KR101686437B1 - 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PTFE 튜브형 인공혈관의 제조 방법에 관한 것으로 PTFE을 방사하여 제조하는 생산 공정상에서 발생하는 엔도톡신을 생산 공정상에서 제거 할 수 있도록 하여 혈관 제조후에 추가 세척 작업이 없더라도 인체 내에 삽입시 생물학적안전성 확보된 제품을 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브 제조 방법{Manufacturing method of polytetrafluoroethylene tube for artificial blood vessel}

본 발명은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브형 인공혈관의 제조 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 PTFE을 방사하여 PTFE 튜브형 인공혈관을 제조하는 생산 공정상에서 발생하는 엔도톡신을 생산 공정상에서 제거 할 수 있도록 하여 혈관 제조 후에 추가 세척 작업이 없더라도 인체 내에 삽 입시 생물학적안전성 확보된 제품을 제조할 수 있는 인공혈관용 PTFE 튜브 제조 방법에 관한 것이다.

폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluroethylene, PTFE)는 내약품성, 내열성이 뛰어나며 비점착성, 저마찰계수 등의 특징을 가지고 있다. 다공질의 구조이기 때문에 투과성, 유연성 등이 우수하여 여과용 필터. 인공혈관 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 또한 생체적합성이 우수한 소재로 봉합사, 인공판막 등의 용도로도 사용되고 있다.

인공혈관은 크게 외과용 인공혈관, 스텐트용 인공혈관으로 나눌 수 있다. 외과용 인공혈관은 개복 수술시에 사용하는 것으로 혈관 손상, 폐쇄, 누공으로 인한 장기 내 혈액의 원활한 공급을 위한 손상 혈관 대체 및 혈관과 혈관의 연결용으로 사용한다. 사용 부위는 무릎 위, 복강, 흉부 등 다양하며 사용 부위에 따라 직경 4~10㎜, 두께도 200~500㎛로 다양하게 요구되어 진다.

스텐트용 인공혈관은 비개복 수술시 주로 사용하며 혈관 손상, 폐쇄 등으로 인해 좁아진 혈관을 정상 상태로 넓히기 위해 카테터 내에 삽입하여 사용한다. 사용 부위는 혈관용(관상동맥용, 말초혈관용, 뇌혈관용), 비혈관용(요관용, 담관용, 기관지용 등)으로 나뉘며 금속 스텐트와 스텐트용 인공혈관을 접착하여 사용한다. 스텐트용 인공혈관의 직경은 6~10㎜ 이며 두께는 100㎛ 이하로 외과용 인공혈관에 비해 두께가 얇은 편이다. 인공혈관 스텐트는 체내에 손상된 혈관을 대신해 주는 역할을 하는 인공장기로서 인공혈관 스텐트는 체내에 영구적 또는 반영구적으로 이식되어 환자에게 사용하기 때문에 체내 자극이 적으며 감염 및 염증 등의 면역 거부 반응을 일으키지 않아야 한다. 또한 다공성인 재료로 만들어져 적당한 투과성을 가져야 하며 계속되는 수축 및 팽창에 견디는 탄성과 유연성을 가져야 하고 혈류의 흐름이 원활하여야 하며 혈관 내면에 혈액이 응고되지 말아야 한다.

이러한 인공혈관 스텐트는 시술 부위에 카테터를 사용하여 체내에 삽입하여 배치된다. 일반적으로 이식 가능한 생체적합성 물질을 사용해야 하며, 보다 구체적으로는 얇고. 내구성이 있으며, 생체적합성인 관형 물질을 포함해야 한다.

금속 스텐트와 결합하여 사용하는 관형 물질로는 나일론, 실크, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌(PP), 폴리우레탄(PU), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리아미드(PA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌(PE), 폴리에스터(PES), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리비닐리덴플로아이드(PVDF), 폴리실록산(Silicone Rubber), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 폴리탁트산(PLA)을 원재료로 이용하여 위 스텐트와 결합하여 사용하고 있다 (대한민국 공개특허 제 2011-0107236호 참조).

