KR101695429B1 - Composition for promoting incubation of motor neuron in vitro comprising coenzyme q10 - Google Patents
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Abstract
Description
본 명세서는 코엔자임 Q10을 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present disclosure relates to a composition comprising Coenzyme Q10.
운동 신경세포 질환(Motor neuron disease)은 운동 신경에 점진적인 퇴행이 일어나는 중증 신경계 질환군으로 뇌에서 나와 연수 또는 척수로 전달되는 상위 운동신경이나 척수에서부터 근육으로 전달되는 하위 운동신경 모두에 영향을 줄 수 있다. 상위 운동신경이 손상되면 신체의 과도한 반사 반응이 나타나고, 하위 운동신경이 손상되면 근육이 진행적으로 위축(atrophy)되고, 쇠약해진다. 운동신경원 병은 여러 다른 형태로 나타나지만, 일반적으로 희귀성 질환에 속한다. Motor neuron disease is a group of severe neurological diseases with progressive degeneration of the motor nerves, which can affect both the upper motor nerves that are transmitted from the brain to the soft tissues or spinal cord or from the spinal cord to the lower motor nerves have. When the upper motor nerve is damaged, excessive reflection of the body occurs. When the lower motor nerve is damaged, the muscle progressively becomes atrophy and weakens. Motor neuronopathies occur in many different forms, but generally belong to rare diseases.
이러한 운동 신경세포 질환의 정확한 원인은 아직 밝혀져 있지 않으며 이러한 질환에는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 가족성 운동 신경세포 질환(Familial motor neuron disease) 등이 있다.The exact cause of these motor neuron diseases has not yet been elucidated. These diseases include amyotrophic lateral sclerosis (ALS), primary lateral sclerosis, Werdni-Hoffman disease, Kugelberg-Welander syndrome, progressive spinal muscular atrophy, progressive bulbar palsy, familial motor neuron disease, and the like.
대부분 이러한 운동 신경세포 질환은 수초 형성의 이상으로 발생되는 병으로서 수초는 신경이 뇌에서 보내지는 메시지를 최대속도로 전달하고 해석할 수 있도록 도와주는 기능을 한다. 신경이 이러한 수초는 소실하게 되면, 적절한 기능을 할 수가 없고 메시지를 전달하는데 있어서도 정상보다 느려지게 된다. Most of these motor neuron diseases are caused by abnormality of myelin formation. Myelin functions to help the nerve to transmit and interpret the message sent from the brain at maximum speed. When these nerves are lost, they can not function properly and are slower than normal to transmit messages.
운동 신경세포 질환의 치료를 위한 약물을 검증하기 위한 실험은 이러한 질병을 가지는 운동신경에 대하여 수행되어야 하기 때문에 생체내 실험을 통하여 수행되는 것이 대부분이다. 이러한 생체내 실험은 그 검증 실험의 방법이 용이하지 않으며 일반적으로 마우스와 같은 동물을 대상으로 수행되는 것이기 때문에, 생체외에서 운동 신경세포에 대한 약물의 효과를 평가할 수 있는 방법의 요구가 대두되었다. 또한 신경 손상 후 수초의 재형성을 촉진할 수 방법을 정량적으로 평가하여 효과적인 신경재생으로 이루는데 초점을 맞추고 있다. Experiments to test drugs for the treatment of motor neuron diseases are mostly performed through in vivo experiments because they must be performed on motor neurons with these diseases. Since such in vivo experiments are not easy to perform the verification experiment and are generally performed on animals such as mice, there has been a demand for a method for evaluating the effect of drugs on motor neurons in vitro. It also focuses on the quantitative evaluation of methods that can promote the reformation of aqueducts after nerve injury, thereby achieving effective nerve regeneration.
종래 운동 신경세포를 생체외에서 배양하는 방법으로, 운동 신경세포를 다른 세포들과 공동으로 배양하는 방법이 발표된 바 있으나, 생체외 조건의 배양판에서 안정하고 효과적으로 운동 신경세포 배양과 수초 형성 할 수 있는 기술은 제안되지 않았다. Conventionally, a method of incubating motor neurons in vitro with a method of culturing motoneurons in the presence of other cells has been disclosed. However, in vitro culture plates can be used to stably and effectively form motor neuron cultures and plant cells. No technology has been proposed.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 명세서는 생체외에서 운동 신경세포의 배양을 촉진하고 수초의 형성을 촉진하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In order to solve the above problems, it is an object of the present invention to provide a composition that promotes the cultivation of motor neurons in vitro and promotes the formation of aquatic plants.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에 있어서 코엔자임 Q10을 유효성분으로서 포함하는 생체외 운동 신경세포의 배양 촉진용 조성물을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides, in one aspect, a composition for stimulating the culture of exogenous motor neurons comprising coenzyme Q10 as an active ingredient.
본 발명의 일 측면에 따른 운동 신경세포의 배양 촉진용 조성물은 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하여 생체외(in vitro)조건에서 운동 신경세포를 생존하는 상태로 안정적으로 배양하는 것을 촉진할 수 있다. 따라서, 이러한 조성물은 운동 신경세포를 생체외 조건에서 배양하는데 도움이 되고, 이에 따라 운동 신경세포를 이용한 연구를 수행하는데 용이하고, 특히 신경 손상에 관한 생체외 연구에서의 한계점을 극복할 수 있는 효과를 나타낸다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물을 사용하여 생체외 조건에서도 운동 신경세포를 용이하고 안정하게 배양할 수 있다. The composition for promoting the culture of motor neurons according to an aspect of the present invention can promote the stable cultivation of motor neurons in a viable state in vitro under conditions including coenzyme Q10 as an active ingredient. Therefore, such a composition is useful for culturing motor neurons under extracorporeal conditions, thus facilitating research using motor neurons, and in particular, for overcoming limitations in in vitro studies on nerve damage . That is, the composition according to one aspect of the present invention can be used to easily and stably cultivate motor neurons in an in vitro condition.
특히, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 운동 신경세포 질환을 가지고 있는 개체로부터 수득된 운동신경을 안정하고 효과적으로 배양하는데 사용될 수 있기 때문에, 여러 가지 질환을 가지고 있는 운동신경을 생체외에서 배양하는데 사용될 수 있다. In particular, since the composition according to one aspect of the present invention can be used to stably and effectively cultivate the motor nerve obtained from an individual having motor neuron disease, it can be used for culturing a motor neuron having various diseases in vitro have.
도 1은 생체외에서 운동 신경세포와 시반세포를 공동배양하는 순서도와 배양시 첨가하는 배지의 종류를 나타낸 개략도에 해당한다.
도 2a 및 도 2b는 공동배양시 배양 시점별로 바이오마커에 의해 염색된 운동 신경세포의 광초첨 현미경 촬영 사진이다.
도 3은 공동배양시 코엔자임 Q10을 첨가하는 경우 배양 시점별로 바이오마커에 의해 염색된 운동 신경세포의 광초첨 현미경 촬영 사진이다.Fig. 1 is a schematic diagram showing the flow chart of co-cultivation of motor neurons and sperm cells ex vivo and the kind of medium added during cultivation.
FIGS. 2A and 2B are photomicrographs of motoneurons stained by a biomarker at the time of co-culture.
FIG. 3 is a photomicrograph of a motor neuron stained with a biomarker at the time of incubation when Coenzyme Q10 is added in co-culture.
본 발명은 일 측면에 있어서, 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 신경세포 배양 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a composition for promoting neuronal cell culture comprising coenzyme Q10 as an active ingredient.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 생체외(in Vitro)에서 신경세포의 배양을 촉진하는 것일 수 있다. In one aspect of the invention, the composition may be one that promotes the cultivation of neuronal cells in vitro .
본 발명은 일 측면에 있어서, 상기 신경세포는 운동 신경세포(motor neuron)일 수 있다. In one aspect of the present invention, the nerve cell may be a motor neuron.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 신경세포와 시반세포의 공동배양시 신경세포의 배양을 촉진하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be one which promotes culturing of neuronal cells during co-culture of neuron and regenerative cells.
본 발명은 일측면에 있어서, 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 수초(myelin)형성 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a composition for promoting myelin formation comprising coenzyme Q10 as an active ingredient.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 생체외 또는 생체내에서 수초의 형성을 촉진하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be one which promotes the formation of aquatic plants in vitro or in vivo.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 수초는 신경세포의 수초 일 수 있으며, 더 구체적으로 운동 신경세포의 수초일 수 있다. In one aspect of the present invention, the aquatic plant may be a few seconds of a nerve cell, and more specifically, may be a few seconds of an afferent nerve cell.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 신경세포와 시반세포의 공동배양시 신경세포의 수초형성을 촉진하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be one which promotes the formation of a few-seconds of nerve cells when co-culturing the neuron and the recipient cells.
본 발명은 일 측면에 있어서, 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 운동 신경세포 질환의 치료, 개선, 또는 예방용 조성물에 관한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 운동 신경세포질환은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS)일 수 있다.In one aspect, the present invention may relate to a composition for treating, ameliorating, or preventing a motor neuron disease comprising coenzyme Q10 as an active ingredient. Specifically, in one aspect of the invention, the motor neuron disease may be amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
본 명세서에 기재된 하기 실험예에 따르면 코엔자임 Q10은 운동 신경세포의 수초 형성을 촉진하는 효과를 나타내며, 이는 ALS 치료제로 알려진 릴루졸 보다 더 우수한 효과에 해당한다. 본 명세서의 실험예는 그 배양 조건이 신체 내에서 운동 신경세포가 존재하는 환경과 매우 유사한 환경에 해당한다. 즉, 신체 내에서 운동 신경세포는 수초를 형성한 시반세포와 함께 존재하고 있으며, 운동 신경세포 질환의 경우 이러한 운동 신경세포의 수초 등이 손상되어 발생하는 것이다. 따라서, 본 명세서의 실험예는 시반세포와 함께 배양시에 운동 신경세포의 수초 형성이 이루어지며 이러한 수초형성을 코엔자임 Q10이 현저하게 촉진할 수 있다는 점을 나타내므로, 생체 내에서도 손상된 운동 신경세포를 복구시킴으로써 운동 신경세포 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 효과를 나타낼 것으로 판단된다. According to the following experimental examples described herein, coenzyme Q10 exhibits an effect of promoting the formation of aqueducts of motor neurons, which is more effective than a reuluzol known as an ALS therapeutic agent. The experimental examples in this specification correspond to an environment in which the culture conditions are very similar to the environment in which motor nerve cells are present in the body. In other words, the motor nerve cells are present in the body together with the spermatocytes forming the myelin, and in the case of the motor neuron diseases, these motor nerve cells are damaged. Therefore, the experimental example of the present invention shows that the myelin cell formation of the motor neuron is performed during cultivation together with the spermatogonial cells and that the coenzyme Q10 can remarkably accelerate the formation of such a herbicide. Therefore, Which is effective in treating, ameliorating or preventing motor neuron diseases.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 약학 또는 식품 조성물일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 식품 조성물은 건강식품조성물 일 수 있다.In one aspect of the invention, the composition may be a pharmaceutical or a food composition. Specifically, in one aspect of the present invention, the food composition may be a health food composition.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, soft or hard capsules, etc. These solid preparations may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, Or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
본 발명의 일측면에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. The pharmaceutical dosage forms of the compositions according to one aspect of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may also be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable set. The salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable so long as it is pharmaceutically acceptable and includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention may be administered parenterally or orally, and may be administered in an amount of 0.1 to 500 mg, preferably 1 to 100 mg per kg of body weight per day, Can be administered separately. The dosage for a particular patient may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, severity of disease, and the like.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다. The pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention can be administered orally or parenterally in the form of powders, granules, tablets, soft or hard capsules, oral preparations such as suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations such as ointments, creams, , Injectable solutions, sterile injection solutions, and the like, and may be used in any form suitable for pharmaceutical preparations.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. The composition according to one aspect of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like by various routes such as parenteral, oral, etc. All the ways of administration can be expected, Rectal, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine or intracerebroventricular injection.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은, 그다지 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention has no serious toxicity and side effects and can be safely used for prolonged use for preventive purposes.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 코엔자임 Q10 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.The formulation of the food composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be formulated into, for example, tablets, granules, powders, liquid preparations such as drinks, caramels, gels, bars and the like. The food composition of each formulation can be mixed with the ingredients commonly used in the field other than Coenzyme Q10 without difficulty by those skilled in the art depending on the purpose of formulation or use, and synergistic effect can be obtained when they are applied simultaneously with other ingredients.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 코엔자임 Q10의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.In the food composition according to one aspect of the present invention, the determination of the dosage of coenzyme Q10 is within the level of those skilled in the art, and its daily dose is, for example, from 0.1 mg / kg / day to 5000 mg / kg / May be 50 mg / kg / day to 500 mg / kg / day, but is not limited thereto, and may vary depending on various factors such as the age, health condition, and complication of the subject.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.The food composition according to one aspect of the present invention can be used in various foods such as chewing gum, caramel product, candy, ice cream, confectionery, beverage such as soft drink, mineral water, alcoholic beverage, health including vitamins and minerals It may be a functional food.
