KR101676121B1 - 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법 및 이를 이용한 약물 전달체의 제조 방법 - Google Patents

포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법 및 이를 이용한 약물 전달체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 및 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계를 포함하는, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법에 관한 것으로, 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 세포사멸 유도에 의하여 사멸된 세포 표면에 외재화되므로, 이를 분리 정제할 경우 복잡한 구조를 나타내는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있다. 나아가, 상기 제조된 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 활성화된 대식세포의 CD14와 특이적으로 결합하므로, 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 포함하는 약물전달체는 활성화된 대식세포 표적 용도로 사용할 수 있다.

Description

포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법 및 이를 이용한 약물 전달체의 제조 방법 {A method for preparing phosphatidylinositol phosphate and a drug delivery carrier using the same}
본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법, 이를 이용한 활성화된 대식세포 표적용 리포좀 조성물의 제조방법, 및 그로부터 제조된 약물 전달체에 관한 것이다.
포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)는 Ins(1,4,5)P3, Ins(1,3,4,5)P4 와 같은 myo-이노시톨 포스페이트 및 디아실글리세롤으로 구성되는, 세포막의 세포질층에 위치하는 물질이다. 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 이펙터 단백질의 PIP-결합 도메인을 끌어오는 세포질에서의 닻(anchor)이자, 다양한 자극에 의해 유도되는 신호전달을 증폭하는 단백질 활성제로서 생물학적 회로의 온/오프 스위치를 제공하는 역할을 한다(L. C. Cantley, Science 296, 1655, 2002). 예를 들어 세포의 성장 및 생존에 필수적인 동화작용에 대한 신호경로를 활성화시킨다(T. Balla, Physiol Rev 93, 1019, Jul 2013). 이와 같이 포스파티딜이노시톨 포스페이트는, PI3K/Akt 신호, 인슐린 신호, 엔도사이토시스(endocytosis), 엑소사이토시스(exocytosis), 소포 왕래(vesicle trafficking), 세포 이동, 증식 등 거의 대부분의 생물학적 경로에서 필수적인 세포 내 조정자의 역할을 한다고 알려져 있다.
한편, 포유류 세포에서 인지질은 세포막의 내층(inner leaflet)과 외층(outer leaflet) 사이에 비대칭적으로 분포한다. 예를 들어 포스파티딜세린(PtdSer)과 포스파티딜에타놀아민(PtdEtn)은 세포질 층에 주로 한정되어 있는 반면, 포스파티딜콜린(PtdCho)과 스핑고마일린(SM)은 외질 층(exoplasmic leaflet)에 국한되어 있다.
인체 내에서 세포는 사멸이 유도되면 상기와 같은 인지질의 비대칭적 분포가 붕괴되어 다양한 신호를 나타내므로 대식세포(macrophage)에 의하여 제거된다. , 특히 세포질에 존재하는 포스파티딜세린이 세포 표면에 노출되어 식세포 포식 작용을 유도하는 신호(eat-me signal)로 작용한다고 알려져 있다(D. Marguet et al., Nat Cell Biol 1, 454, 1999). 그러나 포스파티딜이노시톨 포스페이트과 대식세포의 포식 작용과의 관계에 대해서는 알려진바 없다.
한편, 약물전달시스템 (Drug Delivery System: DDS)이란 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로서 약물의 부작용을 줄이고, 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며 효능 및 효과를 극대화 할 수 있도록 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하는 기술을 총칭한다.
약물전달시스템에 사용되는 대표적인 약물 전달체인 리포좀은 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막(lipid bilayer membrane)으로 구성되는 대표적인 약물 전달체이다. 리포좀은 수성상에 의하여 분리된 많은 동심 지질 이중층 (멀티라멜라 소포 또는 MLV) 또는 단일 막 이중층 (유니라멜라 소포)을 포함할 수 있다.
상기 리포좀 등 약물 전달체를 이용한 종양 특이적 약물 전달이 암 치료 분야에서 많은 관심을 모으고 있다. 예를 들어 한국등록특허 제1,270,878호는 인터루킨-4(IL-4) 수용체를 특이적으로 표적하는 펩타이드를 표지한 리포좀을 이용한 표적지향형 약물전달시스템에 대하여 기재하고 있다. 그러나, 보다 효과적인 약물 전달체 개발의 필요성이 여전히 요구되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 대식세포를 표적으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 사멸된 세포에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 외재화되며, 이에 따라 대식세포가 CD14 수용체를 통하여 세포사멸을 인식할 수 있음을 확인하고, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 생성조건 및 상기 조건 하에서 생성된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리하고 리포좀 구성요소로 이용함으로써 대식세포에 특이적으로 약물을 전달할 수 있도록 하는 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 및 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계를 포함하는, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계; 및 상기 분리된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 약물 전달체 표면에 결합시키는 제3단계를 포함하는, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 및 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계를 포함하는, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 다양한 세포에 세포사멸 유도제를 처리할 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 사멸 유도된 세포의 표면에 외재화되어 나타남을 확인하였다(도 1a, 도 2a, 2b, 및 2d). 이러한 외재화는 세포사멸 유도제의 종류나 세포의 종류와는 무관하게 나타났다(도 2c). 또한 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 세포사멸 유도제 처리 2 내지 10시간에 가장 높은 농도로 나타남을 확인하였다. 따라서 이를 분리 정제할 경우 복잡한 구조를 나타내는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명에서의 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법을 구체적으로 설명한다.
먼저, 제1단계는 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 단계이다.
