하여 비교예 4에서는 가교제의 사용량이 증가하였으며, 이에 따라 가교 밀도가 증가하였으며, 공극률이 감소하였다.
비교예 5
상기 실시예 3에서 코어부와 외피부를 형성하는 하이드로젤의 가교밀도를 같은 것(젤라틴 1g 당 글루타알데하이드 2 ml)으로 조합하여 코어부 및 외피부를 모두 GTA2로 하는 것 외에는 실시예 3과 동일하게 하여 코어-외피 구조의 하이드로젤 약물 전달 제형을 제조하였다. 첨부도면에서 GTA22로 표기하였다. 비교예 5에서 약물인 BSA는 코어에만 포함하였다.
비교예 6
상기 실시예 3에서 코어부와 외피부를 형성하는 하이드로젤의 가교밀도를 같은 것(젤라틴 1g 당 글루타알데하이드 4 ml)으로 조합하여 코어부 및 외피부를 모두 단일체 GTA4로 하는 것 외에는 비교예 5와 동일하게 하여 코어-외피 구조의 하이드로젤 스캐폴드를 제조하였다. 첨부도면에서 GTA44로 표기하였다. 비교예 6에서 약물 BSA는 코어에만 포함하였다.
비교예 7
비교예 6과 같은 코어-쉘 모두 젤라틴 1g 당 글루타알데하이드 4 ml를 사용하여 제조한 구조이되 내층 및 외층 모두 BSA를 포함하는 스캐폴드를 제조한 후, 다시 외부를 GTA2층을 전기방사에 의한 부직포 형상으로 제조하여 코어-쉘-외피층의 스캐폴드를 제조하였다. 첨부도면에서 GTA244라 표기하였다. 비교예 7에서 외피층을 제외하고 내층 및 외층에 약물 BSA를 포함하였다.
비교예 8
비교예 6과 같은 코어-쉘 모두 젤라틴 1g 당 글루타알데하이드 4 ml를 사용하여 제조한 구조이되 내층 및 외층 모두 BSA를 포함하는 스캐폴드를 제조한 후, 다시 외부를 GTA4층을 전기방사에 의한 부직포 형상으로 제조하여 코어-쉘-외피층의 스캐폴드를 제조하였다. 첨부도면에서 GTA444라 표기하였다. 비교예 8에서 외피층을 제외하고 내층 및 외층에 약물 BSA를 포함하였다.
상술한 실시예 및 비교예의 스캐폴드 샘플을 이용하여 하기와 같은 다양한 실험을 하였다.
실험예 1
상기 실시예 1 및 2, 비교예 1 및 2에 의해 제조된 실린더 적층형 구조의 스캐폴드(외피층 없음)의 다음의 특성에 대해 시험하였다. 이하에서 먼저 실험 방법에 대하여 간략히 설명하기로 한다.
실험예 1-1 : 팽창실험
화학적으로 가교되고 건조된 상기 실시예 1 및 2, 비교예 1 및 2에 의해 제조된 스캐폴드의 팽창과 확산실험을 위해 건조된 스캐폴드의 무게(W0)를 측정한 후 물에 담그고 37℃에 두었다. 15, 30, 60, 120, 360, 720, 그리고 1440분 후, 팽창된 스캐폴드의 무게(Wt)를 150-mm 필터 종이에서 외부 물기를 제거한 다음 바로 측정하였다. 팽창비는 수학식 1을 통해 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112015011987444-pat00001

