KR101716795B1 - Novel Saccharopolyspora spinosa wsp8209 Producing Spinosad with High Yield and Method for Producing Spinosad - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스피노사드 생산 효율이 우수한 신규 미생물 및 이를 이용한 스피노사드 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 스피노사드의 전구물질인 람노스(rhamnose) 또는 스피노사드 자체에 의한 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해(feedback inhibition) 및 생장 저해를 극복하면서 고효율로 스피노사드를 생산할 수 있는 신규 미생물, 그리고 이 미생물을 배양함으로써 스피노사드를 고효율로 생산할 수 있는 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물은 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해 및 생장 저해를 극복하면서 우수한 수율로 스피노사드를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 신규 미생물을 이용하면 스피노사드의 생산 효율을 크게 높일 수 있으며, 이에 따라 생산 시간 및 필요 인력을 획기적으로 줄일 수 있고, 생산 단가 또한 크게 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 본 발명의 신규 미생물 배양액은 그 자체로도 스피노사드의 함량이 높아 그대로 살충제로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.The present invention relates to a novel microorganism having an excellent production efficiency of spinosad, and a method for producing the spinosad using the same, and more particularly, to a method for producing a spinosad in which the feedback of the spinosad biosynthesis process by the rhamnose or spinosad itself, inhibition and growth inhibition, and a production method capable of producing spinosad with high efficiency by culturing the microorganism.
The novel microorganism of the present invention can produce spinosad in an excellent yield while overcoming feedback inhibition and growth inhibition of the spinosad biosynthesis process. Therefore, the production efficiency of spinosad can be greatly increased by using the novel microorganism of the present invention, and it is expected that the production time and manpower can be drastically reduced, and the production cost can be greatly reduced. In addition, the novel microorganism culture of the present invention has a high content of spinosad in itself, so that it can be used as a pesticide as it is.
Description
본 발명은 스피노사드 생산 효율이 우수한 신규 미생물 및 이를 이용한 스피노사드 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 스피노사드의 전구물질인 람노스(rhamnose) 또는 스피노사드 자체에 의한 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해(feedback inhibition) 및 생장 저해를 극복하면서 고효율로 스피노사드를 생산할 수 있는 신규 미생물, 그리고 이 미생물을 배양함으로써 스피노사드를 고효율로 생산할 수 있는 생산 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel microorganism having an excellent production efficiency of spinosad, and a method for producing the spinosad using the same, and more particularly, to a method for producing a spinosad in which the feedback of the spinosad biosynthesis process by the rhamnose or spinosad itself, inhibition and growth inhibition, and a production method capable of producing spinosad with high efficiency by culturing the microorganism.
스피노신(spinosyn)은 공지된 농업용 살충제이다. 동물 및 인간에 대해서 독성이 적기 때문에, 환경친화적인 "친환경적" 살충제로 간주된다. 스피노신은 또한 몇몇 외부기생충박멸 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 즉 이들은 쌍시목에 속하는 모기 유충, 검정파리 유충 및 침파리 성충에 대해 시험관내 활성을 갖고, 기니아 피그 및 양에 기생하는 검정파리 유충 및 침파리 성충에 대해 살충작용을 나타낸다. 또한 근래에는 양 및 애완동물들에 서식하는 외부기생충을 방제하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서 독성이 적고 안정성이 증가된 스피노신의 유용한 제제는, 외부기생충을 박멸함으로써 이러한 해충에 의해 감염되는 질환을 예방하는데 잠재적으로 가치가 있다. 스피노신은 스피노신 A, B, C, D 등으로 분류되며, 이들중 스피노신 A와 D의 혼합물 형태를 일반적으로 스피노사드(spinosad)라 한다.Spinosyn is a known agricultural insecticide. Because it is less toxic to animals and humans, it is considered an environmentally friendly "environmentally friendly" pesticide. Spinosynes are also known to have some exterminating activity against parasites. That is, they have an in vitro activity against mosquito larvae, black fly larvae, and fly larvae belonging to the twin-necked rhizome, and exhibit an insecticidal action against black fly larvae and larval fly larvae which are parasitic to guinea pigs and sheep. It has also recently been shown to be useful for controlling external parasites in sheep and pets. Thus, useful preparations of spinosyn which are less toxic and more stable are potentially valuable in preventing diseases infected by these pests by eradicating external parasites. Spinosyns are classified as spinosyns A, B, C, D, etc. Among them, the form of mixture of spinosyn A and D is generally referred to as spinosad.