본 발명의 일 측면에 따른 코엔자임 Q10를 포함하는 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 코엔자임 Q10를 포함하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. The beverage containing coenzyme Q10 according to one aspect of the present invention is not particularly limited to other components other than those containing coenzyme Q10 as an essential ingredient in the indicated ratios and may contain various flavors or natural carbohydrates such as ordinary beverages, As shown in FIG.
상기 외에 본 발명의 일 측면에 따른 건강 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the health food composition according to one aspect of the present invention can be used in various foods, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, Salts of alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like. In addition, the functional food compositions of the present invention may comprise natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical, but is generally included in the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 조성물의 총 부피를 기준으로 유효성분인 코엔자임 Q10을 0.1uM 내지 1M의 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 조성물의 총 부피를 기준으로 0.1uM 이상, 0.2uM 이상, 0.3uM 이상, 0.4uM 이상, 0.5uM 이상, 0.6uM 이상, 0.7uM 이상, 0.8uM 이상, 0.9uM 이상, 1.0uM 이상, 1.1uM 이상, 1.2uM 이상, 1.3uM 이상, 1.5uM 이상, 1.7uM 이상, 2.0uM 이상, 3uM 이상, 5uM 이상, 10uM 이상, 50uM 이상, 100uM 이상, 300uM 이상, 500uM 이상, 1 mM 이상, 5 mM 이상, 10 mM 이상, 50 mM 이상, 100 mM 이상, 500 mM 이상, 또는 1 M 이상이거나, 1 M 이하, 500 mM 이하, 100 mM 이하, 50 mM 이하, 10 mM 이하, 5 mM 이하, 1 mM 이하, 500uM 이하, 300uM 이하, 100uM 이하, 50uM 이하, 10uM 이하, 5uM 이하, 3uM 이하, 2.0uM 이하, 1.7uM 이하, 1.5uM 이하, 1.3uM 이하, 1.2uM 이하, 1.1uM 이하, 1.0uM 이하, 0.9uM 이하, 0.8uM 이하, 0.7uM 이하, 0.6uM 이하, 0.5uM 이하, 0.4uM 이하, 0.3uM 이하, 0.2uM 이하,또는 0.1uM 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may comprise Coenzyme Q10 as an active ingredient at a concentration of 0.1 uM to 1 M based on the total volume of the composition. Specifically, in one aspect of the present invention, the composition comprises at least 0.1 uM, at least 0.2 uM, at least 0.3 uM, at least 0.4 uM, at least 0.5 uM, at least 0.6 uM, at least 0.7 uM, at least 0.8 uM or more, at least 0.9 uM, at least 1.0 uM, at least 1.1 uM, at least 1.2 uM, at least 1.3 uM, at least 1.5 uM, at least 1.7 uM, at least 2.0 uM, at least 3 uM, at least 5 uM, at least 10 uM, at least 50 uM, 500 mM or more, 500 mM or more, 1 mM or more, 5 mM or more, 10 mM or more, 50 mM or more, 100 mM or more, 500 mM or more or 1 M or more, 1 M or less, 500 mM or less, 100 mM or less, Or less, 10 mM or less, 5 mM or less, 1 mM or less, 500 μM or less, 300 μM or less, 100 μM or less, 50 μM or less, 10 μM or less, 5 μM or less, 3 μM or less, 2.0 μM or less, 1.7 μM or less, Up to 1.2 uM, up to 1.1 uM, up to 1.0 uM, up to 0.9 uM, up to 0.8 uM, up to 0.7 uM, up to 0.6 uM, up to 0.5 uM, up to 0.4 uM, up to 0.3 uM, up to 0.2 uM, have.
본 발명의 일 측면에 있어서, 코엔자임 Q10은 유비퀴논 또는 코엔자임 Q로도 알려진 것으로서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 자명하게 인식 할 수 있는 물질이며, Cas 번호 303-98-0에 해당하고 분자량이 863.37g/mol이며 하기 화학식을 가지는 물질을 의미한다. In one aspect of the present invention, coenzyme Q10 is also known as ubiquinone or Coenzyme Q, and is a substance that can be easily recognized by a person skilled in the art to which the present invention belongs. It corresponds to Cas No. 303-98-0, Is 863.37 g / mol and means a substance having the following formula.
[화학식][Chemical Formula]
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 신경세포의 배양은 1) 시반세포 위에 운동 신경세포 세포를 시딩하는 단계; 및 2) 운동 신경세포 세포와 시반세포를 공동배양하는 단계;를 포함하는 생체외(in vitro)에서 신경세포, 구체적으로 운동 신경세포를 배양하는 방법으로 수행되는 것일 수 있다.In one aspect of the present invention, the culturing of the neuron comprises the steps of: 1) seeding motor neuron cells over time; And 2) co-culturing the motor neuron cell and the recipient cell in vitro to cultivate the neuron, specifically, the motor neuron.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포는 고체, 액체 또는 겔 배지 위에 시딩된 것일 수 있다.In one aspect of the invention, the time-resolved cells may be seeded onto a solid, liquid or gel medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포는 배지 위에 시딩될 수 있으며, 이러한 배지는 배양 용기에 도말 된 것일 수 있다. In one aspect of the invention, the time-resolved cells may be seeded onto the medium, and such medium may be one which has been plated in a culture vessel.
본 발명의 일 측면에 있어서, 배양 용기는 배지가 도말 될 수 있는 것이면 제한되지 않으며, 본 명세서에 기재된 배양판이 포함될 수 있고, 그 밖에 실험적으로 사용될 수 있는 튜브, 시험관, 비커, 플라스크 등 배지가 도말 되어 세포를 배양할 수 있는 것이면 제한되지 않는다.In one aspect of the present invention, the culture container is not limited as long as the culture medium can be smoked, and the culture medium described in the present specification can be included and the culture medium such as tubes, test tubes, beakers, flasks, So long as the cells can be cultured.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 시딩된 시반세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the method may further comprise culturing seeded time-lapse cells.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 시반세포의 배양은 6일 내지 10일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 6일 이상 수행되어야 하며, 5일 이하로 수행되는 경우 운동 신경세포를 시딩하였을 때에 시반세포와 운동 신경세포가 배양판에 부착되지 못하고 떨어져, 생체외에서 운동 신경세포의 배양이 잘 이루어 지지 않게 될 수 있다. 구체적으로 시반세포의 배양은 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상 및/또는 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하의 기간 동안 수행될 수 있다. In one aspect of the present invention, the culturing of the time-lapse cells may be performed for 6 to 10 days. In one aspect of the present invention, the cultivation of the spermatogonial cells should be performed for 6 days or more, and when the spermatogonial cells are seeded for 5 days or less, the spermatocytes and motor neurons fail to attach to the culture plate, In addition, the culture of motor neurons may not be successful. Specifically, the culturing of the spermatogonial cells is carried out for at least 6 days, at least 7 days, at least 8 days, at least 9 days, at least 10 days, at least 11 days, at least 12 days and / or at least 12 days, at least 11 days, Day, up to 8 days, up to 7 days, up to 6 days.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 제1배지 및 제2배지 중 하나 이상을 첨가하여 수행하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the culturing of the time-resolved cells may be performed by adding at least one of the first medium and the second medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 포스콜린(forskolin) 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 제1배지는 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. In one aspect of the invention, the first medium comprises horse serum, glutamine, penicilin / streptomycin, human heregulin beta-1, and forskolin ). ≪ / RTI > Specifically, the first medium may comprise at least one selected from the group consisting of horse serum, glutamine, penicillin / streptomycin, human herlegulant beta-1, and phoscholin.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물 중 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the second medium may further comprise at least one of human basic fibroblast growth factor and bovine pituitary extract in the first medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 시반세포를 배양하기 위한 배지라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 상업적으로 사용될 수 있는 배지로서 론자사의 고-글루코스 DMEM 배지(4.5g/L glucose w/o L-글루타민 또는 페놀레드)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one aspect of the present invention, the first medium can be used without limitation as long as it is a medium for culturing the time-lapse cells, and can be used as a commercially available medium in a high-glucose DMEM medium (4.5 g / L glucose w / o L-glutamine or phenol red) may be used, but are not limited thereto.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 무수염화칼슘(calcium chloride anhydrous), 덱스트로오스, 질산제2철 9수화물(ferric nitrate nonahydrate), 무수 황산 마그네슘(magnesium sulfate anhydrous), 염화칼륨(potassium chloride), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 염화나트륨(sodium chloride), L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(L-arginine monohydrochloride), 글라이신(glycine), L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate), L-이소루신(L-isoleucine), L-루신(L-leucine), L-라이신 모노하이드로클로라이드(L-lysine monohydrochloride), L-메티오닌(L-methionine), L-페닐알라닌(L-phenylalanie), L-세린(L-serine), L-트레오닌(L-threonine), L-트립토판(L-tryptophan), L-발린(L-valine), D-판토텐산 칼슘(D-calcium pantothenate), 염화콜린(choline chloride), 엽산(folic acid), I-이노시톨(I-inositol), 나이아신 아미드(niacinamide), 피리독신 모노하이드로클로라이드(pyridoxine monohydrochloride), 리보플라빈(riboflavin), 티아민 모노하이드로클로라이드(thiamine monohydrochloride), 피브루산 나트륨염(pyruvic acid sodium salt), L-티로신 디소디움염 디하이드레이트(L-tyrosine disodium salt, dehydrate), L-시스틴 디하이드로클로라이드(L-cystine dihydrochloride), 무수 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, anhydrous)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the first medium is selected from the group consisting of calcium chloride anhydrous, dextrose, ferric nitrate nonahydrate, magnesium sulfate anhydrous, potassium chloride, , Sodium bicarbonate, sodium chloride, L-arginine monohydrochloride, glycine, L-histidine monohydrochloride monohydrate, L L-isoleucine, L-leucine, L-lysine monohydrochloride, L-methionine, L-phenylalanine, L L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-valine, D-calcium pantothenate, choline chloride, folic acid, I-inositol, niacinamide Niacinamide, pyridoxine monohydrochloride, riboflavin, thiamine monohydrochloride, pyruvic acid sodium salt, L-tyrosine disodium salt dihydrate (L -tyrosine disodium salt, dehydrate, L-cystine dihydrochloride, sodium phosphate monobasic (anhydrous), and the like.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 제1배지의 총부피를 기준으로 하여 하기와 같은 농도로 각 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 0.1~0.3g/L의 무수염화칼슘; 3.5~5.5 g/L의 덱스트로오스; 0.05~0.2mg/L의 질산제2철 9수화물; 90~110mg/L의 무수 황산 마그네슘; 0.3~0.5g/L의 염화칼륨; 3.0~5.0g/L의 탄산수소나트륨; 5.5~7.5g/L의 염화나트륨; 75.0~95.0mg/L의 L-아르기닌 모노하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 글라이신; 35.0~50.0mg/L의 L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트; 80.0~120.0mg/L의 L-이소루신; 80.0~120.0mg/L의 L-루신; 130.0~160.0mg/L의 L-라이신 모노하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 L-메티오닌; 55.0~75.0mg/L의 L-페닐알라닌; 35.0~50.0mg/L의 L-세린; 85.0~110.0mg/L의 L-트레오닌; 13.0~20.0mg/L의 L-트립토판; 85.0~110.0mg/L의 L-발린; 2.0~6.0mg/L의 D-판토텐산 칼슘; 2.0~6.0mg/L의 염화콜린; 2.0~6.0mg/L의 엽산; 4.0~10.0mg/L의 I-이노시톨; 2.0~6.0mg/L의 나이아신 아미드; 2.0~6.0mg/L의 피리독신 모노하이드로클로라이드; 0.30~0.50mg/L의 리보플라빈; 2.0~6.0mg/L의 티아민 모노하이드로클로라이드; 90.0~120.0mg/L의 피브루산 나트륨염; 90.0~120.0mg/L의 L-티로신 디소디움염 디하이드레이트; 50.0~70.0mg/L의 L-시스틴 디하이드로클로라이드; 90.0~120.0mg/L의 무수 인산수소나트륨.In one aspect of the invention, the first medium may comprise one or more of the following substances at a concentration based on the total volume of the first medium: 0.1 to 0.3 g / L of anhydrous calcium chloride; 3.5 to 5.5 g / L of dextrose; 0.05 to 0.2 mg / L ferric nitrate hexahydrate; 90 to 110 mg / L of anhydrous magnesium sulfate; 0.3 to 0.5 g / L of potassium chloride; 3.0 to 5.0 g / L of sodium hydrogencarbonate; 5.5 to 7.5 g / L of sodium chloride; 75.0 to 95.0 mg / L of L-arginine monohydrochloride; 20.0 to 40.0 mg / L of glycine; 35.0 to 50.0 mg / L of L-histidine monohydrochloride monohydrate; 80.0-120.0 mg / L of L-isoleucine; 80.0-120.0 mg / L L-leucine; 130.0 to 160.0 mg / L of L-lysine monohydrochloride; 20.0 to 40.0 mg / L of L-methionine; 55.0 to 75.0 mg / L of L-phenylalanine; 35.0 to 50.0 mg / L of L-serine; 85.0 to 110.0 mg / L of L-threonine; 13.0 to 20.0 mg / L of L-tryptophan; 85.0 to 110.0 mg / L of L-valine; 2.0-6.0 mg / L calcium D-pantothenate; 2.0-6.0 mg / L choline chloride; 2.0 to 6.0 mg / L folic acid; 4.0 to 10.0 mg / L of I-inositol; 2.0 to 6.0 mg / L of niacinamide; 2.0 to 6.0 mg / L of pyridoxine monohydrochloride; 0.30 to 0.50 mg / L riboflavin; 2.0 to 6.0 mg / L thiamine monohydrochloride; 90.0 to 120.0 mg / L sodium fibrate sodium salt; 90.0 to 120.0 mg / L of L-tyrosine disodium salt dihydrate; 50.0 to 70.0 mg / L of L-cystine dihydrochloride; 90.0 to 120.0 mg / L of anhydrous sodium hydrogen phosphate.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the first medium is one in which high-glucose Dulbecco's modified eagle medium is supplemented with horse serum, glutamine, penicillin / streptomycin, human herlegulin beta-1 and phoscholine .