세포사멸은 세포 수축, 핵의 응축 및 세포막 기포형성이 일어나, 세포가 사멸에 이르는 것으로, 상기 세포 수축은 세포골격의 손상에 의한 세포 크기 감소, 세포질 응집 및 세포내 소기관들의 밀집을 의미하고, 핵 응축은 단백질분해효소와 핵산분해효소에 의한 핵 파괴 및 염색질(chromatin)이 응축되는 일련의 과정을 의미한다. 세포사멸이 진행되는 세포는 세포막에 기포가 발생하고 전체적으로 예정세포사체(apoptotic body)라 불리는 소체를 형성한다 (Kerr et al. 1972).
상기 세포사멸 유도제는 상기와 같은 세포사멸을 유도할 수 있는 물질로서 당업계에 알려진 물질이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 일 예로 상기 세포사멸 유도제는 덱사메타손, 캄프토테신, 에토포사이드, 및 사이클로헥시미드로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 세포사멸 유도제의 처리는 예를 들어 목적하는 세포의 배지에 세포사멸 유도제를 포함하여 세포에 처리하거나, 배양되는 세포 위에 도포하여 이루어질 수 있으나, 당업계에서 세포에 물질을 처리하는 방법이라면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.
제1단계는 세포사멸 유도제를 2시간 내지 10시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다. 일 예로 제1단계는 덱사메타손 또는 캄프토테신을 5시간 내지 7시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다. 다른 일 예로 상기 제1단계는 사이클로헥시미드를 3시간 내지 5시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 덱사메타손 또는 캄프토테신을 5시간 내지 7시간 동안 세포에 처리한 결과, 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 사멸 세포 표면으로 외재화되어 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다(도 3a). 다른 실시예에서, 사이클로헥시미드를 2 내지 10시간 세포에 처리한 결과, 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 사멸 세포 표면으로 외재화되어 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).
상기 제1단계에서, 세포사멸 유도제인 덱사메타손은 15 내지 25 μM의 농도로, 상기 캄프토테신은 2 내지 5 μM의 농도로. 상기 에토포사이드는 80 내지 120 μM의 농도로, 상기 사이클로헥시미드는 150 내지 250 μM의 농도로 세포에 처리될 수 있다. 상기 농도에서 세포사멸이 효과적으로 나타나므로 이에 따라 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
제2단계는 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 단계이다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 일 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 정상 세포에서 세포막의 내층, 즉 세포질 층에 위치하나, 인비트로에서 세포사멸 유도제에 의하여 사멸을 유도할 경우, 세포사멸 초기단계 및 2차 세포 괴사 단계에서 사멸세포의 표면에 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 외재화되는 것을 확인하였다. 따라서 이를 분리 정제할 경우 복잡한 구조를 나타내는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명자들은 상기와 같은 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 외재화가 세포사멸 유도제의 종류 또는 세포의 종류와 상관없이 이루어짐을 확인하였다.
사멸 세포에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리하는 방법은 세포로부터 산성 지질을 분리하는 단계; 및 상기 산성 지질로부터 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 대한 일 실시예에서는 세포에 TCA 및 클로로포름 및 염산을 가하여 세포로부터 산성 지질을 분리하였으나, 당업계에서 세포로부터 산성 지질을 분리하는 방법이라면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리하는 단계는 크로마토그래피 등 당업계에서 산성 지질로부터 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리, 정제하는 방법이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 크로마토그래피는 얇은막 크로마토그래피법(thin layer chromatography; TLC), HPLC 법(High-performance liquid chromatography), 또는 그의 혼합방법을 포함할 수 있다. 세포 사멸이 유도되지 않을 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 세포 외부에 노출되지 않으므로, 상기 방법에 의하여 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 분리할 수 없다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 약물 전달체 표면에 결합시키는 단계를 포함하는, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계; 및 상기 분리된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 약물 전달체 표면에 결합시키는 제3단계를 포함하는, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체의 제조방법을 제공한다. 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 모방하여 행동하는 이노시톨-6-포스페이트(InsP6)를 이용하여 복강 대식세포에 의한 흡수를 평가한 결과, 활성화된 Thio-pMacs와 RAW264.7 는 이노시톨-6-포스페이트를 효과적으로 포식하며, 이러한 효과는 처리 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다(도 7a 내지 도 7c).
본 발명의 다른 실시예에서, InsP6 또는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹은 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와 염 브릿지에 의해 고정되는 것으로 나타났다(도 8a). 산성 이노시톨 포스페이트 그룹은 단백질의 염기성 아미노산 잔기에 결합하는데 필수적이므로, CD14에서 아르기닌의 염기성의 잔기인 R93, R148, R150, R230가 단백질-지질 결합을 중재할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 야생형 재조합 CD14 수용체는 곧바로 사멸세포의 표면에 결합하는 반면, PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 차단하도록 변이된 CD14 수용체의 경우 사멸세포를 사로잡을 수 없었다(도 9). 이러한 결과는, CD14가 사멸세포에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3와 직접 결합함으로써 사멸세포를 인식함을 시사하는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, CD14가 결손된 마우스의 간 쿠퍼 세포는 IC-InsP6 를 거의 포식하지 못한 반면, 야생형의 경우 효과적으로 IC-InsP6 를 포식하였다(도 10a). 이러한 결과는, 대식세포의 CD14가 PtdIns(3,4,5)P3 를 모방하는 IC-InsP6 의 포식을 직접적으로 조절함을 시사하는 것이다.