PTFE 인공혈관 생산시 원재료 및 생산 공정에서 유입될 수 있는 엔도톡신은 주로 그람음성균(gram-negative bateria)에 존재하는 것으로 생물공정과정을 통해 만들어지는 치료용 단백질의 주된 오염요인 중의 하나로 알려져 있다. 엔도톡신은 미량이라도 인체에 직접 적용되는 용도로 사용하는 경우에는 체내에서 여러 가지 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 엔도톡신은 대부분의 단백질이 변성되는 조건인 고온에서도 활성이 유지되는 등 생물학적으로 안정된 상태를 유지하고 있다. 일반적으로는 엔도톡신을 효율적으로 파괴하기 위해서는 섭씨 200℃ 이상의 고온이나 최소한 0.1M 이상의 강산 또는 강염기 조건에 몇 시간동안 반응시켜야 하는 것으로 알려져 있다. (대한민국 공개특허 제 2010-0059171호 참조)

인공혈관과 같은 인체내 삽입하여 사용하는 의료기기의 안전성 테스트는 식약처에서 가이드라인을 정한 생물학적안전성테스트를 진행하여 안전성을 확인 할 수 있는데, 생물학적안전성테스트 항목 중 용출물 시험, 세포독성 시험, 피내반응 시험, 독성 시험, 발열성 시험, 용혈성 시험 등의 테스트를 통해서도 인체 삽입시 안전성 확인이 가능하다.

본 발명은 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE) 인공혈관의 생산 공정에서 발생하는 엔도톡신을 생산공정상에서 제거하여 혈관 제조 후에 추가 세척 작업이 없더라도 인체 내에 삽입시 생물학적안전성 확보된 제품을 제조할 수 있는 인공혈관용 PTFE 튜브 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브의 제조 방법은, 폴리테트라플루오로에틸렌을 방사하여 튜브형태로 제조하는 단계; 상기 방사된 튜브를 열건조하여 윤활제를 증발시켜 상기 튜브의 표면에 기공을 형성시키는 단계;와 기공이 형성된 상기 튜브를 에어크린을 통해 생산공정상에서 발생한 이물질을 제거하는 단계:와 이물질이 제거된 상기 튜브를 50 - 65 ℃의 아세톤에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조시키는 제 1세척 단계;와 상기 제 1세척 단계를 거친 튜브를 70 - 85 ℃의 에탄올에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조 시키는 제 2세척 단계;와 상기 제 2세척 단계를 거친 튜브를 과산화수소, 과초산, 초산 및 증류수로 이루어진 혼합물에 침지하여 세척 시키는 제 3세척 단계;와 상기 제 3세척 단계를 거친 튜브를 100℃이상의 증류수에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조 시키는 제 4세척 단계;를 포함함을 특징으로 한다.

여기서, 상기 각 용매의 온도 범위는 각 용매의 비점을 고려하여 산정한 것이다.

상기에서, 제 3세척단계에서, 상기 혼합물은 온도 35℃의 증류수에 과산화수소 3~5중량%, 과초산 0.5~1중량%을 넣고 초산 0.01~0.05중량%를 혼합한 것일 수 있다.

일반적으로 생산공정상에서 PTFE 튜브의 세척 작업은 이루어지지 않으나 본 발명에서는 상기와 같은 제 1 - 제4의 일련의 세척과정을 통해, 엔도톡신이 완전히 제거되어 혈관 제조 후에 추가 세척 작업이 없더라도 인체 내에 삽입시 생물학적 안전성이 확보된 제품을 제조할 수 있게된다.

또한 본 발명의 제조방법은 생산 시간 단축 및 작업과정 단일화를 통해 비용 절감을 꾀할 수 있게된다.

상기 방법으로 제조된 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브는 두께가 50~100㎛이고, 파열강도가 1.5MPa 이상이고, 혈액누수율이 10㎖/㎠/min 이하인 것일 수 있다.