스피노사드는 사카로폴리스포라 스피노사 ATCC49460를 배양하여 생산하지만 이 균주는 생산 수율이 현저히 낮아서 경쟁력 있는 산업적 개발을 이루기 어렵다. 따라서 생산 수율이 높은 새로운 균주의 개발이 우선되어야 만이 경쟁력 있는 스피노사드 생산이 가능한 것이다.Spinosad is produced by culturing Saccharopolus foraminifera ATCC49460, but the production yield of this strain is so low that competitive industrial development is difficult to achieve. Therefore, the development of a new strain with high production yield should be prioritized to produce a competitive spinosad.
이에 본 발명자는 사카로폴리스포라 스피노사 ATCC49460를 모균주로 사용하여 돌연변이를 시도하였고, 스피노사드의 전구물질인 람노스(rhamnose) 또는 스피노사드 자체에 의한 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해(feedback inhibition) 및 생장 저해를 극복할 수 있는 돌연변이를 선별하고자 하였다. 따라서 람노스 또는 스피노사드가 고농도로 존재하는 조건에서 돌연변이를 유도하는 방법을 사용하여 새로운 스피노사드 고생산 균주를 개발하고자 하였다.Therefore, the present inventors attempted mutation using Saccharopolus foraminifera ATCC49460 as a parent strain, and found that the feedback inhibition of the spinosad biosynthesis process by rhamnose or spinosad itself, which is a precursor of spinosad, And mutation that can overcome growth inhibition. Therefore, we tried to develop a new strain producing spinosad using a method of inducing mutation in the presence of high concentrations of rhamnose or spinosad.
이의 결과, 람노스와 스피노사드에 의한 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해 및 생장 저해를 극복할 수 있는 새로운 균주로써, 스피노사드 생산 효율이 우수한 새로운 균주를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
As a result, the present invention was completed by selecting a new strain having superior spinosad production efficiency as a new strain capable of overcoming feedback inhibition and growth inhibition of spinosad biosynthesis by rhamnose and spinosad.
따라서 본 발명의 주된 목적은 스피노사드를 생합성하는 과정 중에 발생하는 전구물질 및 스피노사드 자체에 의한 피드백 저해를 극복할 수 있으면서 고효율로 스피노사드를 생산할 수 있는 신규 미생물을 제공하는데 있다.Accordingly, it is a main object of the present invention to provide a novel microorganism capable of overcoming feedback inhibition by a precursor and spinosad itself occurring during the process of biosynthesis of spinosad, and capable of producing spinosad with high efficiency.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미생물을 이용하여 고효율로 스피노사드를 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for producing spinosad with high efficiency using the novel microorganism.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 스피노사드(spinosad)를 생산하는 신규 미생물인 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) wsp8209를 제공한다. 상기 신규 미생물은 한국미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 KCTC 12629BP로 기탁되어 있다.According to one aspect of the invention, the present invention provides Saccharopolyspora spinosa wsp8209, a novel microorganism that produces spinosad. The new microorganism has been deposited with the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) under accession number KCTC 12629BP.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사카로폴리스포라 스피노사 wsp8209를 배양하는 것을 특징으로 하는 스피노사드 생산 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing spinosad, which comprises culturing the above-mentioned Saccharopolysporas spinosa wsp8209.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사카로폴리스포라 스피노사 wsp8209의 배양액을 유효성분으로 함유하는 살충제를 제공한다.
According to still another aspect of the present invention, there is provided an insecticide comprising as an active ingredient a culture solution of Saccharopolyspora spinosa wsp8209.
