KR101716771B1 - A method for prevention of chromosomal aberration in pluripotent stem cells through the inhibition of SIRT1 activity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시험관내 반복 계대 배양으로 인한 염색체 이상을 억제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, SIRT1 효소 활성 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 염색체 이상을 억제하면서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for suppressing chromosomal anomalies caused by in vitro repeated passage culture, and more particularly, to a method for culturing cells while suppressing chromosomal abnormalities of pre-differentiating stem cells by inhibiting SIRT1 enzyme activity.
Description
본 발명은 시험관내 반복 계대 배양으로 인한 염색체 이상을 억제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 SIRT1 활성 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 염색체 이상을 억제하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for suppressing chromosomal anomalies caused by repeated in-vitro culture, and more particularly, to a method for inhibiting chromosomal anomalies of pre-differentiating stem cells by inhibiting SIRT1 activity.
1981년 생쥐 배반포로부터 배아줄기세포가 분리되어 시험관에서 배양이 가능해졌고 (Evans MJ & M., Nature 292:154-56, 1981), 1988 년에는 생쥐배아줄기세포에 특정 유전자 도입법이 완성되어 최초로 유전자 도입 생쥐가 만들어지게 되었다 (Robertson EJ, Trends Genet., 2:9-13, 1986). 유전자 도입 생쥐 제조 기술은 이후 유전자의 기능 연구 및 인간의 질환 모델을 수립하는 데에 없어서는 안 될 중요한 기술로서 생명과학/의학의 발달에 견인차 역할을 해왔다 (Zheng B. et al., Mol. Cell Biol., 20:648-55, 2000). 인간 배아 줄기세포의 시험관 배양은 1998 년 위스콘신대학의 톰슨박사가 인간 배아줄기세포주를 처음으로 수립하여 완성하였다 (Thomson JA, Science 282(5391): 1145-7, 1998). 생쥐 배아 줄기세포에 비하여 인간 배아 줄기세포는 시험관 배양이 더욱 어렵고 조작이 불편하여 세포를 대량 배양하여 유전자 조작 혹은 시험관 조작하여 세포 치료제로 이용하는 데에 많은 기술적 어려움을 안고 있다 (Thomson JA, Science 282(5391): 1145-7, 1998).
In 1981, embryonic stem cells were isolated from mouse blastocysts and cultured in vitro (Evans MJ & M., Nature 292: 154-56, 1981). In 1988, a specific gene transfer strategy was completed in mouse embryonic stem cells, Introduced mice (Robertson EJ, Trends Genet., 2: 9-13, 1986). Genetically engineered mouse technology has been the driving force behind the development of life sciences / medicine as an indispensable technology for studying the function of genes and establishing human disease models (Zheng B. et al., Mol. Cell Biol , ≪ / RTI > 20: 648-55,2000). In vitro culture of human embryonic stem cells was completed in 1998 by Dr Thompson of the University of Wisconsin, Thomson JA, Science 282 (5391): 1145-7, 1998. Compared with mouse embryonic stem cells, human embryonic stem cells are more difficult to cultivate in vitro and are inconvenient to manipulate, resulting in a number of technical difficulties in using large amounts of cells as a cell therapy agent by gene manipulation or in vitro manipulation (Thomson JA, Science 282 5391): 1145-7,1998).
배아줄기세포는 무한 증식이 가능하며, 장기간 시험관내 배양을 하여도 전분화능이 유지되고 또한 내배엽, 외배엽 그리고 중배엽을 이루는 여러 세포로의 분화가 가능하다 (Gerecht-Nir S & Itskovitz-Eldor J., Clin. Obstet. Gynaecol. 18:843-852, 2004). 배아줄기세포의 체세포 구성 전세포로의 분화능력과 더불어 이러한 무한증식능력 때문에 배아줄기세포가 표적 장기나 세포의 재생에 이용될 잠재적 가능성을 지니고 있어 현재 활발히 연구가 진행 중에 있다.
Embryonic stem cells are capable of endogenous proliferation and differentiation into pluripotent cells that maintain endogenous pluripotency and endodermal, ectodermal, and mesodermal lobe even when cultured for a long time in vitro (Gerecht-Nir S & Itskovitz-Eldor J., Clin. Obstet., Gynecol., 18: 843-852, 2004). Embryonic Stem Cell Composition of Somatic Cells Embryonic stem cells have potential to be used for regeneration of target organs or cells due to their ability to differentiate into charac- terized cells and are being actively studied.
