KR101675320B1 - Marine bacteria having excellent algicidal activity and method for removing red tide using the same - Google Patents

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이상섭
김진수
문샛별
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경기대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a marine bacteria having excellent algicidal activity, and to a method for removing red tide using the same. More particularly, the present invention relates to a Neptunomonas sp. marine bacteria strain having excellent algicidal activity, a bacterial formulation prepared by fixating the strain to a carrier for removing red tide, and to a method for removing red tide comprising a step of injecting at least one among the strain or the bacterial formulation to a sea area having red tide.

Description

우수한 살조능을 갖는 해양 미생물 및 이를 이용한 적조 제거 방법{MARINE BACTERIA HAVING EXCELLENT ALGICIDAL ACTIVITY AND METHOD FOR REMOVING RED TIDE USING THE SAME}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a marine microorganism having excellent fungicidal activity and a method for removing red tide using the same. BACKGROUND ART < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 우수한 살조능을 갖는 해양 미생물 및 이를 이용한 적조 제거 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 적조 발생 원인 조류들 중 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 선별적 살조능이 우수한 해양 미생물 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a marine microorganism having excellent fungicidal activity and a method for removing red tide using the same. More particularly, the present invention relates to a marine microorganism having excellent selective fecundity against cochlodinium polykrikoides And a red tide removing method using the same.

적조란 일반적으로 해양에 서식하는 동식물성 플랑크톤, 원생동물 및 박테리아와 같은 미생물이 일시에 다량으로 증식되거나 또는 집적되어 바닷물의 색깔을 변색시키고 해양 생물에 나쁜 영향을 미치는 현상을 뜻한다. 적조 현상은 어패류를 폐사시키거나 독화시켜 수산업에 막대한 피해를 주고, 심지어 인간에까지 그 영향을 미쳐 직간접적으로 우리에게 심각한 문제를 야기시키고 있다.
Red tide is a phenomenon in which microorganisms such as phytoplankton, protozoa, and bacteria, which live in the ocean in general, are massively multiplied or integrated at a time to discolor the sea water and adversely affect marine life. Red tide phenomenon causes serious damage to the fisheries industry by causing death or poisoning of fish and shellfish, and even affecting human beings, directly or indirectly causing serious problems for us.

이와 같은 적조 현상은 세계의 모든 연안 수역에서 널리 발생하며, 계절에 관계없이 상습적으로 발생하고 있고, 특히 적조 생물은 규조류에서 편모조류로 바뀌어 가고 고밀도화되어 가는 경향을 보이고 있다.
These red tide phenomena occur widely in all coastal waters of the world, and occur regularly irrespective of seasons. Especially, red tide creatures tend to change from diatoms to monocotyledons and become denser.

적조를 일으키는 생물은 식물성 플랑크톤으로 규조류(diatom), 편모조류(dinoflagellate), 남조류(blue-green algae), 미세조류(microalgae), 원생동물 등을 들 수 있는데, 우리나라에서 발견된 것만 해도 50여 종에 이른다. 플랑크톤의 종류에 따라 바닷물의 색깔은 적색으로 국한되지 않고 다갈색, 청색, 백색 등으로 나타나기도 한다. 우리 나라에서 발생하는 대표적인 적조원인 생물은 국립수산과학원의 적조 속보를 2010년 4월부터 2013년 7월까지 분석한 후 발생빈도가 빈번한 식물성 적조생물을 위주로 선별하면, 코클리디움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)가 118회로 가장 많고 유해성 편모조류로 어장에 가장 많은 피해를 주기로 알려져 있다. 이 외에 차토넬라 마리나 (Chattonella marina), 헤테로카파사 트리퀘트라(Heterocapasa triquetra), 스크립시엘라 트로코이드(Scrippsiella trochoides), 스케레토네마 코스타튬(Skeletonema costatum), 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo), 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum)등이 주종을 이룬다.
The creatures that cause red tide are phytoplankton, diatom, dinoflagellate, blue-green algae, microalgae, protozoa, and more than 50 species found in Korea . Depending on the type of plankton, the color of the seawater is not limited to red but may also appear as brown, blue, or white. The representative red tide creatures in Korea are analyzed from April, 2010 to July, 2013 by the red tide bulletin of the National Fisheries Research and Development Institute and then selected by focusing on the vegetative red tide creatures with frequent occurrence, Cochlodinium polykrikoides) are the most abundant in 118 and are known to cause the most damage to fisheries due to harmful monocotyledonous birds. In addition to these, there are also other types of fish such as Chattonella marina, Heterocapasa triquetra, Scrippsiella trochoides, Skeletonema costatum, Heterosigma akashiwo, (Prorocentrum minimum) and so on.

한편, 지금까지 알려진 적조 원인 생물의 제거 방법은 화학약품 살포법, 초음파 및 오존처리법, 해면회수 및 침강법, 황토 살포법 등이 있다.
On the other hand, known methods for removing bivalent organisms include chemical spraying, ultrasonic and ozone treatment, sea surface recovery and sedimentation, and loess spraying.

이러한 방법 중 가장 많이 사용되고 있는 화학약품 살포법은 황산구리(CuSO4), 이산화염소(ClO2), 시마진(Simazine) 등을 살포하는 방법으로서 과거부터 이용되어 왔는데, 그 중 비용이 가장 저렴하여 널리 이용되는 황산구리는 유해성 편 모조류에만 특이적(specific)이지 않아 적조원인 생물 외에 다른 해양생물에까지 영향을 끼쳐, 수중의 다른 생물에 대한 독성 및 부식의 측면에서 문제를 일으킬 수 있으며, 또한 상기 황산구리는 일시적 효과만 나타내기 때문에 반복 사용해야 하며, 조류의 적조 발생시 수반되는 높은 알칼리성 환경 조건 하에서는 황산구리가 불안정해지기 때문에 많은 양을 처리하여야 하므로 비경제적이라는 단점이 있다.
Among these methods, the most widely used chemical spraying method has been used since the past as a method of spraying copper sulfate (CuSO 4 ), chlorine dioxide (ClO 2 ), simazine (Simazine) and the like, The copper sulfate used is not specific to the harmful zooplankton, and it affects other marine life besides the cause of red tide. Therefore, it may cause problems in terms of toxicity and corrosion to other organisms in the water, And it is disadvantageous in that it is uneconomical because the copper sulfate is unstable under high alkaline environmental conditions accompanied with the occurrence of red tide of algae, and therefore it is required to treat a large amount.

