KR101694585B1 - 다공성 산화철 담체에 메탄 산화세균의 고정화 및 이의 응용 - Google Patents
다공성 산화철 담체에 메탄 산화세균의 고정화 및 이의 응용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다공성 Fe2O3 고정화 담체의 다공성 공간에 많은 세포를 고정화 할 수 있는 방법으로, 본 발명에 의하면 담체의 다공성 표면에 세포가 도포됨과 동시에 글루타알데히드에 의해 세포 고정화가 진행된다. 따라서 고정화 효율이 우수할 뿐 아니라 세포가 고농도로 고정화되어도 세포의 활성이 높게 유지되므로, 간단한 공정으로 고정화 효율 및 세포 활성이 높은 생물반응기를 제작할 수 있고, 이와 같이 고정화된 메탄 산화세균을 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생산하였다.
Description
본 발명은 다공성 Fe2O3 고정화 담체 안쪽 다공성 표면에 메탄산화 세균을 고정화하고 이를 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
동물세포, 식물세포, 미생물 및 효소 등의 생물학적 활성을 이용하기 위한 방법의 일환으로 이들을 고정화하는 방법이 개발되어 왔다 (Birnbaum, S., et al., FEBS Letters, 122, 393-404, 1981; 및 Brodelius, P., et al., FEBS Letters, 122, 312-319, 1980). 일반적으로 이러한 고정화에는 알긴산, 키토산, 폴리비닐알콜, 콜라젠, 카복시메틸셀룰로스, 아가, 아가로스, 젤라틴 등과 같은 합성 및 천연 고분자가 널리 사용되고 있다 (Lambert, F., et al., BioChem. Biophys. Acta., 759,81-88, 1983). 이와 같은 고분자를 이용하는 방법으로는 통상적으로 알긴산 용액에 세포를 혼합하고 이를 염화칼슘 용액과 같은 2가 양이온 용액에 방울로 떨어뜨림으로서 비드 형상의 젤("젤 비드") 형태로 고정화하는 방법이 가장 널리 사용되고 있다 (D. Serp, et al., Biotechnology and Bioengineering, 70(1), 41-53, 2000). 이러한 방법에서 가교 역할을 하는 양이온을 달리하거나 알긴산 젤 비드의 표면을 폴리라이신 또는 키토산과 같은 양이온 고분자로 코팅하여 강도나 안정성을 높이는 등 다양한 응용 방법이 보고되어 있다(Lishan Wang, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 90(8), 1134-1142, 2001). 그러나, 이러한 젤 비드 형태의 고정화에서 형성되는 구형 비드는 일반적으로 직경이 500 ㎛ 이상이므로 세포의 농도가 높은 경우에는 젤 비드의 중심부에서 산소나 영양분의 고갈로 인한 세포 괴사가 종종 발생한다(Schrezenmeir J., et al., Transplantation, 57(9), 1308-14, 1994). 이러한 문제는 젤 비드의 크기를 줄임으로써 어느 정도 해소할 수 있으나, 일반적인 액적 형성 방법으로는 직경 500 ㎛ 이하의 크기를 가지는 젤 비드를 제조하기 어려우며 작은 크기의 젤 비드 제조과정에서 세포 손상이 많이 발생하게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 셀라이트, 세라믹, 활성탄과 같은 다공성 무기물 담체류에 세포현탁액을 혼합시켜 담체의 공극 안으로 세포를 침투시키고, 이를 알긴산, 키토산, 폴리비닐알콜과 같은 유기 고분자류에 담가 담체 표면에 막을 형성한 다음, 다시 가교용액으로 처리하여 젤 막을 형성하는 세포 고정화 방법(대한민국 특허공개 제1999-021170호)이나, 이러한 무기물 담체 대신 성형성 및 기계적 물성이 우수한 플라스틱 폴리머를 사용하여 알긴산 필름을 형성시키는 방법(대한민국 특허공개 제2003-0026943호) 등이 연구되어 왔다. 그러나, 상기 방법들은 세포 침투 후 고분자 용액 처리 및 젤 형성 공정을 수행하기 때문에 담체 표면에 고른 막을 형성하기 어려워 고정화 효율이 떨어지며, 세포의 활성 및 분포도 일정치 않아 이로 인해 여러 가지 문제점이 발생될 수 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 간단한 공정으로 고정화 담체 안 다공성 공간에 많은 세포가 고정화될 수 있고 세포에 대한 산소 및 영양분 전달 환경이 매우 우수하여 고정화된 세포의 활성을 높게 할 수 있는 공정을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다공성 Fe2O3 고정화 담체에 미생물을 고정화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 메탄 산화세균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 고정화 방법에 의하여 고정화된 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 