전분화능 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 대량 배양이 가능해야하고 원하는 세포로의 분화를 조절할 수 있는 기술력의 수립이 매우 절실하다. 그러나 배아줄기세포를 대량배양하기 위하여 시험관내에서 반복배양하면 염색체수 이상이 발생하는 것으로 여러 연구에서 보고되고 있다. 마우스 배아줄기세포의 경우 시험관에서 25 번 반복 계대배양을 하면 정상배수의 염색체수 (euploid) 를 갖는 세포수가 전체의 20%정도 밖에 되지 않는다 (Longo L. et al., Transgenic Research 6:321-28, 1997). 또한 인간 배아줄기세포도 반복 계대 배양에 의해 이배수의 염색체 (aneuploid)를 갖는 세포가 증가하는 것으로 알려져 있다 (Spits C. Nature Biotechnology, 26(12):1361-1363, 2008).
In order for stem cells to be used as a cell therapy agent, it is necessary to cultivate a large amount of cells and to establish a technology capable of controlling the differentiation into a desired cell. However, several studies have reported that when the cells are repeatedly cultured in vitro for the purpose of mass culture of embryonic stem cells, chromosome aberration occurs. In the case of mouse embryonic stem cells, the number of cells with normal euploid number is only about 20% when subjected to 25 repeated passages in vitro (Longo L. et al., Transgenic Research 6: 321-28 , 1997). In addition, human embryonic stem cells are also known to have an increased number of cells with a doubled number of aneuploids (Spits C. Nature Biotechnology, 26 (12): 1361-1363, 2008).
염색체수 이상 (aneuploidy)을 포함한 세포의 염색체이상은 암 형성 초기에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Li R et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:3236-3241,2000). 배아줄기세포의 염색체이상에 주목하는 이유는 염색체이상이 있는 배아줄기세포를 장기 및 세포 재생에 이용할 경우 분화된 세포가 암세포로 변이될 가능성이 있기 때문이다. 따라서 염색체 및 유전자이상이 없는 유전적으로 완전한 배아줄기세포의 확보는 배아줄기 세포를 세포 및 장기재생 이용할 시 전제가 되어야 할 중요한 사항이다.
Chromosomal abnormalities in cells, including aneuploidy, are known to play a very important role in early cancer development (Li R et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 97: 3236-3241, 2000). The reason why we are paying attention to chromosomal abnormalities of embryonic stem cells is that when embryonic stem cells with chromosomal abnormalities are used for organs and cell regeneration, differentiated cells may be transformed into cancer cells. Therefore, securing genetically perfect embryonic stem cells without chromosome and gene abnormality is a prerequisite for using embryonic stem cells for cell and organ regeneration.
구강 상피세포암, leiomyosarcoma 등의 암세포등에서 p53이 결실되어 있을 경우 이배수의 염색체 (aneuploidy)를 가진 세포수가 증가된다고 알려져 있고 (Kaleli S et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 100(1):96-9, 2001) 또한 p53이란 단백질이 mutation된 경우도 염색체수 이상이 증가되어 있다고 알려져 있다 (Garder PJ et al., Br. J. Cancer 71(2):215-8, 1995). 즉 p53이 결실되어 있거나 mutation에 의해 기능이 소실되면 염색체 수 이상이 생김을 의미한다. 마우스 배아줄기세포에서 p53이 다량 발현되어 있으나 그 기능이 소실되어 있다 (Aladjem, M.I. et al., Curr. Biol. 8, 145-155, 1998). 이 기능 소실은 마우스 배아줄기세포가 histone diacetylase의 일종인 SIRT1이 과령 발현되어 있어 p53을 diacetylation시킴으로서 p53의 transcription activity를 저해하고 있기 때문이다 (Han MK et al., Cell Stem Cell 2(3):241-251, 2008). 따라서 p53이 지니고 있는 염색체 이상 감시 기능을 SIRT1이 억제하여 배아줄기세포의 염색체 이상을 유도할 것으로 예상되고, 결국 SIRT1 활성을 억제하면 염색체 이상이 교정될 것으로 예측되나 이에 대한 연구가 거의 없다.