이와 같이, 본 발명자들은 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 CD14를 통하여 활성화된 대식세포를 특이적으로 표적할 수 있음을 최초로 밝힌 것이다.
상기 제1단계는 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 단계이다(도 1a). 상기 세포사멸, 세포사멸 유도제 및 처리방법은 상기한 것과 같다.
상기 제1단계는 사이클로헥시미드를 3시간 내지 5시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다.
제2단계는 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 단계이다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 분리방법은 상기한 것과 같다.
제3단계는 상기 분리된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 약물 전달체 표면에 결합시키는 단계이다.
상기 약물 전달체는 치료 부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달하기 위하여 당업계에서 사용되는 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 리포좀, 고분자 미셀, 나노입자, 임플란트, 에멀젼 또는 하이드로젤일 수 있다. 상기 약물 전달체는 당업계에 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리포좀의 경우 유기 용매 중에 현탁된 지질 분자를 감압하에 증발시켜 용기 내에 건조 필름을 형성하고, 적절한 양의 수성상을 상기 용기에 첨가한 후 혼합물을 교반한 후, 상기 혼합물을 멀티라멜라 소포가 형성되기에 충분한 시간 동안 요동 없이 방치함으로써 제조될 수 있다. 상기 약물 전달체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약물은 질병을 치료하기 위한 물질로서, 당업계에서 리포좀 내부에 봉입될 수 있는 것으로 알려진 물질이라면 제한되지 않으나 화학 약물, 펩타이드, 또는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 약물 전달체 표면에의 결합은 작용기를 통한 화학적 결합에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 작용기는 약물 전달체 표면에 형성되는 것으로 당업계에서 알려진 물질이라면 제한되지 않고 사용할 수 있으나, 예를 들어, 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 약물 전달체에 노출된 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 통하여 결합될 수 있다. 또는 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 약물 전달체에 노출된 헤파린 또는 카테콜기를 포함하는 화합물을 통하여 결합될 수 있다.
상기 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)는 전체 약물 전달체 중량의 0.1 내지 3 중량%으로 포함될 수 있다. 상기 중량부 미만으로 포함될 경우 활성화된 대식세포를 효과적으로 표적할 수 없다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 포함하는, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체를 제공한다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)일 수 있으며, 구체적인 내용은 상기한 것과 같다. 상기 약물 전달체는 상기한 것과 같다. 상기 약물 전달체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)는 전체 약물 전달체 중량의 0.1 내지 3 중량%으로 포함될 수 있다. 상기 중량부 미만으로 포함될 경우 활성화된 대식세포를 효과적으로 표적할 수 없다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 CD14를 통해 활성화된 대식세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로(도 1b), 본 발명에 따른 약물전달체는 활성화된 대식세포 표적 용도로 사용하여 대식세포의 활성화로 인한 질병을 효과적으로 치료할 수 있다. 상기 대식세포의 활성화로 인한 질병은 예를 들어 급성 발열, 간비장비대, 림프절 종대, 피부 및 점막 출혈, 범혈구감소증, 류마티스 관절염, 성인형 스틸병, 또는 전신홍반루푸스을 포함하는 대식세포 활성화 증후군일 수 있다(민준기, 성인형 스틸병 환자의 골수소견과 사이토카인 발현, 대한 류마티스 학회지, Vol. 16, No. 3, September, 2009).
따라서 상기 약물 전달체는 급성 발열, 간비장비대, 림프절 종대, 피부 및 점막 출혈, 범혈구감소증, 류마티스 관절염, 성인형 스틸병, 및 전신홍반루푸스을 포함하는 대식세포 활성화 증후군의 예방 또는 치료를 위하여 효과적으로 사용할 수 있다.
포스파티딜이노시톨 포스페이트는 세포사멸 유도에 의하여 사멸된 세포 표면에 외재화됨을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법은, 복잡한 구조를 나타내는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있다.
나아가, 상기 제조된 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 활성화된 대식세포의 CD14와 특이적으로 결합하므로, 본 발명에 따른 약물전달체는 활성화된 대식세포 표적 용도로 사용하여 대식세포의 활성화로 인한 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1a는 세포사멸 유도제 처리에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 외재화 및 이에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조를 모식도로 나타낸 것이고, 도 1b는 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 CD14를 통한 활성화된 대식세포와의 결합을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 세포사멸 유도제 처리에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 외재화를 나타낸 것으로, 도 2a는 세포사멸 초기단계에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3, 도 2b는 2차 괴사 단계에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3, 도 2c는 세포사멸 유도제에 따른 PtdIns(3,4,5)P3 의 외재화, 도 2d는 외재화된 PtdIns(4,5)P2 를 나타낸 것이다.
도 3a는 세포사멸 유도제 처리에 따른 Jarkat T 세포의 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를, 도 3b는 세포사멸 유도제 처리에 따른 HeLa 세포의 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 단백질-지질 어세이 및 면역 블로팅 결과를 나타낸 것이고, 도 4c는 PIP-친밀도 비드 풀다운 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 Akt 단백질의 작용의 모식도를 나타낸 것이고, 도 5b 및 도 5c는 재조합 Akt 단백질과 사멸세포 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 나타낸 것이다.
도 6은 IC-InsP6 의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 7a는 복강 대식세포에 의해서 흡수되는 IC-InsP6를 나타낸 것이고, 도 7b, 7c 는 RAW264.7 대식세포에 의해서 흡수되는 IC-InsP6를 나타낸 것이다.