본 발명의 일 측면에 있어서, 페니실린/스트렙토마이신은 각각의 항생제를 0.1:1 내지 1:0.1의 비율로 혼합한 것일 수 있으며, 구체적으로 페니실린과 스트렙토마이신이 0.9:1.1 내지 1.1:0.9, 더욱 구체적으로 1:1의 비율로 혼합된 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, penicillin / streptomycin may be a mixture of antibiotics at a ratio of 0.1: 1 to 1: 0.1. Specifically, penicillin / streptomycin may be mixed at a ratio of 0.9: 1.1 to 1.1: 0.9, In a ratio of 1: 1.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0.5~5ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, 및 0.1~1.5μM의 포스콜린을 포함하는 것일 수 있다.In one aspect of the invention, the first medium comprises 8-12% horse serum, 1 mM to 8 mM glutamine, 50-150 units / ml penicillin / streptomycin, 0.5-5 ng / ml human 0.1 to 1.5 [mu] M of phocholin.
구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지의 총부피를 기준으로 제1배지에 포함된 말 혈청은 6부피%이상, 7부피%이상, 8부피%이상, 9부피%이상, 10부피%이상, 11부피%이상, 12부피%이상, 13부피%이상, 14부피%이상, 15부피%이상 및/또는 15부피%이하, 14부피%이하, 13부피%이하, 12부피%이하, 11부피%이하, 10부피%이하, 9부피%이하, 8부피%이하, 7부피%이하, 6부피%이하 일 수 있다. Specifically, in one aspect of the present invention, the horse serum contained in the first medium is at least 6 vol%, at least 7 vol%, at least 8 vol%, at least 9 vol%, at least 10 vol At least 12 vol.%, At least 13 vol.%, At least 14 vol.%, At least 15 vol.% And / or at most 15 vol.%, At most 14 vol.%, At most 13 vol. Not more than 11 vol.%, Not more than 10 vol.%, Not more than 9 vol.%, Not more than 8 vol.%, Not more than 7 vol.%, Not more than 6 vol.%.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 글루타민은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상, 10mM 이상 및/또는 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 5 mM 이하, 4 mM 이하, 3 mM 이하, 2 mM 이하, 1 mM 이하, 0.1 mM 이하 일 수 있다.In one aspect of the invention, the glutamine contained in the first medium is at least 0.1 mM, at least 1 mM, at least 2 mM, at least 3 mM, at least 4 mM, at least 5 mM, at least 6 mM, at least 7 mM, at least 8 mM Up to 5 mM, up to 4 mM, up to 3 mM, up to 2 mM, up to 1 mM, or up to 10 mM, and / or up to 10 mM, 0.1 mM or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 페니실린/스트렙토마이신은 제1배지의 총부피에 대하여 10 units/ml 이상, 20 units/ml 이상, 50 units/ml 이상, 70 units/ml 이상, 90 units/ml 이상, 100 units/ml 이상, 120 units/ml 이상, 140 units/ml 이상, 150 units/ml 이상, 200 units/ml 이상, 및/또는 200 units/ml 이하, 150 units/ml 이하, 130 units/ml 이하, 110 units/ml 이하, 100 units/ml 이하, 80 units/ml 이하, 60 units/ml 이하, 40 units/ml 이하, 20 units/ml 이하, 10 units/ml 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the penicillin / streptomycin contained in the first medium is at least 10 units / ml, at least 20 units / ml, at least 50 units / ml, at least 70 units / ml At least 90 units / ml, at least 100 units / ml, at least 120 units / ml, at least 140 units / ml, at least 150 units / ml, at least 200 units / ml, and / or at least 200 units / Or less, less than 110 units / ml, less than 100 units / ml, less than 80 units / ml, less than 60 units / ml, less than 40 units / ml, less than 20 units / ml, less than 10 units / ml have.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 인간 헤레굴린 베타-1은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1 ng/ml 이상, 0.5 ng/ml 이상, 1 ng/ml 이상, 2 ng/ml 이상, 3 ng/ml 이상, 4 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 6 ng/ml 이상, 및/또는 6 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 4 ng/ml 이하, 3 ng/ml 이하, 2 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하, 0.1 ng/ml 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the human herelogen beta-1 contained in the first medium is at least 0.1 ng / ml, at least 0.5 ng / ml, at least 1 ng / ml, at least 2 ng / 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, and / or 6 ng / ml, 5 ng / ml and 4 ng / / ml, 2 ng / ml or less, 1 ng / ml or less, 0.1 ng / ml or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 포스콜린은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1 μM 이상, 0.2 μM 이상, 0.3 μM 이상, 0.4 μM 이상, 0.5 μM 이상, 0.6 μM 이상, 0.7 μM 이상, 0.8 μM 이상, 0.9 μM 이상, 1.0 μM 이상, 1.1 μM 이상, 1.3 μM 이상, 1.5 μM 이상, 및/또는 1.5 μM 이하, 1.3 μM 이하, 1.2 μM 이하, 1.1 μM 이하, 1.0 μM 이하, 0.9 μM 이하, 0.8 μM 이하, 0.7 μM 이하, 0.6 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.4 μM 이하, 0.3 μM 이하, 0.2 μM 이하, 0.1 μM 이하일 수 있다.In one aspect of the invention, the amount of the phoca colin contained in the first medium is at least 0.1 μM, at least 0.2 μM, at least 0.3 μM, at least 0.4 μM, at least 0.5 μM, at least 0.6 μM, at least 0.7 more than 0.8 μM, more than 0.9 μM, more than 1.0 μM, more than 1.1 μM, more than 1.3 μM, more than 1.5 μM, and / or less than 1.5 μM, less than 1.3 μM, less than 1.2 μM, less than 1.1 μM, less than 1.0 μM, Less than 0.9 μM, less than 0.8 μM, less than 0.7 μM, less than 0.6 μM, less than 0.5 μM, less than 0.4 μM, less than 0.3 μM, less than 0.2 μM, less than 0.1 μM.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지는 제2배지의 총부피에 대해 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30μg/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지에 포함된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 제2배지의 총부피에 대해 1 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 10 ng/ml 이상, 15 ng/ml 이상, 20 ng/ml 이상, 및/또는 20 ng/ml 이하, 15 ng/ml 이하, 13 ng/ml 이하, 10 ng/ml 이하, 7 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 3 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하, 0.1 ng/ml 이하일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지에 포함된 소 뇌하수체 추출물은 제2배지의 총부피에 대해 1 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 13 μg/ml 이상, 15 μg/ml 이상, 17 μg/ml 이상, 20 μg/ml 이상, 23 μg/ml 이상, 25 μg/ml 이상, 27 μg/ml 이상, 30 μg/ml 이상, 40 μg/ml 이상, 및/또는 40 μg/ml 이하, 30 μg/ml 이하, 27 μg/ml 이하, 25 μg/ml 이하, 23 μg/ml 이하, 20 μg/ml 이하, 17 μg/ml 이하, 15 μg/ml 이하, 13 μg/ml 이하, 10 μg/ml 이하, 5 μg/ml 이하, 1 μg/ml 이하일 수 있다. In one aspect of the invention, the second medium may comprise 1 to 20 ng / ml of human basic fibroblast growth factor and 10 to 30 μg / ml of bovine pituitary extract, based on the total volume of the second medium. Specifically, in one aspect of the present invention, the human basic fibroblast growth factor contained in the second medium is at least 1 ng / ml, at least 5 ng / ml, at least 10 ng / ml, at least 15, no more than 20 ng / ml, no more than 20 ng / ml, no more than 15 ng / ml, no more than 13 ng / ml, no more than 10 ng / ml, no more than 7 ng / 3 ng / ml or less, 1 ng / ml or less, and 0.1 ng / ml or less. Specifically, in one aspect of the present invention, the bovine pituitary extract contained in the second medium is at least 1 μg / ml, at least 5 μg / ml, at least 10 μg / ml, at least 13 μg / ml More than 15 μg / ml, greater than 17 μg / ml, greater than 20 μg / ml, greater than 23 μg / ml, greater than 25 μg / ml, greater than 27 μg / ml, greater than 30 μg / ml, greater than 40 μg / ml, Less than 30 μg / ml, less than 27 μg / ml, less than 25 μg / ml, less than 23 μg / ml, less than 20 μg / ml, less than 17 μg / ml and less than 15 μg / ml , 13 μg / ml or less, 10 μg / ml or less, 5 μg / ml or less, and 1 μg / ml or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 시반세포를 시딩한 후에 제1배지를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the cultivation of the spermatogonial cells may be performed by seeding the spermatogonial cells and then culturing the cells by adding the first medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 제1배지의 첨가 후, 3일 내지 5일 째에 제1배지를 제2배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the cultivation of the spermatogonial cells may be performed by replacing the first medium with the second medium on the 3rd to 5th days after the addition of the first medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 배지 위에 1x104 내지 5x104 의 세포수를 올리고, 35 내지 40℃, 더 구체적으로 36~38℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 것일 수 있다. In one aspect of the invention, culture of thirty cells is carried out at 1x10 4 to raise the number of cells of
본 발명의 일 측면에 있어서, 1)운동 신경세포를 시딩하는 단계는 시반세포의 세포층(cell layer)위에 운동 신경세포를 시딩하는 것일 수 있다. 구체적으로 이러한 시반세포의 세포층은 공급 세포층(feeder cell layer)일 수 있으며, 이러한 시반세포는 운동 신경세포의 배양시에 운동 신경세포의 축삭 주변으로 이동하여 축삭에 수초를 형성할 수 있다. In one aspect of the present invention, the step of 1) seeding the motor neuron may be to seed the motor neuron on the cell layer of the sphineric cell. Specifically, such a cell layer of the spermatocyte may be a feeder cell layer, which can move around the axon of the motor neuron when the motor neuron is cultured to form a myelin of the axon.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 1)단계에서 시딩되는 운동 신경세포는 3x103 내지 1x104개의 세포수일 수 있다. In one aspect of the present invention, the motor neuron seeded in step 1) may be 3 x 10 3 to 1 x 10 4 cells.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 제3배지 및 제4배지 중 하나 이상을 첨가하여 운동 신경세포와 시반세포를 공동배양하는 것일 수 있다.In one aspect of the present invention, the step 2) may include co-culturing the motor neuron and the systolic cells by adding at least one of the third medium and the fourth medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27® 무혈청 서플먼트(B-27® serum-free supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 제3배지는 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 포함할 수 있다.In one aspect of the invention, the third medium is horse serum, B-27 serum-free supplement, L-glutamine, Beta-mercaptoethanol ), Phoca colin, bovine pituitary extract, and brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Specifically, the third medium may include horse serum, B-27® serum-free serum supplement, L-glutamine, beta-mercaptoethanol, phoscholine, bovine pituitary extract, and brain-derived neurotrophic factor.