It is known that the number of cells with aneuploidy is increased when p53 is deleted in cancer cells such as oral epithelial cell and leiomyosarcoma (Kaleli S et al., Eur., J. Obstet., Gynecol. Reprod. 100 (1): 96-9, 2001). It is also known that the mutation of p53 protein increases the number of chromosomes (Garder PJ et al., Br. J. Cancer 71 (2): 215-8, 1995). In other words, when p53 is deleted or its function is lost by mutation, it means chromosomal abnormalities. The expression of p53 in mouse embryonic stem cells is abundant, but its function is lost (Aladjem, MI et al., Curr. Biol. 8, 145-155, 1998). This loss of function is due to the fact that mouse embryonic stem cells are overexpressed in SIRT1, a type of histone diacetylase, which inhibits p53 transcription activity by diacetylation of p53 (Han MK et al., Cell Stem Cell 2 (3): 241 -251, 2008). Therefore, it is expected that SIRT1 suppresses the chromosome abnormality monitoring function of p53 and induces the chromosomal abnormality of embryonic stem cells. As a result, if the SIRT1 activity is inhibited, the chromosome abnormality is expected to be corrected, but there is little research on this.
이에 본 발명자들은 SIRT1의 발현과 반복계대 배양에 따른 염색체 수 이상에 대하여 연구한 결과, 놀랍게도 그 관계를 규명함으로써 전분화능을 유지하면서 염색체 수 이상을 방지하는 방법을 도출할 수 있었다.Thus, the inventors of the present invention have studied the expression of SIRT1 and the number of chromosomes according to the repeated passage culture. As a result, it has been surprisingly found that a method of preventing chromosomal abnormality while maintaining the ability to differentiate can be derived.
따라서, 본 발명의 목적은 SIRT1의 효소활성을 억제하여 전분화능 줄기세포의 염색체 수 이상을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for inhibiting the enzymatic activity of SIRT1 to inhibit the chromosomal abnormality of the pluripotent stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 SIRT1의 효소활성 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 염색체 수 이상을 방지하면서 세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for culturing cells while preventing chromosomal abnormality of pre-differentiating stem cells by inhibiting enzyme activity of SIRT1.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 전분화능 줄기세포의 SIRT1의 효소활성 억제에 의해 염색체 수 이상을 억제하는 방법을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a method for inhibiting chromosome number abnormality by suppressing the enzyme activity of SIRT1 of pre-differentiating stem cells.
본 발명은 또한, SIRT1의 효소활성 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 염색체 수 이상을 방지하면서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for culturing a cell while preventing chromosome number abnormality of pre-differentiating stem cells by inhibiting the enzyme activity of SIRT1.
상기 전분화능 줄기세포는 대부분 배아 또는 성체세포로부터 유래될 수도 있다.The pre-differentiating stem cells may be mostly derived from embryonic or adult cells.
상기 SIRT1의 효소활성 억제하는 방법으로는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.Any of the methods known in the art can be used as a method for inhibiting the enzyme activity of SIRT1.
SIRT1의 효소활성을 억제하기 위하여, 전분화능 줄기세포의 배양액에 SIRT1의 효소활성 억제물질을 첨가할 수 있다. 또는, SIRT1의 효소활성을 억제하기 위하여 SIRT1의 효소활성 억제물질을 세포의 배양용기, 배양구슬, 지지체, 또는 이들의 조합에 코팅할 수도 있다.
In order to inhibit the enzyme activity of SIRT1, an inhibitor of enzyme activity of SIRT1 may be added to the culture medium of the pluripotent stem cells. Alternatively, in order to inhibit the enzyme activity of SIRT1, the enzyme activity inhibitor of SIRT1 may be coated on a cell culture container, a culture bead, a support, or a combination thereof.
상기 SIRT1의 효소활성 억제물질의 예로는 Ex-527, Sirtinol 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Examples of the inhibitor of enzyme activity of SIRT1 include Ex-527, Sirtinol, or a combination thereof, but are not limited thereto.
상기 SIRT1의 효소활성 억제에 의해 염색체 수 이상을 억제하는 방법 또는 이를 이용한 세포의 배양방법은 전분화능 줄기 세포 이외에도 다른 세포에도 적용될 수 있다.