대한민국등록특허 제0407829호에는 초음파 처리법을 통한 적조제거 방법이 개시되어 있는데, 이러한 기술은 초음파로 적조원인 생물의 세포를 파괴하는 방법이고, 오존처리법은 적조 발생 수역에 고압의 오존을 투입하여 적조로 인한 독성을 중화시키는 방법으로, 두 방법 모두 실용화 단계에는 이르지 못하고 있다.
Korean Patent No. 0407829 discloses a red tide removing method using an ultrasonic treatment method. This technique is a method of destroying cells of an organism causing red tide by ultrasonic waves. In the ozone treatment method, high pressure ozone is injected into a red tide occurrence water zone, Both methods are not yet in practical use.

해면회수 및 침강법은 원심분리기, 응집본조, 혼합조 및 가압부상조로 구성된 가압부상분리장치를 이용하여 기포를 발생시켜 적조 생물을 흡착, 부상시키고 해표면에서 회수하는 방법으로 우리나라에서 널리 사용하고 있다.
The sea surface recovery and sedimentation method is widely used in Korea as a method of generating bubbles by using a pressurized floating separator composed of a centrifuge, an agglomerate, a mixing tank, and a pressurized float tank to adsorb and float the red tide organisms and recover them from the sea surface .

또한 대한민국등록특허 제0325396호에는 황토 살포법에 의한 적조 제거 방법이 개시되어 있는데, 즉, 황토(계면활성점토. Montmorillonite)를 해수 중에 살포하여 적조생물을 흡착 침강시키고, 황토 속의 알루미늄 이온이 적조원인 생물의 세포를 파괴시키는 성질을 이용한 방법으로 우리나라에서 널리 사용하고 있다. 그러나, 해수 중에 황토를 살포하면 부유 물질이 증가되어 어류 양식장과 저층에 정착 생물이 살고 있는 어장에서는 어류 아가미 폐쇄로 인한 호흡 장애 발생 등과 같이 생물에 영향을 미칠 수 있으므로 주의를 요한다. 더불어, 황토는 적조 생물을 바다 밑으로 가라앉혀 죽이므로 바다 속에 2차 오염을 유발할 것으로 여겨진다.
Korean Patent No. 0325396 discloses a red tide removing method by a loess spraying method. That is, a red tide (interfacial clay / montmorillonite) is sprayed in seawater to adsorb and settle red tide creatures, and aluminum ions in the loess It is widely used in Korea by using the property of destroying biological cells. However, caution should be exercised when the loess is sprayed in the seawater, since suspended matter increases in the fish farm and fisheries where settlement organisms live in the lower layer, which may affect the organisms such as respiratory disorders caused by fish gill closure. In addition, loess is believed to cause secondary pollution in the oceans, as the red tide creatures sink under the ocean.

적조 현상을 제어하기 위한 또 다른 방법으로 많은 생물학적인 방법들이 시도되고 있으며, 적조 현상에 있어서 박테리아의 역할이 중요하게 부각되고 있다.
Many biological methods have been attempted as another method for controlling the red tide phenomenon, and the role of bacteria in red tide phenomenon has become important.

따라서 상술한 문제점을 해소할 수 있으면서 동시에 적조를 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 미생물의 조합이 제공되는 경우 관련 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
Therefore, when the combination of new microorganisms capable of eliminating the above-mentioned problems and simultaneously removing the red tide is provided, it is expected that the present invention can be usefully applied in related fields.

이에 본 발명의 한 측면은 살조능이 우수한 해양 미생물 균주를 제공하는 것이다.
Accordingly, one aspect of the present invention is to provide a marine microorganism strain having excellent lyophilicity.

본 발명의 다른 측면은 살조능이 우수한 해양 미생물 균주를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
Another aspect of the present invention is to provide a microorganism preparation for removing red tide comprising a marine microorganism strain having excellent lyophilicity.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 살조능이 우수한 해양 미생물 균주 또는 미생물 제제를 이용하여 효과적으로 적조를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
Another aspect of the present invention is to provide a method for effectively removing red tide using a marine microorganism strain or microbial agent having excellent lyophilicity.

본 발명의 일 견지에 의하면 우수한 살조능을 갖는 넵튜노모나스(Neptunomonas) 속 해양 미생물 균주가 제공된다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a marine microorganism strain belonging to Neptunomonas having excellent fungicidal activity.

상기 균주는 넵튜노모나스 속 (Neptunomonas sp. 2R1)(기탁번호 KACC92080P)을 포함하는 것이 바람직하다.
Preferably, the strain comprises Neptunomonas sp. 2R1 (Accession No. KACC92080P).

상기 균주는 적조 발생 조류 중 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 매우 우수한 선별적 살조능을 갖는 것이 바람직하다.
It is preferred that the strain has a very good selective kill ability against Cochlodinium polykrikoides in red tide occurrence birds.

본 발명의 다른 견지에 의하면 본 발명의 해양 미생물 균주가 담체에 고정된 적조 제거용 미생물 제제가 제공된다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a microorganism preparation for vetching, wherein the marine microorganism strain of the present invention is immobilized on a carrier.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 해양 미생물 균주를 이용한 적조 방제 시스템이 제공된다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a red tide control system using the marine microorganism strain.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 균주 또는 미생물 제제를 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법이 제공된다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a red tide removing method comprising the step of putting the strain or microbial agent of the present invention into a sea area where red tide occurs.