상기 본 발명의 신규 미생물은 사카로폴리스포라 스피노사 ATCC49460을 모균주로 하는 세 단계의 돌연변이 방법을 통해 수득되었다. 세 단계 모두 UV 조사 돌연변이 방법을 사용하였으며, 첫 번째는 UV 조사만을 처리, 두 번째는 고농도의 람노스(rhamnose) 조건에서 UV 조사 처리, 세 번째는 고농도의 스피노사드 조건에서 UV 조사 처리하는 방법을 사용하였다.The novel microorganism of the present invention was obtained through a three-step mutagenesis method using Saccharopolysporas spinosa ATCC49460 as a parent strain. In all three steps, the UV irradiation mutagenesis method was used. The first was UV irradiation only, the second was UV irradiation at high concentration of rhamnose, and the third was UV irradiation at high concentration of spinosad. Respectively.
두 번째와 세 번째 단계에서 고농도의 람노스 또는 스피노사드 조건으로 처리한 것은 균주가 스피노사드를 생합성함에 따라 발생하는 전구물질 또는 스피노사드 자체로 인해 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해(feedback inhibition) 또는 균주의 생장 저해가 일어날 수 있으므로 이에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하기 위한 것이다.In the second and third steps, treatment with a high concentration of rhamnose or spinosad conditions can be achieved by the feedback inhibition of the spinosad biosynthetic process due to the precursor or spinosad itself that occurs as the strain biosynthesizes the spinosad, Which is resistant to the growth of the strain.
상기 본 발명의 신규 미생물은 포도당(glucose), 효모추출물(yeast extract) 및 펩톤(peptone)이 함유된 배지에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 포도당 5 ~ 20g/ℓ, 효모추출물 1 ~ 5g/ℓ, 펩톤 10 ~ 50g/ℓ가 함유된 배지, 보다 바람직하게는 포도당 약 10g/ℓ, 효모추출물 약 3g/ℓ, 펩톤 약 30g/ℓ가 함유된 배지에서 배양하는 것이 좋다. 배양온도는 25 내지 35℃가 적당하며, 바람직하게는 약 30℃가 좋다.The novel microorganism of the present invention can be cultivated in a medium containing glucose, yeast extract and peptone, preferably 5 to 20 g / l of glucose, 1 to 5 g / l of yeast extract , A medium containing 10 to 50 g / l of peptone, more preferably about 10 g / l of glucose, about 3 g / l of yeast extract and about 30 g / l of peptone. The incubation temperature is suitably 25 to 35 占 폚, preferably about 30 占 폚.
상기 본 발명의 신규 미생물을 유지할 때, 복귀 돌연변이(back mutation)를 방지하기 위해서 상기 배지에 람노스 및 스피노사드를 함유시켜 배양하는 것이 바람직하다. 람노스는 0.1 ~ 2㎎/ℓ, 스피노사드는 5 ~ 100㎎/ℓ의 농도로 배지에 함유시키는 것이 바람직하다.When the novel microorganism of the present invention is maintained, it is preferable to culture the medium containing Raminose and Spinosad in the medium to prevent back mutation. It is preferable that the medium is contained in a concentration of 0.1 to 2 mg / L of rhamnose and 5 to 100 mg / L of spinosad.
상기 본 발명의 신규 미생물을 배양하여 배양물을 수득하고 통상의 스피노사드 추출 또는 정체 방법을 사용하면 매우 높은 수율(약 760㎎/ℓ)로 스피노사드를 생산할 수 있다. 추후 배양 배지의 최적화 등을 통해 수율을 더욱 증대시킬 수 있을 것이라 예상된다.When the culture of the novel microorganism of the present invention is cultured to obtain a culture product and a conventional spinosad extraction or stagnation method is used, spinosad can be produced at a very high yield (about 760 mg / L). It is expected that the yield can be further increased through optimization of the culture medium and the like.
본 발명에 따르면, 상기 본 발명의 신규 미생물은 스피노사드를 고효율로 생산할 수 있다. 따라서 별도의 추출 또는 정제과정을 거치지 않더라도 배양액 자체만으로도 우수한 살충효과를 나타낼 수 있다.