The method of suppressing the chromosome number abnormality by inhibiting the enzyme activity of SIRT1 or the method of culturing the cells using the method can be applied to other cells than the whole differentiating stem cells.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 제공하는 전분화능 줄기 세포의 반복 계대 배양에 의한 염색체 수 이상을 억제하는 방법은 SIRT1 효소활성 억제에 의한다. 이러한 억제방법을 적용함으로써, 전분화능을 유지하면서 염색체 수 이상이 억제된 줄기세포를 배양할 수 있다.The method of inhibiting the chromosome number abnormality by repeated passaging of the pluripotent stem cells provided by the present invention is due to inhibition of SIRT1 enzyme activity. By applying this suppression method, it is possible to cultivate stem cells in which the number of chromosomes is suppressed while maintaining the ability to differentiate.
SIRT1 효소활성의 억제는 본 발명에서 제공하는 세포의 분화를 억제하는 방법의 핵심 수단이며, 본 발명자는 여러 실험결과를 토대로 SIRT1 효소활성의 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 염색체 수 이상 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
The inhibition of SIRT1 enzyme activity is a key means of inhibiting the differentiation of cells provided by the present invention. Based on the results of various experiments, the present inventors have found that inhibition of SIRT1 enzyme activity can inhibit the number of chromosomes of pre-differentiating stem cells .
SIRT1 효소활성의 억제는 본 발명에서 제공하는 세포의 염색체 수 이상을 억제하는 방법의 핵심 수단이며, 본 발명자는 여러 실험결과를 토대로 SIRT1 효소활성의 억제에 의해 세포의 염색체 수 이상을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
The inhibition of SIRT1 enzyme activity is a key means of inhibiting the number of chromosomes in cells provided by the present invention. Based on the results of various experiments, the present inventors have found that inhibition of SIRT1 enzyme activity can inhibit the number of chromosomes in a cell .
본 발명자들은 SIRT1 효소활성의 억제 했을 경우와 그렇지 않았을 경우의 염색체수 이상 세포수를 조사하였다.The present inventors investigated the number of abnormal chromosomal aberrations when SIRT1 enzyme activity was inhibited or not.
줄기세포의 염색체 수 이상은 세포분열억제제인 colcemid를 처리하여 세포 분열을 중기상(metaphase) 상에서 정지시킨 후 염색체 수를 현미경상에서 세어 검사하였다. 정상 마우스 배아줄기세포를 25 번 계대 배양하면 세포의 80% 가 염색체 수의 이상이 발생한 반면 SIRT1 유전자가 결실된 마우스 배아줄기세포는 25 번 계대배양 후에도 약 20% 만이 염색체 수 이상을 보였다. 따라서 SIRT1의 효소활성이 없으면 시험관내에서도 반복 계대 배양에도 마우스 배아줄기세포의 염색체 수 이상이 저해됨을 증명하였다. 한편, 유전자가 결실된 마우스 배아줄기세포는 마우스 배아줄기세포 특이 marker 인 Alkaline phosphatase, nanog, Oct-3/4 그리고 SSEA-1의 발현이 정상 마우스와 차이가 없어 배아줄기세포의 성격을 변화시키지 않는다. 따라서 본 연구자들은 SIRT1의 기능을 저해시키면 배아줄기세포의 전분화능을 유지시키면서 시험관내 반복계대 배양에 의한 염색체 수 이상을 방지할 수 있음을 증명하였다.
The chromosomal abnormality of stem cells was treated with colcemid, a cell division inhibitor, and the cell division was stopped on the metaphase, and the number of chromosomes was counted on a microscope. When normal mouse embryonic stem cells were transfected 25 times, 80% of the cells had chromosomal abnormalities, whereas only 20% of the mouse embryonic stem cells, in which the SIRT1 gene had been deleted, had chromosomal abnormalities even after passage of the 25th passage. Therefore, it has been demonstrated that the absence of SIRT1 enzyme activity inhibits the chromosomal abnormality of mouse embryonic stem cells in repeated passaging in vitro. On the other hand, mouse embryonic stem cells in which the gene has been deleted do not change the characteristics of embryonic stem cells because the expression of mouse embryonic stem cell-specific markers such as Alkaline phosphatase, nanog, Oct-3/4 and SSEA- . Therefore, we have shown that inhibition of SIRT1 function can prevent chromosome aberration by repeated subculture in vitro while maintaining the ability to differentiate into embryonic stem cells.