팽창은 하이드로젤로 이루어진 스캐폴드의 중요한 특성이다. 하이드로젤이 물과 접촉할 때, 하이드로젤 안으로의 물 확산을 통해 팽창하고 퍼져나간다. 도 10은 팽창실험 결과로서, 팽창비(swelling ratio)는 180분까지 급속히 증가하다가 느려지기 시작하며 720분 이후에 평형에 도달하였다. SG5가 물 저장을 위한 더 많은 공간을 제공하기 때문에 SG5의 평형 팽창비(equilibrium swelling ratio)는 SG10보다 컸다.
한편, MG5/10/5 스캐폴드의 평형 팽창비는 MG10/5/10 스캐폴드보다 컸다. SG5와 MG5/10/5의 팽창률은 큰 공극 크기 때문에 높았다.
실험예 1-2 : 생체 분해 실험
스캐폴드의 효소분해를 평가하기 위해, 스캐폴드는 60 ㎍/mL 콜라게나제(collagenase)를 포함하는 PBS에 담겨졌다. 1, 2, 3, 4 및 7일 후, 실험에 사용된 스캐폴드를 물로 세척한 후 동결건조하였다. 동결건조된 스캐폴드는 잔여무게를 계산하기 위해 하기 수학식 2를 사용하여 무게를 측정하였다.
[수학식 2]
Figure 112015011987444-pat00002
여기서, W 0 는 건조질량이고, W D 는 분해 후 질량이다.
도 11은 콜라게나제를 이용한 스캐폴드의 효소 분해 실험 결과 그래프이다. 종래에 알려진 것과 같이 본 실험에서도 스캐폴드 제조시 사용된 젤라틴 용액 농도가 감소함에 따라 효소에 의한 분해율이 증가하였다. 즉, 외층의 5% 젤라틴 조성 때문에 젤라틴 SG5와 MG5/10/5의 무게가 1일 이내에 급격히 감소하였으나, SG10 및 MG10/5/10의 스캐폴드는 SG5와 MG5/10/5 스캐폴드보다 적게 감소하는 것을 관찰하였다. SG5와 MG5/10/5는 4일 차까지 SG10와 MG10/5/10보다 빠르게 분해되었다. 1일 차까지 SG10와 MG10/5/10에서 비슷한 분해율을 관찰하였다. 그러나 1일 차 이후, MG10/5/10는 5% 젤라틴을 포함하는 내층의 분해 때문에 SG10보다 빠르게 분해되었다. 4일 차 이후, MG10/5/10 스캐폴드 분해는 내층의 5% 젤라틴이 상하 외층의 10% 젤라틴이 녹는 것보다 빠르게 녹기 때문에 다른 스캐폴드보다 더욱 확연하게 분해가 일어났다. 7일 차 이후, SG5, SG10, MG5/10/5 및 MG10/5/10 스캐폴드의 남은 무게는 각각 약 15%, 38%, 27%, 20%였다. 특히, 7일 차에 MG10/5/10의 남은 무게는 MG5/10/5보다 적었는데 이는 전술한 바와 같이 MG10/5/10의 경우 내층 5% 젤라틴의 높은 분해율 때문에 상하에 적층된 외층(10% 젤라틴)이 서로 분리되었기 때문이다.
실험예 1-3 : 세포 부착능 및 증식 실험
세포 배양 분석을 위해 전골세포 MC3T3-E1 세포가 사용되었다. 상기 세포는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 α-MEM 배지에서 배양되었고, 37℃, 5% CO2 조건에서 보관되었다. 배지는 2 ~ 3일 마다 바꿔주었다. MC3T3-E1 세포는 0.25% 트립신을 사용하여 띄어내었고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 α-MEM 배지에서 섞어 주었다. 파종 전, 스캐폴드는 70% 알코올에 30분 담근 후 UV에서 1시간 소독하였다. 소독 후, PBS로 세척하고, 37℃ 무 혈청 α-MEM에서 2시간 동안 미리 적셔두었다. 그 후 1 x 105의 세포를 포함한 MC3T3-E1 세포혼합액 100㎕를 파종하였다.
도 12a는 스캐폴드에 세포 부착하는 과정을 설명하는 도면이다. 세포 부착과 증식을 평가하기 위해, 4시간 동안 스캐폴드 샘플에 MC3T3-E1 세포 파종한 후, CCK-8 키트를 사용하여 부착한 세포의 수를 계산하였다. 요약하자면, CCK-8과 무 혈청 α-MEM을 1:10의 비율로 혼합하고, 스캐폴드가 담긴 각 웰(well)에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 보관 후, 450nm에서의 광학 밀도(O.D.) 값을 측정하여 표준 곡선을 기반으로 광학 밀도 값을 이용하여 세포수를 계산하였다. 세포 부착 분석 후, 스캐폴드를 새로운 웰에 옮기고, α-MEM을 첨가하였다. 세포 파종된 스캐폴드에서의 증식된 세포수는 CCK-8 키트를 이용하여 1, 4, 7일 차에 계산하였다.