본 발명의 일 측면에 있어서, B-27® 무혈청 서플먼트는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파-토코페롤, 비타민 A, BSA(Bovine serum albumin)(fatty acid free Fraction V), 카탈라아제, 인간 재조합 인슐린, 인간 프랜스페린, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCL, 글루타티온, L-카르니틴 HCL, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCL, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 및 트리아이오도-L-티로민(Triiodo-L-Thyronine, T3)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. In one aspect of the invention, the B-27 serum-free serum supplement is selected from the group consisting of biotin, DL alpha tocopherol acetate, DL alpha-tocopherol, vitamin A, Bovine serum albumin (FSA), catalase, L-carnitine HCL, linoleic acid, linolenic acid, progesterone, putrescine 2HCL, sodium selenite, and the like. , And triiodo-L-thyronine (T3).
본 발명의 일 측면에 있어서, 제4배지는 제 3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the fourth medium may further comprise L-ascorbic acid in the third medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 신경세포를 배양하기 위한 배지라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 예를 들어 상업적으로 사용될 수 있는 배지로서 론자사의 뉴로베이살TM 배지(NeurobasalTM medium) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one aspect of the invention, the third medium may be used without limitation if the medium for culturing neural cells, for example, commercially neuro bay live TM media (Neurobasal TM medium) Lonza, Inc. as a medium that can be used, etc. May be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 글라이신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라진-H2O, L-시스테인, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소루신, L-루신, L-라이신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알리닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, 나이아신 아미드, 염산 피리독신(Pyridoxal hydrochloride), 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, I-이노시톨, 무수 염화칼슘, 질산제2철 9수화물, 무수 염화 마그네슘, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산수소나트륨, 황산아연, 덱스트로오스, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 페놀레드, 소디움 피루베이트(Sodium Pyruvate)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.In one aspect of the invention, the third medium is glycine, L- alanine, L- arginine hydrochloride, L- asparagine -H 2 O, L- cysteine, L- histidine hydrochloride -H 2 O, iso-L- L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, choline chloride, D-lysine, L-leucine, L-lysine hydrochloride, L-methionine, L-phenylalanine, Pyridoxal hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, I-inositol, anhydrous calcium chloride, ferric nitrate hexahydrate, anhydrous magnesium chloride, potassium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride , Sodium hydrogenphosphate, zinc sulfate, dextrose, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), phenol red, sodium pyruvate have.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 제3배지의 총부피를 기준으로 하여 하기와 같은 농도로 각 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 20.0~40.0mg/L의 글라이신; 1.0~3.0mg/L의 L-알라닌; 75.0~95.0mg/L의 L-아르기닌 하이드로클로라이드; 0.5~1.0mg/L의 L-아스파라진-H2O; 25.0~40.0mg/L의 L-시스테인; 35.0~50.0mg/L의 L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O; 90.0~115.0mg/L의 L-이소루신; 90.0~115.0mg/L의 L-루신; 135.0~155.0mg/L의 L-라이신 하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 L-메티오닌; 55.0~75.0mg/L의 L-페닐알리닌; 6.5~8.5mg/L의 L-프롤린; 35.0~50.0mg/L의 L-세린; 85.0~105.0mg/L의 L-트레오닌; 10.0~20.0mg/L의 L-트립토판; 65.0~80.0mg/L의 L-티로신; 85.0~110.0mg/L의 L-발린; 2.0~6.0mg/L의 염화 콜린; 2.0~6.0mg/L의 D-판토텐산 칼슘; 2.0~6.0mg/L의 엽산; 2.0~6.0mg/L의 나이아신 아미드; 2.0~6.0mg/L의 염산 피리독신; 0.2~0.6mg/L의 리보플라빈; 2.0~6.0mg/L의 티아민 하이드로클로라이드; 0.003~0.009mg/L의 비타민 B12; 6.0~8.0mg/L의 I-이노시톨; 180.0~220.0mg/L의 무수 염화칼슘; 0.05~0.2mg/L의 질산제2철 9수화물; 70.0~90.0mg/L의 무수 염화 마그네슘; 350.0~450.0mg/L의 염화칼륨; 2000.0~2400.0mg/L의 탄산수소나트륨; 2800.0~3200.0mg/L의 염화나트륨; 100.0~150.0mg/L의 인산수소나트륨; 0.10~0.30mg/L의 황산아연; 3.5~5.5g/L의 덱스트로오스, 2.2~3.2g/L의 HEPES; 7.5~9.0mg/L의 페놀레드; 20.0~30.0mg/L의 소디움 피루베이트.In one aspect of the invention, the third medium may comprise one or more of the following substances at a concentration based on the total volume of the third medium: 20.0 to 40.0 mg / L of glycine; 1.0 to 3.0 mg / L of L-alanine; 75.0 to 95.0 mg / L L-arginine hydrochloride; 0.5 to 1.0 mg / L of L-asparagine-H 2 O; 25.0 to 40.0 mg / L of L-cysteine; 35.0 to 50.0 mg / L L-histidine hydrochloride-H 2 O; 90.0 to 115.0 mg / L of L-isoleucine; 90.0 to 115.0 mg / L of L-leucine; 135.0 to 155.0 mg / L of L-lysine hydrochloride; 20.0 to 40.0 mg / L of L-methionine; 55.0 to 75.0 mg / L of L-phenylalanine; 6.5 to 8.5 mg / L of L-proline; 35.0 to 50.0 mg / L of L-serine; 85.0-105.0 mg / L L-threonine; 10.0 to 20.0 mg / L of L-tryptophan; 65.0-80.0 mg / L of L-tyrosine; 85.0 to 110.0 mg / L of L-valine; 2.0-6.0 mg / L choline chloride; 2.0-6.0 mg / L calcium D-pantothenate; 2.0 to 6.0 mg / L folic acid; 2.0 to 6.0 mg / L of niacinamide; 2.0 to 6.0 mg / L pyridoxine hydrochloride; 0.2-0.6 mg / L riboflavin; 2.0 to 6.0 mg / L thiamine hydrochloride; 0.003 to 0.009 mg / L of vitamin B12; 6.0-8.0 mg / L I-inositol; 180.0 to 220.0 mg / L of anhydrous calcium chloride; 0.05 to 0.2 mg / L ferric nitrate hexahydrate; 70.0 to 90.0 mg / L of anhydrous magnesium chloride; 350.0 to 450.0 mg / L of potassium chloride; 2000.0 to 2400.0 mg / L sodium hydrogencarbonate; 2800.0 to 3200.0 mg / L sodium chloride; 100.0 to 150.0 mg / L sodium hydrogen phosphate; 0.10 to 0.30 mg / L of zinc sulfate; 3.5 to 5.5 g / L of dextrose, 2.2 to 3.2 g / L of HEPES; 7.5 to 9.0 mg / L phenol red; 20.0 to 30.0 mg / L of sodium pyruvate.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the third medium is a Neurobasal medium supplemented with horse serum, B-27 占 serum-free serum supplement, L-glutamine, beta-mercaptoethanol, Brain-derived neurophysiologist.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 0.5~5% 말 혈청, 0.1~5X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트, 0.1~1.5mM의 L-글루타민, 1~50uM 의 베타-머캅토에탄올, 0.1~1.5M의 포스콜린, 1~40μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, 및 1~30ng/ml 의 뇌유래 신경영양인자를 포함하는 것일 수 있다. In one aspect of the invention, the third medium comprises 0.5-5% horse serum, 0.1-5X B-27 serum-free serum supplement, 0.1-1.5 mM L-glutamine, 1-50 uM beta-mercaptoethanol , 0.1 to 1.5 M phoca colin, 1 to 40 μg / ml bovine pituitary extract, and 1 to 30 ng / ml brain-derived neurotrophic factor.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 제4배지에 포함된 L-아스코르브산은 제4배지의 총부피에 대해 1 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 10 ng/ml 이상, 20 ng/ml 이상, 30 ng/ml 이상, 40 ng/ml 이상, 45 ng/ml 이상, 50 ng/ml 이상, 55 ng/ml 이상, 60 ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 80 ng/ml 이상, 90 ng/ml 이상, 100 ng/ml 이상, 및/또는 100 ng/ml 이하, 90 ng/ml 이하, 80 ng/ml 이하, 70 ng/ml 이하, 60 ng/ml 이하, 55 ng/ml 이하, 50 ng/ml 이하, 45 ng/ml 이하, 40 ng/ml 이하, 30 ng/ml 이하, 20 ng/ml 이하, 10 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the fourth medium may include 1 to 100 ng / ml of L-ascorbic acid. Specifically, the L-ascorbic acid contained in the fourth medium is added to the fourth medium in an amount of 1 ng / ml to 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 30 ng / At least 40 ng / ml, at least 45 ng / ml, at least 50 ng / ml, at least 55 ng / ml, at least 60 ng / ml, at least 70 ng / ml, at least 80 ng / ml, at least 90 ng / or less, and / or 100 ng / ml or less, 90 ng / ml or less, 80 ng / ml or less, 70 ng / ml or less, 60 ng / ml or less, 55 ng / ml or less, 50 ng / ng / ml, 40 ng / ml, 30 ng / ml, 20 ng / ml, 10 ng / ml, 5 ng / ml and 1 ng / ml.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 말 혈청은 0.5% 이상, 1%이상, 1.5%이상, 2%이상, 2.5%이상, 3%이상, 4%이상, 5%이상, 및/또는 5%이하, 4%이하, 3%이하, 2.5%이하, 2%이하, 1.5%이하, 1%이하, 0.5%이하 일 수 있다. In one aspect of the present invention, the horse serum contained in the third medium contains at least 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5% Or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2.5% or less, 2% or less, 1.5% or less, 1% or less, 0.5% or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 B-27® 무혈청 서플먼트는 0.1X 농도 이상, 0.5X 농도 이상, 0.7X 농도 이상, 0.9X 농도 이상, 1.0X 농도 이상, 1.1X 농도 이상, 1.3X 농도 이상, 1.5X 농도 이상, 2.0X 농도 이상, 3.0X 농도 이상, 4.0X 농도 이상, 5.0X 농도 이상, 및/또는 0.1X 농도 이하일 수 있다.In one aspect of the present invention, the B-27 serum-free serum supplement contained in the third medium has a concentration of 0.1X or more, 0.5X or more, 0.7X or more, 0.9X or more, 1.0X or more, Or more, 1.3X or more, 1.5X or more, 2.0X or more, 3.0X or more, 4.0X or more, 5.0X or more, and / or 0.1X or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 L-글루타민은 제3배지의 총부피에 대해 0.1 mM 이상, 0.2 mM 이상, 0.3 mM 이상, 0.4 mM 이상, 0.5 mM 이상, 0.6 mM 이상, 0.7 mM 이상, 0.8 mM 이상, 0.9 mM 이상, 1.0 mM 이상, 1.3 mM 이상, 1.5 mM 이상, 및/또는 1.5 mM 이하, 1.3 mM 이하, 1.1 mM 이하, 1.0 mM 이하, 0.9 mM 이하, 0.8 mM 이하, 0.7 mM 이하, 0.6 mM 이하, 0.5 mM 이하, 0.4 mM 이하, 0.3 mM 이하, 0.2 mM 이하, 0.1 mM 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the amount of L-glutamine contained in the third medium is 0.1 mM or more, 0.2 mM or more, 0.3 mM or more, 0.4 mM or more, 0.5 mM or more, 0.6 mM or more, Not less than 0.7 mM, not less than 0.8 mM, not less than 0.9 mM, not less than 1.0 mM, not less than 1.3 mM, not less than 1.5 mM and / or not more than 1.5 mM, not more than 1.3 mM, not more than 1.1 mM, Less than 0.7 mM, less than 0.6 mM, less than 0.5 mM, less than 0.4 mM, less than 0.3 mM, less than 0.2 mM, less than 0.1 mM.