도 8a는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹과 CD14의 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와의 결합을 나타낸 것이고, 도 8b는 종 간 보존된 아미노산 잔기를 나타낸 것이다.
도 9은 야생형 재조합 CD14 수용체 또는 변이된 CD14 수용체와 PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 나타낸 것이다.
도 10a는 CD14가 결손된 마우스 또는 야생형 마우스의 간 쿠퍼 세포의 IC-InsP6 포식을 나타낸 것이고, 도 10b 및 도 10c는 CD14가 결손된 마우스 또는 야생형 마우스의 대식세포의 pHrodo-표지된 사멸세포의 포식을 나타낸 것이다.
도 11는 사멸세포 표면에 외재화된 PdtIns(3,4,5)P3의 역할을 나타낸 모식도 이다.
각 그래프의 오차 바는 3회 이상의 독립적 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 각 그룹 간의 통계적 유의성은 스튜턴트 t-테스트로 결정하였으며, P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실험예 1. 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)의 제조
1-1. 세포 사멸 유도
구체적으로, HeLa 세포, Jarkat T 세포, 또는 CHO(Chinese hamster ovary) K1 세포를 각각 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 포함하는 DMEM 배지, RPMI 배지, 또는 F12 배지에서 배양하였다. 이후, 세포들을 6-웰 플레이트의 커버글라스 상에서 1 x 105 cells/ml 의 밀도로 24시간 동안 배양한 후, 세포사멸 유도 키트(ab102480; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 6시간 동안 37℃에서 처리하였다. 구체적으로, 캄프토테신(camptothecin) 4μM, 사이클로헥시미드 (cycloheximide) 200μM, 덱사메타손(dexamethasone) 20μM, 에토포사이드(etoposide) 100μM을 처리하였다.
1-2. PtdIns (3,4,5)P3 의 제조
상기 실험예 1-1에서 사멸이 유도된 세포 표면 외질의 PtdIns(4,5)P2 또는 PtdIns(3,4,5)P3 을 관찰하기 위하여, 상기 세포를 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고, 단일클론 마우스 IgM 항-PtdIns(4,5)P2 또는 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 (1:100, Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT, USA)와 함께 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 당나귀 항-마우스 IgM 2차 항체로 30분 동안 처리하였다.
그 후, 상기 세포를 현미경에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 세포사멸 초기단계(도 2a) 및 2차 괴사 단계(도 2b)에서 사멸세포의 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3을 관찰할 수 있었다. 상기 외재화는 세포사멸 유도제의 종류나 세포의 종류와는 무관하게 나타났다(도 2c). 따라서, 세포에 사멸이 유도되면 사멸세포가 원형질막 외층에 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 외재화함을 확인하였다.
또한, 세포사멸 초기에 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 패치 형태로 분포되어 있는 반면, PtdIns(4,5)P2 는 프로피디움 요오드화물로 염색되는 세포 사멸의 마지막 단계에서 외재화 되었다(도 2d).
1-3. PtdIns (3,4,5)P 3 의 분리 및 정량
Jarkat T 세포 또는 HeLa 세포를 각각 1 x 107 세포/ml의 농도로 100 cm3 플레이트에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후 10 μM 덱사메타손, 4 μM 캄프토테신, 또는 100 μM 사이클로헥시미드를 다양한 시점(0, 2, 4, 8, 24시간)에 처리하여 세포사멸을 유도한 후, 세포를 회수하고 제조업자(Echelon Biosciences)의 매뉴얼에 따라 산성 지질을 추출하였다.
구체적으로, 10mL의 차가운 0.5 M TCA(trichloroacetic acid)로 세포를 세척하고, 플라스크에 부착된 세포를 회수하여 1,500 rpm 으로 5분 동안 원심분리하였다. 상기 세포 펠렛을 1 Mm EDTA 용액을 포함하는 5% TCA 3mL로 2회 세척하고, MeOH/CHCl3: 12M HCl (80:40:1, v/v) 를 2.25 mL 가한 후, 상온에서 15분 동안 4회 볼텍싱하였다. 그 후 5분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 0.75 mL의 CHCl3 및 1.35 mL 의 0.1M HCl 을 가하여 산성 지질을 분리하고, 유기상을 진공건조기에서 건조시킨 후, 용도에 따라 -80 ℃ (장기보관) 또는 4 ℃ (곧바로 실험)에서 보관하였다.
그 후, 바이오티닐 단일클론 IgG 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 및 스트렙타아비딘-홀스래디시 페록시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase)를 이용한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 로 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 측정하였다(K-2500s, Echelon Biosciences).
그 결과, Jarkat T 세포에서 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도는 덱사메타손 처리시에는 2 내지 10시간, 특히 5시간 내지 7시간에 가장 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 사이클로헥시미드의 경우, 3시간 내지 5시간에 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도가 가장 현저하게 증가하는 것으로 나타났다(도 3a).
HeLa 세포의 경우, 캄프토테신을 처리한 후 5 내지 7시간 동안 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도가 가장 높게 나타났고, 다음으로 사이클로헥시미드를 처리한 후 3 내지 5시간 동안 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도가 높게 나타났다(도 3b).
따라서, 덱사메타손과 캄프토테신의 경우에는 세포의 종류와 상관없이 처리 후 5 내지 7시간에 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도가 가장 높게 나타났고, 사이클로헥시미드의 경우에는 처리 후 3 내지 5시간에 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도가 가장 높게 나타났으므로, 이를 이용하여 PdtIns(3,4,5)P3 를 효과적으로 생산할 수 있음을 알 수 있다.