도 12b는 스캐폴드에 부착된 세포수 측정 결과로서, 세포파종 백분율은 세포 혼합액이 스캐폴드 위에서 웰(well)의 바닥으로 흘러내렸기 때문에 낮았다(13~22%). SG10과 MG10/5/10에서의 부착된 세포 수는 SG5와 MG5/10/5 스캐폴드보다 많았다. SG10과 MG10/5/10에서의 부착된 세포 수는 거의 비슷한 반면, MG5/10/5에서의 세포 수는 SG5보다 많았다. 이 효과는 SG10과 MG10/5/10의 젤라틴 밀도의 영향일 것이라 추정된다.
도 12c의 증식된 세포수 측정 결과로서, 비록 MG5/10/5 스캐폴드에서의 파종된 세포 수는 작았지만, 4일과 7일 차에 MG5/10/5에서의 세포수는 가장 많았다. 다공성 구조는 생체 분자의 자유로운 수송을 가능하게 하고, 세포들이 스캐폴드에서의 이동이 가능하게 하기 때문에 다공 구조가 많은(공극률이 높은 MG5 외층을 갖는) MG5/10/5에서 증식된 세포수가 가장 많은 것으로 해석할 수 있다.
도 12d는 세포 증식률 실험 결과로서, 세포 증식 결과를 완벽히 분석하기 위해, 1일 차에서의 증식 가능한 세포 수를 기반으로 증식률이 계산되었다. 도 12d와 같이, 비록 1일 차에 적은 세포들이 MG5/10/5에 부착했지만, 7일 후 증식률은 다른 스캐폴드보다 높았다. 그러므로 MG5/10/5에서는 큰 확산 상수에 의한 빠른 확산 거동을 보여 세포들이 빠르게 증식하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1-4 : 세포생존율 실험
세포 생존율은 calcein AM(acetomethoxy derivate of calcein)과 EthD-1( ethidium homodimer)으로 구성된 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit를 이용하여 분석하였다. 세포 투과 가능한 calcein AM은 살아있는 세포에서 초록 형광을 발현하지만, 반면에 EthD-1은 손상된 맴브레인을 갖는 세포(예를 들어, 죽은 세포)에 들어가 핵산에 결합하며, 그로 인해 빨간색 형광을 발현한다. 실험에 사용된 스캐폴드는 중심선에서 길이방향으로 절단하였다. 잘린 단면은 2μM calcein AM 및 4 μM EthD-1을 포함하는 LIVE/DEAD assay 용액을 사용하여 염색하였다. 염색된 세포는 형광현미경(AX70; Olympus, Tokyo, Japan)을 통해 관찰하였다.
도 13a는 비교예 1(SG5) 및 비교예 2(SG10)의 스캐폴드 샘플에 대한 세포생전율 실험 결과로서, 먼저 세포 파종 후 1일과 7일 차에 단일층 젤라틴 스캐폴드 (SG5와 SG10)의 내부와 외부에서의 세포 생존율을 평가하였다. SG5 스캐폴드에서, 1일 차 세포 밀도는 SG5가 세포 침투가 용이한 큰 공극 크기를 갖고 있기 때문에 외부보다 내부에서 높았다. 결과적으로, 세포들은 7일 차까지 잘 퍼졌고, 증식했다. 대조적으로, 1일 차 세포 밀도는 SG10 스캐폴드에서 작은 공극 크기 때문에 내부보다 외부에서 높았다. 7일 차에, SG10의 경우 내부에서는 낮은 증식과 적은 죽은 세포수를 보였지만, 외부에서는 많은 죽은 세포가 관찰되었다.
도 13b는 실시예 1(MG5/10/5) 및 실시예 2(MG10/5/10)의 스캐폴드에 대한 실험 결과로서, MG5/10/5 스캐폴드에서, 세포 분포는 죽은 세포가 거의 없이 스캐폴드 전체적으로 균일하였다. 대조적으로, 많은 세포들이 MG10/5/10 스캐폴드의 외층에서 관찰되었다. 또한, 죽은 세포의 수는 상부 외층(top)에서 높았다. 7일 후, MG5/10/5 스캐폴드에서의 세포 수는 스캐폴드 전체적으로 증식하였고, 죽은 세포가 거의 없었다. 비록 몇몇 세포들은 풍부한 영양분 및 산소 때문에 MG10/5/10 스캐폴드의 외층에서 증식하였지만, 또한 몇몇 세포들은 저산소 조건(hypoxia condition) 때문에 죽었다. 많은 세포들이 스캐폴드 내층에서의 약한 영양분 확산 때문에 죽었다. MG10/5/10 스캐폴드 외층에서의 세포들은 내층으로의 영양분 및 산소 공급을 차단했을 것이다. 본 실험결과로부터 세포 거동이 스캐폴드에서의 다공성 구조 조성에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증하였다.
전술한 실험예 1를 정리한 데이터는 하기 표 1과 같다.
구분 평형 팽창비
(%)		 50% 분해율
(days)		 확산계수(106, cm2/min) 세포
생존분포		 약물전달
패턴 		장/단점