본 발명에 의하면, 2차 오염을 유발하거나 다른 생물에 유해한 영향을 미치지 않으면서 동시에 적조 미생물을 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 살조능이 우수한 미생물 및 이를 이용한 적조 제거 방법이 제공되며, 본 발명의 의하면 적조 미생물을 효과적으로 제어함으로써, 해수, 양식장 등에서 발생하는 적조를 방제할 수 있다.
According to the present invention, there is provided a microorganism excellent in new liveliness capable of effectively removing red tide microorganisms while causing no secondary pollution or harmful effect to other organisms, and a method of removing red tide using the microorganisms. According to the present invention, It is possible to control the red tide occurring in seawater, a farm, and the like.

도 1(a)는 본 발명의 살조균에 의해 (현미경 배율: 위 ×100, 아래 ×1,000), 그리고 도1(b)는 본 발명의 살조균 배양액에 의해, 시간에 따라 적조 유발 조류(algae)인 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)가 제거되는 것을 나타낸 현미경 사진이다 (현미경 배율: ×100).
도 2는 살조능이 우수한 해양 미생물의 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 세포 수 변화에 따른 살조능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 살조능 실험 동안 각 살조균의 시간 별 성장을 나타낸 그래프이다.
도 4는 살조균 넵튜노모나스 속 (Neptunomons sp. 2R1)이 적조 발생 조류 중 특이적으로 코클로디늄 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 대해 선별적 살조능이 있음을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한, 적조 방제를 위한 바이오/에코 반응기 시스템의 다이아그램 및 그 결과를 도시한 것이다.
도 6는 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한, 적조 방제를 위한 바이오/에코 반응기 시스템의 실험 사진이다.
도 7은 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한, 적조 방제를 위한 바이오/에코 반응기 시스템에 있어서, 담체에 살조균이 흡착된 실험군(Ceramic+Bacteria)에서 반응조와 유출조에서의 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides) 살조율을 나타낸 것이다.
Fig. 1 (a) is a graph showing the effect of the algae culture of the present invention on the growth of algae (algae) (Cochlodinium polykrikoides) is removed (microscope magnification: × 100).
FIG. 2 is a graph showing the survival rate of Cochlodinium polykrikoides (Cochlodinium polykrikoides) of marine microorganism having excellent lyophilicity according to cell number change.
FIG. 3 is a graph showing the time-dependent growth of each bacterium during the fungicidal experiment.
4 is a graph showing that Neptunomons sp. 2R1 has a selective lyophilicity against Cochlodinium polykrikoides in red tide occurrence birds.
FIG. 5 shows a diagram of a bio / eco reactor system for the red tide control, and the results thereof, applying the shale and marine microorganism strain of the present invention and a ceramic carrier.
FIG. 6 is an experimental photograph of a bio / eco reactor system for red tide control, to which the present invention is applied to a marine microorganism strain and a ceramic carrier.
FIG. 7 is a graph showing the results of an experiment (Ceramic + Bacteria) in which a bacterium was adsorbed on a carrier, in a bio / eco reactor system for the red tide control, in which a salmon and marine microorganism strain of the present invention and a ceramic carrier were applied. Cochlodinium polykrikoides < RTI ID = 0.0 > .

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. However, the embodiments of the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.

본 발명에 의하면 살조능이 우수한 균주, 이러한 균주가 담체에 고정된 미생물 제제 및 이들을 이용한 적조 제거 방법이 제공된다.
According to the present invention, there is provided a strain having excellent lyophilicity, a microorganism preparation in which the strain is immobilized on a carrier, and a red tide removing method using the same.

본 발명에 있어서, 살조능이 우수한 균주는 적조를 유발하는 조류(algea)를 효과적으로 살조(사멸)시키는 것을 의미하는 것이다. 이와 같은 작용에 의해 본 발명의 균주는 적조의 억제 또는 제거 등의 방제 활동에 널리 이용될 수 있다.
In the present invention, a strain having excellent lyophilicity means effectively killing (killing) the algae causing red tide. By such an action, the strain of the present invention can be widely used for controlling activities such as suppression or elimination of red tide.

본 발명에 의하면, 우수한 살조능을 갖는 넵튜노모나스(Neptunomonas) 속 해양 미생물 균주가 제공되며, 특히 상기 균주는 넵튜노모나스속 (Neptunomonas sp. 2R1) (기탁번호 KACC92080P)을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 균주는 통성 혐기성의 특징을 갖는 것이다.
According to the present invention, there is provided a marine microorganism strain belonging to the genus Neptunomonas, which has excellent fungicidal activity. In particular, it is preferable that the strain contains Neptunomonas sp. 2R1 (Accession No. KACC92080P). The strain is characterized by flowable anaerobic.

한편, 상기 본 발명의 혼합 균주에 포함되는 각각의 균주는 환경미생물은행(Korea Environmental Microorganisms Bank, KEMB)에도 개별적으로 기탁하였다. 보다 상세하게, 상기 넵튜노모나스 속 (Neptunomonas sp. 2R1)은 KEMB 3-825로 기탁하였다.
On the other hand, each of the strains contained in the mixed strain of the present invention was individually deposited in Korea Environmental Microorganisms Bank (KEMB). More specifically, the Neptunomonas sp. 2R1 was deposited with KEMB 3-825.

특히, γ-프로테오박테리아에 속하는 해양 세균이 살조균으로 많이 알려진 것에 비해 본 발명에 관한 살조능을 가진 넵튜노모나스(Neptunomonas) 속은 α-프로테오박테리아에 속하며, 이에 속하는 균에서의 살조능은 거의 밝혀지지 않은 상태이다.
Particularly, while the marine bacterium belonging to the gamma-proteobacteria is well known as the killed bacteria, the genus Neptunomonas having the live-fighting ability according to the present invention belongs to the alpha-proteobacteria, It is almost unknown.

