KR101690284B1 - Recombinant Strain Containing Truncated Tup1, and Composition for Alcohol-Producing Containing the Same - Google Patents

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Abstract

알코올 발효 균주로서 갈락토오스 대사능을 증대시키는 폴리펩티드 및 알코올 내성 폴리펩티드가 동시에 과발현되거나, 호흡결손 변이된 재조합 균주를 제공한다. 이와 같은 균주를 이용하는 경우 갈락토오스 대사능 및 알코올 내성이 향상되어 알코올 생산성이 우수하므로 산업적으로 유용하다. The present invention provides a recombinant strain in which an alcohol fermentation strain simultaneously overexpresses a polypeptide that increases galactose metabolic activity and an alcohol resistance polypeptide, or a mutation in respiratory defects. When such a strain is used, galactose metabolism and alcohol tolerance are improved and the alcohol productivity is excellent, which is industrially useful.

Description

유실된 Ｔｕｐ１ 폴리펩티드를 포함하는 재조합 균주 및 이를 포함하는 알코올 생산용 조성물 {Recombinant Strain Containing Truncated Tup1, and Composition for Alcohol-Producing Containing the Same}Technical Field [0001] The present invention relates to a recombinant strain comprising a Tup1 polypeptide and a composition for producing an alcohol containing the Tup1 polypeptide,

유실된 Tup1 폴리펩티드를 포함하는 재조합 균주, 및 이를 포함하는 알코올 생산용 조성물에 관한 것이다.
A recombinant strain comprising a deficient Tup1 polypeptide, and a composition for producing alcohol containing the same.

전세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가함에 따라 안정적이고 지속적으로 에너지를 생산하는 신재생 대체에너지 개념이 화두가 되고 있다. 그러한 대체에너지 개발의 일환으로 바이오매스 자원으로부터 알코올을 생산하는 기술이 주목을 받고 있다. As the global exhaustion of fossil fuels and concerns about environmental pollution increase, the concept of renewable and alternative energy that produces stable and sustainable energy is becoming a hot topic. Techniques for producing alcohol from biomass resources are attracting attention as part of such alternative energy development.

현재 사탕수수 등의 당질계, 옥수수 등의 전분계를 이용한 제 1 세대 알코올이 생산되고 있으나, 이는 식품 및 가축 사료와의 경쟁, 재배 면적의 포화 등 많은 문제에 봉착되어 있다. 이에, 지구상에서 가장 풍부하고 고갈 없이 재생이 가능한 자원으로 대표되는 목질자원 리그노셀룰로오스(lignocelluloses)를 이용한 제 2 세대 알코올이 개발 중에 있다. First-generation alcohols such as sugar cane and sugar starch, such as corn, have been produced. However, this has led to many problems such as competition with food and livestock feed, saturation of cultivation area, and the like. Accordingly, a second-generation alcohol using lignocelluloses, which is the most abundant and reproducible resource on the planet, is under development.

최근에는 해조류(algae)를 이용한 알코올의 개발이 진행 중에 있다. 해조류는 성장속도가 빠르고, 광범위한 지역에서 재배가 용이하며, 이산화탄소 흡수 능력이 높기 때문에 효과적으로 이산화탄소를 고정화할 수 있어서 새로운 에너지 자원으로서 적절한 것으로 기대된다. 또한, 해조류는 리그닌에 비해 치밀하지 않은 조직을 가지므로 제 1 세대, 제 2 세대 알코올에 사용되는 바이오매스에 비해 상대적으로 당화가 용이하며, 생산량도 매우 방대하다는 장점이 있다. 또한, 상대적으로 풍부한 해양자원을 활용할 수 있어 대단한 잠재력을 가지고 있다.
In recent years, the development of alcohols using algae is underway. Seaweeds are expected to be suitable as new energy sources because they have a high growth rate, are easy to cultivate in a wide area, and can absorb carbon dioxide effectively because of their high ability to absorb carbon dioxide. In addition, seaweeds are less dense than lignin, so they are easier to saccharify compared to biomass used in first- and second-generation alcohols, and the yield is very large. It also has great potential to utilize relatively abundant marine resources.

자연계에 존재하는 효모의 경우, 갈락토오스를 대사하기는 하지만, 그 대사 속도는 글루코오스에 비해 현저히 작기 때문에 실용화에 한계가 있다. 또한, 알코올 내성이 낮아 고농도 알코올 존재 하에서는 생산성이 현저히 저하된다. In the case of yeast existing in nature, although galactose is metabolized, its metabolic rate is significantly smaller than that of glucose, so that practical use is limited. In addition, the alcohol resistance is low, and productivity is significantly lowered in the presence of a high concentration alcohol.

이에 고농도의 갈락토스, 포도당 혼합당 조건에서 높은 에탄올 수율 및 생산성을 갖는 재조합 균주를 제공하고자 한다. Therefore, it is intended to provide a recombinant strain having high ethanol yield and productivity under conditions of high concentration of galactose and glucose mixed sugar.

본 발명의 일 측면에 따르면, 갈락토오스의 대사능을 증진시킬 수 있는 폴리펩티드 및 알코올 저항성을 증대시킬 수 있는 폴리펩티드가 과발현된 재조합 균주에 관한 것이다. According to one aspect of the present invention, there is provided a recombinant strain in which a polypeptide capable of promoting the metabolic activity of galactose and a polypeptide capable of increasing alcohol resistance are overexpressed.

일 예에서, 상기 재조합 균주는 (i) 전사억제인자(transcriptional repressor)인 Tup1으로부터 발현억제 도메인의 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드, 및 (ii) 알코올 내성을 증가시키는 Ino1이 발현된 제2 폴리펩티드가 동시 과발현된 재조합 균주일 수 있다. In one example, the recombinant strain comprises (i) a first polypeptide in which the function of the expression suppression domain is deficient from Tup1, a transcriptional repressor, and (ii) a second polypeptide in which Ino1 is expressed that increases alcohol resistance Which may be simultaneously overexpressed recombinant strains.

상기 제1 폴리펩티드는 서열번호 1로 나타난 아미노산 서열 중 위치 288 ~ 389 번째 아미노산의 1 또는 복수개가 치환, 삽입, 부가 또는 유실된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. The first polypeptide may consist of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids at positions 288 to 389 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted, inserted, added or deleted.

예를 들어, 발현억제 도메인인 카르복실 말단 도메인이 유실된 Tup1 폴리펩티드(이하, 'truncated Tup1' 또는 '유실된 Tup1'으로 약칭함) 일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 서열번호 3으로 나타난 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. For example, the Tup1 polypeptide (hereinafter abbreviated as 'truncated Tup1' or 'lost Tup1') may be a carboxyl terminal domain that is an expression suppressing domain. Such a polypeptide may have 90% or more sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

상기 제2 폴리펩티드는 알코올 내성 폴리펩티드로서 서열번호 2로 나타난 아미노산 서열과 70% 이상의 서열상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 Ino1이 발현된 폴리펩티드 수 있다. The second polypeptide may be an alcohol-resistant polypeptide consisting of an amino acid sequence having 70% or more sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. For example, a polypeptide in which Ino1 derived from Saccharomyces cerevisiae is expressed can be used.

상기 제1, 제2 폴리펩티드는 멀티카피 플라스미드에 도입된 상태로 형질전환(co-transformation) 시켜 동시-과발현될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 폴리펩티드는 도 1에 기재된 개열지도를 갖는 벡터에 도입되고, 상기 제2 폴리펩티드는 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 벡터에 도입되어 동시 과발현될 수 있다. The first and second polypeptides can be co-transduced into a state introduced into a multicopy plasmid to be co-overexpressed. For example, the first polypeptide may be introduced into a vector having a cleavage map as shown in Fig. 1, and the second polypeptide may be introduced into a vector having a cleavage map as shown in Fig. 2 and simultaneously overexpressed.

상기 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있다. The strain may be Saccharomyces cerevisiae .

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전사억제인자인 Tup1으로부터 발현억제 도메인의 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드가 과발현되고 호흡결손 변이가 유도된 재조합 균주를 제공하고자 한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant strain in which a first polypeptide deficient in the function of an expression suppression domain is overexpressed and a respiratory defect mutation is induced from Tup1, a transcription inhibitory factor.

일 예에 따르면, 서열번호 1로 나타난 아미노산 서열 중 위치 288 ~ 389 번째 아미노산의 1 또는 복수 개가 치환, 삽입, 부가 또는 유실된 아미노산 서열로 이루어지고, 발현억제도메인의 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드가 과발현되고 호흡유실 변이된 재조합 균주이다.According to one example, a first polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids at position 288 to 389 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted, inserted, added, or deleted and the function of the expression- Overexpressed and respiratory deficient mutant strains.

상기 재조합 균주에는 제1 폴리펩티드 이외에도 서열번호 2로 나타난 염기서열과 70% 이상의 서열상동성을 갖는 염기서열로 이루어지고, 알코올 내성을 증가시키는 Ino1인 제2 폴리펩티드가 더욱 과발현될 수 있다. In addition to the first polypeptide, the recombinant strain may further overexpress a second polypeptide, which is a Ino1 second polypeptide comprising a nucleotide sequence having 70% or more sequence homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and which increases alcohol resistance.

상기 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있다. The strain may be Saccharomyces cerevisiae .

본 발명의 또 다른 측면은 상기 재조합 균주를 포함하는 알코올 생산용 조성물 및 이를 이용한 알코올의 생산 방법이다.
Another aspect of the present invention is a composition for producing alcohol containing the recombinant strain and a method for producing alcohol using the same.