본 발명에서는 인공혈관용으로 사용하는 PTFE를 압출을 통해 방사 후 DRY zone을 통해 윤활제를 휘발시킨 후 PTFE 표면의 기공을 발생시킨다. 이러한 기공은 인공혈관으로 적용시 세포의 증식이 용이한 환경을 만들어 주는 역할을 한다. 또한 300~400℃의 DRY zone에서 PTFE 튜브를 적당한 speed로 잡아당겨 연신을 통해 PTFE 튜브의 두께 및 직경을 조정할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 에어크린을 통해 생산공정상에서 발생한 이물질을 제거하고 온도 56.6℃로 가열시킨 아세톤 99.9%에 1~5분간 Dipping 후 세척 후 UV 램프를 거쳐 건조 시킨다. 온도 78℃로 가열시킨 에탄올 99%에 1~5분간 Dipping 후 세척 후 UV 램프를 거쳐 건조 시킨다. 마지막으로 온도 100℃이상의 증류수에 1~5분간 Dippping 후 세척 과정을 거친다. UV 램프를 이용한 건조는 PTFE 튜브 세척시 옆 챔버로 이동시에 발생할 수 있는 오염을 방지해 주는 역할을 한다.

본 발명에 따라 제조된 PTFE 인공혈관은 제조 공정상에 엔도톡신이 제거되어 추가 cleaning 공정을 거치지 않아도 되어 생산 공정에 대한 비용 발생을 줄일 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조과정을 설명하기 위한 개략도이다.

폴리테트라플루오로에틸렌 튜브의 형성.

PTFE 파우더와 액체 윤활제를 혼합한 후에 이를 압출하여 직경 6㎜ 외경의 튜브를 제조한다. 제조된 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브는 두께가 50-100㎛이고, 파열강도가 1.5MPa 이상이고, 혈액누수율이 10㎖/㎠/min 이하이었다.

제조한 PTFE 인공혈관은 Dry zone을 거쳐 윤활제를 휘발시키고 일정한 speed를 주어 연신을 시킨 후 에어크린을 통해 강한 에어로 이물질을 제거한다.

세척과정

첫 번째로 온도 56.6℃로 가열시킨 아세톤 99.9%에 1~5분간 Dipping 후 윤활제 및 이물질을 제거 후 열풍 건조 시킨다.

두 번째로 온도 78℃로 가열시킨 에탄올 99%에 1~5분간 Dipping 후 세척 후 열풍 건조 시킨다.

이러한 세척 단계를 거쳤음에도 불구하고 엔도톡신이 완전히 제거되지 않아 열발생이 일어나는 것을 방지하기 위해, 다음 단계에서 혼합물을 통해 세척을 진행한다. 이 혼합물의 구성은 Hydrogen Peroxide (과산화수소), Peracetic acid (과초산), Acetic acid, 증류수로 되어 있다.

Hydrogen Peroxide(과산화수소)는 일반 세균, 바이러스, 결핵균, 진균 등의 제거시에 효과가 있으며 Hydrogen Peroxide(과산화수소)와 Hydrogen Peroxide (과초산)을 함께 사용하는 경우에는 세균 제거시 상승 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

Hydrogen Peroxide (과초산)는 일반적으로 단 몇 방울로 다양한 종류의 세균을 박멸하는 강력한 성능을 갖고 있으며 미생물의 세포외막을 산화시킴으로써 살균작용을 하는 원리를 갖고 있으며 자연으로 쉽게 되돌아가는 성분들로 이루어져 있다. 사용되는 분야로는 의료장비 살균 세척, 식품, 음료, 주류 생산 공정의 살균세척제, 냉각탑 용수, 채광 공정 용수, 식품 가공 용수, 펄프 및 제지 공장 용수 등을 포함하는 산업용수의 살균 세척에 유용하게 이용되고 있다. 사용 후 초산, 산소, 물로 분해되며 초산은 쉽게 생분해되고 COD 영향을 적게 주는 것으로 알려져 있어 환경 친화적인 장점이 있다. 과초산은 pH와 온도의 영향을 받는데 pH가 낮을 때, 온도가 높을때 더 효과적이며 물의 온도가 15℃일 때 35℃일 때보다 과초산의 양이 5배 더 필요하다. 이 화합물은 온도 35℃의 증류수에 Hydrogen Peroxide 3~5%, Peracetic acid 0.5~1%을 넣고 Peracetic acid의 살균 세척 효과 기능을 최대화하기 위해 pH를 6이하로 맞춰주기 위해 Acetic acid 0.01~0.05%를 혼합하여 만들어서 사용한다.