1-4. 단백질-지질 오버레이 어세이 및 면역블로팅
다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 이노시톨 포스페이트 그룹이 대식세포 CD14 수용체와 직접 결합하는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3에서 제조한 전체 길이의 재조합 인간 CD14 단백질과 변이 CD14 단백질을 이용하여 단백질-지질 오버레이 어세이를 수행하였다.
(1) 재료의 준비
PIP 스트립 또는 PIP 어레이는 Echelon Biosciences에서 구입하였다.
재조합 CD14 단백질은 하기의 방법으로 생산하였다: 먼저, 하기의 프라이머(Genemed Synthesis,Inc.)를 사용하여 CD14 (1-365 잔기) 전체 길이를 코딩하는 인간 야생형 CD14 cDNA를 PCR로 증폭하였다.
전방향 프라이머
5'-TTGGTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3' - 서열번호 1
역방향 프라이머
5'-TTCTTTCCTACACAGCGGCACCC-3' - 서열번호 2
그 후, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Invitrogen)를 이용하여 pcDNA6 V5 HisA (Invitrogen)의 HindIII 와 XbaI 절단 위치로 복제하여, C 말단에 V5 와 His6 태그를 갖는 단백질을 생산하고, 서열 분석을 통하여 검증하였다. 그 후, 제조업체의 설명서에 따라 리포펙타민 플러스 시약(Lipofectamine Plus reagent)을 이용하여 상기 선형 벡터 10 μg 를 CHO K1 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2일 경과 후, CHO K1세포에 2일 마다 블라스티사이딘(blasticidin) 5 μg/ml 로 처리하여 블라스티시딘(blasticidin)-저항성인 안정된 세포주를 얻었다. 항-CD14 항체로 면역블로팅을 진행하고, CHO K1-CD14 세포를 블라스티사이딘 1 μg/ml을 포함하는 F12 배지에 배양하였다. 각 안정된 세포주를 3일 동안 20개의 150 cm3 플레이트 안에서 배양하였다. 그 후, 수집된 세포들을 용해 버퍼 (50mM Tris pH7.6, 500mM NaCl, 20mM imidazole, EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche, Germany))에 현탁하고, 초음파 분해하였다. 각 재조합 단백질을 Ni-NTA 아가로즈 레진 (Qiagen) 상에서 정제하고, 50mM Tris pH 7.6, 250mM NaCl, 및 300mM 이미다졸로 녹여 분리하였다. 그 후, 정제된 재조합 단백질들을 50mM Tris pH7.6, 20mM NaCl 로 투석하였고, 젤 여과(Superdex-200 FPLC) 크로마토 그래피로 추가 정제하여, 재조합 CD14 수용체 단백질을 얻었다.
(2) 단백질-지질 결합 어세이 및 면역블로팅
3% BSA를 포함하는 TBS-T (50mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.4, EDTA-free protease inhibitor cocktail; Roche, Germany)로 막을 15분간 배양하여 막에 대한 비특이적 결합을 블로킹하였다. 상기 블로킹 후, 막을 30분 동안 각 정제된 재조합 CD14 단백질과 함께 인큐베이션하였고, PBS로 3회 세척하고 항-CD14 (rabbit, HPA002127; Sigma-Aldrich)와 함께 다시 배양한 후, 30분 동안 HRP(horseradish peroxidase)-라벨된 2차 항체 (goat; HAF007; R&D Systems)와 함께 배양하였다. 상기 결합은 ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm, Japan)로 감지하였다. Tota et al (Mol Cell Biol 32, 118, 2012)에 기재된 것과 같이 PIP-친밀도 비드 풀다운(PIP-affinity bead pulldowns)을 수행하였다.
그 후, 정제된 야생형 또는 변이 단백질을 단백질 농도에 따라 4배 희석하고, 포스포이노시톨 비즈 20-40 μL 또는 20mM IC-InsP6(Iron-Calcium-InsP6(Phytate))를 포함하는 TBS-T 20-30 μL로 옮겨, 30분 동안 부드럽게 혼합하였다. 가라앉은 비즈는 TBS-T로 4회 세척하였다. 상기 단백질들은 SDS 샘플 버퍼로 용출하였고, SDS-PAGE로 분리한 후, 면역 블로팅(anti-CD14 antibody; HPA002127; Sigma)으로 감지하였다.
그 결과, CD14는 다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 대해서만 강한 결합 친화성을 보인 반면, 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 스핑고신 1 포스페이트에 대해서는 친화성을 보이지 않음을 확인하였다(도 4a).
또한, 면역 블로팅 결과, CD14는 PtdIns(3,4,5)P3 과 6.3 pmol의 세기로 가장 강하게 결합함을 확인하였다(도 4b). 이러한 결과는 CD14 수용체가 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 이노시톨 포스페이트 그룹을 통하여 직접 결합함을 시사하는 것이다.
또한, PIP-친밀도 비드 풀다운 결과, CD14가 변이된 단백질의 경우 PIP 비즈와 결합하지 않는 반면, 야생형 CD14 단백질의 경우 PtdIns(3)P, PtdIns(4)P, PtdIns(5)P, PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3와 결함함을 확인하였다(도 4c).
1-5. Akt 단백질을 이용한 PtdIns (3,4,5)P3의 외재화 확인
Akt 단백질의 PH 도메인은 세포내 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합하는 바이오센서이다(도 5a, T. Balla, J Cell Sci 118, 2093-2104, 2005). 따라서 이를 이용하여 PtdIns(3,4,5)P3 이 사멸세포 표면에 외재화하는지 확인하는 실험을 진행하였다.