도 1은 제조된 pRS424 Truncated Tup1 벡터의 개열지도이다;
도 2는 제조된 pRS426GPD Ino1 벡터의 개열지도이다;
도 3 내지 도 6은 혼합당(2% 글루코오스 2% 갈락토오스)조건에서 낮은 셀 농도의 균주 배양시 발효능을 나타낸 그래프이다 (도 3; 대조군 효모, 도 4; Ino1 과발현 효모, 도 5; truncated Tup1 과발현 효모, 도 6; truncated Tup1 및 Ino1 과발현 효모);
도 7 및 8은 혼합당 (2% 글루코오스 2% 갈락토오스) 조건에서 호흡저해 변이 균주 배양시 발효능을 나타낸 그래프이다 (도 7은 셀 농도를 나타내고, 도 8은 에탄올 생산량을 나타낸다)
도 9 내지 12는 혼합당 (2% 글루코오스 2% 갈락토오스) 조건에서 낮은 셀 농도의 호흡저해 변이 균주와 일반 균주의 발효능을 나타낸 그래프이다(도 9; 대조군 효모, 도 10; 호흡저해 변이된 대조군 효모, 도 11; truncated Tup1 과발현 효모, 도 12; 호흡저해 변이된 truncated Tup1 과발현 효모);
서열번호의 간단한 설명
서열번호 1: 사카로마이세스 세레비시애 유래의 TUP1의 아미노산 서열이다;
서열번호 2: 사카로마이세스 세레비시애 유래의 Ino1 의 아미노산 서열이다;
서열번호 3: TUP1에서 카르복실 말단 도메인이 유실된 TUP1의 아미노산 서열이다; Figure 1 is a cleavage map of the pRS424 Truncated Tup1 vector produced;
Figure 2 is a cleavage map of the pRS426GPD Ino1 vector produced;
3 to 6 are graphs showing the efficacy of a strain cultured at a low cell concentration under mixed glucose (2% glucose 2% galactose) (FIG. 3: control yeast, FIG. 4: Ino1 overexpressing yeast, FIG. 5: truncated Tup1 Overexpressing yeast, Figure 6: truncated Tupl and Ino1 overexpressing yeast);
7 and 8 are graphs showing the efficacy of culturing the respiratory-inhibitory mutant strains under mixed glucose (2% glucose 2% galactose) (FIG. 7 shows the cell concentration and FIG. 8 shows the ethanol production)
9 to 12 are graphs showing the efficacy of a low cell concentration respiratory inhibition mutant strain and a general strain under mixed glucose (2% glucose 2% galactose) (Fig. 9: control yeast, Fig. 10: control group with respiratory inhibition mutation Yeast, Figure 11, truncated Tup1 overexpressing yeast, Figure 12: truncated Tup1 overexpressing yeast with respiratory inhibition mutation);
Brief description of sequence number
SEQ ID NO: 1: amino acid sequence of TUP1 derived from Saccharomyces cerevisiae;
SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of Ino1 derived from Saccharomyces cerevisiae;
SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of TUP1 in which the carboxyl terminal domain is deleted in TUP1;

이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 실시예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 실시예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다. Hereinafter, advantages and features of the present invention and methods of performing the same will be more readily understood by reference to the following detailed description of the embodiments and the accompanying drawings. However, it should be understood that the present invention may be embodied in many other specific forms without departing from the spirit or scope of the invention.

또한, 본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 성분, 반응 조건 등의 수치을 나타내는 모든 숫자는 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명의 목적하는 바에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. It is also to be understood that all numbers expressing numerical values of the components, reaction conditions, etc. used in the specification and claims of the present invention can be modified. Accordingly, unless indicated to the contrary, the numerical parameters set forth in the specification and the appended claims are approximations that may vary depending on the purview of the present invention.

본 발명에서 사용된 용어는 별도의 언급이 없다면 하기와 같은 의미를 갖는다. 또한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에서 별도의 언급이 없다면 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. The terms used in the present invention have the following meanings unless otherwise specified. Also, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise stated herein.

용어 '바이오매스'는 에탄올, 탄화수소류, 가솔린, 천연 가스, 메테인, 바이오디젤 및 수소 가스 등의 에너지, 전기, 플라스틱, 중합체, 영양분(인간 및 동물), 폴리펩티드, 생체분자, 약제(인간 및 가축), 비료 혹은 기타 산물을 생산하는 생산 시스템에서 이용될 수 있는 유기성분의 임의의 재료 혹은 이들 재료의 조합을 의미한다. The term 'biomass' is used to encompass energy such as ethanol, hydrocarbons, gasoline, natural gas, methane, biodiesel and hydrogen gas, electricity, plastics, polymers, nutrients (humans and animals), polypeptides, biomolecules, Means any material of organic constituents, or a combination of these materials, that can be used in a production system that produces fertilizers or other products.

용어 '리그노셀룰로오스계 바이오매스' 는 사실상 환경 친화적 기준에서 에너지에 이용 가능한 소정의 식물 유래의 유기물(목재 혹은 비목재)을 의미한다. 예를 들어, 옥수수 여물, 밀짚, 볏짚, 사탕수수 바가스 등의 농작물 폐기물 및 잔류물을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 나무, 목재 에너지 작물, 목재 폐기물 및 잔류물, 예컨대 침엽수림 솎아낸 것, 나무껍질 폐기물, 톱밥, 종이/펄프 산업 폐증기, 목재 섬유 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 지팽이풀 등의 목초류, 정원 쓰레기(예컨대, 잔디 깎은 것, 낙엽, 나무 깎은 것 및 덤불), 야채 처리 폐기물 등을 들 수 있다. 셀룰로오스 공급원료는 소정 유형의 식물 바이오매스, 예컨대, 비목재 식물 바이오매스, 경작물, 목초, 설탕 가공 잔류물, 농업 잔류물, 예를 들어, 콩 여물, 옥수수 여물, 볏짚, 왕겨, 보리짚, 옥수수 속대, 밀짚, 캐놀라짚, 볏짚, 귀리짚, 귀리껍질, 옥수수 섬유, 재활용 목재 펄프 섬유, 톱밥, 경목, 침엽수, 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 셀룰로스 폐재료, 신문용지, 보드지, 톱밥 등을 들 수 있다.The term " lignocellulosic biomass " refers to any plant-derived organic material (wood or non-wood) that is available for energy on a substantially environmentally friendly basis. But are not limited to, crop wastes and residues such as, for example, corn tillage, straw, rice straw, sugarcane bargain, and the like. Also included are, but are not limited to, wood, wood energy crops, wood waste and residues such as coniferous trees, bark waste, sawdust, paper / pulp industry waste steam, wood fibers and the like. Also, grasses such as persimmon grasses, garden garbage (for example, lawn mowers, fallen leaves, shrubs and bushes), and vegetable-treated wastes. The cellulose feedstock may be selected from the group consisting of certain types of plant biomass such as non-timber plant biomass, crops, grasses, sugar processing residues, agricultural residues such as soybean tallow, corn tiller, rice straw, Corn fiber, recycled wood pulp fiber, sawdust, hardwood, conifer, or a combination thereof. ≪ Desc / Clms Page number 2 > Further, cellulose waste materials, newsprint paper, cardboard paper, sawdust, and the like can be mentioned.

용어 '서열상동성'은 서열을 비교하여 측정되는 2 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 이상의 폴리펩티드 서열 간의 관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 각각 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 지칭한다. 2 이상의 서열의 동일성 및 유사성의 비교 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP와 같은 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1 (Wisconsin Sequence Analysis package, version 9.1; Devereux J etal, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, 미국 위스콘신주 매디슨 소재 제네틱스 컴퓨터 그룹으로부터 입수가능)을 사용하여 2개의 폴리펩티드 간의 %동일성 및 2개의 폴리펩티드 서열 간의 %동일성 및 %유사성을 측정할 수 있다. 또 다른 서열 간의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 프로그램으로는, BLAST 프로그램 패밀리 (Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재 National Center for Biotechnology Information(NCBI)로부터 입수가능하고 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통하여 접근가능함) 및 FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 19988, 위스콘신 서열 분석 팩키지의 일부로 입수가능함)를 들 수 있다. The term " sequence homology " reflects the relationship between two or more polypeptide sequences or two or more polypeptide sequences measured by comparing the sequences. In general, identity refers to the exact nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid match of two polypeptides or two polypeptide sequences, respectively, over the length of the sequence being compared. Methods for comparing the identity and similarity of two or more sequences are known in the art. For example, from the Wisconsin Sequence Analysis package, version 9.1 (Devereux J etal, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, Genetics Computer Group, Madison, Wis., USA), such as the programs BESTFIT and GAP Can be used to determine% identity between two polypeptides and% identity and% similarity between two polypeptide sequences. Programs for measuring identity and / or similarity between sequences include the BLAST program family (Altschul SF et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul SF et al., Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997, available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Md., And accessible via the NCBI homepage at www.ncbi.nlm.nih.gov) and FASTA (Pearson WR, Methods in Enzymology , 183, 63-99, 1990, Pearson WR and Lipman DJ, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 19988, Wisconsin sequence analysis package).

용어 '알코올 내성이 증가'한다는 것은 호스트셀의 알코올에 대한 저항성이 증가했다는 것을 의미한다. 알코올 내성 증가는 MIC (Minimum Inhibitory Concentration)에서 셀 성장률, 최종 셀농도, 레그 시간(lag time)의 감소율을 야생형 셀 또는 대조군 셀(공벡터(empty vector)로 변형된 개체)과 비교하여 관찰될 수 있다.
The term " increased alcohol tolerance " means that the resistance of the host cell to alcohol is increased. Increased alcohol tolerance can be observed by comparing the rate of decrease in cell growth rate, final cell concentration, and lag time in the MIC (Minimum Inhibitory Concentration) with wild type or control cells (those transformed into empty vectors) have.

재조합 균주Recombinant strain

해조류 바이오매스 등 다수의 탄소원에는 다당류로서 글루코오스 외에도 갈락토오스를 포함하고 있다. 그러나, 효모 등의 발효 미생물은 갈락토오스의 대사 이용성이 낮기 때문에 대부분의 갈락토오스가 활용되지 못하고 폐기되고 있는 실정이다. 따라서, 글루코오스, 갈락토오스 등을 모두 함유하는 혼합당의 효과적인 발효를 위해서는 갈락토오스의 대사 이용성을 증가시킬 필요가 있다. Many carbon sources such as seaweed biomass include galactose as a polysaccharide in addition to glucose. However, the fermentation microorganisms such as yeast are low in the metabolism availability of galactose, so that most of the galactose is disused and disused. Therefore, it is necessary to increase the metabolic availability of galactose for effective fermentation of mixed sugars containing both glucose and galactose.

또한, 일반적인 발효 미생물은 낮은 수준의 알코올 내성을 가지므로 알코올의 농도가 높아지면 미생물은 스스로 생산한 알코올에 의해 손상을 받게 되고, 알코올의 농도가 15%를 넘으면 사멸하게 될 수도 있다. 따라서, 알코올 내성이 우수한 발효 균주를 개발할 필요가 있다.
In addition, since general fermenting microorganisms have a low level of alcohol tolerance, when the concentration of alcohol is high, the microorganism is damaged by self-produced alcohol, and if the concentration of alcohol exceeds 15%, the microorganism may die. Therefore, it is necessary to develop a fermentation strain having excellent alcohol resistance.

동시 과발현된 재조합 균주Simultaneously overexpressed recombinant strains

본 발명의 일 실시예에 따르면 갈락토오스 대사능 증대 폴리펩티드 및 알코올 내성을 증가시키는 폴리펩티드가 동시 과발현된 재조합 균주를 제공한다. 상기 재조합 균주는 해조류 바이오매스, 유가공 부산물 등에서 다량 생산되는 갈락토오스를 글루코오스 혼합 존재에서도 빠르게 대사하여 에탄올로 전환할 수 있다. 구체적으로, 혼합당 배지로부터 에탄올 생산 공정에서 갈락토오스 대사능 증대 폴리펩티드 및 알코올내성 증진 폴리펩티드가 동시에 과발현된 재조합 균주를 이용하는 경우 글루코오스 소모 후 갈락토오스 이용 개시 이전에 생기는 지연 시간(lag time)의 감소와 갈락토오스 대사 폴리펩티드들의 발현을 활성화시켜 에탄올의 생산성을 향상시키는 결과를 유도할 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, a recombinant strain in which a galactose metabolic enhancing polypeptide and a polypeptide that increases alcohol tolerance are simultaneously overexpressed is provided. The recombinant strains can rapidly metabolize galactose, which is produced in large quantities in seaweed biomass, dairy products, and the like, even in the presence of glucose, and convert it to ethanol. Specifically, when a recombinant strain in which the galactose metabolism-enhancing polypeptide and the alcohol tolerance enhancing polypeptide are simultaneously overexpressed in the ethanol production process from the mixed sugar medium is used, the lag time before the start of galactose utilization after glucose consumption and the decrease of the galactose metabolism It is possible to activate the expression of the polypeptides and to improve the productivity of ethanol.