상기와 같은 혼합물로 세척 후 엔도톡신이 완전히 제거된 것으로 확인이 되었다. 그러나 마지막 단계인 증류수 세척 단계로 가는 도중에 오염물질에 노출이 되어 LAL Test 결과 열 발생이 일어나는 것으로 확인이 되었다. 이에 화합물은 인체에 유해할 가능성이 있으므로 이를 제거하기 위해 마지막 단계인 증류수를 통한 1~5분간의 Dipping 후 rinse 단계를 추가하였다. 증류수 rinse 단계로 가는 과정에서 오염물질에 노출되지 않도록 하기 위해 PTFE 튜브가 이동하는 경로에 UV램프를 설치하였다. 증류수 rinse 후 열풍 건조를 거쳐 멸균백에 포장하는 단계로 가는 경로에도 UV램프를 설치하여 엔도톡신으로부터 완전히 차단하는 것이 바람직하다.

이하에서는 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브(본 발명의 세척과정을 거치기전의 튜브)를 여러 경우의 세척과정을 통해 엔도톡신의 제거여부를 확인하였다.(실시예 1 - 2) 또한 상기에서 제조된 본 발명의 PTFE 인공혈관의 세포독성 시험, 피내반응시험, 독성시험, 발열성 시험 및 용혈성 시험을 하였다.(실시예 3 - 7)

실시 예 1. LAL ( Limulus amebocyte lysate ) TEST

PTFE 인공혈관을 체내에 삽입 하였을 때 이물질이 있을 경우에는 열 발생이 일어나게 된다. PTFE 인공혈관의 생산 공정 및 cleaning 공정에서의 이물질 존재 여부를 확인하기 위해 LAL(Limulus amebocyte lysate)시약의 정성 시험 분석법인 Gel clot 방법을 이용하여 gel 형성 유무에 따른 열 발생 인자인 엔도톡신의 유무를 확인하였다.

표 1은 PTFE 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것)을 아세톤, 에탄올 세척 후에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

Negative Water Control	Positive Water Control	Negative Product Control	Positive Product Control
-	+	+	+

→ 엔도톡신 완전히 제거되지 않음 확인

표2는 PTFE 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것)을 아세톤, 에탄올, 혼합액, 증류수 세척 후(세척 중간에 UV램프 미적용)에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

Negative Water Control	Positive Water Control	Negative Product Control	Positive Product Control
-	+	+	+

→ 엔도톡신 완전히 제거되지 않음 확인

표3은 PTFE 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것) 본 발명에 의한 세척공정 후(세척 중간에 UV램프 적용)에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

Negative Water Control	Positive Water Control	Negative Product Control	Positive Product Control
-	+	-	+

→ 엔도톡신 제거 확인

실시 예 2. 용출물 시험

■ 시험물질 준비 (PTFE 인공혈관)(세척과정 거치기전 튜브형태의 것)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다.(표4)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	70℃, 24h

■ 시험방법

1) 성상

용출이 끝난 후 검액 5㎖를 시험관에 넣고 흰색을 배경으로 하여 관찰한다.

2) pH

검액 및 공시험액 20㎖씩을 취하여 여기에 염화칼륨용액(1.0g/L) 1.0㎖씩을 넣고 두 액의 pH를 측정하여 그 차이를 산출한다.

3)과망간산칼륨환원성물질

검액 20㎖를 마개 달린 삼각플라스크에 취하고, 묽은황산 1㎖를 넣고 0.002mol/L 과망간산칼륨액 20.0㎖ 넣은 다음 3분간 끓여 식힌 다음 요오드화칼륨 0.10g을 넣어 마개를 단단하게 하고 흔들어 섞어 10분간 방치한 다음 0.01mol/L 티오황산나트륨액으로 적정한다. (지시약: 전분시액 5방울) 따로 공시험액 20.0㎖를 써서 같은 방법으로 조작한다. 검액 및 공시험액을 적정하는데 소비된 0.002mol/L 과장간산칼륨액의 소비량의 차이를 산출한다.