본 발명자들이 SIRT1 유전자에는 영향을 미치지 않으면서 그 효소활성을 억제하여 기능을 정지시키는 SIRT1 inhibitor인 Ex527을 마우스 배아줄기세포에 처리한 결과, 처리하지 않는 세포에 비해 염색체 수 이상을 보이는 세포수가 약 1/4 정도로 감소하였다. 반면 Ex527 처리에 의해서 전분화성을 증명해주는 marker 유전자인 nanog, Oct-3/4, STAT3, Sox-2, FGF4, Rex1의 발현은 처리하지 않는 세포와 차이가 없고 또한 분화을 증명해주는 marker인 FGF5의 발현이 증가되지 않음을 관찰하여 Ex527의 처리에 의해서도 전분화성이 유지됨을 증명하였다. SIRT1 유전자 결실 마우스 배아줄기세포와 SIRT1 효소활성억제제인 Ex527의 결과로부터 SIRT1 효소활성 억제에 의해 마우스 배아줄기세포의 장기간 반복계대 배양에 의한 염색체 수 이상이 방지되는 것이 보편적인 현상임을 확인하였으며, 이로부터 마우스 배아줄기세포의 장기 배양에 따른 염색체 수 이상을 억제하면서 마우스 배아줄기세포를 배양할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
The present inventors treated Ex527, a SIRT1 inhibitor that inhibits the enzyme activity of SIRT1 gene and inhibited its function, to mouse embryonic stem cells. As a result, the number of cells having chromosome number more than about 1 / 4. On the other hand, the expression of nanog, Oct-3/4, STAT3, Sox-2, FGF4, and Rex1, which is a marker gene that demonstrates the ability of starvation by Ex527 treatment, is not different from that of untreated cells and the expression of FGF5 Was not increased and proved that the starch was retained even by the treatment of Ex527. From the results of SIRT1 gene deletion mouse embryonic stem cell and Ex527 SIRT1 enzyme activity inhibitor, it has been confirmed that inhibition of SIRT1 enzyme activity is a universal phenomenon that the chromosomal abnormality due to long-term repeated passage of mouse embryonic stem cells is prevented It was found that mouse embryonic stem cells can be cultured while suppressing the number of chromosomes due to long-term culture of mouse embryonic stem cells.
염색체 이상이 있는 배아줄기세포를 장기 및 세포 재생에 이용할 경우 분화된 세포가 암세포로 변이될 가능성이 있기 때문에 본 발명의 시험관 내 반복 계대 배양으로 인한 염색체 이상을 억제하는 방법은 안전하게 배아줄기세포를 배양할 수 있으며, 배아줄기세포 연구에 큰 발전을 도모할 수 있을 것이다.
When embryonic stem cells having chromosomal abnormality are used for organ and cell regeneration, since the differentiated cells are likely to be transformed into cancer cells, the method of inhibiting chromosomal anomalies caused by the in vitro repeated passage culture of the present invention can safely cultivate embryonic stem cells And will be able to make great progress in research on embryonic stem cells.
도 1은 전분화능 배아줄기세포 marker인 Oct-3/4, SSEA-1, alkaline phosphatase, nanog의 발현양의 차이를 B6 마우스 배아줄기세포주와 SIRT1이 결실된 마우스 배아줄기세포주에서 비교한 결과이다.
도 2는 B6 마우스 배아줄기세포주와 SIRT1이 결실된 마우스 배아줄기세포주를 각각 시험관내에서 10 번과 25 번 계대 배양한 후 염색체 수를 세어 비교한 결과이다.
도 3은 마우스 배아줄기세포주와 SIRT1 저해제인 Ex527를 처리한 것과 처리하지 않는 것을 각각 시험관내에서 10 번과 25 번 계대 배양한 후 염색체 수를 세어 비교한 결과이다.
도 4는 마우스 배아줄기세포주와 SIRT1 저해제인 Ex527를 처리한 것과 처리하지 않는 것을 각각 시험관내에서 10 번과 25 번 계대 배양한 후 미분화 마커와 분화 마커의 발현양을 비교한 결과이다.FIG. 1 shows the results of comparing the expression levels of Oct-3/4, SSEA-1, alkaline phosphatase and nanog, which are markers of pre-differentiation embryonic stem cell, in B6 mouse embryonic stem cell line and mouse embryonic stem cell line lacking SIRT1.
FIG. 2 shows the results of comparing the numbers of chromosomes after B6 mouse embryonic stem cell lines and SIRT1-deleted mouse embryonic stem cell lines were cultured in 10 and 25 passages, respectively, in vitro.