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 베타-머캅토에탄올은 제3배지의 총부피에 대해 0.1 uM이상, 0.5 uM이상, 1.0 uM이상, 5.0 uM이상, 10.0uM이상, 15.0uM이상, 20.0uM이상, 21.0uM이상, 22.0uM이상, 23.0uM이상, 24.0uM이상, 25.0uM이상, 26.0uM이상, 27.0uM이상, 28.0uM이상, 29.0uM이상, 30.0uM이상, 35.0uM이상, 40.0uM이상, 45.0uM이상, 50.0uM이상, 60.0uM이상, 70.0 uM이상, 및/또는 70.0 uM이하, 60.0 uM이하, 50.0 uM이하, 45.0 uM이하, 40.0uM이하, 35.0uM이하, 30.0uM이하, 29.0uM이하, 28.0uM이하, 27.0uM이하, 26.0uM이하, 25.0uM이하, 24.0uM이하, 23.0uM이하, 22.0uM이하, 21.0uM이하, 20.0uM이하, 15.0uM이하, 10.0uM이하, 5.0uM이하, 1.0uM이하, 0.5uM이하, 0.1uM이하 일 수 있다.In one aspect of the invention, the beta-mercaptoethanol contained in the third medium is at least 0.1 uM, at least 0.5 uM, at least 1.0 uM, at least 5.0 uM, at least 10.0 uM, at least 15 uM 25.0 uM, 26.0 uM, 27.0 uM, 28.0 uM, 29.0 uM, 30.0 uM, 35.0 uM, 22.0 uM, 22.0 uM, 40.0 uM or more, 45.0 uM or more, 50.0 uM or more, 60.0 uM or more, 70.0 uM or more and / or 70.0 uM or less, 60.0 uM or less, 50.0 uM or less, 45.0 uM or less, 40.0 uM or less, 35.0 uM or less, 25.0 uM or less, 24.0 uM or less, 23.0 uM or less, 22.0 uM or less, 21.0 uM or less, 20.0 uM or less, 15.0 uM or less, 10.0 uM or less, 5.0 or less uM or less, 1.0 uM or less, 0.5 uM or less, 0.1 uM or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 포스콜린은 제3배지의 총부피에 대해 0.1M 이상, 0.2M 이상, 0.3M 이상, 0.4M 이상, 0.5M 이상, 0.6M 이상, 0.7M 이상, 0.8M 이상, 0.9M 이상, 1.0M 이상, 1.3M 이상, 1.5M 이상, 및/또는 1.5M 이하, 1.3M 이하, 1.1M 이하, 1.0M 이하, 0.9M 이하, 0.8M 이하, 0.7M 이하, 0.6M 이하, 0.5M 이하, 0.4M 이하, 0.3M 이하, 0.2M 이하, 0.1M 이하일 수 있다. In one aspect of the present invention, the phoscholin contained in the third medium is 0.1 M or more, 0.2 M or more, 0.3 M or more, 0.4 M or more, 0.5 M or more, 0.6 M or more, or 0.7 M or more, 0.8M or more, 0.9M or more, 1.0M or more, 1.3M or more, 1.5M or more and / or 1.5M or less, 1.3M or less, 1.1M or less, 1.0M or less, 0.7M or less, 0.6M or less, 0.5M or less, 0.4M or less, 0.3M or less, 0.2M or less, 0.1M or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 소 뇌하수체 추출물은 제3배지의 총부피에 대해 1μg/ml 이상, 5μg/ml 이상, 10μg/ml 이상, 15μg/ml 이상, 17μg/ml 이상, 18μg/ml 이상, 19μg/ml 이상, 20μg/ml 이상, 21μg/ml 이상, 22μg/ml 이상, 23μg/ml 이상, 25μg/ml 이상, 30μg/ml 이상, 40μg/ml 이상, 50μg/ml 이상, 및/또는 50μg/ml 이하, 40μg/ml 이하, 30μg/ml 이하, 25μg/ml 이하, 23μg/ml 이하, 22μg/ml 이하, 21μg/ml 이하, 20μg/ml 이하, 19μg/ml 이하, 18μg/ml 이하, 17μg/ml 이하, 15μg/ml 이하, 10μg/ml 이하, 5μg/ml 이하, 1μg/ml 이하일 수 있다.In one aspect of the present invention, the bovine pituitary extract contained in the third medium is at least 1 μg / ml, at least 5 μg / ml, at least 10 μg / ml, at least 15 μg / ml, at least 17 μg / ml At least 20 μg / ml, at least 20 μg / ml, at least 22 μg / ml, at least 23 μg / ml, at least 25 μg / ml, at least 30 μg / ml, at least 40 μg / ml, at least 50 μg / ml And / or less than or equal to 50 μg / ml, less than or equal to 40 μg / ml, less than or equal to 30 μg / ml, less than or equal to 25 μg / ml, less than or equal to 23 μg / ml, less than or equal to 22 μg / ml, less than or equal to 20 μg / ml, ml or less, 17 μg / ml or less, 15 μg / ml or less, 10 μg / ml or less, 5 μg / ml or less and 1 μg / ml or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 뇌유래 신경영양인자는 제3배지의 총부피에 대해 1ng/ml 이상, 5ng/ml 이상, 7ng/ml 이상, 8ng/ml 이상, 9ng/ml 이상, 10ng/ml 이상, 11ng/ml 이상, 12ng/ml 이상, 13ng/ml 이상, 15ng/ml 이상, 20ng/ml 이상, 30ng/ml 이상, 및/또는 30ng/ml 이하, 20ng/ml 이하, 15ng/ml 이하, 13ng/ml 이하, 12ng/ml 이하, 11ng/ml 이하, 10ng/ml 이하, 9ng/ml 이하, 8ng/ml 이하, 7ng/ml 이하, 6ng/ml 이하, 5ng/ml 이하, 1ng/ml 이하일 수 있다. In one aspect of the invention, the brain-derived neurotrophic factor contained in the third medium is at least 1 ng / ml, at least 5 ng / ml, at least 7 ng / ml, at least 8 ng / ml, at least 9 ng / ml More than 10 ng / ml, more than 11 ng / ml, more than 12 ng / ml, more than 13 ng / ml, more than 15 ng / ml, more than 20 ng / ml, more than 30 ng / ml, and / 10 ng / ml, 9 ng / ml, 8 ng / ml, 7 ng / ml, 6 ng / ml, 5 ng / ml or less, 1 ng / ml or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 운동 신경세포를 시반세포 위에 시딩 한 후에 제3배지를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the step 2) may be performed by seeding the motor neurons on the normal cells and then culturing the cells by adding the third medium.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 제3배지를 첨가하여 배양 후 5일 내지 9일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 2)단계는 제3배지를 첨가하여 배양 후 6일 내지 8일째, 더 구체적으로 7일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다.In one aspect of the present invention, the step 2) may be performed by adding a third medium and replacing the fourth medium with the fourth medium after 5 to 9 days. Specifically, the step 2) may be performed by adding the third medium and culturing the medium by replacing it with the fourth medium for 6 days to 8 days, more specifically, for 7 days.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후,코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 3)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 더 구체적으로 6일 이후에 코엔자임Q10을 2일 내지 4일 간격, 더 구체적으로 3일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 것일 수 있다.In one aspect of the present invention, the step 2) may be performed by adding Coenzyme Q10 (coenzyme Q10) at intervals of 2 days to 4 days after 4 to 7 days from co-cultivation. Specifically, step 3) may be performed by adding Coenzyme Q10 at intervals of 2 days to 4 days, more specifically at intervals of 3 days, from 4 days to 7 days after co-cultivation, more specifically, after 6 days.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2) 단계의 공동배양은 5일 내지 40일 동안 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계의 공동배양은 5일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 50일 이상, 60일 이상, 70일 이상, 또는 100일 이상 동안 수행하거나, 100일 이하, 70일 이하, 50일 이하, 30일 이하, 25일 이하, 22일 이하, 20일 이하, 10일 이하, 또는 5일 이하 동안 수행하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the co-culture of step 2) may be performed for 5 to 40 days. Specifically, in one aspect of the present invention, the co-culture of step 2) is performed for 5 days or longer, 10 days or longer, 15 days or longer, 20 days or longer, 21 days or longer, 25 days or longer, 30 days or longer, 50 days, 60 days, 70 days, 100 days or more, 100 days or less, 70 days or less, 50 days or less, 30 days or less, 25 days or less, 22 days or less, 20 days or less, Or less, or 5 days or less.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계의 공동배양은 2일 내지 4일 주기로 배지의 50%를 교체하고 35℃ 내지 40℃, 더 구체적으로 36~38℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the co-cultivation in step 2) is carried out by replacing 50% of the medium with a period of 2 to 4 days, and at a temperature of 35 ° C to 40 ° C, more specifically, 36 to 38 ° C and 4-6% 2 < / RTI > conditions.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 2) 단계 이후에 3)공동 배양으로 시반세포가 운동 신경세포의 수초(myelin)를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the method may further comprise the step of 3) co-culturing after step 2), wherein the normal cells form myelin of motor neurons.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 3) 단계 이후에 수초가 형성된 운동 신경세포를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the method may further comprise the step of obtaining motoneurons in which a few seconds have been formed after step 3).
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 배양판에서 수행되는 것일 수 있다.In one aspect of the invention, the culturing of the time-resolved cells may be performed in a culture plate.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 배양판은 커버슬립(coverslip) 또는 배양디쉬(culture dish)일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니며 고체 또는 겔 형 배지가 도말 될 수 있는 용기라면 제한 없이 사용될 수 있다.In one aspect of the present invention, the culture plate may be a coverslip or a culture dish, but is not limited to, and can be used without limitation if it is a container in which a solid or gel-type culture medium can be plated .