먼저, 4μM의 캄프토테신을 6시간 동안 처리하여 HeLa 세포와 CHO 세포에 사멸을 유도한 후, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고,
2μg의 재조합 Akt 단백질(Millipore) 과 30분 동안 배양하였다. 그 후, 재조합 단백질-결합된 상기 세포들을 래빗 항-CD14 항체 (HPA00212; 1:200, Sigma-Aldrich USA) 또는 단일클론 마우스 항-Akt1 항체의 PH(Pleckstrin homology) 도메인 (05-591, 1:100, Millipore)으로 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 2차 항체로 30분 동안 처리하였다. 그 후, DAPI로 대조염색하여 핵을 가시화하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 대조염색하여 사멸 세포를 분별할 수 있도록 하였다.
그 후, 상기 세포를 현미경에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 재조합 Akt 단백질이 PH 도메인을 통하여 사멸세포 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합함을 확인하였다(도 5b, 5c).
실험예 2. CD14 단백질과 사멸세포의 특이적 결합 확인
2-1. IC - InsP 6 의 제조
PtdInsPs는 Ins(1,4,5)P3, Ins(1,3,4,5)P4와 같은 myo-이노시톨 포스페이트 및 디아실글리세롤으로 구성되므로, InsP6는 PtdInsPs를 모방하여 행동한다. 따라서 InsP6을 이용하여 하기의 실험을 진행하였다.
한편 철이온은 프루시안 블루에 의해 염색되기 때문에, InsP6의 세포 내 위치를 용이하게 모니터링하기 위하여 InsP6에 철을 결합시켰다(Fe3 +-InsP6). 구체적으로, 등몰 농도의 Fe3 + 이온과 InsP6 (파이테이트, hexakisphosphate) 용액 (pH 6.0)을 혼합하여 Fe3 +-InsP6 용액 10mM을 제조하였다. 그 후, Fe3 +-InsP6 가 혈액 내 칼슘을 킬레이팅할 가능성을 최소화하기 위하여 등몰 농도의 Ca2 + 이온을 Fe3 +-InsP6 용액에 첨가하였다. 그리고 1 N NaOH 을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정한 IC-InsP6 (Fe3 +-Ca2 +-InsP6)용액을 제조하였다. 도 6은 IC-InsP6 의 화학구조를 나타낸 것이다.
2-2. 복강 대식세포에 의한 IC - InsP 6 의 흡수 평가
동물 실험들은 동물관리사용위원회에서 승인을 받았으며, 모든 사용되는 동물들은 가천대학교 이길여 암당뇨연구원의 동물 실험을 위한 윤리 가이드라인 및 유전자 조작 실험을 위한 안전 가이드라인에 따라 진행되었다.
C57BL/6 마우스에서 티오글리콜산염에 의해 유발된 복강 대식세포 (Thio-pMacs; thioglycollate-elicited peritoneal macrophages)를 수득하였다. 구체적으로, 2 ml 의 3% Brewer 티오글리콜산염 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)를 마우스에 복강내 주사하고, 3-5일 후, 차가운 PBS로 복강을 세척하여 복강 대식세포를 회수하였다. 상기 세포를1,500 rpm 으로 5분간 원심분리하였다. 상기 세포 펠렛을 PBS로 3회 세척하고, 10% FBS (Gibco)를 포함하는 DMEM 배지에 재현탁한 후, 1 x 105 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트의 커버글라스(Nunc, Fisher Scientific) 상에서 배양하였다. 세포를 16시간 동안 부착배양하였고, 부유 세포를 제거하기 위하여 상기 슬라이드를 세척하였다. 그 후, 부착된 Thio-pMacs 세포를 0.5 μg/ml의 LPS 유무에 따라 6시간 동안 배양하였다. LPS는 Thio-pMacs의 활성화를 유도한다.
배양 후, 상기 세포를 0 - 0.1 mM IC-InsP6 로 4시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하여 자유 IC-InsP6 를 제거하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후, 세포 내 철의 흡수를 확인하기 위하여 다음과 같이 염색을 진행하였다. 구체적으로 커버글라스를 염색 용액(5% potassium ferrocyanide, 12% HCl)에 1시간 동안 놓아둔 후, 증류수로 3회 세척하고, 프루시안 블루 염색하였다. 그 후 뉴클리어패스트레드로 대조염색하고, 마운팅 배지(Thermoscientific, Somerset, NJ, USA)에 올려두었다.
그 결과, LPS에 의해 자극되어 활성화된 Thio-pMacs 는 자극하지 않은 Thio-pMacs과 비교할 때 IC-InsP6를 효과적으로 포식하며, 이러한 효과는 처리 농도 의존적으로 증가하였다(도 7a).
한편, 동일한 실험 결과 RAW264.7 대식세포 또한 IC-InsP6를 농도 의존적으로 효과적으로 포식함을 확인하였다(도 7b, 7c). 이러한 결과는 IC-InsP6 이 활성화된 대식세포에 의하여 선택적으로 포식됨을 시사하는 것이다.
2-3. 분자 모델링 및 서열 정렬
CD14 수용체와 결합하는 InsP6의 잔기를 확인하기 위하여 하기와 같이 분자 모델링을 진행하였다.