FIG. 3 shows the results of comparing the numbers of chromosomes after 10 and 25 passages of the mouse embryonic stem cell line and the SIRT1 inhibitor, Ex527, in the test tube, respectively.
FIG. 4 shows the results of comparing the amounts of undifferentiated markers and differentiation markers after 10 and 25 passages of the mouse embryonic stem cell line and the SIRT1 inhibitor Ex527, respectively, in the test tube.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the present invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
<< 실시예Example 1> 세포 배양 1> Cell culture
B6 마우스 배아줄기세포 주 및 SIRT1 유전자가 결실된 B6 마우스 배아줄기세포를 Canada에 있는 Ottawa Health Research Institute의 Michael W. Mcburney로부터 분양받아 2일에 한번씩 계대 배양하였다.
B6 mouse embryonic stem cell line and B6 mouse embryonic stem cell line deficient in SIRT1 gene were distributed from Michael W. Mcburney of Ottawa Health Research Institute in Canada and subcultured every 2 days.
<< 실시예Example 2> 2> FACSFACS ( ( FluorescenceFluorescence activatedactivated cellcell sortersorter )를 통한 ) Through 전분화능Total differentiation ability marker 발현 검증 marker expression verification
B6 마우스 배아줄기세포 주 및 SIRT1 유전자가 결실된 B6 마우스 배아줄기세포 주를 48시간 배양 후 전분화능 표시 marker 인 Oct-3/4와 SSEA-1 의 발현 양을 FACS 분석법을 통하여 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타 내었다.
B6 mouse embryonic stem cell line and SIRT1 gene-deficient B6 mouse embryonic stem cell line were cultured for 48 hours. The expression levels of Oct-3/4 and SSEA-1 were measured by FACS analysis. The results are shown in Fig.
<< 실시예Example 3> 3> AlkalineAlkaline phosphatase포스화제 염색 dyeing
B6 마우스 배아줄기세포 주 및 SIRT1 유전자가 결실된 B6 마우스 배아줄기세포 주를 4일 간 배양 후 Alkaline phosphatase staining kit (미국Chemicon사) 를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
B6 mouse embryonic stem cell line and B6 mouse embryonic stem cell line deficient in SIRT1 gene were cultured for 4 days and then assayed using Alkaline phosphatase staining kit (Chemicon, USA). The results are shown in Fig.
<< 실시예Example 4> 4> NanogNanog 발현양Expression level 측정 Measure
B6 마우스 배아줄기세포 주 및 SIRT1 유전자가 결실된 B6 마우스 배아줄기세포 주를 4일 간 배양 후 Alkaline phosphatase staining kit (미국Chemicon사) 를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
B6 mouse embryonic stem cell line and B6 mouse embryonic stem cell line deficient in SIRT1 gene were cultured for 4 days and then assayed using Alkaline phosphatase staining kit (Chemicon, USA). The results are shown in Fig.
<< 실시예Example 5> 염색체 수 이상 측정 5> Chromosome aberration measurement
염색체 수를 세기 위하여 5X105cell을 48시간동안 배양한 후 colchicine(0.1 ㎍/㎖)을 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 7시간동안 방치하였다. DPBS로 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA를 넣고 1분간 방치하였다. 원심분리 후 세포를 0.075M KCl 저장액에서 5분간 반응시켰다. -20℃에서 30분간 보관한 Fixative(Methanol : Acetic acid = 3 : 1) 3 ㎖을 첨가하여 10분간 방치하였다. 원심분리한 후 세포를 Fixative 100 ㎕로 suspension하고 35 ㎕를 슬라이드 위 30 cm에서 떨어뜨리고 건조시켰다. 75℃ Hot steam을 1~3초간 쏘여주고 최소 1 h 방치한다. Propidium Iodide staining(0.4 mg/㎖)하여 슬라이드를 형광 현미경하에서 염색체 수를 세었다. B6 마우스 배아줄기세포 주 및 SIRT1 유전자가 결실된 B6 마우스 배아줄기세포 주를 시험관에서 25 번 계대 배양 후 염색체 수를 센 결과는 도 2에서 나타내었고 SIRT1 저해제인 500 nM의 Ex527을 처리한 세포주와 처리하지 않은 세포주를 25 번 계대 배양 후 염색체 수를 센 결과는 도 3에 나타내었다.