본 명세서에서 배양판은 세포를 배양할 수 있는 기판을 의미하는 것으로서, 이러한 기판 위에 배지를 도말하고 그 배지 위에 세포를 시딩하여 배양할 수 있는 것을 의미할 수 있다. 이러한 배양판은 그 크기와 모양이 제한되지 않으며, 세포를 배양할 수 있는 공간을 가지고 있을 수 있으며, 이러한 공간은 평평한 면으로 구성된 것일 수 있으나 반드시 평평할 필요는 없다. The term "culture plate" as used herein means a substrate on which cells can be cultured. This means that the culture medium can be cultured on the substrate by seeding the cells and seeding the cells on the culture medium. Such a culture plate is not limited in its size and shape, and may have a space for culturing the cells. Such a space may be composed of a flat surface, but it is not necessarily flat.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 신경세포, 구체적으로 운동 신경세포는 운동 신경세포 질환(Motor neuron disease)을 가지는 개체로부터 수득된 것일 수 있다.In one aspect of the present invention, the neuron, specifically, the motor neuron may be one obtained from a subject having motor neuron disease.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 운동 신경세포 질환은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 및 가족성 운동 신경세포 질환(Familial motor neuron disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. In one aspect of the invention, the motor neuron disease is selected from the group consisting of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), primary lateral sclerosis, Werdni-Hoffman disease, - selected from the group consisting of Kugelberg-Welander syndrome, progressive spinal muscular atrophy, progressive bulbar palsy, and familial motor neuron disease It can be more than one.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 개체는 포유류일 수 있다. In one aspect of the invention, the subject may be a mammal.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples. However, these examples and test examples are provided for illustrative purposes only in order to facilitate understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예 1] 세포 배양을 위한 배지[Example 1] Culture medium for cell culture
(1) A-1 배지(시반세포 배양)(1) A-1 medium (time-lapse cell culture)
50ml 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)(Lonza사)에 5ml 말 혈청 (최종농도: 10부피% 말 혈청, horse serum)(Gibco사), 200mM L-글루타민 5ml (최종농도: 4mM의 L-글루타민, glutamine)(Invritrogen사), 100units/ml의 페니실린/스트렙토마이신(1:1비율) 0.5ml(최종농도: 1 부피% 페니실린/스트렙토마이신, penicilin/streptomycin)(Sigma사), 100ng/ml 인간 헤레귤린 베타-1 1ul(최종농도: 2ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, human heregulin beta-1)(Sigma사), 및 5mM 포스콜린 5ul(최종농도:0.5μM 의 포스콜린, forskolin)(Sigma사)를 첨가하여 A-1 배지를 제조하였다.5 ml of horse serum (final concentration: 10% by volume horse serum, Gibco), 5 ml of 200 mM L-glutamine (final concentration: 4 mM) were added to 50 ml of high-glucose Dulbecco's modified eagle medium (Lonza) (Final concentration: 1 vol% penicillin / streptomycin) (Sigma), 100 ng / ml penicillin / streptomycin (1: 1 ratio) (final concentration: 2 ng / ml of human heregulin beta-1) (Sigma) and 5 mM of phoscholine (final concentration: 0.5 μM of phoscholine, forskolin (Sigma) was added to prepare A-1 medium.
(2) A-2 배지(시반세포 배양)(2) A-2 medium (time cell culture)
상기 (1)에서 제조된 A-1배지에 100ug/ml 인간 연기성 섬유아세포 성장인자50ul (최종농도: 10ng/ml, human basic fibroblast growth factor)(Sigma사), 및 1mg/ml 소 뇌하수체 추출물 1ml (최종농도: 20μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, bovine pituitary extract)(Sigma사)을 더 첨가하여 A-2배지를 제조하였다. 50 μl (final concentration: 10 ng / ml, human basic fibroblast growth factor) (Sigma) of 100 μg / ml human acting fibroblast growth factor and 1 ml of 1 mg / ml bovine pituitary extract were added to the A-1 medium prepared in the above (1) (Final concentration: 20 μg / ml bovine pituitary extract) (Sigma) was further added to prepare A-2 medium.
(3) B 배지(시반세포와 운동 신경세포의 공동배양)(3) B medium (coculture of synapses and motor neurons)
50ml 뉴로베이살TM 배지(NeurobasalTM medium)(Lonza사)에 말 혈청 5ml (최종농도: 2부피% 말 혈청, horse serum)(Gibco사), 1X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트(supplement)(Gibco사), 200mmM L-글루타민 125ul(최종농도: 0.5mM의 L-글루타민, L-glutamine)(Invitrogene 사) 1mM 베타-머캅토에탄올 1.25ml (최종농도: 25uM 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol (Sigma사), 5mM 포스콜린 5ul (최종농도: 0.5 M의 포스콜린)(Sigma사), 1mg/ml 소 뇌하수체 추출물 1ml (최종농도: 20μg/ml의 소 뇌하수체 추출물)(Sigma사), 및 10ug/ml 뇌유래 신경영양인자 50ul (최종농도: 10ng/ml의 뇌유래 신경영양인자, brain-derived neurotrophic factor, BDNF)(Sigma사)를 첨가하여 B 배지를 제조하였다. 50ml neuro bay live TM medium (Neurobasal medium TM) horse serum (Lonza, Inc.) 5ml (final concentration: 2% by volume of horse serum, horse serum) (Gibco, Inc.), the concentration of 1X B-27® serum-free Supplement (supplement) (Final concentration: 25 uM beta-mercaptoethanol (Beta-mercaptoethanol) (manufactured by Gibco), 125 mmol of L-glutamine (final concentration: 0.5 mM L- 1 ml of a 1 mg / ml bovine pituitary extract (final concentration: 20 μg / ml bovine pituitary extract) (Sigma), 5 μl of mercaptoethanol (Sigma), 5 μl of phocolin B medium was prepared by adding 10 ug / ml brain-derived neurotrophic factor 50ul (final concentration: 10 ng / ml brain-derived neurotrophic factor, BDNF) (Sigma).
(4) C 배지(시반세포와 운동 신경세포의 공동배양)(4) C medium (coculture of synovial cells and motor neurons)
(3)에서 제조한 B배지에 10mg/ml L- 아스코르브산 250ul (최종농도: 50ug/ml의 L-아스코르브산)(Sigma사)을 더 첨가하여 C 배지를 제조하였다. Ascorbic acid (final concentration: 50 ug / ml of L-ascorbic acid) (Sigma) was added to the B medium prepared in (3) to prepare C medium.
[실시예 2] 시반세포와 운동 신경 세포의 공동배양 및 그 시스템[Example 2] Covalent cell and motor neuron co-culture and its system
(1) 커버슬립 상에 마트리겔의 코팅(1) coating of matrigel on cover slip
성장 인자가 제거된 마트리겔(Growth factor reduced-matrigel)(Life technologies사)을 고-글르코스 배지(Lonza사)에 1:3 의 비율로 희석하였다. 그런 뒤 12mmφ의 커버슬립(coverslips)에 이를 30μl씩 도말하였다(coverslips에 약 3mm 두께로 도말됨). 그리고 커버슬립을 37℃ 배양기에 넣고 45분간 배양하여 코팅하였다. 이러한 커버슬립은 60mmφ 디쉬에 놓여져 있다. Growth factor reduced-matrigel (Life technologies), in which the growth factor was removed, was diluted 1: 3 in high-Glucose medium (Lonza). They were then plated on coverslips of 12 mm in diameter by 30 microliters (plated on coverslips to a thickness of about 3 mm). Then, the cover slip was placed in a 37 ° C incubator and incubated for 45 minutes. This cover slip is placed in a 60 mm diameter dish.
(2) 시반세포의 분리 및 배양(2) Isolation and Culture of Time-lapse Cells
1) 생후?4일령인 ICR(CD-1®) outbred mice (Samtaco사)?한 세트?(10-15마리)를 준비하였다. 준비된 마우스들에 대해 소독된 가위를 이용하여 마우스의 경추부분을 빠르게 절단하였다. 그런 뒤 경추이하 부분을 60φ 디쉬에 담긴 70% 알코올에 좌골신경을 꺼내기 전 까지 담가 놓았다.1) We prepared a set (10-15 mice) of ICR (CD-1®) outbred mice (Samtaco), 4 days old. The cervical portion of the mouse was quickly cut using disinfected scissors for the prepared mice. After that, the lower part of the cervical spine was immersed in 70% alcohol in a 60φ dish until the sciatic nerve was removed.
2) 수술용 집게(forseps)와 칼을 이용하여 경추 이하 부분의 피부를 잘라 벗겨내고 대퇴근육 근처에서?좌골신경(sciatic nerve)를 뽑아내었다. 이렇게 추출한 좌골신경을?4℃의 PBS(Lonza사) 3ml이 담긴 15ml 하나의 튜브에 담가 놓았다.2) Surgical forceps and knives were used to cut the skin below the cervical vertebrae, and sciatic nerves were extracted near the femur muscles. The sciatic nerve thus extracted was immersed in a 15 ml tube containing 3 ml of PBS (Lonza Co.) at 4 ° C.
3) 그런 뒤 2.5% 트립신 500 ul(Sigma사)?과?10mg/ml 콜라게네이즈 500ul(Roshe사)를 튜브에 분주하고,?3ml PBS를 더 넣어주었다.3) Then, 500 μl of 2.5% trypsin (Sigma) and 500 μl of collagenase (10 μg / ml) (Roshe) were placed in a tube and 3 ml of PBS was added.
4)그런 뒤 이를 37℃의 워터 베스(Water bath)에서?30분간?인큐베이션(incubation)?시켰다. 4) Then, it was incubated in a 37 ° C water bath for 30 minutes.
5) 30분 후 이를 190Xg으로 5분간?원심분리(2-16p,Sigma사) 하였다.5) After 30 minutes, it was centrifuged (2-16p, Sigma) for 5 minutes at 190Xg.
6) 원심분리 후, 상층액을 제거하였다. 6) After centrifugation, the supernatant was removed.
7) 부유물이 제거된 시료에 말 혈청의 10%(Horse Serum)(Gibco사)가 들어간?DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)(Gibco사)로?3회?세척(washing)?하였다. 세척 후 190 x g 에서 5분간?원심분리 하였다. 7) The suspension was washed three times with Dulbecco's modified eagle medium (Gibco) containing 10% horse serum (Gibco) in horse serum. After washing, the cells were centrifuged at 190 x g for 5 minutes.
8) 원심분리 후, 상층액을 제거하였다.8) After centrifugation, the supernatant was removed.
9) 상층액이 제거된 침전물에 1ml?A-1배지를 넣고?현탁(suspension) 시켰다.9) 1 ml? A-1 medium was added to the precipitate from which the supernatant was removed, and the suspension was suspended.
10) 세포의 수를 헤마토사이토미터(Hematocytometer, MARIEN사)기로 측정한 뒤 각 웰(coverslip)당 3x104 개의 요구 세포수를 상기 (1)에서 성장인자가 제거된 마트리겔로 코팅된 커버슬립 상에 올렸다.10) cells were counted by a hematocytometer (MARIEN), and the number of required cells of 3x10 4 cells per each coverslip was measured using a cover slip coated with a matrigel in which the growth factor was removed in the above (1) On the top.
11) 그런 뒤 1시간30분~2시간 가량?37℃ 5% CO2 조건에서 인큐베이션(incubation)시켰다.11) Then, incubation was carried out at 37 ° C and 5% CO 2 for 1 hour and 30 minutes to 2 hours.
12) 세포가 커버슬립에 부착되었는지를 현미경 20x 렌즈(TS100,Nikon)로 확인한 뒤 실시예 1에서 제조한 A-1 배지를 마트리겔로 코팅된 커버슬립이 들어있는 60mmφ 디쉬에 3ml넣고, 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다.12) After confirming whether the cells were attached to the cover slip with a microscope 20x lens (TS100, Nikon), 3 ml of the A-1 medium prepared in Example 1 was put into a 60 mm? Dish containing a cover slip coated with Matrigel, And cultured at 5% CO 2 .