4) 증발잔류물

검액 20㎖를 취하여 수욕상에서 증발건조하고 잔류물을 105℃에서 1시간 건조하여 무게를 달고, 증발전의 무게와 증발 후의 무게차를 산출한다.

5) 자외가시부흡수스펙트럼

검액을 가지고 공시험액을 대조로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 250~350㎚의 각각의 구간에서의 최대흡광도를 기록한다.

6) 중금속

검액과 공시험액 각 10㎖과 납표준액 2㎖을 네슬러관에 취하여 묽은 아세트산 2㎖와 물을 넣어 50㎖로 하고 각각 검액과 비교액으로 한다. 검액과 비교액에 황화나트륨 시액 1방울씩을 넣고, 5분간 방치한 다음, 2개의 관을 백색 배경하에서 관찰한다.

■ 시험결과

표5는 PTFE 튜브형 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것) 아세톤, 에탄올 세척 후(세척 중간에 UV램프 미적용)에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

시험항목	시험기준	시험결과	판정
성상	검액은 무색투명하고 이물이 없음	검액은 무색투명하고 이물이 없음	P
pH	1.5이하	0.16	P
과망간산칼륨환원성물질	소비량의 차 2.0㎖ 이하	2.16㎖	F
증발잔류물	잔류물의 차 1.0㎎ 이하	1.1㎎	F
자외가시부흡수스펙트럼	0.1 이하	0.130	F
중금속	검액이 비교액보다 진하지 않아야 한다.	검액이 비교액보다 진하지 않음	P

→ 과망간산칼륨환원성물질, 증발잔류물, 자외가시부흡수스펙트럼 시험항목 Fail 됨

표6은 PTFE 튜브형 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것) 아세톤, 에탄올, 혼합액 세척 후 (세척 중간에 UV램프 미적용, 증류수 세척 없음)에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

시험항목	시험기준	시험결과	판정
성상	검액은 무색투명하고 이물이 없음	검액은 무색투명하고 이물이 없음	P
pH	1.5이하	0.16	P
과망간산칼륨환원성물질	소비량의 차 2.0㎖ 이하	2.16㎖	F
증발잔류물	잔류물의 차 1.0㎎ 이하	0.41㎎	P
자외가시부흡수스펙트럼	0.1 이하	0.045	P
중금속	검액이 비교액보다 진하지 않아야 한다.	검액이 비교액보다 진하지 않음	P

→ 과망간산칼륨환원성물질 시험항목 Fail 됨

표7은 PTFE 튜브형 인공혈관(세척과정 거치기전 튜브형태의 것) 본발명 공정 후(세척 중간에 UV램프 적용)에 엔도톡신이 검출되는지에 대한 결과이다.

시험항목	시험기준	시험결과	판정
성상	검액은 무색투명하고 이물이 없음	검액은 무색투명하고 이물이 없음	P
pH	1.5이하	0.16	P
과망간산칼륨환원성물질	소비량의 차 2.0㎖ 이하	1.01㎖	P
증발잔류물	잔류물의 차 1.0㎎ 이하	0.41㎎	P
자외가시부흡수스펙트럼	0.1 이하	0.045	P
중금속	검액이 비교액보다 진하지 않아야 한다.	검액이 비교액보다 진하지 않음	P

실시 예 3. 세포독성 시험

■ 시험물질 준비 (본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다. (표 8)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	(37±1)℃, (24±2)h

■ 대조물질 준비

음성대조 및 양성대조 물질

음성대조물질(HDPE, High Density Polyethylene) 및 양성대조 물질(Natural Rubber)을 시험물질 준비와 같은 용출조건으로 용출하여 시험에 사용하였다.