실시예 1
(MG5/10/5)

1000

3.8

1.647		 전체적으로 고르게 분포
 5% 젤라틴보다는 느리지만 10%보다는 빠름 물질수송이 원활하고 내부에서 세포생존에 유리


실시예 2
(MG10/5/10)

1000

4.3

0.645		 외부는 높고 내부는 낮음 10% 젤라틴보다는 느리지만 거의 비슷함 물질수송이 원활하지 않아 세포 생존에 부적합


비교예 1
(SG5)

1150

3

1.381		 고르게 분포, 하지만 밀도 낮음
 10% 젤라틴보다 빠름
(약물이 빨리 소모됨)		 물질수송 원활하지만 초기 약물 유출(burst release) 가능성 큼


비교예 2
(SG10)

1100

6.5

0.419		 외부만 밀도 높고 내부는 밀도 낮음
 5% 젤라틴보다 느림
(약물이 오랜 기간 방출됨)
 물질수송 원활하지 않아 세포 생존에 부적합
상기 실험의 결과 가교 밀도가 낮을수록 공극 크기 및 공극률이 커져 팽창비 가 증가(비교예 1의 팽창비가 비교예보다 큼)하고, 실시예 1(MG5/10.5)의 경우 외층의 가교 밀도가 낮고 내층의 가교 밀도가 높아 물 흡수 저장 공간이 큰 반면, 실시예 2(MG10/5/10)의 경우 물 흡수 저장 공간이 작아 비교예들과 비교하여 낮은 팽창비를 가짐을 알 수 있다.
또한, 가교 밀도에 따라 분해율이 다른데, 가교 밀도 낮을수록 분해율이 증가하고, 실시예 1의 경우, 외부 층의 가교 밀도가 낮아 외부 층의 분해 속도가 빠르고 내부 층의 분해 속도는 상대적으로 느리지만, 실시예 2의 경우, 외부 층의 분해속도보다 내부 층의 분해 속도가 빠르므로, 스캐폴드 분리 현상이 나타날 수 있다.
또한, 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 세포 생존 분포 차이를 나타내는데, 비교예 2의 경우 공극 크기 및 공극률이 작기 때문에 세포가 내부로 이동하지 못하고 주로 외부에서만 생존하게 되므로 내부 세포는 물질 수송이 어려워 거의 죽었으며, 실시예 1의 경우, 외부 층의 팽창비 및 분해율이 크기 때문에 내부로의 물질 수송이 원활하여 생존 세포 분포가 고른 것을 보여 스캐폴드로 가장 바람직하게 사용될 수 있을 것이다.
상기 실험예 1-1 내지 1-4의 결과로부터, 내층 및 외층의 공극률(또는 밀도)을 조절함으로써, 스캐폴드로서 필요한 다양한 인자를 제어할 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 초기 약물 방출 속도가 필요한 경우, 후기 약물 방출 속도가 중요한 경우, 세포 생존율이 중요한 경우 등의 필요에 따라 내층 및 외층의 공극률을 적절히 배합함으로써 원하는 약물 전달 효과를 갖는 스캐폴드를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2
상기와 같이 제조된 실시예 3(GTA24) 및 4(GTA42), 비교예 3 내지 6(GTA2 ~ GTA44)에 의해 제조된 코어-외피 구조의 스캐폴드(외피층 없음)의 팽창과 확산 실험, 분해율, 약물 저장 효율 및 방출 기관 등의 특성을 다음과 같이 실험하였다.
실험예 2-1 : 코어-쉘 사이의 경계면 관찰 실험
도 14는 실험예 2에서 실험한 스캐폴드들의 SEM 측정 사진으로서, 코어와 쉘 파트 사이의 경계를 관찰하기 위해 SEM 분석을 수행하였다. 횡단면에서 코어와 쉘은 쉽게 구별할 수 있었다. 건조된 하이드로젤 스캐폴드의 코어와 쉘 파트의 분리는 관찰될 수 있다. 그러나 경계의 분리에 의해 생성된 공간은 작았고, 수분 흡수에 의한 팽창 상태에서 완전히 사라지게 된다(실험결과 미첨부). 즉, 하이드로젤 스캐폴드는 팽창 상태에서만 사용되기 때문에 실질적으로 코어와 쉘 사이의 도 14와 같은 경계 분리 현상은 아무런 문제가 되지 않는다.
실험예 2-2 : 팽창률 실험
도 15는 팽창 실험 결과로서, 팽창비는 처음 360분까지 빠르게 증가하고, 그 후 증가율이 느려졌다. GTA2, GTA22 및 GTA24의 평형 팽창비는 GTA4, GTA44 및 GTA42의 팽창비보다 확연하게 컸다. GTA2, GTA22 및 GTA는 약 1600%-1800%까지 부풀었지만, 반면에 GTA4, GTA44 및 GTA42는 약 1000%-1200%까지 부풀었다.