A. 갈락토오스 대사능 증대 폴리펩티드 (제1 폴리펩티드)A. Galactose Metabolism Enhancement Polypeptide (First Polypeptide)

상기 제1 폴리펩티드는 예를 들어, 갈락토오스 대사 폴리펩티드의 발현을 억제하는 전사억제인자(transcriptional repressor)로부터 발현억제 도메인의 기능이 흠결된 폴리펩티드다. 갈락토오스 대사 유전자의 발현이 억제되는 경우 갈락토오스의 대사 이용성이 낮아지게 된다. 이에, 갈락토오스 대사 유전자의 발현을 억제하는 전사억제인자가 제 기능을 수행하지 못하게 되면 상대적으로 갈락토오스 대사 이용성이 높아질 수 있다. The first polypeptide is, for example, a polypeptide deficient in the expression suppression domain from a transcriptional repressor that inhibits the expression of a galactose metabolism polypeptide. When the expression of the galactose metabolite gene is inhibited, the metabolic availability of galactose is lowered. Thus, if the transcriptional repressor that inhibits the expression of the galactose metabolite gene does not function, the galactose metabolism may be relatively increased.

상기 갈락토오스 대사 유전자는 예를 들어, gal2, gal1, gal7, gal10, gal5 (pgm1, pgm2) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전사억제인자의 예로는 Tup1, gal4, gal3, gal80, gal6, mig1, ssn6 등이 있다. Examples of the galactose metabolism gene include, but are not limited to, gal2, gal1, gal7, gal10, gal5 (pgm1, pgm2). Examples of the transcriptional repressor include Tup1, gal4, gal3, gal80, gal6, mig1, and ssn6.

일 예에서, 상기 전사억제인자는 Tup1이고, 여기서 발현억제도메인의 기능이 흠결된 것일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 서열번호 1로 나타난 아미노산 서열 중 위치 288 ~ 389 번째 아미노산의 1 또는 복수개가 치환, 삽입, 부가 또는 유실된 아미노산 서열로 이루어지고, 발현억제도메인의 기능이 흠결된 것일 수 있다. In one example, the transcription repressor is Tup1, wherein the function of the expression suppression domain is defective. Such a polypeptide may consist of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acid residues 288 to 389 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted, inserted, added or deleted, and the function of the expression suppression domain is deficient.

이와 관련하여, 본 출원인의 선출원인 한국 특허출원 제2008-0107277호에는 카르복실 말단이 유실된 truncated Tup1이 과발현된 균주가 개시되어 있으며, 상기 특허의 내용은 참조로서 여기에 합체된다. 여기에 개시된 truncated Tup1 폴리펩티드는 Tup1의 아미노산 서열 중 285번째 아미노산부터 유실되어 1~284번 위치의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 것이다. In this regard, Korean Patent Application No. 2008-0107277, which is the applicant's preferred cause, discloses a strain overexpressing truncated Tup1 in which carboxyl terminal is lost, and the content of the patent is incorporated herein by reference. The truncated Tup1 polypeptide disclosed herein encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of position 1 to 284, which is deleted from the 285th amino acid of the amino acid sequence of Tup1.

상기 특허에 개시된 바와 같이, Tup1 은 갈락토오스 대사 유전자의 발현을 억제시키는 전사억제인자인 바, Tup1 에서 발현억제도메인이 유실된 폴리펩티드 변이체인 truncated Tup1의 경우 갈락토오스 대사 유전자의 발현을 억제시킬 수 없게 된다. 이에 갈락토오스 대사 유전자의 발현이 상대적으로 촉진되게 된다. As described in the above patent, Tup1 is unable to inhibit the expression of the galactose metabolite gene in the case of truncated Tup1, a polypeptide mutant in which the expression suppression domain is lost in Tup1, which is a transcriptional repressor that inhibits the expression of the galactose metabolase gene. Therefore, expression of the galactose metabolism gene is relatively accelerated.

상기 발현억제도메인이 유실된 Tup1 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 서열상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
The Tup1 polypeptide in which the expression suppression domain is deleted has an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99% or more sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: Lt; / RTI >

B. 알코올 내성 폴리펩티드 (제2 폴리펩티드) B. Alcohol-Resistant Polypeptides (Second Polypeptide)

상기 알코올 내성 폴리펩티드는 호스트셀인 제조합 균주의 알코올 내성을 증가시킨다. 알코올 내성 폴리펩티드를 선별하기 위해 본 출원의 발명자들은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈 라이브러리 분석을 수행하였고, 이에 따라 8개의 폴리뉴클레오티드 편절을 밝혀낸 바 있다. 이는 본 출원인의 또 다른 선출원인 한국특허출원 제2009-0036253호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 내용은 참조로서 여기에 합체된다. The alcohol resistant polypeptide increases the alcohol tolerance of a recombinant strain that is a host cell. To select alcohol resistant polypeptides, the inventors of the present application conducted genomic library analysis of Saccharomyces cerevisiae , thereby revealing eight polynucleotide fragments. This is disclosed in Korean Patent Application No. 2009-0036253, which is another election cause of the present applicant, the content of which is incorporated herein by reference.

상기 특허에 따르면 Ino1 폴리펩티드가 과발현된 균주의 알코올 내성이 매우 우수하다. 상기 알코올 내성 폴리펩티드는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 Ino1 폴리펩티드일 수 있다. 이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 서열상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
According to the patent, the strain overexpressing the Ino1 polypeptide has excellent alcohol resistance. The alcohol resistant polypeptide may be an Ino1 polypeptide derived from Saccharomyces cerevisiae . Which is capable of encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99% sequence homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:

C. 동시-과발현 C. Simultaneous overexpression

상기 폴리펩티드는 재조합 균주 내에서 동시 과발현된다. 상기 폴리펩티드의 과발현 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며 폴리뉴클레오티드의 복제수를 증대시켜 이루어질 수 있다. 이를 위해 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구조체는 다양한 수의 복제가 가능한 플라스미드 등의 벡터 내에 도입되거나 또는 염색체 중에 합체되어 증폭될 수 있다. 이용 가능한 벡터로는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입 가능한 DNA 단편 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 서로 다른 멀티카피 플라스미드에 도입된 상태로 동시-과발현될 수 있다. 예를 들어, 상기 갈락토오스 대사 조절 폴리펩티드는 도 1에 기재된 개열지도를 갖는 벡터에 도입되고, 상기 알코올 내성 폴리펩티드는 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 벡터에 도입되어 동시 과발현될 수 있다. The polypeptide is overexpressed simultaneously in a recombinant strain. The method of overexpression of the polypeptide is not particularly limited and may be performed by increasing the number of copies of the polynucleotide. To this end, the polynucleotide or polynucleotide construct may be introduced into a vector such as a plasmid or the like capable of replicating in various numbers, or may be amplified by being incorporated into a chromosome. Usable vectors include, but are not limited to, bacteria, plasmids, phage, cosmid, episomes, viruses, and insertable DNA fragments. For example, the first and second polypeptides can each be co-overexpressed as introduced into different multicopy plasmids. For example, the galactose metabolism-regulating polypeptide may be introduced into a vector having a cleavage map as shown in Fig. 1, and the alcohol-resistant polypeptide may be introduced into a vector having a cleavage map as shown in Fig. 2 and simultaneously overexpressed.

이외에도 과발현은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법을 통해 달성될 수 있다 [Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)); Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)); Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)); EP 0 472 869; US 4,601,893; Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)); LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)); WO 96/15246; Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)); JP-A-10-229891; Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)); Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)); 및 공지의 유전/분자 생물학 교과서 참조]. In addition, overexpression can be achieved through methods well known in the art [Martin et < RTI ID = 0.0 > al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)); Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)); Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)); EP 0 472 869; US 4,601,893; (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)); LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)); Schwarzer and Puhler (Bio / Technology 9, 84-87 ; Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)); Makrides et al., ≪ RTI ID = 0.0 > (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)), and a well-known genetic / molecular biology textbook.

상기 벡터를 균주 내로 도입하는 기술은 당업계에 다수 공지되어 있다 ["Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) 및Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) 참조]. Techniques for introducing the vector into a strain are well known in the art ["Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).

예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 미세주입, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 스크레이프 로딩, 탄도(ballistic) 도입 또는 감염을 포함한다. 또한, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 시스템, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효소 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스로부터 유래한 벡터 등 다양한 발현 시스템을 사용할 수 있다. For example, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic ) Introduction or infection. In addition, various expression systems such as chromosomal, episomal and virus-derived systems, bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, enzyme episomes, insertion elements, yeast chromosomal elements, vectors derived from viruses and the like can be used.

상기 두 개의 폴리펩티드들을 균주 내에서 과발현시켜 형질전환시 두 폴리펩티드들이 동시에 형질전환할 수도 있고, 순차적으로 형질전환할 수도 있다. 예를 들어, 균주가 대장균인 경우에는 한 종류의 벡터만을 받아들일 수 있으므로 두 벡터를 동시에 혼합하여 형질전환할 수 없으나, 효모의 경우에는 두 벡터를 모두 혼합하여 형질전환할 수 있다. 동시 과발현시 벡터들의 복제 기점(replication origin)이 다르고 양립 가능한 벡터들에 별개의 클론으로 발현을 수행한다.
The two polypeptides may be overexpressed in a strain so that both polypeptides can be transformed simultaneously or sequentially when transformed. For example, when the strain is Escherichia coli, only one kind of vector can be accepted. Therefore, two vectors can not be mixed and transformed simultaneously. In the case of yeast, both vectors can be transformed by mixing. At simultaneous overexpression, the vectors are expressed in separate clones at different replication origin and compatible vectors.

D. 재조합 균주 D. Recombinant strains

상기 균주는 특별히 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곰팡이, 효모 등과 같이 탄소원에서 배양되었을 때 알코올을 생산할 수 있는 발효성 균주일 수 있다. 또한, 본 발명에서 기술하고 있는 폴리펩티드들의 발현에 충분한 세포 환경을 제공하는 균주일 수 있다.The strain may be a fermentative strain capable of producing an alcohol when cultured in a carbon source such as bacteria, fungi, yeast, etc., although it is not particularly limited. It may also be a strain that provides a sufficient cellular environment for the expression of the polypeptides described herein.

상기 균주는 예를 들어, 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) P2, 브레타노마이세스 커스터시(Brettanomyces curstersii), 사카로마이세스 우브즈런(Saccharomyces uvzrun), 캔디다 브래시카에(Candida brassicae). 벤트리컬리 (Sarcina ventriculi), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) IMB3, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이저린키이(Clostridium beijerinckii), 클루이베로마이세스 푸레질리스(Kluyveromyces fragilis), Brettanomyces custersii, Clostriduim aurantibutylicum 및 Clostridium tetanomorphum 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. Such strains include, for example, Klebsiella oxytoca P2, Brettanomyces curstersii, Saccharomyces uvzrun , Candida brassicae , . For example, Sarcina ventriculi , Zymomonas mobilis , Kluyveromyces marxianus IMB3, Clostridium acetobutylicum , Clostridium beijerinckii ), Kluyveromyces fragilis , Brettanomyces custersii , Clostridium aurantibutylicum and Clostridium tetanomorphum . However, the present invention is not limited thereto.