나아가, 본 발명은 우수한 살조능을 갖는 상기 해양 미생물 균주는 넵튜노모나스 속 (Neptunomonas sp. 2R1)인 것이 바람직하다. 상기 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2015년 6월 22일에 P15-086호로 기탁하고, 2015년 6월 29일에 수탁번호 KACC92080P로 수탁증을 획득하였다.
Furthermore, it is preferable that the marine microorganism strain having excellent survival ability is Neptunomonas sp. 2R1. The strain was deposited at the National Institute of Agricultural Science and Technology (KACC) on June 22, 2015 with P15-086, and on June 29, 2015 with the deposit number KACC92080P.

본 발명에 의한 상기 해양 미생물 균주는 적조 미생물 중 특히 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 우수한 살조능을 갖는 것이다.
The marine microorganism strain according to the present invention has excellent survival ability against cochlodinium polykrikoides among red tide microorganisms.

한편, 본 발명에 의하면 상술한 바와 같은 우수한 살조능을 갖는 본 발명의 해양 미생물 균주가 담체에 고정된 적조 제거용 미생물 제제가 제공된다. 본 발명에 따라 균주를 담체에 고정화시켜 적조 발생 해역에 적용하는 경우에는 균주의 안정적인 분포를 가능하게 하며, 해수에 희석되는 정도가 저감되고 이에 따라 지속적으로 살조능을 유지할 수 있도록 한다.
According to the present invention, there is provided a microorganism preparation for red tide removal, wherein the marine microorganism strain of the present invention having the above-described superior germicidal activity is immobilized on a carrier. According to the present invention, when a strain is immobilized on a carrier and applied to a red tide generation area, stable distribution of the strain is enabled and the dilution degree in the seawater is reduced, so that the living ability can be maintained continuously.

이때, 상기 균주의 고정은 흡착에 의해 이루어지는 것으로 구체적으로는 세라믹 담체와 함께 균주를 호기적으로 4시간 배양하는 방법에 의해 담체에 고정될 수 있다
In this case, the immobilization of the strain is carried out by adsorption. Specifically, the strain may be immobilized on the carrier by aerobically culturing the strain together with the ceramic carrier for 4 hours

한편, 본 발명의 상기 담체는 적점토, 석분오니, 폐백토, 전기로(EAF) 더스트, 팽창혈암, 화산석 및 석탄회로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
Meanwhile, it is preferable that the carrier of the present invention includes at least one or more selected from the group consisting of red mud, sludge sludge, clay loam, EAF dust, expanded shale, volcanic stone and fly ash.

특히 상기 담체는 적점토 40 내지 60 중량%, 석분오니 20 내지 40 중량% 및 폐백토 5 내지 20 중량%를 포함하는 것이 바람직하며, 이에 전기로(EAF) 더스트 1 내지 10 중량%를 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
In particular, the carrier preferably comprises from 40 to 60% by weight of red mud, from 20 to 40% by weight of sludge sludge and from 5 to 20% by weight of pulverulent soot and further comprises from 1 to 10% by weight of EAF dust Is more preferable.

본 발명에 의한 상기 담체는 물 흡수율이 15 내지 25%인 것이 바람직하며, 상기 물 흡수율이 15% 미만인 경우에는 균주 체류시간이 짧아지고 처리 시간이 짧아지는 현상이 있으며, 25%를 초과하는 경우에는 담체가 경도가 약해지는 현상이 있다.
The carrier according to the present invention preferably has a water absorption rate of 15 to 25%, and when the water absorption rate is less than 15%, the bacterial retention time is shortened and the treatment time is shortened. When the water absorption rate is more than 25% There is a phenomenon that the hardness of the carrier becomes weak.

나아가, 상기 담체는 비중이 0.8 내지 1.6인 것이 바람직하며, 상기 비중이 0.8 미만인 경우에는 경도가 약하여 잘 부서지는 문제가 있으며, 1.6를 초과하는 경우에는 경도는 좋지만 수중에 침강되는 문제가 있다.
Further, the carrier preferably has a specific gravity of 0.8 to 1.6, and when the specific gravity is less than 0.8, there is a problem that the hardness is weak and it breaks well. When the specific gravity exceeds 1.6, the carrier has a good hardness but has a problem of being precipitated in water.

한편, 상기 담체는 겉보기 기공률이 17 내지 26%인 것이 바람직하며, 상기 겉보기 기공률이 17% 미만인 경우에는 균주 흡착에 문제가 있으며, 26%를 초과하는 경우에는 경도가 약하고 균주 흡착에 문제가 있다.
On the other hand, the carrier preferably has an apparent porosity of 17 to 26%. When the apparent porosity is less than 17%, there is a problem in adsorption of the strain. When the apparent porosity is more than 26%, the carrier has a low hardness.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상술한 바와 같은 본 발명의 혼합 균주 또는 미생물 제제를 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 유류 분해 방법이 제공된다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for oil degradation comprising the step of introducing the mixed strain or microbial agent of the present invention as described above into a sea area where red tide occurs.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of specific examples. The following examples are provided to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example

1. 미생물 시료 채취1. Sample collection

남해의 통영 앞바다의 4군데 지역(마산만, 진해만, 돝섬, 가두리 양식장)을 선정하였으며, 각 지역에서 하기 표 1과 같이 해수와 퇴적물을 채취하였다. 해수의 경우, 바닷물의 깊이에 따라 용존 산소량과 온도의 조건이 다르기 때문에, 미생물 분포가 다를 것을 고려하여 다양한 깊이의 해수를 채취 후 섞어 주었다.
Four areas (Masan Bay, Jinhae Bay, Jamsom, Caguri) were selected from the offshore Tongyeong coast of the South Sea, and seawater and sediments were collected from each region as shown in Table 1 below. In the case of seawater, the conditions of dissolved oxygen and temperature are different according to the depth of seawater. Therefore, various depths of seawater were collected and mixed in consideration of different microbial distribution.