더구나, 쉘의 부피가 코어 파트의 부피보다 크기 때문에, 전체 팽창에서의 쉘 파트의 효과는 코어 파트보다 더 큰 의미가 있다. 이것은 GTA22와 GTA24의 평형 팽창비가 GTA44와 GTA42보다 더 큰 것에서도 확인할 수 있다. 그러나 GTA24의 평형 팽창비는 낮은 팽창비를 보이는 GTA4로 구성된 코어 파트 때문에 GTA2와 GTA22보다 다소 낮았다. 유사하게, GTA42의 평형 팽창비는 높은 팽창비를 보이는 GTA2로 구성된 코어 파트 때문에 GTA2와 GTA22보다 다소 높았다. 즉, 팽창비는 쉘 파트의 가교 밀도에 의해 주로 결정되었다.
실험예 2-3 : 생체 분해 실험 결과
건조된 젤라틴 스캐폴드의 효소 분해를 평가하기 위해, 스캐폴드는 60 ㎍/mL 콜라게나제를 포함하는 DPBS에 담가졌다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 후, 스캐폴드 샘플은 물로 세척하였고, 48시간 동안 동결건조하였다. 동결건조된 스캐폴드는 다음 식을 사용하여 결정한 잔여 무게를 계산하기 위해 무게를 측정하였다.
[수학식 3]
Remaining weight(%) = ((W 0 -W d )/W 0 )) x 100
여기서, W 0 는 하이드로젤 스캐폴드의 초기 질량이고, W d 는 분해 후 질량이다.
그 결과는 도 16과 같다. GTA2 하이드로젤의 분해율은 높은 표면적 대 부피비 때문에 GTA4 하이드로젤보다 더 높았다. GTA2, GTA22 및 GTA24 스캐폴드는 GTA4, GTA44 및 GTA42 스캐폴드의 분해율보다 상대적으로 높았다. 이 관찰은 외부와 접촉한 쉘 파트의 가교 밀도가 하이드로젤 스캐폴드의 분해율에 주요하게 영향을 끼친다는 것을 보여준다. 그러나 비록 큰 영향은 아니지만 코어 파트 또한 분해에 영향을 끼친다. 코어 파트의 분해에 미치는 효과는 쉘을 통한 더 빠른 효소 확산이 코어 파트의 분해를 야기하기 때문에 GTA2로 구성된 쉘 파트를 갖는 것에서 더 유의적 의미를 나타냈다.
실험예 2-4 : 약물 저장 효율 실험
본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해서는 코어-쉘 타입 하이드로젤 구조의 제작 과정은 반응하지 않은 가교제인 글루타알데하이드를 제거하는 세척 과정을 포함한다. 그러므로 세척 과정 동안 코어 및 쉘에 저장된 약물(BSA)의 초기 손실은 불가피하다. 결과적으로, 약물 저장 효율 분석은 세척과정 동안 약물 손실 양을 확인하기 위해 수행되었다.
약물 저장 효율은 하이드로젤 스캐폴드의 가교 밀도에 의해 영향을 받았으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.
Figure 112015011987444-pat00003
상기 표 2와 같이, 59.33%~75.56% 범위의 BSA 저장 효율을 보여준다. GTA4의 저장 효율은 GTA2보다 높았다. GTA2로부터의 많은 양의 BSA는 높은 팽창비 때문에 빠져나갔고, 결과적으로 초기 대량 방출을 야기했다. GTA22와 GTA44의 저장 효율은 GTA2와 GTA4보다 약간 높았다. 그러나 코어 파트에 저장된 약물의 효과는 GTA2 및 GTA4와 비교하여 통계적으로 유의미하지는 않았다. 약물 저장 효율에서의 쉘 파트의 기여는 주목할만하지 않다. 반면에, GTA24와 GTA44의 저장 효율은 GTA22와 GTA42보다 상당히 높았다. 그러므로 이것은 쉘 파트의 가교 밀도 보다 코어 파트의 가교 밀도가 약물 저장 효율에서의 효과가 더 크다는 것으로 결론 지을 수 있었다.
실험예 2-5 : 약물 누적 방출 거동 실험 결과
가교 밀도(공극률)와 코어-쉘 구조의 약물 방출 효과를 확인하기 위해, 하이드로젤로부터 BSA의 누적 방출 거동은 28일까지 평가하였으며 그 결과는 도 17과 같다.
하이드로젤 스캐폴드의 약물 방출 물성을 평가하기 위해, BSA는 실험 약물로 선택하였다. 모든 샘플들(GTA2, GTA4, GTA22, GTA44, GTA24 및 GTA42)은 DPBS에 담가서 37℃에 보관하였다. 다양한 시점에서, 방출된 BSA의 양은 BCA(bicinchoninic acid) protein assay kit(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 통해 결정되었다. 샘플에서 채집한 상측액(50㎕)에 BCA 분석 시약 150㎕를 넣고, 37℃에서 30분간 보관하였다. 그 후, 562nm에서의 샘플 광학 밀도(OD) 값은 Synergy H1 microplate reader를 이용하여 특정되었다. 방출된 BSA의 양은 BCA 분석 kit를 사용하여 만든 표준 곡선을 기반으로 계산되었다. BSA 누적 방출 양은 저장된 BSA의 초기 양의 백분율로 표현되었다.
[수학식 4]