According to the present invention, the novel microorganism of the present invention can produce spinosad with high efficiency. Therefore, even if the extraction or purification process is not performed separately, the culture medium alone can exhibit an excellent insecticidal effect.
본 발명의 신규 미생물은 스피노사드 생합성 과정의 피드백 저해 및 생장 저해를 극복하면서 우수한 수율로 스피노사드를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 신규 미생물을 이용하면 스피노사드의 생산 효율을 크게 높일 수 있으며, 이에 따라 생산 시간 및 필요 인력을 획기적으로 줄일 수 있고, 생산 단가 또한 크게 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 본 발명의 신규 미생물 배양액은 그 자체로도 스피노사드의 함량이 높아 그대로 살충제로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
The novel microorganism of the present invention can produce spinosad in an excellent yield while overcoming feedback inhibition and growth inhibition of the spinosad biosynthesis process. Therefore, the production efficiency of spinosad can be greatly increased by using the novel microorganism of the present invention, and it is expected that the production time and manpower can be drastically reduced, and the production cost can be greatly reduced. In addition, the novel microorganism culture of the present invention has a high content of spinosad in itself, so that it can be used as a pesticide as it is.
도 1은 스피노신(spinosyn) A 및 D의 화학구조이다.
도 2는 본 발명에 따른 돌연변이 유도 및 스피노사드 고생산 균주 선별 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 미생물인 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) wsp8209(KCTC 12629BP)를 고체배지에서 배양하여 촬영한 사진이다. 좌측은 spreading, 우측은 streaking하여 배양한 것이다.
도 4는 본 발명의 신규 미생물로부터 생산된 스피노사드 샘플을 LC-MS 분석한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 신규 미생물로부터 생산된 스피노사드 샘플을 HPLC 분석한 결과 그래프이다. 실선은 본 발명의 신규 미생물로부터 생산된 스피노사드의 HPLC 결과이며 점선은 스피노사드 표준품의 결과이다.
도 6은 본 발명의 신규 미생물로부터 생산된 스피노사드 샘플의 장구벌레에 대한 살충효과를 Bioassay하여 나타낸 그래프이다.Figure 1 is the chemical structure of spinosyn A and D;
Fig. 2 shows a process for inducing mutagenesis and spinosadin production according to the present invention.
Fig. 3 is a photograph of Saccharopolyspora spinosa wsp8209 (KCTC 12629BP), a novel microorganism of the present invention, cultured in a solid medium. The left side is spreading and the right side is streaking.
4 is a graph of LC-MS analysis of a spinosad sample produced from the novel microorganism of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing HPLC analysis of a spinosad sample produced from the novel microorganism of the present invention. FIG. The solid line is the HPLC result of spinosad produced from the novel microorganism of the present invention, and the dotted line is the result of the spinosad standard.
6 is a graph showing the insecticidal effect of the spinosad sample produced from the novel microorganism of the present invention on the organoleptic worm by Bioassay.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예 1. 돌연변이 유도 및 스피노사드 고생산 균주 선별Example 1. Mutagenesis and spinosad high production strain selection
사카로폴리스포라 스피노사 ATCC49460를 모균주로 하여 스피노사드를 고수율로 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 선별할 계획으로 모균주에 대해 인위적 돌연변이 유도처리를 수행하였다. 그리고 선별된 돌연변이 균주 중 스피노사드의 전구물질로 알려진 람노스(rhamnose)의 농도가 높은 상태(1㎎/ℓ)에서 스피노사드에 노출되어도 내성이 있는 균주를 선별하였다. 또한 스피노사드에 노출되어도 내성이 있는 균주를 선별하여 고농도 스피노사드 배양액(5㎎/ℓ)에서 생존함으로써 고수율의 배양 상태를 유지하도록 하였다. 상기의 과정을 반복하여 최종적으로 사카로폴리스포라 스피노사 WSP8209를 선발하였다.In order to select a mutant strain capable of producing spinosad in high yield using Saccharopolus foraminifera ATCC49460 as a parent strain, an artificial mutagenesis treatment was performed on the parent strain. The selected strains were resistant to exposure to spinosad in a high concentration of rhamnose (1 mg / l), known as a precursor of spinosad. In addition, strains resistant to exposure to spinosad were selected and survived in high-concentration spinosad culture (5 mg / l) to maintain high yield. The above procedure was repeated to finally select Saccharopolus foresinosa WSP8209.