■ 시험방법

세포의 단층배양과 그 형태 및 세포의 양을 현미경으로 확인하고, 6 Well Plate에 각 Well에 세포배양액 4㎖씩 분주하였다. 1일 배양 후 세포의 단층배양상태를 확인하고, 세포의 Confluency가 80%이상이면, 각 Well의 배양액을 제거한 후, 공시험액, 시험물질, 음성대조물질 및 양성대조물질의 추출액을 4㎖씩 처리하여 배양한다. 배양 후 24시간, 48시간에 현미경을 이용하여 세포의 성장정도 및 용해정도를 관찰하였다. 관찰 결과는 아래의 표에 따라 등급을 판정한다. 음성대조물질 용출액을 적용한 세포의 등급이 0등급, 양성대조물질 용출액을 적용한 세포의 등급이 4등급 이상일 경우, 시험상태가 적합한 것으로 판단한다. 시험물질을 적용한 세포를 관찰한 결과, 판정 등급이 2이하일 경우, 시험물질 용출액에 세포독성이 없는 것으로 판정하였다.

표9는 등급설명이다.

등급	반응도	배양세포의 상태
0	없음 (None)	세포질내 과립(intracytoplasmic granule)의 분리, 세포 용해 없음,세포성장의 저해 없음
1	아주미약 (Slight)	세포의 모양이 둥글게 되고, 느슨하게 부착되어 있으며, 세포질 내 과립이 소실되었거나, 형태에 변화를 보인 세포가 20%를 넘지 않음. 때때로 용해된 세포가 존재하고; 약간의 성장 저해가 관찰됨
2	미약 (Mild)	세포의 모양이 둥글게 되고, 세포질 내 과립이 소실된 세포가 50%를 넘지 않고, 광범위한 세포 용해는 보이지 않음. 세포의 성장 저해가 50%를 넘지 않음.
3	중증도 (Moderate)	세포의 모양이 둥글게 되었거나 용해된 세포가 70%를 넘지 않음. 세포층이 완전히 파괴되지는 않았으나 50%이상의 성장 저해를 보임
4	심함 (Severe)	세포층이 거의 또는 완전히 파괴 됨

■ 시험결과

표10은 본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관의 세포독성 시험 결과이다.

	세포독성 등급
	초기			24시간			48시간
PTFE 튜브형인조혈관 용출액	0	0	0	0	0	0	0	0	0
음성대조물질 용출액	0	0	0	0	0	0	0	0	0
양성대조물질 용출액	0	0	0	4	4	4	4	4	4
공시험액	0	0	0	0	0	0	0	0	0

세포독성시험결과, 음성대조물질 용출액을 적용한 세포는 0등급, 양성대조물질 용출액을 적용한 세포는 4등급으로서, 시험과정 및 시험조건 중 특이사항은 없었다. 시험물질 용출액의 결과는 0으로서 세포의 용해 정도나 성장저해 정도가 거의 나타나지 않았으므로, 본 시험 조건하에서 사용된 본발명에 의해 제조된 PTFE 튜브형 인공혈관은 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

실시 예 4. 피내반응 시험

■ 시험물질 준비 (본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다. (표 11)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	(70±2)℃, (24±2)h

■ 대조물질 준비

음성대조물질을 시험물질 조제와 같은 용출조건으로 용출하여 시험에 사용하였다.

■ 시험과정

시험(투여) 4~18시간전에 토끼의 등 부위를 제모하였다. 용출액을 투여하기에 충분한 공간을 확보할 수 있도록, 척추 주변을 충분히 제모하였다.

척추를 중심으로 한쪽 면(두부 좌축면 상단)에는 극성용매로 용출한 0.2㎖를 투여하였다. 시험물질을 피내투여 하기에 적절한 최소한의 주사침을 이용하였다. 유사한 방법으로, 각 토끼의 다른면(두부 우측면 상단)에 극성용매 대조액 0.2㎖를 투여하였다. 각 토끼의 아래쪽(미부 좌측면 하단 및 우측면 하단)에도 동일한 방법으로 비극성용매의 시험액과 대조액을 투여하였다. 만약 다른 용출용매가 사용된다면, 다른 용출용매로 용출한 시험액 및 대조액에 대해서도 상기의 과정을 반복한다.