가두리Cage 마산만Masan Bay 돝섬 진해만Jinhae Bay 위도Latitude 34°59'38.19"N34 ° 59'38.19 "N 35° 6'12.88"N35 ° 6'12.88 "N 35°11'0.44"N35 ° 11'0.44 "N 35° 6'55.77"N35 ° 6'55.77 "N 경도Hardness 128°40'26.38"E128 ° 40'26.38 "E 128°36'14.31"E128 ° 36'14.31 "E 128°34'59.31"E128 ° 34'59.31 "E 128°41'7.16"E128 ° 41'7.16 "E 해수 깊이Depth of sea water 8, 10, 15m8, 10, 15m 8, 10, 15m8, 10, 15m 8, 10, 15m8, 10, 15m 8, 10, 15m8, 10, 15m 퇴적물 깊이Sediment depth 퇴적물 표면Sediment surface 퇴적물 표면Sediment surface 퇴적물 표면Sediment surface 퇴적물 표면Sediment surface

해수 시료는 채수통을 이용하여 각 지점에서 20 L씩 채취하였다. 채수한 해수와 퇴적물은 아이스박스에 담아 운반하였다.
The seawater samples were sampled at 20 L from each spot using a vat. The collected seawater and sediments were carried in the ice box.

2. 균주 분리2. Strain isolation

남해안의 적조가 빈번히 발생하는 해역에서 해수 및 해저 퇴적물 시료를 채취하여 해양 세균을 분리하였다.
Seawater and submarine sediment samples were collected from marine areas where red tides frequently occur in the southern coast to isolate marine bacteria.

채취한 시료를 바탕으로 하여 살조 미생물을 확보하기 위해 다양한 배지를 이용하였다. 이때 사용한 배지는 10% 마린 아가(Difco 2216, 표 2), 10% R2A 아가(MB cell, 표 3), 100% 마린 아가, 100% R2A 아가를 사용하였고, 모든 배지는 해수에서 분리한 미생물을 배양하기 위한 것이므로 염도 35‰에 맞추어 NaCl 35 g/L로 조성하였다.
Based on the collected samples, various media were used to obtain algae microorganisms. The medium used was 10% marine agar (Difco 2216, Table 2), 10% R2A agar (MB cell, Table 3), 100% marine agar, 100% R2A agar and all the media used were microorganisms isolated from seawater For the cultivation, the composition was adjusted to 35 g / L of salinity and 35 g / L of NaCl.

마린 브로스 2216의 배지 조성(조절 pH 7.6 ±0.2)The medium composition of the Marine Broth 2216 (control pH 7.6 ± 0.2) 펩톤peptone 5 g5 g 효모 추출물Yeast extract 1 g1 g 페릭 시트레이트Ferric citrate 0.1 g0.1 g 소듐 클로라이드Sodium chloride 35 g35 g 마그네슘 클로라이드Magnesium chloride 5.9 g5.9 g 마그네슘 설페이트Magnesium sulfate 3.24 g3.24 g 칼슘 클로라이드Calcium chloride 1.8 g1.8 g 포타슘 클로라이드Potassium chloride 0.55 g0.55 g 소듐 바이카보네이트Sodium bicarbonate 0.16 g0.16 g 포타슘 브로마이드Potassium bromide 0.08 g0.08 g 스크론튬 클로라이드Strontium chloride 34 mg34 mg 보릭산Boric acid 22 mg22 mg 소듐 실리케이트Sodium silicate 4 mg4 mg 소듐 플루오라이드Sodium fluoride 2.4 mg2.4 mg 암모늄 니트레이트Ammonium nitrate 1.6 mg1.6 mg 디소듐 포스페이트Disodium phosphate 8 mg8 mg D.W.D.W. 1000 ml1000 ml

R2A 브로스의 조성(조절 pH 7.2 ± 0.2)Composition of R2A broth (adjusted pH 7.2 ± 0.2) 프로테오스 펩톤Proteose peptone 0.5 g0.5 g 효모 추출물Yeast extract 0.5 g0.5 g 카제인의 산소화물(acid digest)The casein oxygen digest (acid digest) 0.5 g0.5 g 글루코즈Glucose 0.5 g0.5 g 가용성 녹말Soluble starch 0.5 g0.5 g 디포타슘 포스페이트Dipotassium phosphate 0.3 g0.3 g 마그네슘 설페이트Magnesium sulfate 0.024 g0.024 g 소듐 피루베이트Sodium pyruvate 0.3 g0.3 g D.W.D.W. 1000 ml1000 ml

채취한 지역과 배지 별 분리균의 수는 호기 조건의 경우 하기 표 4, 그리고 혐기 조건의 경우 표 5에 나타내었다. 호기 조건과 혐기 조건에서 시료채취는 각각 3회씩 진행하였고 분리한 균주의 수는 각각 총 3490종, 1160종이었다. 위의 분리된 균주들을 비롯하여 호기, 통성혐기, 혐기성 상태에서 선별된 균주들을 이용해 살조능을 실험하였다.
The number of isolates by harvesting area and media is shown in Table 4 for aerobic conditions and in Table 5 for anaerobic conditions. The samples were collected three times in aerobic condition and anaerobic condition. The number of isolates was 3490 and 1160, respectively. Experiments were carried out using isolates, aerobic, anaerobic and anaerobic strains.

  해수sea water 해저 퇴적물(Sediment)Subsea sediment (Sediment) synthesis 10% MB10% MB 10% R2A10% R2A 100% MB100% MB 100% R2A100% R2A 10% MB10% MB 10% R2A10% R2A 100% MB100% MB 100% R2A100% R2A 마산만Masan Bay 63 (51)63 (51) 86 (95)86 (95) 88 (75)88 (75) 3 (50)3 (50) 113 (81)113 (81) 17 (25)17 (25) 15 (50)15 (50) 20 (46)20 (46) 405 (473)405 (473) 진해만Jinhae Bay 48 (83)48 (83) 28 (42)28 (42) 16 (61)16 (61) 16 (22)16 (22) 104 (107)104 (107) 24 (32)24 (32) 56 (61)56 (61) 16 (71)16 (71) 268 (478)268 (478) 가두리Cage 54 (91)54 (91) 144 (125)144 (125) - (18)- (18) - (41)- (41) 126 (81)126 (81) 12 (18)12 (18) 54 (72)54 (72) - (52)- (52) 390 (598)390 (598) 돝섬 32 (72)32 (72) 24 (32)24 (32) 60 (54)60 (54) 60 (69)60 (69) 126 (145)126 (145) 12 (21)12 (21) 39 (41)39 (41) 39 (48)39 (48) 392 (482)392 (482) synthesis 197 (297)197 (297) 282 (293)282 (293) 164 (208)164 (208) 79 (182)79 (182) 469 (514)469 (514) 65
(96)
65
(96)
124 (224)124 (224) 75 (217)75 (217) 34903490