5 × 10 5 cells were cultured for 48 hours, and colchicine (0.1 μg / ㎖) was treated for 7 hours at 37 ° C in a 5% CO2 incubator. After washing with DPBS, 0.25% trypsin-EDTA was added and left for 1 minute. After centrifugation, the cells were incubated in a 0.075 M KCl stock solution for 5 minutes. 3 ml of Fixative (methanol: Acetic acid = 3: 1) stored at -20 ° C for 30 minutes was added and left for 10 minutes. After centrifugation, the cells were suspended in 100 μl of Fixative, and 35 μl of the cells were dropped at a distance of 30 cm from the slide and dried. Heat at 75 ℃ for 1 ~ 3 seconds and let stand for at least 1 hour. Propidium iodide staining (0.4 mg / ml) was used to count the number of chromosomes on a slide under a fluorescent microscope. B6 mouse embryonic stem cell line and the B6 mouse embryonic stem cell line in which the SIRT1 gene was deleted were subjected to chromosome counting after passage of 25 times in vitro. The results are shown in Fig. 2, and the cell line treated with Ex527 The result of counting the number of chromosomes after culturing the untransfected cell line 25 times is shown in FIG.
<< 실시예Example 6> 6> RTRT -- PCRPCR 방법을 이용한 배아줄기세포의 미분화 특성 분석 Of undifferentiated embryonic stem cells
SIRT1 저해제인 100 nM의 Ex527을 처리한 세포주와 처리하지 않은 세포주를 25 번 계대 배양 후 배아줄기세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 RNA 추출 kit (Qiagen RNeasy Mini Kit; Qiagen RNase-Free DNase Set)를 이용하여 추출하였다. 만능줄기세포에서 분리한 2 ㎍의 전체 RNA를 주형으로 하고, 단일가닥 cDNA 합성 kit (Promega ImProm-II™ Reverse Transcription System)를 사용하여, 42℃에서 60분간 역전사 반응을 수행하였다. 이후 70℃에서 15분간 반응하여 역전사효소를 불활성화시켰다. PCR DNA합성 kit (Promega's PCR Core System I, #M7660)를 사용하여 다음과 같은 프라이머(primer)가 첨가된 반응액에서 전체 반응물 1㎕(100ng)를 주형으로 하여 cDNA를 합성하였다. 증폭된 DNA를 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다.
SIRT1 inhibitor, 100 nM of Ex527, and untreated cell line were cultured for 25 passages. Total RNA (total RNA) was extracted from embryonic stem cells using a Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen RNase-Free DNase Set) Respectively. Reverse transcription was performed at 42 캜 for 60 minutes using a single-stranded cDNA synthesis kit (Promega ImProm-II Reverse Transcription System) with 2 쨉 g total RNA isolated from pluripotent stem cells as a template. And then reacted at 70 ° C for 15 minutes to inactivate the reverse transcriptase. CDNA was synthesized using 1 μl (100 ng) of the total reaction as a template in the reaction solution to which the following primer was added using the PCR DNA synthesis kit (Promega's PCR Core System I, # M7660). The amplified DNA was electrophoresed on 1.5% agarose gel to confirm the DNA band.
이때 사용된 프라이머는 대조군인 HPRT 프라이머의 경우,In the case of the control group HPRT primer,
forward sequence는 5'-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3', The forward sequence is 5'-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3 ',
reverse sequence는 5'-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3', The reverse sequence was 5'-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3 '
Nanog 프라이머의 경우, In the case of Nanog primers,
forward sequence는 5'-AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG-3', The forward sequence is 5'-AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG-3 ',
reverse sequence는 5'-CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG-3', The reverse sequence was 5'-CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG-3 '
Sox2 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-GAGAGCAAGTACTGGCAAGACCG-3', For the Sox2 primer, the forward sequence is 5'-GAGAGCAAGTACTGGCAAGACCG-3 '
reverse sequence는 5'-TATACATGGATTCTCGCCAGCC-3'The reverse sequence was 5'-TATACATGGATTCTCGCCAGCC-3 '
의 염기서열을 사용하여 60℃에서 30초간 중합(annealing)하였다.
Was annealed at 60 DEG C for 30 seconds.