고정화된 미생물을 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 수용액을 함유할 수 있는 macro-porous Fe2O3 고정화 담체 표면에 메탄산화 세균을 고정화하고 이를 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로는 macro-porous Fe2O3 담체를 이용하여 메탄산화 세균을 고정화하여 연속적으로 메탄올을 생산하는 공정을 제시하는 것이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 세포 고정화 방법을 이용하면 macro-porous Fe2O3의 300-400 μm의 다공성 공간에 많은 세포가 고정화될 수 있고 세포에 대한 산소 및 영양분 전달 환경이 매우 우수하여 고정화된 세포의 활성이 높게 유지된다. 따라서 본 발명의 방법으로 세포가 고정된 담체는 다양한 용도의 세포 고정화 반응기에 응용될 수 있다. 본 발명에서는 macro-porous Fe2O3 담체를 이용하여 메탄산화 세균을 고정화 하여 연속적으로 메탄올을 생산하는 공정을 제시한다.
도 1은 시간에 따른 상대적 메탄올 생산율. ●는 순수 메탄 산화 세균, ○는 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균, ▼는 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균.
도 2는 고정화한 효소를 이용하여 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율. ○는 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균, ●는 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균의 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율.
도 2는 고정화한 효소를 이용하여 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율. ○는 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균, ●는 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균의 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율.
이하, 본 발명을 하기의 비한정적인 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
분무열분해
공정에 의한
macro
-
porous
Fe
2
O
3
구조체의 합성
증류수에 Fumed Fe2O3를 분산시킨 뒤에 분무건조 장치의 노즐을 통해 액적을 반응기로 분사시키면, 액적이 건조되고, 나노크기의 입자가 응집되어 macro-porous Fe2O3 나노구조체를 형성한다. 이러한 과정을 통해 수십 마이크론 크기의 나노구조체가 형성되며, 다음은 해당 나노구조체 합성의 자세한 조건을 나타낸다.
- 용액 제조 : 증류수에 Fumed Fe2O3를 분산시킴
- 제조 조건 : 반응기 입구온도 400˚C, 출구온도 100˚C, 노즐 압력 2 bar
- 사용 시약 : Fumed Fe2O3 (100 m2/g)
- 콜로이드 용액의 농도 : 0.5 M
실시예
2: 메탄 산화 세균의 배양
120 ml의 NMS 배지 (pH 7)에 Methylosinus sporium 균주를 30℃, 150 rpm에서 12일간 배양한다. 배양액을 4℃, 4000rpm에서 30분간 원심분리한다. 세포 침전물을 10 ml의 potassium phosphate buffer (20 mM)로 두 번 세척한다.
실시예
3: 실리카겔을 이용한 세포 고정화
수용성 액체인 sodium silicate (27 wt% SiO2, 10 wt% NaOH) 4 ml과 LUDOX HS-40 colloidal silica 40 wt% 수용성 suspension (시그마-알드리치사 제품) 4 ml을 섞고 pH 7에 맞춘다. 만들어진 혼합액에 2 ml의 Methylosinus sporium (50 mg of dry cell mass)을 넣은 후 천천히 교반하여 균질화 한다. 25℃에서 2분간 gel을 형성시킨다.
실시예
4:
macro
-
porous
Fe
2
O
3
구조체를 이용한 세포 고정화
Phosphate buffer 존재 하에 Methylosinus sporium (20 mg of dry cell mass) 2 ml과 200 mg의 macro-porous Fe2O3 구조체, 0.05 M glutaraldehyde를 최종 부피가 10 ml이 되도록 섞은 후 150rpm, 25℃에서 4시간 동안 교반한다. 고정화된 세포는 4000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리한 후 5 ml의 potassium phosphate buffer (20 mM)로 두 번 세척한다.