13) 시반 세포를 마트리겔로 코팅된 커버슬립에 시딩(seeding)하고 배양한 후 4 일째에 A-2 배지로 바꾸고 37℃ 5% CO2 조건에서 2일 더 배양하였다.13) The seed cells were seeded on a cover slip coated with Matrigel, and cultured. The cells were changed to A-2 medium on the fourth day and cultured for another 2 days under the condition of 37 ° C and 5% CO 2 .
(3) 운동 신경세포의 분리 및 배양(3) Isolation and culture of motor neurons
1) 이소플루레인(Isofluran(하나제약주식회사))을 사용하여 임신 14일째의 CD-1® 마우스(Samtaco사)를 호흡 마취하였다.1) CD-1® mouse (Samtaco) on the 14th day of pregnancy was anesthetized by using isoflurane (Isofluran (Hana Pharmaceutical Co., Ltd.)).
2) 마취 상태를 확인 한 후, 경추 탈골을 하였다.2) After confirming the state of anesthesia, cervical dislocation was performed.
3) 경추 탈골시킨 쥐의 배 쪽을 알코올로 소독한 후 개복하고, 임신한 마우스의 태아(fetus)를 꺼내 4 ℃의 HBSS(hank’s balanced salt solution)(Lonza사)에 넣어두었다.3) The cervical dislocated mouse was disinfected with alcohol, and the fetus was removed from the pregnant mouse and placed in a 4 ° C hank's balanced salt solution (Lonza).
4) 태아 척수(fetal spinal cord)의 요추(lumbar) 부분의 절개(dissection)를 진행하였다.4) The lumbar part of the fetal spinal cord was dissected.
5) 태아 마우스로부터 각각 분리한 척수를 HBSS(hank’s balanced salt solution)(Lonza사)에 보관하였다.5) The spinal cords isolated from fetal mice were stored in HBSS (Hank's balanced salt solution) (Lonza Co.).
6) 분리된 척수에 1% 트립신 용액(trypsin solution)(Worthington사)을 20μl 넣고 37℃ 워터 베스(water bath)에서 인큐베이션(incubation)시켰다.6) 20 μl of 1% trypsin solution (Worthington) was added to the separated spinal cord and incubated at 37 ° C in a water bath.
7) 1% 트립신 저해제(trypsin inhibitor)(Sigma사)를 20μl 넣고 200ul짜리 피펫을 (Pipette, eppendorf사) 이용하여 10 내지 20회 가량 척수 조직을 분쇄하였다. 7) 20 μl of a 1% trypsin inhibitor (Sigma) was added and the spinal cord tissue was pulverized 10 to 20 times using a 200-μl pipette (Pipette, eppendorf).
8) 7)의 척수를 준비된 면역 패닝(immunopanning) 디쉬(dish) 위에 올렸다. 면역 패닝 디쉬의 경우, p75 항체 (Abcam사)가 포함된 10mM의 트리스-Cl 용액(T＆I사)을 24웰에 300μl씩 넣은 후 4℃ 에서 운동 신경세포의 배양 하루 전부터 보관하여 웰의 바닥을 코팅시켜 준비하였다.8) The spinal cord of 7) was placed on a prepared immunopanning dish. In the case of the immunopanning dish, 300 μl of a 10 mM Tris-Cl solution (T & I) containing p75 antibody (Abcam Co.) was added to each well of 24 wells and stored at 4 ° C. for 1 day before the culture of motor neurons, Respectively.
9) 8)의 면역 패닝 디쉬에 올려진 척수를 상온에서 45분간 인큐베이션 시켰다.9) The spinal cord placed on the immunopanning dish of 8) was incubated at room temperature for 45 minutes.
10) 인큐베이션 후 면역 패닝 디쉬를 글루타맥스 1(Glutamax1)(Gibco사)이 들어간 뉴로 베이살 배지(Neurobasal medium)(Invitrogen사)로 두 번 세척 하였다.10) After incubation, the immunopaning dishes were washed twice with Neurobasal medium (Invitrogen) containing Glutamax1 (Gibco).
11) 탈분극 용액(Depolarization solution)(증류수에 0.8% 염화나트륨, 30mM 의 염화칼륨, 및 2mM의 염화칼슘(Merk사)을 혼합한 혼합물)을 이용하여 디쉬에 부착된 운동 신경세포를 탈착시켰다.11) Depolarization solution (a mixture of 0.8% sodium chloride, 30 mM potassium chloride, and 2 mM calcium chloride (Merk) in distilled water) was used to desorb motile neurons attached to the dish.
12) 탈착된 운동 신경세포 세포를 15ml 튜브에 보관하였다.12) Desorbed motor neuron cells were stored in 15 ml tubes.
13) 이러한 튜브를 400Xg에서 5분 동안 원심분리 하였다.13) These tubes were centrifuged at 400Xg for 5 minutes.
14) 원심분리 후 튜브의 상층액을 제거하였다.14) After centrifugation, the supernatant of the tube was removed.
15) 상층액이 제거된 운동 신경세포 세포들에 실시예 1에서 제조한 B 배지를 첨가하여 재현탁시켰다.15) The supernatant-removed motor neuron cells were resuspended by adding the medium B prepared in Example 1.
16) 세포의 수를 확인하였다.16) number of cells.
(4) 시반세포와 운동 신경세포의 공동배양(4) co-cultivation of sperm cells and motor neurons
1) 60mmφ의 배양 디시에서 배양한 시반세포가 담긴 커버슬립을 35mmφ의 배양 디시로 옮기고, 상기 (2)에 따라서 12mmφ 커버슬립 위에서 6일 동안 배양한 시반세포에 운동 신경세포를 5X103 내지 1X104 개의 세포수로 올렸다.1) during the transfer the cover slip has a thirty cell culture in a culture dish of 60mmφ contained in the culture dish of 35mmφ, the above-mentioned (2) according 12mmφ cover slip on 6 days a 5X10 the motor neurons in the culture thirty cell 3 to 1X10 4 Cell number.
2) 그런 뒤 커버슬립을 37℃ 배양기에서 1시간 정도 배양한 뒤, 운동 신경세포 세포의 부착을 현미경 20X 렌즈로(TS100,Nikon) 확인하였다.2) The cover slip was incubated in a 37 ° C incubator for about 1 hour, and the adhesion of motor neuron cells was confirmed with a microscope 20X lens (TS100, Nikon).
3) 현미경으로 부착을 확인한 후, 배양 디시(culture dish)(35mmφ) 위에 나머지 B 배지를 2ml 가량 채워 주었다. 그런 뒤 시반세포와 운동 신경세포를 3일에 한 번씩 50%의 배지를 새롭게 교체하면서 37℃, 5 % CO2 조건으로 배양기에서 공동배양 하였다. 3) After confirming adhesion with a microscope, 2 ml of the remaining B medium was filled on a culture dish (35 mmφ). Then, the spermatic cells and the motor neurons were co-cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 under a fresh medium of 50% every 3 days.
4) 시반세포와 운동 신경세포를 공동 배양한(co-culture)후 7일째에 C 배지로 교체하여 배양하였다. 4) After 7 days of co-culture, the cells were replaced with medium C and cultured.
5) C배지를 3일에 한번씩 50% 배지만 교체하면서, 37℃, 5 % CO2 조건으로 배양기에서 배양하였다.5) The C medium was replaced with 50% of the medium every 3 days, and the cells were cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 .
6) 상기 배양을 통해 커버슬립 위에서 수초(myelin)가 형성된 운동 신경세포를 수득할 수 있었다. 6) Through the above cultivation, motor neurons having myelin formed on the cover slip could be obtained.
[시험예 1] 코엔자임 Q10을 첨가하지 않은 경우 운동 신경세포의 배양 및 수초 형성 확인 [Test Example 1] Culturing of motor neurons and confirmation of formation of aquatic plants when coenzyme Q10 was not added
코엔자임 Q10을 첨가하지 않은 상태에서 시반세포와 운동 신경세포의 공동배양시 운동 신경세포의 축삭에서 수초가 형성되고, 운동 신경세포의 배양이 안정하게 잘 이루어지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. In order to confirm whether the axon of the axon of the synovial cells and the motoneurons coexist with the coenzyme Q10 added, and that the culture of the motoneurons is stable, the following experiment .
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 배양 시점별로 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)(파랑), Sox10(Transcription factor Sox-10, NM_006941)(1:500, 노랑), MBP(Myelin basic protein, NP_001020252)(1:500, 초록), Tuj-1(1:1000, 빨강), MAG(Myelin associated glycoprotein, NP_001186145)(빨강) 바이오마커(모두 Abcam사에서 입수)로 운동 신경세포를 염색하였으며 이를 광초점 현미경(50μm 스케일바)으로 염색 정도를 확인하였다. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (blue), Sox10 (transcription factor Sox-10, NM_006941) (1: 500, yellow), MBP Myelin associated glycoprotein, NP_001186145) (Red) Biomarkers (all from Abcam) were used to express motoneurons, such as Myelin basic protein, NP_001020252 (1: 500, green), Tuj-1 And the degree of staining was confirmed by a photomicroscope (50 μm scale bar).
DAPI의 경우 핵을 염색하기 위한 것이며, Sox-10은 시반세포의 전사인자로서 시반세포의 핵을 염색하기 위한 것이고, MBP는 수초 형성 단백질로서 수초가 생성되는지 여부를 확인하기 위한 것이고 Tuj-1은 축삭을 염색하여 그 변화정도를 확인하기 위한 것이고, MAG는 수초 형성시 수초 절흔(Schmit lanterman incisures, 또는 Myelin incisures)에서 발현되는 단백질로서 수초 형성 여부를 확인하기 위한 것 이다. In the case of DAPI, it is to stain the nucleus. Sox-10 is the transcription factor of the time-lapse cell to stain the nucleus of the spermatic cells. MBP is to check whether a few seconds is generated as a herb formation protein. Tuj- MAG is a protein expressed in the myelin sheath (Schmit lanterman incisures, or Myelin incisures) to confirm the formation of aquatic plant.
이러한 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었으며, 도 2a에 따르면 배양 10일째부터 수초형성 단백질의 발현이 시작된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 시반세포가 분화되기 시작된 것을 의미하고 축삭 주위를 시반세포가 둘러싸고 있음을 의미하는 것이다. 또한, 이러한 수초형성 단백질의 발현은 Tuj-1의 염색 부분과 거의 일치하는 것으로 미루어 보아 시반세포가 운동 신경세포의 축삭 근처에서 수초를 형성하는 것이라고 판단할 수 있다. These results are shown in FIGS. 2A and 2B. According to FIG. 2A, it was confirmed that the expression of a herpes zoster protein started from the 10th day of culture, indicating that the differentiation of the somatic cells began, . In addition, the expression of these herpes zyme proteins almost coincided with the staining portion of Tuj-1, suggesting that the normal cells form a few second near the axons of motor neurons.
또한, 도 2b에 따르면 본 발명의 일측면에 따른 공동배양을 진행할 경우 공동배양 후 27일 및 35일 까지도 수초 형성과 관련된 단백질들이 계속 발현되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 이는 생체외 환경에서 운동 신경세포를 안정하게 배양할 수 있다는 것을 의미한다. In addition, according to FIG. 2B, when co-culturing according to one aspect of the present invention is carried out, it can be confirmed that proteins associated with aquatic plant formation are continuously expressed even after 27 days and 35 days after co-cultivation, Can be stably cultured.