Cumulative release (%) = (B-C)/A x 100 여기서, A는 하이드로젤 스캐폴드에 초기 저장된 BSA 양이고, B는 BSA가 저장된 하이드로젤 스캐폴드로부터 실제 방출된 단백질 양이며(젤라틴과 BSA), C는 BSA가 저장하지 않은 하이드로젤 스캐폴드로부터 실제 방출된 단백질 양(오직 젤라틴)이다.
가교 밀도와 코어-쉘 구조의 약물 방출 효과를 확인하기 위해, 하이드로젤로부터 BSA의 누적 방출 거동은 28일까지 평가되었다. 단일 타입 하이드로젤 스캐폴드(GTA2 및 GTA4)에서의 BSA는 스캐폴드 전체에 분산된 반면에 코어-쉘 타입 하이드로젤 스캐폴드는 오직 코어 파트에만 BSA가 저장되었다. GTA2에서의 BSA 누적 방출은 GTA4보다 빨랐다. GTA2 스캐폴드의 낮은 가교 밀도와 큰 공극 지름 때문에, BSA는 빠르게 확산되어 빠져나갔다. GTA2에서의 BSA 방출은 4일 후에 평형에 도달하였지만, GTA4에서의 BSA 방출은 9일 후에 평형에 도달하였다. 이것은 GTA2의 높은 팽창비가 BSA의 빠른 방출을 야기한 것으로 보인다. GTA22로부터의 방출 속도는 GTA2보다 약간 느렸고, GTA44의 방출 속도는 GTA4보다 상당히 느렸다. 이 현상은 확산 장벽(shell 파트)에 인한 지연 효과의 직접적인 결과이다. 코어 파트에 저장된 약물은 쉘을 통한 BSA의 초기 확산이 이루어져야 하기 때문에 초기 방출 거동을 지연 시켰다(단일 타입 하이드로젤 스캐폴드와 비교에서).
GTA24의 초기 방출 속도는 GTA24의 높은 코어 파트의 가교 밀도 때문에 GTA22보다 상당히 느렸다. 이것은 16일까지 BSA의 지속적인 방출을 나타냈다. 유사하게, GTA44의 초기 방출 속도는 GTA42보다 상당히 느렸다. 그러나 GTA42와 GTA22의 방출 속도는 초기에는 거의 차이를 보이지 않았다. 이런 결과는 높은 가교 밀도의 코어 파트가 초기 방출 속도 감소에 기여하는 반면, 쉘 파트는 아무런 영향이 없는 것을 나타낸다.
반면에, 쉘 파트의 영향은 지속적 방출 기간에 더 관련된 것으로 보인다. 초기 방출 속도가 비슷함에도 GTA42는 GTA22보다 더 긴 방출 기간을 나타냈다. 이러한 비슷한 이유로, GTA42 및 GTA44의 지속 방출 기간은 GTA22 및 GTA24보다 길었다.
요약하면, 초기 방출 속도는 코어 파트의 가교 밀도에 의해 영향을 받는 반면, 전체 방출 기간은 쉘 파트에 의해 영향을 받는다고 결론 지을 수 있다.
실험예 2-6 : 약물 방출 거동 실험
실험예 2-6의 약물 방출 거동 실험은 전술한 실험예 2-5의 누적 약물 방출 실험과 달리, 실험 기간 동안의 누적 방출량이 아닌 스캐폴드로부터 수용액으로 방출되는 BSA의 양을 1일부터 22일까지 매일 새롭게 측정한 수용액 1 ml 당 BSA의 방출량(mg)을 측정한 결과이다. 예를 들어, 2일째 측정시에는 1일째의 약물이 방출된 수용액을 버리고 새로운 수용액에 다시 1일째 실험에 사용된 동일한 스캐폴드를 담그고 하루 동안 방출되는 약물의 양을 측정하는 방식으로 진행되었다.
도 18a는 실험예 2-6의 실험 결과이며, 상기 도 18a에서 GTA2와 GTA4의 결과만을 발췌한 도면이 도 18b이다. 도 18b와 같이 젤라틴의 가교 밀도가 높을수록, 공극 크기 및 공극률이 작아지므로 BSA 방출이 지연됨을 알 수 있었다.
도 18c는 도 18a의 결과 중 GTA2, GTA4, GTA22 및 GTA44의 결과만을 발췌한 도면으로서, GTA22와 GTA44는 코어에만 BSA가 저장되는데, 여기서 쉘 구조가 초기 BSA 방출을 지연시키기 때문에 초기 방출 속도를 보면 GTA2와 GTA4가 GTA22 및 GTA44에 비하여 높음을 알 수 있었다.
도 18d는 도 18a의 결과 중 GTA22, GTA44, GTA24 및 GTA42의 결과만을 발췌한 도면으로서, 코어와 쉘의 가교밀도 조절에 의해 다양한 방출 거동을 구현할 수 있음을 알 수 있다.
상기 결과를 종합하면 하기 표 3과 같다.
Figure 112015011987444-pat00004
즉 쉘은 초기 약물 방출에 영향을 미치고, 코어는 방출 총기간에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었으며, 높은 가교밀도를 갖는 코어를 갖는 스캐폴드는 지속적 장기간 약물 방출이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2-7 : 세포 증식 실험