  해수sea water 해저 퇴적물(Sediment)Subsea sediment (Sediment)   MBMB R2AR2A 27s27s MBMB R2AR2A 27s27s synthesis 마산만Masan Bay 22 (30)22 (30) - (41)- (41) - (28)- (28) 45 (51)45 (51) 29 (29)29 (29) 28 (30)28 (30) 124 (209)124 (209) 진해만Jinhae Bay 39 (31)39 (31) 26 (28)26 (28) 10 (19)10 (19) 9 (24)9 (24) 10 (20)10 (20) - (21)- (21) 94 (143)94 (143) 가두리Cage 20 (11)20 (11) 76 (11)76 (11) - (32)- (32) 16 (18)16 (18) 21 (51)21 (51) - (18)- (18) 133 (141)133 (141) 돝섬 52 (25 )52 (25) 15 (20)15 (20) 7 (19)7 (19) 42 (50)42 (50) 38 (24)38 (24) - (24)- (24) 154 (162)154 (162) synthesis 133 (97)133 (97) 117 (100)117 (100) 17 (98)17 (98) 112 (143)112 (143) 98 (124)98 (124) 28 (93)28 (93) 11601160

3. 적조생물의 선택 및 배양3. Selection and culture of red tide creatures

(1) 적조 생물 및 배지의 선택(1) Selection of red tide creature and medium

연안에서 가장 빈번히 발생하는 적조 미생물을 선택하기 위하여 기존의 논문과 자료를 토대로 적조류 별 빈도를 조사하였다. 이때 국내에 발표된 적조관련 논문 및 해양수산과학원, 해양과학기술원 등의 데이터베이스를 활용하였다. 그 중 발생 빈도수가 꾸준히 증가 추세에 있으며, 발생 시 단시간에 광역으로 심각한 피해를 일으키고 제어가 쉽지 않아 어려움을 겪고 있는 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 선택하여 살조 실험에 사용하였다. 선별한 적조는 서울대로부터 분양받았다. 분양받은 조류는 f/2배지(표 6)를 사용하였다.
In order to select the most frequently occurring red tide microorganisms on the coast, the frequency of each species was investigated based on existing papers and data. At this time, we used database of the red tide related papers published in Korea, and the database of the marine fisheries science institute and the ocean science and technology institute. Among them, Cochlodinium polykrikoides (Cochlodinium polykrikoides), which is experiencing a steady increase in the frequency of occurrence and severe difficulty in control of the wide area in a short time in a short time, was used for the killing experiment. The selected red tide was sold from Seoul National University. F / 2 medium (Table 6) was used for the algae.

성분ingredient 스탁 용액(Stock Solution)Stock Solution amount NaNO3 NaNO 3 75 g/L dH2O75 g / L dH 2 O 1 mL1 mL NaH2PO4H2ONaH 2 PO 4 H 2 O 5 g/L dH2O5 g / L dH 2 O 1 mL1 mL Na2SiO39H2ONa 2 SiO 3 9H 2 O 30 g/L dH2O30 g / L dH 2 O 1 mL1 mL 미량 금속 용액Trace metal solution (see recipe below)(see recipe below) 1 mL1 mL 비타민 용액Vitamin solution (see recipe below)(see recipe below) 0.5 ml0.5 ml 해수sea water 1L1L

하기 표 7은 f/2배지의 미량 금속 용액(trace metal solution)의 조성을 나타낸 것이고, 표 8은 f/2배지의 비타민 용액의 조성을 나타낸 것이다.
Table 7 shows the composition of the trace metal solution in the f / 2 medium. Table 8 shows the composition of the vitamin solution in the f / 2 medium.

성분ingredient 프라이머리 스탁 용액(Primary Stock Solution)Primary Stock Solution amount FeCl3 6H2OFeCl 3 6H 2 O -- 3.15 g3.15 g Na2EDTA 2H2ONa 2 EDTA 2 H 2 O -- 4.36 g4.36 g CuSO4 5H2OCuSO 4 5H 2 O 9.8 g/L dH2O9.8 g / L dH 2 O 1 mL1 mL Na2MoO4 2H2ONa 2 MoO 4 2H 2 O 6.3 g/L dH2O6.3 g / L dH 2 O 1 mL1 mL ZnSO4 7H2OZnSO 4 7H 2 O 22.0 g/L dH2O22.0 g / L dH 2 O 1 mL1 mL CoCl2 6H2OCoCl 2 6H 2 O 10.0 g/L dH2O10.0 g / L dH 2 O 1 mL1 mL MnCl2 4H2OMnCl 2 4H 2 O 180.0 g/L dH2O180.0 g / L dH 2 O 1 Ml1 Ml D.WD.W 1L1L

성분ingredient 프라이머리 스탁 용액(Primary Stock Solution)Primary Stock Solution amount 티아민 HCl(vit. B1)Thiamine HCl (vit. B 1 ) -- 200 mg200 mg 비오틴(vit. H)Biotin (vit. H) 0.1 g/L dH2O0.1 g / L dH 2 O 10 mL10 mL 시아노코발라민 (vit. B12)Cyanocobalamin (vit. B 12 ) 1.0 g/L dH2O1.0 g / L dH 2 O 1 ml1 ml D.WD.W 1L1L