보다 자세한 내용은 다음과 같다.
The details are as follows.
돌연변이 유도 및 균주 선별Mutagenesis and strain selection
모균주를 20㎖ Bennet agar배지에 도말하여 30℃에서 7일간 배양하였다. 그 후 콜로니 형태가 크고 분화구 형태가 유지되는 콜로니를 선별하여 Bennet배지에 접종하고 30℃에서 7일간 배양하였다. 콜로니가 생성된 후 Bennet agar에 1,000배 희석하여 도말하였다. 그 뒤 자외선램프와 30cm의 거리를 두고 20초간 자외선을 조사하였으며, 7일 배양후 99%의 균이 사멸되었음을 확인하였다.The parent strain was plated on a 20 ml Bennet agar medium and incubated at 30 ° C for 7 days. Colonies with large colony morphology were then selected and inoculated into Bennet medium and cultured at 30 ° C for 7 days. After colony formation, the cells were stained with Bennet agar diluted 1,000 times. After that, ultraviolet rays were irradiated for 20 seconds at a distance of 30 cm from the ultraviolet lamp. It was confirmed that 99% of bacteria were killed after 7 days of incubation.
한편, 자외선 조사 후 암실에 최소 3일간 보관한 다음 일주일간 30℃에서 베넷 액체배지를 사용하여 배양하였다. 그 후 다음에 기술할 스피노사드 추출방법으로 스피노사드를 추출하고 다음에 기술할 정량방법으로 스피노사드를 정량하였다. 재차 배양 과정에서 스피노사드를 가장 많이 생산하는 균주를 확인하고 최종 우수균주를 선별하였다.On the other hand, after UV irradiation, the cells were stored in a dark room for at least 3 days and then cultured in Bennett liquid medium at 30 ° C for one week. Then, spinosad was extracted by the spinosad extraction method described below, and spinosad was quantified by the following quantitative method. The strain that produced the most spinosad in the culture was identified and the final good strain was selected.
선별된 균주를 대상으로 상기와 같은 방법으로 돌연변이를 유도하되, 람노스(rhamnose)를 고농도로 함유한 배지를 사용하여 스피노사드 고생산 균주를 선별한 다음, 이때 선별된 균주를 대상으로 다시 스피노사드를 고농도로 함유한 배지를 사용하여 최종적으로 수율이 가장 높은 돌연변이 균주를 선별하였다(도 2 참조).The selected strains were subjected to mutagenesis in the same manner as above, and strains producing high production of spinosad were selected using a medium containing a high concentration of rhamnose. Then, the selected strains were subjected to spinosad (See Fig. 2). [0052] As shown in Fig.
총 세 단계의 돌연변이 균주 실험을 시행하였으며, 결과는 다음과 같다.A total of three mutant strains were tested and the results were as follows.
UV 조사만으로 C18을 선별하였고, 그 후 람노스를 첨가하여 돌연변이를 유도한 균주 중 수율이 높았던 C18R9를 선별하였다. 마지막으로 스피노사드를 첨가하여 돌연변이를 유도한 균주 중 수율이 가장 높은 균주를 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하였다.C18 was selected only by UV irradiation, and then C18R9, which had a high yield among strains inducing mutation, was selected by adding Ramanose. Finally, the strain with the highest yield among strains inducing mutation by adding spinosad was deposited in the Korean Collection for Type Cultures (KCTC).
WSP8209 변이균주의 형태적 및 배양학적인 부분을 살펴보면 콜로니는 둥근 모양을 나타내고 돔 형태의 융기된 모습을 띠고 있다. 이는 초기 사카로폴리스포라 스피노사가 분화구 모양을 나타내고 있는 것과 비교된다(도 3 참조).