또한, 상기 균주는 효모일 수 있는 바, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 파키솔렌(Pachysolen) 속, 클라비스포라(Clavispora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 디베리오마이세스(Debaryomyces) 속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 캔디다(Candida) 속, 피키아(Pichia) 속, 및 데케라(Dekkera) 속으로 이루어진 군에서 선택된 속에 속하는 종일 수 있으며, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The strain may also be a yeast strain, such as Saccharomyces spp., Pachysolen spp ., Clavispora spp ., Kluyveromyces spp., Debaryomyces spp. ) in the shoe wanni can all belonging to the genus Oh, my process (Schwanniomyces) genus Candida (Candida) genus Pichia (Pichia) in, and having Mosquera (selected from the group consisting of genus Dekkera), for example, My as Saccharomyces process But is not limited to, Saccharomyces cerevisiae .

본 발명의 일 예에서, Tup1으로부터 발현억제 도메인의 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드 및 알코올 내성을 증가시키는 Ino1이 발현된 제2 폴리펩티드가 동시 과발현된 재조합 균주이다. In one example of the present invention, a first polypeptide deficient in the function of the expression suppression domain from Tup1 and a second polypeptide expressing Ino1 increasing the alcohol resistance are simultaneously overexpressed.

본 발명의 또 하나의 예에 따르면, 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래하고, 서열번호 3으로 나타난 아미노산 서열을 갖는 truncated Tup1 및 서열번호 2로 나타난 아미노산 서열을 갖는 Ino1이 동시 과발현된 재조합 균주를 제공한다. 이러한 재조합 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로서 대한민국 대전시 유성구에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 04월 21일자로 CEN.PK2-1D pRS424-Tr-Tup1/pRS426-Ino 1으로 명명하여 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11682BP를 부여받았다.
According to another example of the present invention, a recombinant strain derived from Saccharomyces cerevisiae, which is truncated Tup1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and simultaneously overexpressing Ino1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to provide. These recombinant strains were Saccharomyces cerevisiae , which was deposited on Apr. 21, 2010 in CEN.PK2-1D pRS424-Tr-Tup1 / pRS426-Ino 1 (National Institute of Bioscience and Human-Technology) And received the deposit number KCTC 11682BP.

호흡결손 변이된 재조합 균주Recombinant strain with respiratory deficit mutation

본 발명의 또 다른 예에 따르면 갈락토오스 대사능 증대 제1 폴리펩티드가 과발현되고 호흡결손 변이(respiration deficient mutant)된 재조합 균주를 제공한다. 이러한 재조합 균주는 제1 폴리펩티드의 과발현과 호흡결손 변이(respiration deficient mutant)에 의해 갈락토오스 이용성 및 에탄올 생산성이 증대된다. 호흡결손 변이에 의해 당 대사가 TCA 회로(cycle) 및 호흡관련 대사경로가 아닌 발효대사 경로를 거치게 됨으로써 에탄올 생산성을 더욱 증가시키게 된다. 따라서 해조류, 유가공 부산물 등 갈락토오스를 탄소원으로 하여 에탄올 및 고부가 대사물질 생산공정 등 모든 생물공정의 생산성의 향상을 가져올 수 있다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a recombinant strain in which a galactose metabolic enhancer first polypeptide is overexpressed and a respiration deficient mutant. These recombinant strains are increased in galactose utilization and ethanol productivity by overexpression of the first polypeptide and respiration deficient mutant. Respiratory deficit mutations lead to increased glucose production by glucose metabolism through the fermentative metabolic pathway rather than the TCA cycle and respiratory metabolic pathways. Therefore, productivity of all biological processes such as ethanol and high-valued metabolite production process can be improved by using galactose as a carbon source such as seaweeds and milk products.

상기 갈락토오스 대사능 증대 폴리펩티드는 항목 A에서 상술한 바와 같이 Tup1 에서 발현억제 도메인의 기능이 흠결된 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1로 나타난 아미노산 서열 중 위치 288 ~ 389 번째 아미노산의 1 또는 복수 개가 치환, 삽입, 부가 또는 유실된 아미노산 서열로 이루어지고, 발현억제도메인의 기능이 흠결된 폴리펩티드일 수 있다. 구체적인 예에서 Tup1 폴리펩티드에서 발현억제 도메인인 카르복실 말단 도메인이 유실된 truncated Tup1를 들 수 있다. The galactose metabolic enhancing polypeptide may be a mutant polypeptide deficient in the function of the expression suppression domain in Tup1 as described in item A above. For example, a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more of the 288th to 389th amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted, inserted, added or deleted, and the function of the expression suppression domain is deficient can be used. A specific example is truncated Tup1 in which the carboxyl end-domain, the expression inhibition domain, is lost in the Tup1 polypeptide.

경우에 따라 갈락토오스 대사능 증대 폴리펩티드 이외에도 알코올 생산성을 향상시킬 수 있는 다양한 폴리펩티드가 더욱 도입될 수 있으며 예를 들어, 항목 B에서 상술한 알코올 내성인 Ino1 폴리펩티드(제2 폴리펩티드)가 Tup1 변이체 폴리펩티드와 동시 과발현될 수 있다. In addition to the galactose metabolic enhancer polypeptide, various polypeptides capable of enhancing alcohol productivity can be further introduced. For example, the alcohol-resistant Ino1 polypeptide (second polypeptide) described above in item B is coexpressed with the Tup1 mutant polypeptide .

이와 같은 재조합 균주에 있어서 호흡결손 변이를 유도하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 효모의 경우 브롬화에티듐(ethidium bromide)을 선택배지에 같이 넣고 배양함으로써 호흡결손 변이가 유도될 수 있다 (기타 참조문헌: Goldring, E. S., L. I. Grossmann, D. Krupnick, D. R. Cryer, and J. Marmur. 1970. The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxyribonucleic acid during induction of petite with ethidium bromide. J. Mol. Biol. 52:323-335/ Slonimski, P. P., G. Perrodin and J. H. Croft, 1968 Ethidium bromide-induced mutation of yeast mitochondria: Complete transformation of cells into respiratory deficient nonchromosomal "petites." Biochem. Biophys. Res. Commun. 30:232-239/ Jin, Y. S., Alper, H, Y. T. Yang, and G. Stephanopoulos. 2005. Improvement of xylose uptake and ethanol production in recombinant Saccharomyces cerevisiae through an inverse metabolic engineering approach. Appl. Environ. Microbiol. 71:8249-8256). The method for inducing the respiratory defect mutation in such a recombinant strain is not particularly limited and can be carried out according to methods well known in the art. For example, in the case of yeast, respiratory deficit mutations can be induced by incorporating ethidium bromide into a selective medium and culturing them (see other references: Goldring, ES, LI Grossmann, D. Krupnick, DR Cryer, and J. Marmur 1970. The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxyribonucleic acid during induction of petite with ethidium bromide. J. Mol. Biol. 52: 323-335 / Slonimski, PP, G. Perrodin and JH Croft, 1968 Ethidium Biochem. Biophys. Res. Commun. 30: 232-239 / Jin, YS, Alper, H, YT Yang, and G. Stephanopoulos. 2005. Improvement of xylose uptake and ethanol production in recombinant Saccharomyces cerevisiae through an inverse metabolic engineering approach, Appl. Environ. Microbiol. 71: 8249-8256).

상기 재조합 균주는 항목D에서 상술한 바와 같은 다양한 균주를 들 수 있고, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The recombinant strains include various strains as described above in Item D, for example, but not limited to, Saccharomyces cerevisiae .

알코올 생산용 조성물Composition for producing alcohol

본 발명의 또 다른 예는 상술한 동시 과발현된 재조합 균주 또는 호흡결손 변이된 재조합 균주를 포함하는 알코올 생산용 조성물을 제공한다. Another example of the present invention provides a composition for producing alcohol comprising the above-mentioned simultaneously overexpressed recombinant strain or a respiratory deficient mutated recombinant strain.

이러한 조성물은 발효 미생물로서 상기 재조합 균주를 포함하는 바 탄소원으로서 바이오매스 또는 다당류 기질을 발효하여 알코올을 생산할 수 있다. 상술한 바와 같이, 재조합 균주는 갈락토오스의 대사능 및 알코올 내성이 우수하다. 따라서, 글루코오스 이외에 갈락토오스를 함유하는 혼합 다당류를 효과적으로 알코올 발효시킬 수 있다. 또한, 알코올 내성이 우수하므로 고농도의 알코올에서도 생존율(viability)이 높아 발효에서 균주의 항상성(Homeostasis)을 높일 수 있고 알코올 생산성을 향상시킬 수 있다. Such a composition includes the recombinant strain as a fermenting microorganism, and can produce alcohol by fermenting a biomass or polysaccharide substrate as a carbon source. As described above, the recombinant strain is excellent in the metabolic ability and alcohol tolerance of galactose. Therefore, the mixed polysaccharide containing galactose in addition to glucose can be effectively fermented by alcohol. In addition, since the alcohol resistance is excellent, the viability of the alcohol at a high concentration is high, so that the homostasis of the strain in the fermentation can be enhanced and the alcohol productivity can be improved.

상기 조성물에는 재조합 균주 이외에도 필요에 따라 다양한 영양배지, 버퍼액 등이 포함될 수 있다. In addition to the recombinant strains, the composition may include various nutrient media, buffer solutions and the like as needed.

상기 알코올 생산용 조성물을 사용하여 알코올을 제조하는 과정은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 선택적으로 바이오매스 등의 탄소원을 당화에 유리하도록 전처리하는 단계, 당화효소를 이용하여 바이오매스를 당화하는 단계, 및 상기 알코올 생산용 조성물을 첨가하여 환원당을 알코올로 전환하는 발효 단계의 세 단계 공정을 통해 이루어지고 있다. The process for producing the alcohol using the composition for producing alcohol is not particularly limited. For example, the process for preparing the alcohol may include, for example, pretreating a carbon source such as biomass to facilitate saccharification, saccharifying the biomass using a saccharifying enzyme And a fermentation step of converting the reducing sugar to an alcohol by adding the composition for producing alcohol.

상기 탄소원은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 갈락토오스 및/또는 글루코오스 함유 탄소원일 수 있다. 구체적인 예에서, 셀룰로오스계, 리그노셀룰로오스계, 해조류 바이오매스 등일 수 있다. 상기 해조류 바이오매스는 예를 들어, 홍조류, 녹조류, 갈조류 등을 모두 포함할 수 있다. The carbon source is not particularly limited and may be, for example, a carbon source containing galactose and / or glucose. In a specific example, it may be a cellulose-based, lignocellulosic-based, seaweed biomass, or the like. The seaweed biomass may include, for example, red algae, green algae, brown algae, and the like.