[시험예 2] 코엔자임 Q10의 첨가시 운동 신경세포의 배양 및 수초 형성 확인 [Test Example 2] Culture of motoneurons and formation of aquatic plant cells when coenzyme Q10 was added
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 공동배양 시점으로부터 6일 째에 코엔자임 Q10과 양성대조군으로서 ALS 치료제로서 널리 알려져 있는 릴루졸(riluzole, 시그마 알드리치 코리아로부터 구입, 이하 동일)을 1μM씩 3일에 한번 간격으로 처리하였으며, 시험예 1에 따른 방법과 동일한 염색 방법으로 세포들을 염색하였다. 이를 광초점 현미경(50μm 스케일바)으로 촬영하였으며 이러한 결과를 도 3 및 도 5에 나타내었다. 도 5의 경우 시험예 1에서 코엔자임 Q10을 처리하지 않은 경우를 대조군(Control)로 설정하여 이를 함께 나타내었다.On the sixth day of co-cultivation according to Example 2, coenzyme Q10 and co-cultured riluzole (purchased from Sigma-Aldrich Korea, hereinafter), which is well known as an ALS therapeutic agent as a positive control, And the cells were stained by the same dyeing method as in Test Example 1. [ This was photographed with a photomicroscope (50 μm scale bar) and the results are shown in FIG. 3 and FIG. In the case of FIG. 5, the case where coenzyme Q10 was not treated in Test Example 1 was set as a control (Control), and these were shown together.
도 3에 따르면 코엔자임 Q10을 처리하는 경우 코엔자임 Q10을 처리하지 않은 공동배양(도 2)에 비하여 3일 먼저 수초 형성 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 3에서 수초 형성 단백질은 공동배양 후 7일째에 발현이 시작되는 것을 확인할 수 있으나, 도 2에서 수초 형성 단백질은 공동배양 후 10일째에 발현되었다. 또한, 코엔자임 Q10을 처리하고 그 다음날인 공동배양 7일째에 확인하였을 때, 수초 형성 단백질이 바로 발현되는 것으로 보아 코엔자임 Q10이 수초 형성 단백질의 발현을 매우 촉진시키고 수초 형성을 촉진시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있었다. 3, it was confirmed that when the coenzyme Q10 was treated, the myelin-forming protein was expressed three days earlier than the co-culture without coenzyme Q10 treatment (FIG. 2). Specifically, in Fig. 3, the expression of the herbicide-forming protein was observed at 7 days after the co-culture, whereas in Fig. 2, the herbicidal protein was expressed at 10 days after the co-culture. In addition, when the coenzyme Q10 was treated and confirmed on the next day, the co-cultivation was confirmed on the 7th day, the expression of the herbicide-forming protein was immediately observed, confirming that coenzyme Q10 greatly promoted the expression of the herbicidal protein and promoted the formation of herbicide I could.
도 5에 따르면 상기 내용과 마찬가지로 코엔자임 Q10을 처리하는 경우에 수초 형성 단백질의 발현이 배양 7일째에 확인되어 가장 빨리 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 결과는 ALS 치료제인 릴루졸에 비하여 더 빠르게 이루어진 것으로서 코엔자임 Q10이 릴루졸에 비하여 수초 형성 단백질의 생성을 더 빠르게 촉진한다는 점을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 5, when the coenzyme Q10 was treated, expression of a herpes zoster protein was confirmed on the 7th day of culturing, and it was confirmed to be the fastest. In addition, this result was faster than that of the ALS therapeutic, and it was confirmed that coenzyme Q10 accelerates the production of a plant-forming protein more rapidly than that of riluzole.
따라서, 이러한 결과를 통해 코엔자임 Q10이 수초 형성 단백질의 발현을 촉진시키는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 생체외 조건에서 신경세포의 배양을 촉진하고, 신경세포 수초의 형성을 촉진하는 효과를 나타낸다는 점을 확인할 수 있다. Accordingly, it can be confirmed that coenzyme Q10 promotes the expression of a herbicidal protein through these results, and the composition according to one aspect of the present invention promotes cultivation of neuron cells in vitro and promotes the formation of aqueduct The results are shown in Fig.
[시험예 3] 코엔자임 Q10의 첨가시 MPB 단백질의 발현 확인 [Test Example 3] Expression of MPB protein upon addition of coenzyme Q10
코엔자임 Q10을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 수초 생성 전 시반세포(Pre-myelinating Schwann cell)와 수초를 생성하는 시반세포(Myelinating Schwan cell)의 MBP 발현 정도를 배양 기간에 따라 확인하는 것을 통하여 코엔자임 Q10이 신경세포의 배양을 촉진하고 수초 형성을 촉진하는 효과를 가진다는 점을 확인하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다. The expression levels of MBP in pre-myelinating Schwann cells and myelinating Schwan cells in coelzyme Q10 treated and untreated were determined by incubation period. The following experiment was conducted to confirm that coenzyme Q10 has the effect of promoting the cultivation of neurons and promoting the formation of aquatic plants.
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 대조군으로서 코엔자임 Q10을 처리하지 않은 공동배양 샘플과, 코엔자임 Q10과 양성대조군으로서 ALS치료제로서 알려진 릴루졸(riluzole)을 공동배양 6일째부터 1μM씩 3일에 한번 간격으로 처리한 샘플을 마련하였다. 그런 뒤 배양 시점별로 세포를 MBP-항체(Abcam사)로 염색하고, 그 발현 양상을 20x 공초점 현미경을 이용하여 무작위로 각 샘플 당 6곳의 지역을 촬영하고 MBP가 발현된 세포의 개수를 측정하고, 수초 생성-전 시반세포(pre-myelinating Schwann cell)와 수초 생성 시반세포(myelinating Schwann cell)의 비율을 측정하였다. 이러한 결과를 도 4에 나타내었다. In the co-cultivation process according to Example 2, a co-cultured sample not treated with coenzyme Q10 as a control group and coenzyme Q10 and a riluzole known as an ALS therapeutic agent as a positive control were cultured for 3 days at a concentration of 1 [mu] A sample treated at one time interval was prepared. Then, the cells were stained with MBP-antibody (Abcam) at the time of culture, and the expression patterns thereof were randomly photographed at 6 sites per each sample using a 20x confocal microscope and the number of cells expressing MBP was measured , And the ratio of pre-myelinating Schwann cell to myelinating Schwann cell was measured. These results are shown in Fig.
도 4에 따르면 코엔자임 Q10을 처리한 경우에 가장 먼저 수초 생성-전 시반세포에서 수초 형성 단백질(MPB)이 발현되는 것을 정량적으로 확인할 수 있었다. 또한, 배양 후 14일이 경과한 뒤에도 코엔자임 Q10을 처리하게 되면 수초 형성 시반세포가 미처리 대조군 및 릴루졸 처리군에 비하여 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 코엔자임 Q10 처리군은 ALS 치료제로서 널리 알려진 릴루졸에 비하여도 수초 생성-전 시반세포에서 MPB가 먼저 발현되는 양상을 보이고 배양 14일째에도 수초 생성 시반세포의 비율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 일측면에 따른 코엔자임 Q10을 포함하는 조성물이 릴루졸에 비하여도 더 효과가 좋다는 점을 확인할 수 있다.4, quantification of the expression of myelin-forming protein (MPB) in the myelinogenesis-precursor cells was observed first when coenzyme Q10 was treated. In addition, it was confirmed that when coenzyme Q10 was treated 14 days after the cultivation, cells at the early stage of planting were remarkably higher than those in the untreated control and riluzole treated groups. In addition, the coenzyme Q10-treated group showed MPB expression in the myelin-preeclaminized cells earlier than the well-known riluzole as the ALS therapeutic agent, and the proportion of the myelin-producing cells was higher on the 14th day of culture. Thus, it can be confirmed that the composition containing coenzyme Q10 according to one aspect of the present invention is more effective than riluzole.
이러한 상기 실험결과에 따르면 코엔자임 Q10은 릴루졸에 비하여 운동 신경세포의 수초 형성을 더욱 현저하게 촉진하는 효과를 가진다는 점을 확인할 수 있고, 상기 실험예는 생체 내에서 운동 신경세포가 존재하는 상태와 유사한 것에 해당하므로 코엔자임 Q10은 생체 내에서도 운동 신경세포의 수초 형성을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 판단되며, 이에 따라 운동 신경세포질환의 치료, 개선 또는 예방하는 효과를 나타낼 것으로 판단된다.According to the above experimental results, it can be confirmed that coenzyme Q10 has an effect of promoting the formation of aqueduct neuron more remarkably than that of riluzole. Therefore, coenzyme Q10 is considered to be effective in promoting the formation of myelin cells in vivo. Accordingly, it is considered that coenzyme Q10 is effective for treating, improving or preventing motor neuron diseases.
이상으로 본 명세서의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 명세서의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 명세서의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific portions of the disclosure in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific embodiments are merely exemplary and are not intended to limit the scope of the disclosure. Accordingly, the actual scope of the disclosure will be defined by the appended claims and their equivalents.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 명세서를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Formulation examples of compositions according to one aspect of the invention are described below, but are also applicable to various other formulations, which are not intended to be limiting but rather to illustrate only specific details.
[제형예 1] 연질 캡슐[Formulation Example 1] Soft capsule
코엔자임Q10 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 혼합하여 연질 캡슐 충진액을 제조한다. 1 캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질 캡슐을 제조한다. 그리고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부, 글리세린 24 중량부 및 솔비톨액 10 중량부의 비율로 연질 캡슐 시트를 제조하고 상기 충진액을 충진시켜 본 명세서에 따른 조성물 400mg이 함유된 연질 캡슐을 제조한다. Coenzyme Q10 8 mg, vitamin E 9 mg, vitamin C 9 mg, palm oil 2 mg, vegetable hardening oil 8 mg, yellow 4 mg and lecithin 9 mg are mixed and mixed according to a conventional method to prepare a soft capsule filling liquid. 400 mg per capsule is filled to prepare a soft capsule. Separately from the above, a soft capsule sheet was prepared in a ratio of 66 parts by weight of gelatin, 24 parts by weight of glycerin and 10 parts by weight of sorbitol solution, and filled with the filling solution to prepare a soft capsule containing 400 mg of the composition according to the present invention.
[제형예 2] 정제[Formulation Example 2] Tablets
코엔자임Q10 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가한다. 이들 조성물 500mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.Coenzyme Q10 8 mg, vitamin E 9 mg, vitamin C 9 mg, galactooligosaccharide 200 mg, lactose 60 mg and maltose 140 mg are mixed, granulated using a fluid bed drier, and 6 mg sugar ester is added. 500 mg of these compositions are tabletted by conventional methods to prepare tablets.
[제형예 3] 드링크제[Formulation Example 3] Drinking agent
코엔자임Q10 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되도록 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5초간 살균하여 드링크제를 제조한다.Coenzyme Q10 8mg, Vitamin E 9mg, Vitamin C 9mg, glucose 10g, citric acid 0.6g, and liquid oligosaccharide 25g are mixed and 300ml of purified water is added to each bottle to fill 200ml each bottle. It is filled in a bottle and sterilized at 130 ° C for 4 to 5 seconds to prepare a drink.
[제형예 4] 과립제[Formulation Example 4]
코엔자임Q10 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250㎎ 및 전분 550㎎을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.Coenzyme Q10 8mg, Vitamin E 9mg, Vitamin C 9mg, anhydrous crystalline glucose 250mg and starch 550mg are mixed and formed into granules by using a fluidized bed granulator and filled into a capsule to prepare a granule.
[제형예 5] 주사제[Formulation Example 5]
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조하였다.Injections were prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 1 below.
[제형예 6] 건강기능식품[Formulation Example 6] Health functional food
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강기능식품을 제조하였다.Health functional foods were prepared according to the conventional methods according to the compositions shown in Table 2 below.
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is comparatively mixed with a component suitable for a health functional food as a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified.
[제형예 7] 건강 음료[Formulation Example 7] Health drinks
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강음료를 제조하였다.Health drinks were prepared according to the compositions shown in Table 3 below in a conventional manner.
통상의 건강 음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균한다.The above components are mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture is stirred and heated at 85 DEG C for about 1 hour, and then the solution is sterilized by filtration.
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- 2015-10-15 KR KR1020150143905A patent/KR101695429B1/en active IP Right Grant
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