먼저, AutoDock PyRx (http://pyrx.sourceforge.net/)를 이용하여 hADAR2(PDBid: 1ZY7)에서 고도로 정제된 InsP6 좌표를 CD14 (PDBid:1WWL) 결정 구조에 도킹시켰다. 도킹시키는 동안 CD14를 수용체로 처리하였고 견고함을 유지하면서, CD14의 회전가능한 결합의 유연성을 유지하였다. 그리드 박스는 CD14 단백질 전체의 x, y, z 방향으로 커버되었다. AutoDock PyRx에 의해 보고된 10개의 최저 에너지 구조는 PyMOL software (www.pymol.org)에 의하여 점검되었다. 10개의 최저 에너지 구조(energy conformation) 중, 어떠한 입체 배좌에 대한 RMSD (평균 제곱근 편차, root-mean-square deviation) 없이 첫 번째 분자(-6.2 kcal/mol, binding affinity)를 추가실험을 위하여 선정하였다. 모든 컴퓨터 계산은 출판된 CD14 구조(IWWL)를 이용하여 수행하였다(J. I. Kim et al., J Biol Chem 280, 11347-11351, 2005). CD14 패밀리에 해당하는 5개의 서열(소, 토끼, 인간, 마우스, 래트) 모두 SwissProt에서 다운로드 받고 ClustalW로 정렬하였다.
그 결과, InsP6 또는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹은 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와 염 브릿지에 의해 고정되는 것으로 나타났다(도 8a). 이러한 결과는, 단백질-지질 오버레이 실험에서 재조합 CD14가 PtdIns(3,4,5)P3 에 가장 높은 결합력을 나타낸 결과(도 4b)를 설명할 수 있다. 구조에 기초한 서열 정렬은, 이러한 아미노산 잔기가 종 간에 잘 보존되었음을 나타낸다(도 8b). 산성 이노시톨 포스페이트 그룹은 단백질의 염기성 아미노산 잔기에 결합하는데 필수적이므로, CD14에서 아르기닌의 염기성의 잔기인 R93, R148, R150, R230가 단백질-지질 결합을 중재할 수 있음을 알 수 있다.
2-4. CD14 단백질과 사멸세포의 상호작용 확인
CD14 단백질이 사멸 세포에 노출된 PtdIns(3,4,5)P3 를 직접 인식하는지 확인하기 위하여, 하기의 실험을 진행하였다.
먼저, 4 μM 의 캄프토테신을 6시간 동안 처리하여 HeLa 세포와 CHO 세포에 사멸을 유도한 후, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고, 2μg의 정제된 재조합 야생형(WT) CD14 또는 4중 변이된(quadruple mutant) CD14 수용체 단백질(PtdIns(3,4,5)P3을 차단)과 30분 동안 배양하였다. 그 후, 재조합 단백질-결합된 상기 세포들을 래빗 항-CD14 항체 (HPA00212; 1:200, Sigma-Aldrich USA) 또는 단일클론 마우스 항-Akt1 항체의 PH(Pleckstrin homology) 도메인 (05-591, 1:100, Millipore)으로 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 2차 항체로 30분 동안 처리하였다. 그 후, DAPI로 대조염색하여 핵을 가시화하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 대조염색하여 사멸 세포를 분별할 수 있도록 하였다.
그 후, 상기 세포를 차등간섭대비현미경(DIC, differential interference contrast)에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 도 9에 도시된 것과 같이, 야생형 재조합 CD14 수용체는 곧바로 사멸세포의 표면에 결합하는 반면, PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 차단하도록 변이된 CD14 수용체의 경우 사멸세포를 사로잡을 수 없었다. 이러한 결과는, CD14가 사멸세포에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3와 직접 결합함으로써 사멸세포를 인식함을 시사하는 것이다.
2-5. CD14 -/- 마우스 대식세포의 PtdIns (3,4,5)P 3 에 대한 결합 능력 소실
(1) 간 쿠퍼 세포( Kupffer cell )의 식작용 평가
Jackson laboratory USA에서 구입한 CD14가 결손된(CD14-/-) C57BL/6 마우스에 IC-InsP6 를 동맥주사하고, 이로부터 간을 분리한 후, IC-InsP6 에 대한 식작용을 면역조직화학법(Immunohistochemistry) 및 프루시안 블루 염색을 통하여 하기와 같이 확인하였다.
먼저, CD14가 결손된 C57BL/6 마우스(각 그룹 당 n=5)로부터 각각 간 조직을 분리하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 고정한 후 파라핀에 넣어두었다. 그 후, Tris/EDTA (pH 9.0)에서 2분 동안 전자레인지로 끓이면서 항원을 회수하였다. 세포질 대식세포에서의 IC-InsP6 를 감지하기 위하여, 간 조직을 래트 단일클론 항- F4/80 (Bm8, 1:100; eBioscience, San Diego, CA, USA)과 함께 상온에서 90분 동안 배양하였다. 그 후, 홀스래디시 페록시다아제 결합된 2차 항체를 30분 동안 함께 배양하고, 3,3'-디아미노-벤지딘 테트라히드로클로라이드 기질 (3,3'-diamino-benzidine tetrahydrochloride; Dako, Glostrup, Denmark)로 IC-InsP6를 감지하였다. 그 후 프루시안 블루 염색을 진행하였다. F4/80 항체로 쿠퍼 세포를 확인하였고, 프루시안 블루염색을 통하여 식작용을 확인하였다.
그 결과, CD14가 결손된 마우스의 간 쿠퍼 세포는 IC-InsP6 를 거의 포식하지 못한 반면, 야생형의 경우 효과적으로 IC-InsP6 를 포식하였다(도 10a). 이러한 결과는, 대식세포의 CD14가 PtdIns(3,4,5)P3 를 모방하는 IC-InsP6 의 포식을 직접적으로 조절함을 시사하는 것이다.