또한, 상기 탄소원은 예를 들어, 녹말(starch), 셀룰로오스(cellulose), 자일란(xylan), 글루코오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아가로오스 등의 섬유질계 또는 녹조류 다당류, 우무(agar), 펙틴(pectin) 등의 홍조류 다당류, 알지네이트(alginate), 후코이단(fucoidan), 라미나린(laminarin) 등의 갈조류 다당류, 이들의 복합물 또는 혼합물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The carbon source may be selected from the group consisting of starch, cellulose, xylan, glucose, galactose, xylose, agarose and other fiber-based or algae polysaccharides, agar, pectin alginate, fucoidan, laminarin, and the like, complexes or mixtures thereof, and the like, but the present invention is not limited thereto.

상기 전처리 방법은 특별히 제한되지 않으며, 열처리, 산처리, 염기처리 등 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. The pretreatment method is not particularly limited, and can be carried out by methods known in the art such as heat treatment, acid treatment, and base treatment.

상기 열처리는, 기질을 고온에서 가열하는 방법을 통해 수행될 수 있다. 상기 가열은 예를 들어, 기질을 증류수에 넣어 오토클레이브에서 100 ~ 200℃ 에서 10 ~ 80분간 가열하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 경우에 따라, 상기 가열 후 공지의 분쇄 장치를 이용하여 분쇄함으로써 본 발명의 예시에 따른 균주 접근이 용이한 상태가 되게 할 수 있다. The heat treatment may be performed by a method of heating the substrate at a high temperature. The heating can be performed by, for example, heating the substrate in an autoclave at 100 to 200 ° C. for 10 to 80 minutes in distilled water. In addition, if necessary, after the heating, pulverization may be carried out by using a known pulverizing apparatus so that the approach of the strain according to the example of the present invention can be facilitated.

상기 산처리는 예를 들어, 기질을 산 촉매를 포함하는 용액에 침지시키는 방법을 이용할 수 있다. 이 때, 반응 온도는 특별히 제한되지 않으며, 25 ~ 150℃ 범위일 수 있다. 상기 산 촉매의 예로는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 또는 상용 고체산 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 산 촉매는 0.05∼50％ 농도로 부가될 수 있으며, 80∼300℃의 온도에서 반응을 수행할 수 있다. The acid treatment can be performed, for example, by immersing the substrate in a solution containing an acid catalyst. In this case, the reaction temperature is not particularly limited and may be in the range of 25 to 150 ° C. Examples of the acid catalyst include, but are not limited to, H 2 SO 4 , HCl, HBr, HNO 3 , CH 3 COOH, HCOOH, HClO 4, H 3 PO 4 , PTSA or a conventional solid acid. The acid catalyst may be added in a concentration of 0.05 to 50%, and the reaction may be carried out at a temperature of 80 to 300 캜.

상기 염기처리는, 예를 들어 기질을 알칼리성 용매에 소킹(soaking)하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 알칼리 수용액의 예로는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The base treatment may be performed by, for example, soaking the substrate in an alkaline solvent. Examples of the aqueous alkaline solution include, but are not limited to, potassium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia .

상기 당화 단계는 황산 등의 가수분해 촉매 또는 가수분해 효소를 이용하여 바이오매스 또는 다당체를 단당체로 가수분해하는 공정이다. The saccharification step is a step of hydrolyzing a biomass or polysaccharide into a monosaccharide using a hydrolysis catalyst such as sulfuric acid or a hydrolase.

상기 발효 단계는 20 내지 40℃의 온도에서 5.0~8.0의 pH 조건으로 40 시간 이상, 또는 40 내지 100 시간 동안 수행될 수 있다. The fermentation step may be carried out at a temperature of 20 to 40 DEG C for 40 hours or more, or for 40 to 100 hours at a pH of 5.0 to 8.0.

상기 당화와 발효 단계는 각각 별도의 반응기에서 수행하는 분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) 공정으로 수행될 수도 있고, 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행하는 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF) 공정으로 수행될 수도 있다. The saccharification and fermentation steps may be performed by a separate saccharification and fermentation (SHF) process carried out in a separate reactor, or may be performed by a simultaneous saccharification and fermentation , SSF) process.

필요에 따라, 당업자는 기타 추가단계 및/또는 공정을 수행할 수 있는 바, 예를 들어, 상기 탄소원인 바이오매스 등은 수세 과정을 통해 불순물 제거 및 세척을 수행할 수 있고, 건조 및 분쇄하여 분말 상태로 적용될 수 있다. 상기 건조는 예를 들어 열풍 건조기를 이용하거나 자연건조법으로 수행될 수 있고, 상기 분쇄는 다양한 밀링(milling)법을 이용하여 수행될 수 있다. If necessary, those skilled in the art can perform other additional steps and / or processes. For example, the carbon source biomass may be subjected to washing and washing with impurities through a washing process, dried and pulverized to obtain powder Lt; / RTI > The drying can be performed, for example, by using a hot-air drier or by a natural drying method, and the pulverization can be carried out using various milling methods.

상기 알코올은 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 C1 내지 C4의 알코올일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
The alcohol may be, for example, a C 1 to C 4 alcohol such as methanol, ethanol, propanol, butanol, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 제조예 및 실험예에 따라 본 발명을 상술한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Preparation Examples and Experimental Examples of the present invention.

[제조예 1] truncated Tup1/Ino1 동시-과발현된 재조합 균주의 제조 [Preparation Example 1] Preparation of truncated Tup1 / Ino1 co-overexpressed recombinant strains

(1) pRS424 truncated Tup1의 구축(1) Construction of pRS424 truncated Tup1

한국특허출원 제2008-0107277호에 개시된 바에 따라, 세레비시애 CEN.PK2-1D 게놈 라이브러리로부터 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 truncated Tup1을 얻었다. 이를 pRS424 벡터에 도입하여 재조합 플라스미드 pRS424 truncated Tup1를 구축하였다(도 1 참조). As disclosed in Korean Patent Application No. 2008-0107277, truncated Tup1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was obtained from the genome library of Cerevisiae CEN.PK2-1D. This was introduced into the pRS424 vector to construct a recombinant plasmid pRS424 truncated Tup1 (see Fig. 1).

(2) pRS426GPD INO1의 구축(2) Construction of pRS426GPD INO1

Ino1 폴리뉴클레오티드(1601bp)는 사카로마이세스 세레비시애 CEN.PK2-1D genomic DNA을 template로 사용하여 PCR 증폭하여 얻었다. Ino1 은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 두 개의 프라이머는 센스 프라이머로 5'- GGCCTGCAGATGACAGAAGATAATATTGC-3' 및 안티센스 프라이머로 5'- GGCGGATCCTTACAACAATCTCTCTTCGA- 3'을 제작한다. 센스 프라이머 부위에는 PstI 제한효소 인식부위를 가지며, 안티센스 프라이머에는 BamHI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. PCR 증폭 후 INO1는 PstI 와 BamHI 제한효소로 처리하여 효모 표면발현 벡터인 pRS426GPD에 서브클로닝(subcloning)하여 재조합 플라스미드 pRS426GPD INO1(8303bp)을 구축하였다(도 2 참조). The Ino1 polynucleotide (1601 bp) was obtained by PCR amplification using Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D genomic DNA as a template. Ino1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The two primers are 5'-GGCCTGCAGATGACAGAAGATAATATTGC-3 'as a sense primer and 5'-GGCGGATCCTTACAACAATCTCTCTTCGA-3' as an antisense primer. The sense primer region has a PstI restriction enzyme recognition site and the antisense primer has a BamHI restriction enzyme recognition site. After PCR amplification, INO1 was treated with PstI and BamHI restriction enzymes and subcloned into yeast surface expression vector pRS426GPD to construct a recombinant plasmid pRS426GPD INO1 (8303 bp) (see FIG. 2).

(3) 동시 형질전환(3) co-transformation

제조된 pRS424 Truncated Tup1 벡터(도 1 참조) 및 pRS426GPD Ino1 벡터(도 2 참조)는 각각 대장균(E. coli) DH5α에서 증폭, 추출한다. 그런 다음, EZ-Yeast Transformation Kit(BIO 101,Vista, CA, USA)를 사용하여 효모 숙주세포 사카로마이세스 세레비시애 CEN.PK2-1D에 pRS424 truncated TUP1폴리펩티드와 pRS426GPD INO1를 동시 형질전환한다.
The prepared pRS424 Truncated Tup1 vector (see FIG. 1) and the pRS426GPD Ino1 vector (see FIG. 2) are amplified and extracted from E. coli DH5α, respectively. Then, pRS424 truncated TUP1 polypeptide and pRS426GPD INO1 are co-transformed into yeast host cell Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D using the EZ-Yeast Transformation Kit (BIO 101, Vista, CA, USA).

배양 조건Culture conditions

모든 배지는 Autoclave를 통하여 110℃에서 20분간 멸균하여 사용하고, 배지의 조성은 최소배지의 경우 기본적으로 YNB(w/o amino acids, Difco) 6.7 g/L, CSM-Leu, Ura, Trp(MP Biomedicals) 0.62 g/L를 작동액(working solution)으로 하고, 이들을 각각 10X로 농축한 스톡(Stock)을 제조하여 희석하여 사용한다. 나머지 아미노산의 경우 Leucine은 1%(w/v), Uracil은 0.2%(w/v)의 스톡액(Stock solution)을 제조한 다음 각각 작동액은 100X로 하여 사용하였다.
All media were sterilized at 110 ° C for 20 minutes using Autoclave. The composition of the medium was basically 6.7 g / L of YNB (w / o amino acids, Difco), CSM-Leu, Ura, Trp Biomedicals) 0.62 g / L as a working solution, and concentrating them to 10X, respectively, are prepared and diluted. For the remaining amino acids, Stock solution of 1% (w / v) Leucine and 0.2% (w / v) of Uracil were prepared and then the working solution was used at 100X each.

발효 및 선별조건Fermentation and selection conditions

에탄올 발효실험은 30℃를 배양온도로 하여 250mL non-배플 플라스크에서 50mL을 전체부피로 하여 수행하였으며, 통기조건은 산소제한(oxygen limited) 조건으로 한다. 고농도 균주(high cell density) 발효실험의 경우 전배양은 8부 튜브를 사용하여 20 g/L 글루코오스 최소배지 10ml에서 30℃, 200rpm으로 48시간 배양한 균주 1%를 500mL 배플 플라스크를 사용하여 20g/L 글루코오스와 20g/L 갈락토오스 최소배지 200mL 에 접종하여 30℃, 200rpm으로 48~72시간 배양한 균주를 harvest한 후, D.W.에 세척하여 다시 harvest하여 실험에 사용되었으며, 교반속도는 100rpm으로 단위 샘플채취 시간간격은 4시간 및 8시간을 단위로 발효실험을 진행하였다.
Ethanol fermentation was carried out at a temperature of 30 ℃ at a total volume of 50 mL in a 250 mL non-baffle flask. The aeration condition was oxygen limited. For the high cell density fermentation experiment, 1% of the strain cultured for 48 hours at 30 ° C and 200 rpm in 10 ml of 20 g / L glucose using an 8-tube tube was pre-cultured in a 500 ml baffle flask at 20 g / L of glucose and 20 g / L of galactose, and harvested at 30 ° C. and 200 rpm for 48 to 72 hours. The strains were harvested by harvesting and re-harvesting. The agitation speed was 100 rpm, Fermentation experiments were carried out at intervals of 4 hours and 8 hours.