HEK(Human embryonic kidney) 293T 세포가 세포 증식 실험에 사용되었다. 상기 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA)와 1% penicillin-streptomycin(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM, Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)에서 배양되었다. 배지는 2-3일마다 바꾸어 주었다. HEK 293T 세포는 0.25% 트립신을 사용하여 띄어내었고, 10% FBS와 1% enicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM배지에서 섞어 주었다. 파종 전, 젤라틴 스캐폴드는 70% 알코올에 30분 담근 후 UV에서 1시간 소독하였다. 소독 후, PBS로 세척하고, 37℃ serum-free DMEM에서 2시간 동안 미리 적셔두었다. 그 후 5 x 104의 HEK 293T 세포를 포함한 혼합액 50 ㎕를 피펫을 이용하여 스캐폴드 위에 파종하였다.
하이드로젤 스캐폴드의 생체적합성을 평가하기 위해, CCK-8 cell counting kit(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 이용하여 세포 증식 실험을 수행하였다. 요약하자면, CCK-8과 serum-free α-MEM을 1:10의 비율로 혼합하고, 스캐폴드가 담긴 각 well에 첨가하였다. 2시간 보관 후, 450nm에서의 OD 값을 측정하였다.
독성이 있는 가교 시약의 존재는 충분히 가능한 걱정이다. 하이드로젤 스캐폴드의 생체적합성을 평가하기 위해, 상기 방법과 같이 CCK-8 kit를 이용하여 5일 동안 하이드로젤 스캐폴드 안에서의 HEK 293T 세포의 증식을 평가하였다. 도 19는 세포 증식 실험 결과로서, 상대적 광학 밀도 값은 1일 차부터 5일 차까지 증가하였다. 이런 결과들은 BSA가 저장된 하이드로젤 스캐폴드의 생체 적합성을 입증한다. 비록 1일 차에서 GTA2에서의 세포 부착이 GTA4보다 낮았지만, 큰 확산 계수와 평균 공극률의 결과로 5일 동안의 GTA2에서의 증식 능력은 GTA4보다 우수했다. GTA2, GTA22 및 GTA24에 파종된 세포들은 5일까지 잘 증식하였다. 큰 확산 계수와 큰 평균 공극률 때문에 세포들은 빠른 확산 거동을 보이는 GTA2에서 빠르게 증식하였다.
실험예 3
실험예에서는 외피층을 더 갖는 스캐폴드의 물성을 비교하기 위하여, 실시예 3 내지 6, 비교예 6 및 7의 스캐폴드 샘플을 대상으로 실험을 하였다.
실험은 실험예 2-6와 동일하게 32일간 매일 스캐폴드로부터 수용액으로 배출되는 BSA의 양을 측정하였으며, GTA24, GTA224 및 GTA424를 대상으로 한 실험 결과가 도 20a이다. 도 20a와 같이 외피층을 갖는 GTA224와 GTA424의 경우 초기 방출이 지연되고 있음을 알 수 있으며, 특히, 가교밀도가 높은 외피층을 갖는 GTA424가 GTA224보다 초기 방출이 지연되고 있다. 또한, 내층인 코어와 외층은 쉘에 다른 약물을 저장한 후 가교 밀도(공극률)를 달리하면 다른 약물의 다른 약물 방출 거동을 보일 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 이중 방출(dual delivery)의 구현이 가능함을 알 수 있었다.
한편, 도 20b는 GTA44, GTA244 및 GTA444를 대상으로 한 실험으로서, 내층 및 외층의 코어-쉘 모두 가교밀도가 높은 경우 외피층의 방출 지연 효과에 더해져 약물 방출 시간을 최장 30일 정도까지 연장할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 도 20a 및 20b의 결과와 같이, 외피층을 더 갖는 스캐폴드의 경우 더욱 다양한 약물 방출 패턴의 구현이 가능함을 알 수 있었다.
본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 상기 설명된 실시예에 한정되지 않으며, 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략되었다. 이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
10, 20, 30, 100, 200, 300, 400 : 본 발명의 스캐폴드
11 : 내층 12 : 외층
13, 23, 33 : 비드 21 : 내층(코어)
22 : 외층(쉘) 31 : 내층(코어)
32 : 외층(쉘) 50 : 외피층
51a : 제1공간부 51b : 제2공간부
1000 : 전기 방사 장치