선별한 적조류는 실험실 상에서 배양하는 것보다 자연계에서 발생할 때 밀도가 훨씬 높게 자라기 때문에 실험실 상에서도 밀도를 높게 배양하기 위한 배양배지 및 배양조건을 확립하였다. 조류는 20℃, 10000Lux, 3.5% (w/v) NaCl 농도에서 배양하였으며, 배지의 조건을 ① 0.2um 여과지로 여과한 바닷물을 바탕으로 F/2 성분을 넣고 고온·고압 멸균하여 만든 기존의 F/2 배지와 ② 필터한 바닷물에 F/2 조성을 첨가하고 고온·고압 멸균하지 않은 배지, ③ F/2 배지에 비타민 용액과 미량 원소(trace element, SL-6)를 1ml씩 첨가한 배지, ④ 0.2um 여과지로 여과한 바닷물, ⑤ 여과지로 여과하지 않은 바닷물로 총 5가지로 나누어 비교 실험하였다.
Because the selected red algae grow much higher density in the natural environment than in the laboratory, the culture medium and culture conditions for culturing the higher density in the laboratory have been established. The algae were cultivated at 20 ℃, 10000Lux and 3.5% (w / v) NaCl concentration. The media conditions were as follows: 1) F (2), which was prepared by high temperature and high pressure sterilization by adding F / 2 component based on seawater filtered with 0.2um filter paper (2) a medium in which the F / 2 composition is added to the seawater / filter medium, (2) the medium is not sterilized by high temperature and high pressure, (3) the vitamin solution and trace element (SL-6) Filtration of seawater filtered with 0.2um filter paper, and filtration of seawater without filter paper.

실험 결과 코클로디늄 폴리크리코이데스는 F/2 배지와 필터한 바닷물에 F/2 조성을 첨가하고 고온·고압 멸균하지 않은 배지에서 가장 잘 자라는 것으로 확인되었으며, 코클로디늄 폴리크리코이데스를 오염 없이 단일로 잘 배양하기 위해 고온·고압 멸균한 F/2 배지를 이용하여 배양하였다.
Experimental results showed that Co clonidine Polycrycoides was best grown on F / 2 medium and filtered seawater with F / 2 composition and not in high temperature and high pressure sterilized medium. The cells were cultured in a F / 2 medium sterilized at a high temperature and a high pressure for single culture.

(2) 스크리닝(2) Screening

분리된 해양 미생물 균주와 선별된 적조류 간의 혼합 배양액을 통해 살조능을 조사하였다. 이때 사용된 방법은 현미경에서 조류 세포를 직접 계수하는 방법을 사용하였다. 살조능을 가진 균주의 스크린은 24 트랜스플레이트 웰(Transplate Well)에 조류 배양액 0.9mL과 마린 아가, R2A 아가에서 균주를 배양하고 모아 3.5% NaCl로 워싱한 후 3.5% NaCl에 O.D 1.0을 맞춘 균주액 0.1mL를 섞어 혼합배양을 수행하였고 24시간 후에 Sedgwick-Rafter 챔버에 1ml를 옮겨 lugol's 용액 1%로 조류를 고정하고 현미경 상에서 조류 수를 직접 계수하였다.
The viability of the isolates was investigated using a mixed culture of isolated marine microbial strains and selected red algae. At this time, the method used for direct counting of algae cells under a microscope was used. The strains were cultured in 0.9 ml of algae culture medium, 0.2 ml of agar and R2A agar in 24 transplate wells, collected and washed with 3.5% NaCl, and then lysed with a solution of OD 1.0 in 3.5% NaCl After 24 hours, 1 ml was transferred to the Sedgwick-Rafter chamber and the algae were fixed with 1% lugol's solution and the algae count was directly counted on the microscope.

살조능은 하기 식 1을 참조하여 계산하였다. 스크린을 통하여 살조능 고효율 균주는 50% 이상의 살조능을 갖는 균주를 선별하였으며 이를 바탕으로 12시간 간격으로 살조능을 확인하는 실험을 추가로 진행하였다.The survival rate was calculated by referring to Equation 1 below. On the screen, strains with more than 50% viability were screened for survival and high efficiency strains.

Figure 112015063494242-pat00001
..식(1)
Figure 112015063494242-pat00001
(1)

이러한 과정에 의해 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에대한 살조능이 우수한 것으로 선별된 균주는 하기 표 9와 같으며, 특히 그 동안 γ-프로테오박테리아에 속하는 해양세균이 살조균으로 많이 알려진 것에 비해 살조능을 가진 넵튜노모나스(Neptunomonas) 속은 α-프로테오박테리아에 속하며, 이에 속하는 균에서의 살조능은 거의 밝혀지지 않은 상태이다.
The strains selected as having excellent lyophilicity against Cochlodinium polykrikoides by the above process are as shown in Table 9, and in particular, marine bacteria belonging to the γ-proteobacteria have been known as live bacteria Neptunomonas genus, which has a life-enhancing ability, belongs to α-proteobacteria, and the life-giving power of the genus Neptunomonas is almost unknown.

균주Strain 코클로디늄 폴리크리코이데스Co-clodinium policycloides 제거율 (%)Removal rate (%) 계수 (number of cells/mL)Count (number of cells / mL) 비브리오 알지놀리티쿠스 DS8Vibrio alginolyticus DS8 98.798.7 8.0×10 (control: 6.49×103)8.0 x 10 (control: 6.49 x 10 3 ) 넵튜노모나스 속 2R1Neptune Nomonas genus 2R1 98.998.9 7.0×10 (control: 6.29×103)7.0 x 10 (control: 6.29 x 10 3 ) 넵튜노모나스 나프토보란스 2R7Neptunian Nosnap Toborans 2R7 98.298.2 1.1×102 (control: 6.20×103)1.1 × 10 2 (control: 6.20 × 10 3 ) 스완넬라 유피나이 GM5Swanella yupinai GM5 98.798.7 8.0×10 (control: 6.27×103)8.0 x 10 (control: 6.27 x 10 3 ) 비브리오 니오칼레도니쿠스 MS7Vbrionio Caledonics MS7 98.498.4 1.0×102 (control: 6.27×103)1.0 × 10 2 (control: 6.27 × 10 3 )

4. 고효율 균주의 4. High-efficiency strain 시간 별By time 살조능A life force 확인 Confirm

24시간 혼합 배양을 통해 선발된 살조균의 시간 별 살조능의 변화를 보기 위해서 매 12시간씩 계수하여 본 발명의 각 균주의 살조능을 조사하여 도 1에 나타내었다. 이때 살조능의 변화를 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 수 변화를 측정하여 확인하였다.
FIG. 1 shows the viability of each strain of the present invention by counting for 12 hours each time in order to see the change in the viability of the killed bacteria by the time of 24-hour mixed culture. At this time, changes in the survival rate were confirmed by measuring the number of cochlodinium polykrikoides.