■ 시험결과

투여 후 72시간동안 조직반응정도를 기록하고, 한 마리의 시험물질과 대조물질에 대한 모든 홍반과 부종의 피부반응점수를 합산하였다. 각각의 합산한 값을 15(관찰시간대(3)X시험군 또는 대조군 투여 부위(5)로 나누어 시험물질의 점수와 대조물질의 점수에 대한 평균값을 산정하였다. 나머지 두 마리도 같은 방법으로 평균을 구했다. 세 마리의 평균을 합산한 뒤 3으로 나누어 전체 평균을 계산하였다. 만약 시험액 투여부위의 평균점수와 대조액 투여부위의 평균점수의 차가 1 또는 1이하이면 적합으로 판정한다. 만약 어떠한 관찰기간 동안 시험액 투여부위의 평균반응이 대조액 투여부위의 평균반응보다 유의성 있게 크다면, 토끼 3수로 재시험한다.

표 12는 본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관의 피내반응 시험결과이다.

용출액	시험액 평균점수	대조액 평균점수	차이
SC	0.00	0.00	0.00
CSO	0.38	0.15	0.23

위의 표와 같이 시험액 투여부위와 대조액 투여부위의 평균점수의 차는 어떤 관찰기간중에서도 1.0을 초과하지 않았다. 따라서 시험액 투여부위에서 유의성 있는 자극이나 독성증상을 발견할 수 없었다.

실시 예 5. 독성 시험

■ 시험물질 준비(본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다. (표 13)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	(70±2)℃, (24±2)h

■ 대조물질 준비

음성대조물질을 시험물질 조제와 같은 용출조건으로 용출하여 시험에 사용하였다.

■ 시험 과정

시헐물질과 대조물질 용출액을 1회 Mouse에게 투여하였다. 모든 시험계는 투여 전 4~6시간 전 부터 절식을 실시하며, 투여직전 체중을 측정하여 투여량을 환산하였다. 각 군당 ICR 마우스 5수씩 4개 군으로 나누어 시험하였다. 임상증상 관찰은 시험물질 용출액을 투여한 모든 동물에 대하여 투여 후 4시간 및 종료일까지 1일 1회 외관적 이상 및 임상증상 사망동물 및 이상 징후의 발생여부와 그 정도를 관찰하였다. 모든 동물에 대하여 투여일, 투여 1일차, 투여 2일차, 그리고 실험 종료일 (투여 3일차)에 체중을 측정하였다.

■ 시험 결과

본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관의 독성 시험 결과

1) 체중: 시험물질 용출액을 투여한 모든 군에서 정상적인 체중 증가를 나타냄

2) 사망동물: 시험기간 동안 사망한 동물 없음

3) 임상적 관찰: 시험물질 용출액을 투여한 모든 군에서 본 시험물질 용출액에 의한 것이라고 인정되는 임상증상 및 행동이상 등도 관찰되지 않음

실시 예 6. 발열성 시험

■ 시험물질 준비(본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다.(표 14)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	(70±2)℃, (24±2)h

■ 시험 과정

시험개시 최소 1시간 전에 토끼를 보정기에 보정하였다. 최초 체온측정 후, 30분 간격으로 2회 더 측정하였다. 맨 마지막 체온 즉, 3회 차의 체온을 대조체온으로 하였다. 최초 체온이 39.8℃가 넘는 동물은 시험에 사용하지 않고, 시험동물간 대조체온의 차이는 1℃이하였다. 토끼의 이개정맥으로 검액을 투여하며, 투여용량은 10㎖/㎏로 하였다. 최종 투여 후 1시간이 경과된 시점에서 체온을 측정하였고, 체온은 30분 간격으로 5회 측정하였다.

■ 시험 결과

대조체온(투여전 3회 차 체온)과 투여 후 체온측정치 5회 분을 각각 비교하여, 체온의 최대 차를 기록하였다. 시험동물 중 1수라도 0.5℃ 이상의 체온상승이 없을 경우, 적합으로 판정하였다. 만약 0.5℃ 이상의 체온상승이 있는 경우, 시험동물 5수를 추가하여 재시험을 실시해야 한다. 이때의 판정은 0.5℃ 이상의 체온 상승이 총 8수 중 3수 이하이거나 8수 전체의 체온상승 합계가 3.3℃를 초과하지 않으면 적합한 것으로 판정하였다.