[실험예 1] 재조합 균주를 이용한 에탄올 생산(low cell density) [Experimental Example 1] Production of ethanol using recombinant strain (low cell density)

혼합당(2% 글루코오스 2% 갈락토오스) 조건에서 제조예 1의 Truncated Tup1/Ino1 동시과발현 재조합 균주의 발효능 향상을 확인하고자 한다. In order to confirm the improved efficacy of the recombinant overexpressed Truncated Tup1 / Ino1 strain of Preparation Example 1 under the condition of mixed sugar (2% glucose 2% galactose).

재조합 균주의 배양 활성을 위해 글루코오스 (Glucose) 20g/L 함유한 최소배지 (SCD+Leu) 5ml에 균을 전배양 실시한다. For the culture activity of the recombinant strain, the bacteria are pre-cultured in 5 ml of a minimal medium (SCD + Leu) containing 20 g / L of glucose (Glucose).

그런 다음 글루코오스 20g/L 및 갈락토오스 20g/L 를 함유한 최소배지 (SCDG+Leu) 50ml에 동일한 균농도로 1% (low cell density) 정도 접종하고 배양을 실시하며 12시간 단위로 균농도를 측정하고 에탄올 생산능을 확인하고 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다. Then, 50 ml of a minimal medium (SCDG + Leu) containing 20 g / L of glucose and 20 g / L of galactose was inoculated with 1% (low cell density) at the same bacterial concentration and cultured. The ethanol production ability was confirmed, and the results are shown in Figs.

이들 도면을 참조하면, 발효 60시간까지 생성된 최종 에탄올 농도는 각각 대조군 1의 Control 효모는 10.05 g/L(도 3 참조), 비교예1의 Ino1 과발현 효모는 9.31 g/L(도 4 참조), 비교예 2의 Truncated Tup1 과발현 효모는 11.6g/L(도 5 참조)이고, 실시예 1의 Truncated Tup1/Ino1 동시 과발현 효모는 13.7 g/L이다(도 6 참조). 실시예 1의 Truncated Tup1/Ino1 동시 과발현 재조합 효모는 비교예 2의 효모균에 비해 최종 에탄올 농도 측면에서 16% 향상되었음을 알 수 있다.
Referring to these figures, the final ethanol concentrations produced up to 60 hours of fermentation were 10.05 g / L (see FIG. 3) for Control yeast of Control 1 and 9.31 g / L (see FIG. 4) of Ino1 overexpressing yeast of Comparative Example 1, , The Truncated Tup1 over-expressing yeast of Comparative Example 2 is 11.6 g / L (see FIG. 5), and the Truncated Tup1 / Ino1 simultaneous overexpressing yeast of Example 1 is 13.7 g / L (see FIG. It can be seen that the truncated Tup1 / Ino1 over-expressing recombinant yeast of Example 1 was improved by 16% in terms of the final ethanol concentration as compared with the yeast of Comparative Example 2. [

[제조예 2] 호흡결손 균주의 선별 [Preparation Example 2] Selection of respiratory deficient strains

대조군1의 Control 효모와 비교예 2의 Truncated Tup1 과발현 효모 균주를 선택배지(SCD LEU+URA) 10ml에 접종시키고 EtBr (ethidium bromide)를 20ul 넣어 배양한다. Control yeast of Control 1 and Truncated Tup1 overexpressing yeast strain of Comparative Example 2 were inoculated into 10 ml of selective medium (SCD LEU + URA) and incubated with 20 μl of ethidium bromide (EtBr).

3~5일 배양한 다음 선택배지에 도말해서 콜로니가 아직 작은 호흡결손 균주를 선별한다. 선별된 호흡결손 대조군1 균주를 대조군 2로 하고, Truncated Tup1 과발현 효모 균주 중 선별된 호흡결손 균주를 비교예 3이라 한다.
After culturing for 3 to 5 days, the colonies are picked up on selective medium to select small respiratory defects. One selected respiratory deficit control group was designated as control group 2, and a respiratory deficiency strain selected among Truncated Tup1 overexpressing yeast strains was referred to as Comparative Example 3.

[실험예 2] 호흡결손 균주 선별에 의한 에탄올 생산성 확인(High cell density)[Experimental Example 2] Ethanol productivity was confirmed by selection of respiratory deficiency strain (High cell density)

혼합당 (2% 글루코오스 2% 갈락토오스) 조건에서 호흡결손 변이된 대조군 효모(대조군 2, control RD) 및 호흡결손 변이된 Truncated Tup1 과발현 효모 균주(비교예 3, truncated Tup1 RD)의 발효능 향상 효과 및 갈락토오스 이용성 증대 효과를 확인하고자 한다. Effects of enhancing the efficacy of truncated Tup1 overexpressing yeast strains (Comparative Example 3, truncated Tup1 RD) in respiratory deficient mutant control yeast (control 2, control RD) under mixed glucose (2% glucose 2% galactose) Galactose and the increase of galactose utilization.

선별된 균주를 글루코오스 20g/L 함유한 최소배지 (SCD+Leu+Ura) 5ml에서 전배양 한 후 글루코오스 20g/L 와 갈락토오스 20g/L를 함유한 최소배지 (SCDG+Leu+Ura) 200ml에 동일한 균농도로 1% 정도 접종 하고 배양을 실시한다. The selected strains were pre-cultured in 5 ml of a minimal medium (SCD + Leu + Ura) containing 20 g / L of glucose and added to 200 ml of a minimal medium (SCDG + Leu + Ura) containing 20 g / L of glucose and 20 g / L of galactose 1% in concentration and cultivation is carried out.

72시간 동안 배양 후 균을 전부 수거 후 상등액은 제거하고 남은 균 (high cell density)을 글루코오스 20g/L 와 갈락토오스 20g/L를 함유한 최소배지 (SCDG+Leu+Ura) 50ml에 접종하여 배양하였다. 4시간 단위로 균농도를 측정하고 에탄올 생산능을 분석하였고 그 결과를 도 7 내지 8에 나타내었다. After the culture was completed for 72 hours, all of the bacteria were collected and the supernatant was removed and the remaining high cell density was inoculated into 50 ml of a minimal medium (SCDG + Leu + Ura) containing 20 g / L of glucose and 20 g / L of galactose. The bacterial concentration was measured every 4 hours and the ethanol production ability was analyzed. The results are shown in FIGS. 7 to 8.

도 7-8에 나타난 바와 같이, 에탄올 발효 12시간까지 생성된 최종 에탄올 농도는 대조군1 (Control): 10.64 g/L, 대조군 2(Control RD): 16 g/L, 비교예 2(truncated Tup1): 16.7 g/L, 비교예 3(truncated Tup1 RD): 17.3 g/L이다. 즉, truncated Tup1 (16.7g/L)에 비해 truncated Tup1 RD (17.3 g/L) 이 최종 에탄올 농도 측면에서 4% 향상되었음을 알 수 있다. As shown in FIGS. 7-8, the final ethanol concentration produced until 12 hours of ethanol fermentation was 10.64 g / L in Control 1 (control), 16 g / L in Control 2 (control RD) : 16.7 g / L, and truncated Tup1 RD: 17.3 g / L. In other words, the truncated Tup1 RD (17.3 g / L) was 4% higher than the truncated Tup1 (16.7 g / L) in terms of the final ethanol concentration.

최종 에탄올 농도 향상 외에 혼합당이 소모되는 시간을 기준으로 보면, 비교예 2의 Truncated Tup1 과발현 균주가 소모하는 시간은 16시간인 반면, 비교예 3의 호흡결손된 Truncated Tup1 과발현 균주가 소모하는 시간은 10시간임을 알 수 있다.
Based on the time of consumption of the mixed sugar in addition to the improvement of the final ethanol concentration, the consumption time of the Truncated Tup1 overexpressing strain of Comparative Example 2 is 16 hours, while the consumption time of the respiration-deficient truncated Tup1 overexpressing strain of Comparative Example 3 10 hours.

[실험예 3] 호흡결손 균주 선별에 의한 에탄올 생산성 확인(low cell density) [Experimental Example 3] Determination of ethanol productivity by selection of respiratory defects (low cell density)

혼합당 (2% 글루코오스 2% 갈락토오스) 조건에서 호흡결손 변이된 control 효모 균주(대조군 2, control RD) 와 Truncated Tup1 과발현 효모 균주(비교예 3, truncated Tup1 RD)의 발효능 향상 효과 및 갈락토오스 이용성 증대 효과를 확인하고자 한다. Enhancement of efficacy and galactose utilization of control yeast strain (control 2, control RD) and truncated Tup1 overexpressing yeast strain (Comparative Example 3, truncated Tup1 RD) with respiratory deficiency mutation under the condition of mixed sugar (2% glucose 2% galactose) I want to confirm the effect.

선별된 호흡결손 균주를 글루코오스 20g/L 함유한 최소배지 (SCD+Leu+Ura) 5ml에서 전배양 한 후 글루코오스 20g/L과 갈락토오스 20g/L를 함유한 최소배지 (SCDG+Leu+Ura) 50ml에 동일한 균농도로 1% (low cell density) 접종하고 배양을 실시하였다. 12시간 단위로 균농도를 측정하고 에탄올 생산능을 분석하였고, 그 결과를 도 9 내지 12에 나타내었다. The selected respiratory deficient strain was pre-cultured in 5 ml of a minimal medium (SCD + Leu + Ura) containing 20 g / L of glucose and then cultured in 50 ml of a minimal medium (SCDG + Leu + Ura) containing 20 g / L of glucose and 20 g / L of galactose 1% (low cell density) was inoculated with the same bacterial concentration and cultured. The bacterial concentration was measured every 12 hours and the ethanol production ability was analyzed. The results are shown in FIGS. 9 to 12.

호흡결손 균주군을 낮은 셀 농도로 배양한 결과 생성된 최종 에탄올 농도는 대조군 1(Control 효모): 13.27 g/L, 대조군 2(Control RD): 16.5 g/L, 비교예 2(Truncated Tup1): 15.76 g/L, 비교예 3(Truncated Tup1 RD): 17.07 g/L였다. 즉, 비교예 2(Truncated TUP1; 15.76g/L)에 비해 비교예 3의 호흡결손된 Truncated Tup1 (17.07 g/L) 균주가 최종 에탄올 농도 측면에서 8.31% 향상되었음을 알 수 있다.
(Control yeast): 13.27 g / L, Control 2 (Control RD): 16.5 g / L, Truncated Tup1: The final ethanol concentration of the respiratory deficient strain group was lower than that of control group 1 15.76 g / L, and Comparative Example 3 (Truncated Tup1 RD): 17.07 g / L. That is, it can be seen that the truncated Tup1 (17.07 g / L) strain of Comparative Example 3 was improved by 8.31% in terms of the final ethanol concentration in comparison with the Truncated TUP1 (15.76 g / L).