The morphological and cultivational aspects of the WSP8209 mutant strain show that the colonies are round and dome-shaped. This is compared with that of the initial saccharopolith foresinosa showing a crater shape (see FIG. 3).
< 균주동정방법 >≪ Strain identification method >
Shirling과 Gottlieb의 방법(Shirling et al, 1966, Method of Characterization of Streptomyces species, Int. J. System. Bacteriol., 16, 313-340)과 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(Williams et al, 1989, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol 4, Williams & Wilkins)에 기술된 방법을 참고로 하였다.
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Williams et al., 1989) and Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Shirling et al., 1966, Method of Characterization of Streptomyces species, Int. J. System. Bacteriol., 16, 313-340)
< 스피노사드 추출방법 ><Spinosad Extraction Method>
선별된 균주를 배양하여 수득한 배양액과 디클로로메탄을 1:1 비율(v/v)로 혼합하여 위로는 배지층, 아래로는 디클로로메탄층이 나뉨을 확인하고, 충분히 섞어준 뒤 원심분리하여 다시 층이 형성되도록 하였다. 이후 하단의 디클로로메탄층을 분리하여 증발시키면 스피노사드 추출이 완료된다.
The selected strains were cultured, and the obtained culture broth and dichloromethane were mixed at a ratio of 1: 1 (v / v). After confirming the separation of the upper layer and the lower layer of the dichloromethane layer, they were thoroughly mixed and centrifuged Layer was formed. After the lower dichloromethane layer is separated and evaporated, spinosad extraction is completed.
< 스피노사드 정량방법 ><Method for quantitating spinosad>
HPLC(high performance liquid chromatography) 기기를 사용하였으며, 컬럼(column)은 YMC-Pack ODS-AM 컬럼을 사용하였다. 용매로는 아세토니트릴 75% 수용액을 사용하였다. 건조 증발된 스피노사드 샘플을 용매에 녹이고, 유속 0.5㎖/min, 컬럼온도 40℃의 조건 하에서 HPLC 분석을 시행하였다. 분석 결과로 6.8min, 7.3min 대에 스피노신 A와 스피노신 D의 피크가 형성되며, 이는 기존에 분리 정제된 표준품인 스피노사드의 분석 피크(peak)와 일치하므로 동일 물질로 판단할 수 있다. 피크면적(peak area)을 표준품을 통해 그려진 표준곡선(standard curve)에 대입함으로써 정량작업을 수행할 수 있다.
HPLC (high performance liquid chromatography) apparatus was used, and a column was a YMC-Pack ODS-AM column. A 75% aqueous solution of acetonitrile was used as a solvent. The dried and evaporated spinosad sample was dissolved in a solvent and subjected to HPLC analysis under the conditions of a flow rate of 0.5 ml / min and a column temperature of 40 ° C. As a result of the analysis, peaks of spinosyn A and spinosyn D are formed at 6.8 min and 7.3 min, which can be judged to be the same as the analytical peaks of the spinosad, which is a standard product which has been separated and purified. The quantification can be performed by substituting the peak area into the standard curve drawn through the standard product.
실시예 2. wsp8209 변이균주가 생산하는 스피노신 정량Example 2. Quantification of spinosyn produced by the wsp8209 mutant strain
HPLC, LC-MS, Bioassay의 방법으로 사카라폴리스포라 스피노사 wsp8209가 생산한 스피노신의 양을 정성분석 및 정량분석하였다.The amount of spinosyn produced by Saccharopolus foraminifera wsp8209 was qualitatively analyzed and quantitatively analyzed by HPLC, LC-MS, and Bioassay.