실시예
5: 메탄올 생합성
120 ml serum 병에 순수 메탄산화 세균과 고정화한 메탄산화세균 40 mg dry cell mass를 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 5 mM MgCl2이 포함된 20 ml NMS 배지에 넣고 150rpm, 30℃ 조건에서 48시간 배양한다. 반응 초기에 메탄은 10 ㎖를 주입하였으며, 합성된 메탄올 양은 가스크로마토그래피로 측정하였다. 사용한 컬럼은 FID detector가 연결된 HP-5 polyethylene glycol (Agilent 19091J-413) column을 사용하였다. 컬럼 온도는 250℃, 주입기의 온도는 220℃, 검출기 온도는 250℃이었다. 운반기체는 헬륨를 사용하였으며, 유출속도는 25 ㎖/min으로 하여 메탄올 생합성량을 측정하였다.
실시예
6: 고정화 세포를 이용한 시간대별 메탄올 생산
실시예 3, 4와 같이 고정화한 효소를 이용하여 메탄을 반응시켜 시간에 따른 세포에 의해 생성되는 상대적인 메탄올 생산율을 측정하였다. 생산시간은 96 시간까지 확인하였다. 도 1에서 ●는 순수 메탄 산화 세균, ○는 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균, ▼는 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균에서 생성되는 상대적 메탄올 생성율을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화세균이 가장 상대적 메탄올 생산율이 높았다. 메탄올 생산양은 각각 free 메탄 산화세균이 445 μM, 실리카겔에 고정화 된 메탄 산화세균이 120μM , macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄 산화세균이 430 μM의 메탄올을 생산하였다.
실시예
7: 고정화한
메탄산화
세균의 재생산성
실시예 5와 같이 고정화한 효소를 이용하여 메탄을 반응시키고 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율을 측정하였다. 도 2에서 ○는 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균, ●는 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균의 조업 횟수에 따른 상대적 메탄올 생산율 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 조업 횟수가 6회 도달했을 경우 실리카겔에 고정화된 메탄 산화 세균에서 생성된 상대적 메탄올 생산율은 32.5%인데 비하여 macro-porous Fe2O3 구조체에 고정화된 메탄산화 세균에서 생성된 상대적 메탄올 생산율은 66.8% 였다.
Claims (5)
- a)물에 훔드(Fumed) Fe2O3를 분산시킨 뒤에 분무건조 장치를 통해 액적을 100 내지 400℃의 반응기로 분사시켜, 다공성 Fe2O3 나노구조체를 제조하는 단계: 및
b)상기 다공성 Fe2O3 고정화 담체에 미생물을 고정화하는 단계를 포함하는 다공성 Fe2O3 고정화 담체에 미생물을 고정화하는 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 메탄 산화세균인 것을 특징으로 하는 방법.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140114493A KR101694585B1 (ko) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 다공성 산화철 담체에 메탄 산화세균의 고정화 및 이의 응용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140114493A KR101694585B1 (ko) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 다공성 산화철 담체에 메탄 산화세균의 고정화 및 이의 응용 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160026288A KR20160026288A (ko) | 2016-03-09 |
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| KR1020140114493A KR101694585B1 (ko) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 다공성 산화철 담체에 메탄 산화세균의 고정화 및 이의 응용 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102091313B1 (ko) * | 2018-01-30 | 2020-03-19 | 건국대학교 산학협력단 | 메탄산화세균 고정화를 위한 매크로 다공성 지지체 및 이를 이용한 메탄올 생산방법 |
-
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- 2014-08-29 KR KR1020140114493A patent/KR101694585B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FEMS Microbiology Letters, Vol. 78, pp. 103-108 (1991.)* |
| J Am Chem Soc., Vol. 125, No. 7, pp. 1684-1685 (2003.02.19.)* |
| Nano Energy, Vol. 3, pp. 26-35 (2014.01.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160026288A (ko) | 2016-03-09 |
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