표15는 본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관의 발열성 시험결과이다.

토끼번호	체중 (㎏)	투여량 (㎖)	대조체온 (℃)	투여 후 경과시간					체온변화(℃)
				1.0	1.5	2.0	2.5	3.0
시험
1	1.768	17.7	39.3	39.2	39.2	39.2	39.2	39.3	0.0
2	1.855	18.6	39.4	39.2	39.3	39.3	39.3	39.2	0.0
3	1.830	18.3	39.1	38.7	38.8	38.8	38.8	39.0	0.0
TOTAL RISE:									0

대조 체온과 투여 후 체온측정치 5회 분을 각각 비교하였을 때, 0.5℃ 이상의 체온상승을 보이는 시험동물은 발견되지 않았다.

실시 예 7. 용혈성 시험

■ 시험물질 준비 (본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관)

시험물질의 준비는 ISO 10993-12:2012에 따라 수행하였다.(표 16)

검체두께 및 형태	중량	용출용매량	용출조건
무정형	4g	20㎖	(70±2)℃, (24±2)h

■ 대조물질 준비

1) 음성대조 및 양성대조 물질

음성대조물질(High-density Polyethylene RM) 및 양성대조물질(증류수)을 시험물질 준비와 같은 용출조건으로 용출하여 시험에 사용하였다.

■ 시험 과정

시험물질 용출액 7㎖에 희석된 토끼의 혈액 1㎖을 넣고 37℃에서 3h 방치한 후 800g로 15min 원심분리하고 상층액 1.0㎖과 Drabkin's 시약 1.0㎖을 섞어주었다. 최종용액을 15min동안 정치시키고 spectrophotometer를 이용해 540nm의 파장에서 흡광도를 읽었다. 같은 방법으로 대조 물질을 사용하여 시험한다.

■ 시험 결과

표 17은 본 발명에 의해 제조된 PTFE 인공혈관의 용혈성 시험결과이다

구분	혈장 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖)	전혈 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖)	희석된 혈액의 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖)
평균	0.49	111.43	11.05

용혈성시험결과 평균용혈도가 2.0%이하 이므로, 본 시험 조건하에서 사용된 시험물질은 용혈성이 없는 것으로 판단된다.

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Claims (3)

1. 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브의 제조 방법에 있어서,
   폴리테트라플루오로에틸렌을 방사하여 튜브형태로 제조하는 단계;
   상기 방사된 튜브를 열건조하여 윤활제를 증발시켜 상기 튜브의 표면에 기공을 형성시키는 단계;
   기공이 형성된 상기 튜브를 에어를 통해 생산공정상에서 발생한 이물질을 제거하는 단계:
   이물질이 제거된 상기 튜브를 50 - 65 ℃의 아세톤에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조시키는 제 1세척 단계;
   상기 제 1세척 단계를 거친 튜브를 70 - 85 ℃의 에탄올에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조 시키는 제 2세척 단계;
   상기 제 2세척 단계를 거친 튜브를 과산화수소, 과초산, 초산 및 증류수로 이루어진 혼합물에 침지하여 세척 시키는 제 3세척 단계; 및
   상기 제 3세척 단계를 거친 튜브를 100℃이상의 증류수에 1~5분간 침지하여 세척 후 UV 램프를 통해 건조 시키는 제 4세척 단계;를 포함함을 특징으로 하는 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브의 제조 방법.
2. 상기 제 3세척단계에서, 상기 과산화수소, 과초산, 초산 및 증류수로 이루어진 혼합물은 온도 35℃의 증류수에 과산화수소 3~5중량%, 과초산 0.5~1중량%을 넣고 초산 0.01~0.05중량%를 혼합한 것임을 특징으로 하는 인공혈관용 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브의 제조 방법.
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