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
Those skilled in the art will appreciate that various modifications, additions and substitutions are possible, without departing from the scope and spirit of the invention as disclosed in the accompanying claims.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC11682BPKCTC11682BP 2010042120100421

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO. LTD. <120> Recombinant Strain Containing Truncated Tup1, and Composition for Alcohol-Producing Containing the Same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 713 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Thr Ala Ser Val Ser Asn Thr Gln Asn Lys Leu Asn Glu Leu Leu 1 5 10 15 Asp Ala Ile Arg Gln Glu Phe Leu Gln Val Ser Gln Glu Ala Asn Thr 20 25 30 Tyr Arg Leu Gln Asn Gln Lys Asp Tyr Asp Phe Lys Met Asn Gln Gln 35 40 45 Leu Ala Glu Met Gln Gln Ile Arg Asn Thr Val Tyr Glu Leu Glu Leu 50 55 60 Thr His Arg Lys Met Lys Asp Ala Tyr Glu Glu Glu Ile Lys His Leu 65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Glu Gln Arg Asp His Gln Ile Ala Ser Leu Thr Val 85 90 95 Gln Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Gln Gln His Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser Val Pro Val 115 120 125 Ala Gln Gln Pro Pro Ala Thr Thr Ser Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala 130 135 140 Asn Thr Thr Thr Gly Ser Pro Ser Ala Phe Pro Val Gln Ala Ser Arg 145 150 155 160 Pro Asn Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Thr Thr Thr Leu Pro Val Val 165 170 175 Ser Ser Asn Ala Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln 180 185 190 Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Ala Pro Leu 195 200 205 Ser Asn Thr Ala Ile Asn Gly Ser Pro Thr Ser Lys Glu Thr Thr Thr 210 215 220 Leu Pro Ser Val Lys Ala Pro Glu Ser Thr Leu Lys Glu Thr Glu Pro 225 230 235 240 Glu Asn Asn Asn Thr Ser Lys Ile Asn Asp Thr Gly Ser Ala Thr Thr 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Glu Thr Glu Ile Lys Pro Lys Glu Glu 260 265 270 Asp Ala Thr Pro Ala Ser Leu His Gln Asp His Tyr Leu Val Pro Tyr 275 280 285 Asn Gln Arg Ala Asn His Ser Lys Pro Ile Pro Pro Phe Leu Leu Asp 290 295 300 Leu Asp Ser Gln Ser Val Pro Asp Ala Leu Lys Lys Gln Thr Asn Asp 305 310 315 320 Tyr Tyr Ile Leu Tyr Asn Pro Ala Leu Pro Arg Glu Ile Asp Val Glu 325 330 335 Leu His Lys Ser Leu Asp His Thr Ser Val Val Cys Cys Val Lys Phe 340 345 350 Ser Asn Asp Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Gly Cys Asn Lys Thr Thr Gln 355 360 365 Val Tyr Arg Val Ser Asp Gly Ser Leu Val Ala Arg Leu Ser Asp Asp 370 375 380 Ser Ala Ala Asn Asn His Arg Asn Ser Ile Thr Glu Asn Asn Thr Thr 385 390 395 400 Thr Ser Thr Asp Asn Asn Thr Met Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ile 405 410 415 Thr Thr Thr Ala Met Thr Ser Ala Ala Glu Leu Ala Lys Asp Val Glu 420 425 430 Asn Leu Asn Thr Ser Ser Ser Pro Ser Ser Asp Leu Tyr Ile Arg Ser 435 440 445 Val Cys Phe Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Thr Gly Ala Glu Asp 450 455 460 Arg Leu Ile Arg Ile Trp Asp Ile Glu Asn Arg Lys Ile Val Met Ile 465 470 475 480 Leu Gln Gly His Glu Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Pro Ser 485 490 495 Gly Asp Lys Leu Val Ser Gly Ser Gly Asp Arg Thr Val Arg Ile Trp 500 505 510 Asp Leu Arg Thr Gly Gln Cys Ser Leu Thr Leu Ser Ile Glu Asp Gly 515 520 525 Val Thr Thr Val Ala Val Ser Pro Gly Asp Gly Lys Tyr Ile Ala Ala 530 535 540 Gly Ser Leu Asp Arg Ala Val Arg Val Trp Asp Ser Glu Thr Gly Phe 545 550 555 560 Leu Val Glu Arg Leu Asp Ser Glu Asn Glu Ser Gly Thr Gly His Lys 565 570 575 Asp Ser Val Tyr Ser Val Val Phe Thr Arg Asp Gly Gln Ser Val Val 580 585 590 Ser Gly Ser Leu Asp Arg Ser Val Lys Leu Trp Asn Leu Gln Asn Ala 595 600 605 Asn Asn Lys Ser Asp Ser Lys Thr Pro Asn Ser Gly Thr Cys Glu Val 610 615 620 Thr Tyr Ile Gly His Lys Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Thr Thr Gln 625 630 635 640 Asn Asp Glu Tyr Ile Leu Ser Gly Ser Lys Asp Arg Gly Val Leu Phe 645 650 655 Trp Asp Lys Lys Ser Gly Asn Pro Leu Leu Met Leu Gln Gly His Arg 660 665 670 Asn Ser Val Ile Ser Val Ala Val Ala Asn Gly Ser Pro Leu Gly Pro 675 680 685 Glu Tyr Asn Val Phe Ala Thr Gly Ser Gly Asp Cys Lys Ala Arg Ile 690 695 700 Trp Lys Tyr Lys Lys Ile Ala Pro Asn 705 710 <210> 2 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated Tup1 <400> 2 Met Thr Ala Ser Val Ser Asn Thr Gln Asn Lys Leu Asn Glu Leu Leu 1 5 10 15 Asp Ala Ile Arg Gln Glu Phe Leu Gln Val Ser Gln Glu Ala Asn Thr 20 25 30 Tyr Arg Leu Gln Asn Gln Lys Asp Tyr Asp Phe Lys Met Asn Gln Gln 35 40 45 Leu Ala Glu Met Gln Gln Ile Arg Asn Thr Val Tyr Glu Leu Glu Leu 50 55 60 Thr His Arg Lys Met Lys Asp Ala Tyr Glu Glu Glu Ile Lys His Leu 65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Glu Gln Arg Asp His Gln Ile Ala Ser Leu Thr Val 85 90 95 Gln Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Gln Gln His Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser Val Pro Val 115 120 125 Ala Gln Gln Pro Pro Ala Thr Thr Ser Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala 130 135 140 Asn Thr Thr Thr Gly Ser Pro Ser Ala Phe Pro Val Gln Ala Ser Arg 145 150 155 160 Pro Asn Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Thr Thr Thr Leu Pro Val Val 165 170 175 Ser Ser Asn Ala Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln 180 185 190 Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Ala Pro Leu 195 200 205 Ser Asn Thr Ala Ile Asn Gly Ser Pro Thr Ser Lys Glu Thr Thr Thr 210 215 220 Leu Pro Ser Val Lys Ala Pro Glu Ser Thr Leu Lys Glu Thr Glu Pro 225 230 235 240 Glu Asn Asn Asn Thr Ser Lys Ile Asn Asp Thr Gly Ser Ala Thr Thr 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Glu Thr Glu Ile Lys Pro Lys Glu Glu 260 265 270 Asp Ala Thr Pro Ala Ser Leu His Gln Asp His Tyr Leu 275 280 285 <210> 3 <211> 533 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Thr Glu Asp Asn Ile Ala Pro Ile Thr Ser Val Lys Val Val Thr 1 5 10 15 Asp Lys Cys Thr Tyr Lys Asp Asn Glu Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Tyr 20 25 30 Glu Asn Ala Val Val Thr Lys Thr Ala Ser Gly Arg Phe Asp Val Thr 35 40 45 Pro Thr Val Gln Asp Tyr Val Phe Lys Leu Asp Leu Lys Lys Pro Glu 50 55 60 Lys Leu Gly Ile Met Leu Ile Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr 65 70 75 80 Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Lys His Asn Val Glu Phe Gln Thr 85 90 95 Lys Glu Gly Val Lys Gln Pro Asn Tyr Phe Gly Ser Met Thr Gln Cys 100 105 110 Ser Thr Leu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Glu Gly Asn Asp Val Tyr Ala 115 120 125 Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Met Val Ser Pro Asn Asp Phe Val Val 130 135 140 Ser Gly Trp Asp Ile Asn Asn Ala Asp Leu Tyr Glu Ala Met Gln Arg 145 150 155 160 Ser Gln Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln Gln Arg Leu Lys Ala Lys Met 165 170 175 Ser Leu Val Lys Pro Leu Pro Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala 180 185 190 Ala Asn Gln Asp Glu Arg Ala Asn Asn Cys Ile Asn Leu Asp Glu Lys 195 200 205 Gly Asn Val Thr Thr Arg Gly Lys Trp Thr His Leu Gln Arg Ile Arg 210 215 220 Arg Asp Ile Gln Asn Phe Lys Glu Glu Asn Ala Leu Asp Lys Val Ile 225 230 235 240 Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Val Glu Val Ser Pro Gly 245 250 255 Val Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Gln Ser Ile Lys Asn Asp His 260 265 270 Glu Glu Ile Ala Pro Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ala Ser Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly 290 295 300 Leu Val Gln Leu Ala Glu His Glu Gly Thr Phe Ile Ala Gly Asp Asp 305 310 315 320 Leu Lys Ser Gly Gln Thr Lys Leu Lys Ser Val Leu Ala Gln Phe Leu 325 330 335 Val Asp Ala Gly Ile Lys Pro Val Ser Ile Ala Ser Tyr Asn His Leu 340 345 350 Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Pro Lys Gln Phe Arg Ser 355 360 365 Lys Glu Ile Ser Lys Ser Ser Val Ile Asp Asp Ile Ile Ala Ser Asn 370 375 380 Asp Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Leu Gly Lys Lys Val Asp His Cys Ile 385 390 395 400 Val Ile Lys Tyr Met Lys Pro Val Gly Asp Ser Lys Val Ala Met Asp 405 410 415 Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Ile 420 425 430 His Asn Val Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp 435 440 445 Leu Leu Val Met Thr Glu Phe Cys Thr Arg Val Ser Tyr Lys Lys Val 450 455 460 Asp Pro Val Lys Glu Asp Ala Gly Lys Phe Glu Asn Phe Tyr Pro Val 465 470 475 480 Leu Thr Phe Leu Ser Tyr Trp Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly 485 490 495 Phe His Pro Val Asn Gly Leu Asn Lys Gln Arg Thr Ala Leu Glu Asn 500 505 510 Phe Leu Arg Leu Leu Ile Gly Leu Pro Ser Gln Asn Glu Leu Arg Phe 515 520 525 Glu Glu Arg Leu Leu 530 <110> SAMSUNG ELECTRONICS CO. LTD. <120> Recombinant Strain Containing Truncated Tup1, and Composition for          Alcohol-Producing Containing the Same <160> 3 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 713 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Thr Ala Ser Val Ser Asn Thr Gln Asn Lys Leu Asn Glu Leu Leu   1 5 10 15 Asp Ala Ile Arg Gln Glu Phe Leu Gln Val Ser Gln Glu Ala Asn Thr              20 25 30 Tyr Arg Leu Gln Asn Gln Lys Asp Tyr Asp Phe Lys Met Asn Gln Gln          35 40 45 Leu Ala Glu Met Gln Gln Ile Arg Asn Thr Val Tyr Glu Leu Glu Leu      50 55 60 Thr His Arg Lys Met Lys Asp Ala Tyr Glu Glu Glu Ile Lys His Leu  65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Glu Gln Arg Asp His Gln Ile Ala Ser Leu Thr Val                  85 90 95 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Gln Gln His Leu             100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ser Ala Ser Val Pro Val         115 120 125 Ala Gln Gln Pro Pro Ala Thr