(2) 인-비트로 식작용 에세이 (n vitro phagocytosis assay )
CD14 매개 식작용에 PdtIns(3,4,5)P3 의 외재화가 필수적인지 확인하기 위하여, 야생형 또는 CD14 결손 마우스로부터 분리된 것으로서 LPS에 의해 자극된 대식세포에 의하여, PHrodo로 표지된 사멸 Jurkat T 세포에 대한 인비트로 식작용 에세이를 진행하였다. 이 때 항-PdtIns(3,4,5)P3 항체 처리 유무를 달리하였다.
먼저, Jurkat T 세포를 밤새 5 x 106 세포/ml의 농도로 배양하고, 20 μg/mL의 덱사메타손을 6시간 동안 처리하였다. 자라거나 사멸한 Jurkat T 세포를 PBS로 세척하고, pHrodo Red AM (P353721, Life Technologies, USA)와 함께 상온에서 30분 동안 배양하였다. PHrodo 표지된 상기 Jurkat T 세포를 live cell imaging solution (A14291DJ, Life Technologies, USA) 으로 세척하였다.
한편, Thio-pMacs를 6-웰 플레이트에서 5 x 105 세포/well의 밀도로 16시간 동안 배양하고, 0.5 μg/ml 의 LPS 를 6시간 동안 처리하였다.
그 후, PHrodo 표지된 상기 Jurkat T 세포에, LPS로 자극된 Thio-pMacs를 2.5시간 동안 처리하였다. 배양 후, 상기 플레이트를 PBS를 통해 세척하여 PHrodo로 표지된 Jurkat T 세포를 제거하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후, 핵을 가시화하기 위하여 DAPI로 대조염색하였다. 식작용의 정도는 상기 실험예들에서 기재한 것과 같이 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 10b 및 이를 정량화하여 나타낸 도 10c와 같이, CD14 결손된 마우스로부터 분리된 활성화된 대식세포(LPS-stimulated Thio-pMacs)는 야생형의 대식세포와 비교할 때 pHrodo-표지된 사멸세포(Jurkat T cell)를 거의 포식하지 못하는 것으로 나타났다. 또한 항-PdtIns(3,4,5)P3 항체 처리에 의한 PdtIns(3,4,5)P3 의 외재화를 억제하자, 포식작용이 억제되는 것으로 나타났다.
즉, 이러한 결과는 도 11과 같이, 사멸세포 표면에 외재화된 PdtIns(3,4,5)P3 는 CD14 대식세포의 인식 및 포식 작용의 신호로 작용함을 시사한다.
상기와 같이, 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 세포사멸 유도에 의하여 사멸된 세포 표면에 외재화되므로, 이를 분리 정제할 경우 복잡한 구조를 나타내는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 효과적으로 생산할 수 있다.
나아가, 상기 제조된 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 활성화된 대식세포의 CD14와 특이적으로 결합하므로, 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 포함하는 약물전달체는 활성화된 대식세포 표적 용도로 사용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> A method for preparing phosphatidylinositol phosphate and a drug delivery carrier using the same <130> PA131276/KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (forward) <400> 1 ttggtgccaa cagatgaggt tcac 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (reverse) <400> 2 ttctttccta cacagcggca ccc 23

Claims (18)

  1. 세포사멸 유도제를 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 제1단계; 및
    상기 세포사멸이 유도된 세포로부터 세포 표면의 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)를 분리하는 제2단계를 포함하는, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조방법으로,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 인, 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제1단계는 세포사멸 유도제를 2시간 내지 10시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포사멸 유도제는 덱사메타손, 캄프토테신, 에토포사이드, 및 사이클로헥시미드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 덱사메타손은 15 내지 25 μM의 농도로 세포에 처리되는 것인, 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 캄프토테신은 2 내지 5 μM의 농도로 세포에 처리되는 것인, 제조방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 에토포사이드는 80 내지 120 μM의 농도로 세포에 처리되는 것인, 제조방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 사이클로헥시미드는 150 내지 250 μM의 농도로 세포에 처리되는 것인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계는 덱사메타손 또는 캄프토테신을 5시간 내지 7시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계는 사이클로헥시미드를 3시간 내지 5시간 동안 세포에 처리하여 세포사멸을 유도하는 것인, 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의하여 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 약물 전달체 표면에 결합시키는 단계를 포함하며,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 인,
    활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 이노시톨 포스페이트 그룹을 통하여 활성화된 대식세포의 CD14와 특이적으로 결합하는 것인, 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 리포좀인 것인, 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)은 전체 약물 전달체 중량의 0.1 내지 3 중량%으로 포함되는 것인, 제조방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 작용기를 통한 화학적 결합에 의하여 약물 전달체 표면에 결합하는 것인, 제조방법.
  15. 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)이 약물 전달체의 표면에 결합된, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 상기 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2)은 전체 약물 전달체 중량의 0.1 내지 3 중량%으로 포함되는 것인, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 리포좀인 것인, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 급성 발열, 간비장비대, 림프절 종대, 피부 및 점막 출혈, 범혈구감소증, 류마티스 관절염, 성인형 스틸병, 및 전신홍반루푸스을 포함하는 대식세포 활성화 증후군의 예방 또는 치료를 위한 것인, 활성화된 대식세포 표적용 약물 전달체.
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