Claims (18)

  1. 생체적합성 고분자를 포함하여 이루지는 다공성 구조의 내층;
    상기 내층의 일부 또는 전부를 커버하도록 구성되되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는 다공성 구조의 외층; 및
    상기 내층 및 외층을 감싸는 외피층을 포함하여 이루어지되,
    상기 외피층은 스폰지형 또는 섬유형의 다공성 구조이되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지고,
    상기 내층 및 외층에는 각각 1종 이상의 약물이 담지되어 있고,
    상기 내층 및 외층은 공극률이 상이하여 상기 공극률 차에 의하여 담지된 약물의 방출 속도의 제어가 가능하며,
    상기 내층 및 외층은, 내층을 중심으로 상하 양층에 외층을 갖는 적층형 구조인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  2. 생체적합성 고분자를 포함하여 이루지는 다공성 구조의 내층;
    상기 내층의 일부 또는 전부를 커버하도록 구성되되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는 다공성 구조의 외층; 및
    상기 내층 및 외층을 감싸는 외피층을 포함하여 이루어지되,
    상기 외피층은 스폰지형 또는 섬유형의 다공성 구조이되, 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지고,
    상기 내층 및 외층에는 각각 1종 이상의 약물이 담지되어 있고,
    상기 내층 및 외층은 공극률이 상이하여 상기 공극률 차에 의하여 담지된 약물의 방출 속도의 제어가 가능하며,
    상기 내층은 코어(core)이고, 상기 외층은 상기 코어를 외부에서 감싸는 쉘(shell) 형상인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  3. 제1항 또는 제2항에서, 상기 생체적합성 고분자는 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  4. 제3항에서, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알긴산, 아가로스, 셀룰로스, 히알루론산, 키토산, PLA(polylactic acid), PLGA(poly lactic-co-glycolic acid), 폴리카프로락톤, 폴리아크릴산계 하이드로젤, 폴리에틸렌옥사이드계 하이드로젤, 폴리비닐알코올계 하이드로젤 또는 폴리포스파젠계 하이드로젤 단독, 또는 상기 하이드로젤의 혼합인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  5. 제1항에서, 상기 내층 및 외층은 실린더형인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  6. 삭제
  7. 제2항에서, 상기 코어는 실린더형이며, 상기 쉘은 상기 코어를 외부에서 감싸는 실린더형인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  8. 제2항에서, 상기 코어는 구형이며, 상기 쉘은 상기 구형의 코어를 외부에서 감싸는 구형인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  9. 제1항 또는 제2항에서, 상기 내층 및 외층 중 어느 하나 이상에는 약물이 담지된 마이크로 비드 또는 나노 비드가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제2항에서, 상기 외피층에는 약물이 더 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  12. 제11항에서, 상기 외피층에는 약물이 담지된 마이크로 비드 또는 나노 비드가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  13. 제1항 또는 제2항에서, 상기 외피층은 부직포(non woven) 구조의 다공성 구조인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  14. 제1항 또는 제2항에서, 상기 약물은 진통제 또는 항균성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  15. 제14항에서, 상기 진통제는 리도카인(lidocaine)인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  16. 제14항에서, 상기 항균성 펩타이드는 디펜신(defensin) 또는 카텔리시딘(cathelicidin)인 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  17. 제1항 또는 제2항에서, 상기 외피층의 공극률이 내층 및 외층의 공극률에 비하여 더 큰 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
  18. 제1항 또는 제2항에서, 상기 외피층은 2개 이상으로 분리되며, 상기 외피층의 내부에는 상기 내층 및 외층이 삽입될 수 있는 공간을 갖는 것을 특징으로 하는 약물 방출 조절이 가능한 스캐폴드.
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