Ser Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala     130 135 140 Asn Thr Thr Thr Gly Ser Ser Ser Ala Phe Pro Val Gln Ala Ser Arg 145 150 155 160 Pro Asn Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Thr Thr Thr Leu Pro Val Val                 165 170 175 Ser Ser Asn Ala Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln             180 185 190 Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Val Val Ser Ala Pro Leu         195 200 205 Ser Asn Thr Ala Ile Asn Gly Ser Pro Thr Ser Lys Glu Thr Thr Thr     210 215 220 Leu Pro Ser Val Lys Ala Pro Glu Ser Thr Leu Lys Glu Thr Glu Pro 225 230 235 240 Glu Asn Asn Thr Ser Lys Ile Asn Asp Thr Gly Ser Ala Thr Thr                 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Glu Thr Glu Ile Lys Pro Lys Glu Glu             260 265 270 Asp Ala Thr Pro Ala Ser Leu His Gln Asp His Tyr Leu Val Pro Tyr         275 280 285 Asn Gln Arg Ala Asn His Ser Lys Pro Ile Pro Pro Phe Leu Leu Asp     290 295 300 Leu Asp Ser Gln Ser Val Pro Asp Ala Leu Lys Lys Gln Thr Asn Asp 305 310 315 320 Tyr Tyr Ile Leu Tyr Asn Pro Ala Leu Pro Arg Glu Ile Asp Val Glu                 325 330 335 Leu His Lys Ser Leu Asp His Thr Ser Val Val Cys Cys Val Lys Phe             340 345 350 Ser Asn Asp Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Gly Cys Asn Lys Thr Thr Gln         355 360 365 Val Tyr Arg Val Ser Asp Gly Ser Leu Val Ala Arg Leu Ser Asp Asp     370 375 380 Ser Ala Asn Asn His Arg Asn Ser Ile Thr Glu Asn Asn Thr Thr 385 390 395 400 Thr Ser Thr Asp Asn Asn Thr Met Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ile                 405 410 415 Thr Thr Ala Met Thr Ser Ala Ala Glu Leu Ala Lys Asp Val Glu             420 425 430 Asn Leu Asn Thr Ser Ser Ser Pro Ser Ser Asp Leu Tyr Ile Arg Ser         435 440 445 Val Cys Phe Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Thr Gly Ala Glu Asp     450 455 460 Arg Leu Ile Arg Ile Trp Asp Ile Glu Asn Arg Lys Ile Val Met Ile 465 470 475 480 Leu Gln Gly His Glu Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Pro Ser                 485 490 495 Gly Asp Lys Leu Val Ser Gly Ser Gly Asp Arg Thr Val Arg Ile Trp             500 505 510 Asp Leu Arg Thr Gly Gln Cys Ser Leu Thr Leu Ser Ile Glu Asp Gly         515 520 525 Val Thr Thr Val Ala Val Ser Pro Gly Asp Gly Lys Tyr Ile Ala Ala     530 535 540 Gly Ser Leu Asp Arg Ala Val Arg Val Trp Asp Ser Glu Thr Gly Phe 545 550 555 560 Leu Val Glu Arg Leu Asp Ser Glu Asn Glu Ser Gly Thr Gly His Lys                 565 570 575 Asp Ser Val Tyr Ser Val Val Phe Thr Arg Asp Gly Gln Ser Val Val             580 585 590 Ser Gly Ser Leu Asp Arg Ser Val Lys Leu Trp Asn Leu Gln Asn Ala         595 600 605 Asn Asn Lys Ser Asp Ser Lys Thr Pro Asn Ser Gly Thr Cys Glu Val     610 615 620 Thr Tyr Ile Gly His Lys Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Thr Thr Gln 625 630 635 640 Asn Asp Glu Tyr Ile Leu Ser Gly Ser Lys Asp Arg Gly Val Leu Phe                 645 650 655 Trp Asp Lys Lys Ser Gly Asn Pro Leu Leu Met Leu Gln Gly His Arg             660 665 670 Asn Ser Val Ile Ser Val Ala Val Ala Asn Gly Ser Pro Leu Gly Pro         675 680 685 Glu Tyr Asn Val Phe Ala Thr Gly Ser Gly Asp Cys Lys Ala Arg Ile     690 695 700 Trp Lys Tyr Lys Lys Ile Ala Pro Asn 705 710 <210> 2 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated Tup1 <400> 2 Met Thr Ala Ser Val Ser Asn Thr Gln Asn Lys Leu Asn Glu Leu Leu   1 5 10 15 Asp Ala Ile Arg Gln Glu Phe Leu Gln Val Ser Gln Glu Ala Asn Thr              20 25 30 Tyr Arg Leu Gln Asn Gln Lys Asp Tyr Asp Phe Lys Met Asn Gln Gln          35 40 45 Leu Ala Glu Met Gln Gln Ile Arg Asn Thr Val Tyr Glu Leu Glu Leu      50 55 60 Thr His Arg Lys Met Lys Asp Ala Tyr Glu Glu Glu Ile Lys His Leu  65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Glu Gln Arg Asp His Gln Ile Ala Ser Leu Thr Val                  85 90 95 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Gln Gln His Leu             100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ser Ala Ser Val Pro Val         115 120 125 Ala Gln Gln Pro Pro Ala Thr Ser Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala     130 135 140 Asn Thr Thr Thr Gly Ser Ser Ser Ala Phe Pro Val Gln Ala Ser Arg 145 150 155 160 Pro Asn Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Thr Thr Thr Leu Pro Val Val                 165 170 175 Ser Ser Asn Ala Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln             180 185 190 Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Val Val Ser Ala Pro Leu         195 200 205 Ser Asn Thr Ala Ile Asn Gly Ser Pro Thr Ser Lys Glu Thr Thr Thr     210 215 220 Leu Pro Ser Val Lys Ala Pro Glu Ser Thr Leu Lys Glu Thr Glu Pro 225 230 235 240 Glu Asn Asn Thr Ser Lys Ile Asn Asp Thr Gly Ser Ala Thr Thr                 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Glu Thr Glu Ile Lys Pro Lys Glu Glu             260 265 270 Asp Ala Thr Pro Ala Ser Leu His Gln Asp His Tyr Leu         275 280 285 <210> 3 <211> 533 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Thr Glu Asp Asn Ile Ala Pro Ile Thr Ser Val Lys Val Val Thr   1 5 10 15 Asp Lys Cys Thr Tyr Lys Asp Asn Glu Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Tyr              20 25 30 Glu Asn Ala Val Val Thr Lys Thr Ala Ser Gly Arg Phe Asp Val Thr          35 40 45 Pro Thr Val Gln Asp Tyr Val Phe Lys Leu Asp Leu Lys Lys Pro Glu      50 55 60 Lys Leu Gly Ile Met Leu Ile Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr  65 70 75 80 Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Lys His Asn Val Glu Phe Gln Thr                  85 90 95 Lys Glu Gly Val Lys Gln Pro Asn Tyr Phe Gly Ser Met Thr Gln Cys             100 105 110 Ser Thr Leu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Glu Gly Asn Asp Val Tyr Ala         115 120 125 Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Met Val Ser Pro Asn Asp Phe Val Val     130 135 140 Ser Gly Trp Asp Ile Asn Asn Ala Asp Leu Tyr Glu Ala Met Gln Arg 145 150 155 160 Ser Gln Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln Gln Arg Leu Lys Ala Lys Met                 165 170 175 Ser Leu Val Lys Pro Leu Pro Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala             180 185 190 Ala Asn Gln Asp Glu Arg Ala Asn Asn Cys Ile Asn Leu Asp Glu Lys         195 200 205 Gly Asn Val Thr Thr Arg Gly Lys Trp Thr His Leu Gln Arg Ile Arg     210 215 220 Arg Asp Ile Gln Asn Phe Lys Glu Glu Asn Ala Leu Asp Lys Val Ile 225 230 235 240 Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Val Glu Val Ser Pro Gly                 245 250 255 Val Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Gln Ser Ile Lys Asn Asp His             260 265 270 Glu Ile Ala Pro Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ala Ser Ile Leu Glu         275 280 285 Gly Val Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly     290 295 300 Leu Val Gln Leu Ala Glu His Glu Gly Thr Phe Ile Ala Gly Asp Asp 305 310 315 320 Leu Lys Ser Gly Gln Thr Lys Leu Lys Ser Val Leu Ala Gln Phe Leu                 325 330 335 Val Asp Ala Gly Ile Lys Pro Val Ser Ile Ala Ser Tyr Asn His Leu             340 345 350 Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Pro Lys Gln Phe Arg Ser         355 360 365 Lys Glu Ile Ser Lys Ser Ser Val Ile Asp Asp Ile Ile Ala Ser Asn     370 375 380 Asp Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Leu Gly Lys Lys Val Asp His Cys Ile 385 390 395 400 Val Ile Lys Tyr Met Lys Pro Val Gly Asp Ser Lys Val Ala Met Asp                 405 410 415 Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Ile             420 425 430 His Asn Val Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp         435 440 445 Leu Leu Val Met Thr Glu Phe Cys Thr Arg Val Ser Tyr Lys Lys Val     450 455 460 Asp Pro Val Lys Glu Asp Ala Gly Lys Phe Glu Asn Phe Tyr Pro Val 465 470 475 480 Leu Thr Phe Leu Ser Tyr Trp Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly                 485 490 495 Phe His Pro Val Asn Gly Leu Asn Lys Gln Arg Thr Ala Leu Glu Asn             500 505 510 Phe Leu Arg Leu Leu Ile Gly Leu Pro Ser Gln Asn Glu Leu Arg Phe         515 520 525 Glu Glu Arg Leu Leu     530

Claims (10)

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 288 내지 389 번째 위치의 아미노산의 일부가 치환, 삽입, 또는 유실되어 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드; 및
서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩티드;를 과발현하는 재조합 효모.A polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the first polypeptide has a defective function due to substitution, insertion, or loss of a part of the amino acid at positions 288 to 389; And
A second polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; 제 1 항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 재조합 효모.The method according to claim 1,
Wherein said first polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 288 내지 389 번째 위치의 아미노산의 일부가 치환, 삽입, 또는 유실되어 기능이 흠결된 제1 폴리펩티드를 과발현하고, 호흡결손 변이된 재조합 효모.A recombinant yeast overexpressing a first polypeptide deficient in function by substituting, inserting, or losing a part of the amino acid at position 288 to 389 position in a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제 6 항에 있어서,
서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩티드;를 과발현하는 재조합 효모.The method according to claim 6,
A second polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 인, 재조합 효모.The method according to any one of claims 1, 2, 6, and 7,
A recombinant yeast, which is Saccharomyces cerevisiae . 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 균주를 포함하는 알코올 생산용 조성물. A composition for producing an alcohol comprising a recombinant strain according to any one of claims 1, 2, 6, and 7. 삭제delete
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