각 방법에 사용될 샘플을 만들기 위해서 다음과 같이 스피노신을 추출하였다. 먼저 샘플과 디클로로메탄을 1:1로 믹싱하여 13200rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 그 뒤 디클로로메탄층만 분리하여 증발시켰다. 건조된 추출물에 아세토니트릴 75% 수용액을 가하여 정량을 위한 기본적인 샘플을 완성하였다.Spinosynes were extracted as follows to make samples to be used for each method. First, the sample and dichloromethane were mixed 1: 1 and centrifuged at 13200 rpm for 3 minutes. Only the dichloromethane layer was then separated and evaporated. A 75% aqueous solution of acetonitrile was added to the dried extract to complete a basic sample for quantification.
LC-MS법은 ESI법으로 이온화를 진행하였으며, SIM의 방법을 통해 3㎕를 주입하여 정량하였다.The LC-MS method was ionized by the ESI method, and 3 μl was injected through the SIM method and quantified.
표 1과 도 4는 LC-MS 정성/정량분석 결과이다. 스피노신 A의 분자량인 733.0과 스피노신 D에서의 분자량인 747.0에서 LC-MS 결과가 나왔다. 이를 통해 배양액 내에 스피노신이 있음을 확인하였다.Table 1 and Fig. 4 show the LC-MS qualitative / quantitative analysis results. LC-MS results were obtained at the molecular weight of spinocin A of 733.0 and the molecular weight of spinocin D of 747.0. This confirms that spinosyn is present in the culture.
HPLC법에 의해서는 다음과 같은 조건으로 실험하였다. 용매는 아세토니트릴 75% 수용액을 사용하였으며, 유속은 0.5㎖/min, 컬럼은 YMC-Pack ODS-A를 사용하였고, 컬럼 온도는 40℃로 유지하였다. 샘플은 10㎕를 주입하였다.By HPLC method, the following conditions were tested. The solvent used was a 75% aqueous solution of acetonitrile, the flow rate was 0.5 ml / min, the column was YMC-Pack ODS-A, and the column temperature was maintained at 40 ° C. The sample was injected with 10 μl.
이의 결과 표 2 및 도 5와 같이 SC18R9 3(이하 사카로폴리스포라 스피노사 wsp8209)의 결과가 가장 높았다.As a result, as shown in Table 2 and FIG. 5, the results of SC18R9 3 (hereinafter referred to as "Sakapropolis porporinosa wsp8209") were the highest.
Bioassay의 경우 장구벌레를 직접 채집하여 스피노신이 첨가된 대조군과 첨가되지 않은 대조군, 그리고 배양액과 배양액에서 추출한 추출물로 실험을 진행하였다. 이의 결과는 표 3 및 도 6과 같다.In the case of Bioassay, the extracts were extracted from the control and supplemented with spinosyne, and from the culture and culture media. The results are shown in Table 3 and FIG.
결과에 의하면 스피노신 표준품 대조군은 하루 내에 거의 모든 모기가 구제됨을 알 수 있으며, 아무것도 처리하지 않은 대조군은 72시간 이후부터 서서히 모기가 구제됨을 알 수 있다. 실험군인 A9 균액과 A9 추출액(A9 ANC 75% 추출액)은 비록 수율이 사카로폴리스포라 스피노사 wsp8209보다 낮음에도 불구하고 모기 구제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
The results show that almost all of the mosquitoes are rescued in the day of the spinosyn standard control group, and that the control group, which has not been treated with anything, gradually relieves mosquitoes after 72 hours. The experimental group A9 and A9 extract (A9 ANC 75% extract) showed a mosquito repellent effect even though the yield was lower than that of Saccharopolis poraspinosa wsp8209.
모균주의 배양액에서는 스피노사드가 거의 검출이 되지 않았으나 사카로폴리스포라 스피노사 WSP8209는 약 760㎎/ℓ의 높은 수율로 스피노사드를 생산하는 것으로 확인되었다.
Spinosad was not detected in the culture medium of parent strain, but it was confirmed that Saccharopolus foraminifera WSP8209 produced spinosad in a high yield of about 760 mg / l.
Claims (3)
An insecticide containing as an active ingredient a culture solution of Saccharopolyspora spinosa wsp8209 (KCTC 12629BP) of claim 1 as an active ingredient.
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