FGF4 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-AGCGAGGCGTGGTGAGCATCTT-3', For the FGF4 primer, the forward sequence is 5'-AGCGAGGCGTGGTGAGCATCTT-3 '
reverse sequence는 5'-TGGTCCGCCCGTTCTTACTGAG-3'The reverse sequence was 5'-TGGTCCGCCCGTTCTTACTGAG-3 '
염기서열을 사용하였으며 64℃에서 30초간 중합(annealing)하였다. Nucleotide sequence was annealed at 64 ° C for 30 seconds.
FGF5 프라이머의 경우 forward sequence는5'-ATGAGCCTGTCCTTGCTC-3', For the FGF5 primer, the forward sequence is 5'-ATGAGCCTGTCCTTGCTC-3 '
reverse sequence는 5'-GTCTGTACTTCACTGGGC-3'The reverse sequence was 5'-GTCTGTACTTCACTGGGC-3 '
의 염기서열을 사용하여 50℃에서 1분간 중합(annealing)하였다.
Was annealed at 50 < 0 > C for 1 minute.
Rex1 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-ATCCGGGATGAAAGTGAGATTAGC-3', For the Rex1 primer, the forward sequence is 5'-ATCCGGGATGAAAGTGAGATTAGC-3 '
reverse sequence는 5'-CTTCAGCATTTCTTCCCTGCCTTTGC-3'The reverse sequence is 5'-CTTCAGCATTTCTTCCCTGCCTTTGC-3 '
의 염기서열을 사용하여 61℃에서 50초간 중합(annealing)하였다. Was annealed at 61 DEG C for 50 seconds.
Stat3 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-ATGAAGAGTGCCTTCGTGGTGG-3', For the Stat3 primer, the forward sequence is 5'-ATGAAGAGTGCCTTCGTGGTGG-3 '
reverse sequence는 5'-GGATTGATGCCCAAGCATTTGG-3'The reverse sequence was 5'-GGATTGATGCCCAAGCATTTGG-3 '
의 염기서열을 사용하여 60℃에서 40초간 중합(annealing)하였다.
Was annealed at 60 DEG C for 40 seconds.
GAPDH 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-AACGGGAAGCCCATCACC-3', For the GAPDH primer, the forward sequence is 5'-AACGGGAAGCCCATCACC-3 '
reverse sequence는 5'-CAGCCTTGGCAGCACCAG-3'The reverse sequence was 5'-CAGCCTTGGCAGCACCAG-3 '
의 염기서열을 사용하였으며 55℃에서 40초간 중합(annealing)하였다.
Was annealed at 55 ° C for 40 seconds.
Oct3/4 프라이머의 경우 forward sequence는 5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3', For the Oct3 / 4 primer, the forward sequence is 5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3 '
reverse sequence는 5'-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3', The reverse sequence was 5'-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3 '
의 염기서열을 사용하여 57℃에서 30초간 중합(annealing)하였다. Was annealed at 57 DEG C for 30 seconds.
PCR 반응은 95℃에서 1분간 변성시키고 위의 조건으로 anealing한 후, 72℃에서 1분 30초 동안 확장시키는 반응을 25회 반복하도록 수행하였다. PCR 생성물을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
The PCR reaction was denatured at 95 ° C for 1 minute, anealing was performed under the above conditions, and the reaction was repeated 25 times at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds. The PCR product was electrophoresed on 1.5% agarose gel to confirm the DNA band. The results are shown in Fig.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100005685A KR101716771B1 (en) | 2010-01-21 | 2010-01-21 | A method for prevention of chromosomal aberration in pluripotent stem cells through the inhibition of SIRT1 activity |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020100005685A KR101716771B1 (en) | 2010-01-21 | 2010-01-21 | A method for prevention of chromosomal aberration in pluripotent stem cells through the inhibition of SIRT1 activity |
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| KR20110085739A KR20110085739A (en) | 2011-07-27 |
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| KR1020100005685A KR101716771B1 (en) | 2010-01-21 | 2010-01-21 | A method for prevention of chromosomal aberration in pluripotent stem cells through the inhibition of SIRT1 activity |
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|---|---|---|---|---|
| KR20100006452A (en) * | 2008-07-09 | 2010-01-19 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Method for maintenance of human embryonic stem cells using fibroblast derived from human umbilical cord |
-
2010
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Cancer Cell 14, 312-323, October 7, 2008 |
| Cell 135, 907-918, November 28, 2008 |
Also Published As
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|---|---|
| KR20110085739A (en) | 2011-07-27 |
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