나아가, 조류 배양액 1.8mL와 마린 아가, R2A 아가에서 배양하고 모아 3.5% NaCl로 워싱한 후 3.5% NaCl에 O.D 1.0을 맞춘 균주액 0.2mL를 섞어 혼합 배양을 수행하며 살조능을 측정하였고 동시에 변화하는 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 수를 측정하기 위해 헤모사이토미터(Hemocytometer)를 이용하여 균의 수를 계수하였으며 살조균에 의한 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 살조(algicide)되는 현상을 도 1에 나타내었다.
Furthermore, 1.8 mL of the algae culture, 0.2 mL of the strain solution which had been incubated in marine agar and R2A agar, washed with 3.5% NaCl and adjusted to OD 1.0 with 3.5% NaCl was mixed and cultured, To determine the number of cochlodinium polykrikoides, the number of bacteria was counted using a hemocytometer and the number of cochlodinium polykrikoides Fig.

도 1(a)는 본 발명의 살조균에 의해 적조 유발 조류(algae)인 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 살조하는 것을 나타낸 것으로, A는 실험 시작 직후 살조균 처리 0시간, B는 살조균 처리 12시간 후, 그리고 C는 살조균 처리 24시간 후 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)가 제거되는 것을 확인한 현미경 상의 사진이다. 한편, 도1(b)는 살조균 배양액에 의해 적조 유발 조류인 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)가 살조되는 것을 나타낸 것으로, A는 실험 시작 직후 살조균 처리 0시간, B는 살조균 처리 12시간 후, 그리고 C는 살조균 처리 24시간 후 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)이 제거되는 것을 확인한 현미경 상의 사진이다.
FIG. 1 (a) shows the chewing of Cochlodinium polykrikoides, which is algae, by the salting out of the present invention. In FIG. 1, Is a photograph on a microscope which confirms that Cochlodinium polykrikoides is removed after 12 hours of treatment with killed bacteria and C after 24 hours of treatment with killed bacteria. Fig. 1 (b) shows that cochlodinium polykrikoides, which is a red tide-induced algae, is killed by the broth culture, and A shows the treatment time 0 hours after the start of the experiment, 12 hours after treatment, and C is a microscope photograph showing that Cochlodinium polykrikoides is removed after 24 hours of treatment with the killed bacteria.

실험의 재현성을 확인하기 위해 살조능이 높은 다섯 균주들을 바탕으로 재 실험을 진행하여 그 결과를 도 2 및 도 3이 나타내었다.
In order to confirm the reproducibility of the experiment, re-experiments were conducted based on five strains with high lyophilicity and the results are shown in FIGS. 2 and 3.

이때 사용된 균주는 표 9에 기재된 바와 같으며, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 살조균 넵튜노모나스 속 (Neptunomonas sp. 2R1)가 98.9%로 가장 높은 살조능을 보였으며, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 균주의 성장도 8.29×106 cells/ml 로 안정적인 균주의 성장을 보였다.The strains used were as shown in Table 9. As can be seen from FIG. 2, Neptunomonas sp. 2R1 showed the highest survival rate as 98.9% As shown, the growth of the strain was stable at 8.29 × 10 6 cells / ml.

5. 본 발명의 균주에 적합한 5. Suitable for the strain of the invention 담체의Carrier 선정 selection

살조 균주의 기존 현장적용 방법은 살조균을 배양해서 현장에 뿌리는 방법을 이용하였으나, 바닷물에 희석되어 효과가 저감되는 경향이 있었다. 따라서 이에 대응하는 새로운 방법으로, 담체에 살조 고효율 균주를 부착하여 안정화시킴으로써 희석되는 효과를 없애고 지속적으로 살조능을 유지하는 방법을 고안해 내었다.
The existing application method of the typhoid strains tended to be applied to the field by cultivating the killing bacteria but diluted in seawater and the effect was reduced. Therefore, we have devised a new method to eliminate the effect of dilution by continuously attaching and stabilizing a high-killing strain on the carrier and maintaining the survival ability continuously.

본 발명의 살조능이 우수한 균주에 대한 담체의 예로서 하기 표 10과 같이 총 5종의 다기공 세라믹 담체를 제조하였다.
As a carrier for the strain having excellent lyophilicity of the present invention, five types of multi-pore ceramic carriers were prepared as shown in Table 10 below.

세라믹 담체에 살조균을 부착하기 위하여 균주를 최적 배양 배지 4L에 접종 하여 최적 배양 온도인 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 각각의 세라믹 담체는 잘 세척하여 가루를 제거하여 주고, 살조 미생물인 넵튜노모나스(Neptunomonas sp. 2R1)를 O.D(600nm) 0.8로 맞추고 균주 배양액(약 108 cells/ml)에 1.26kg의 세라믹 골재를 넣어 총 약 3L로 총 부피를 조성하여 4시간 동안 실온에서 혼합하여 흡착시켰다.
The strain was inoculated in 4L of optimal culture medium and incubated for 3 days at 28 ℃, which is the optimal culture temperature, for attaching the killed bacteria to the ceramic carrier. Each of the ceramic substrates is well washed to give Removal of the powder, saljo microorganism neptyu eggplant grandma (Neptunomonas sp. 2R1) the OD (600nm) focused by 0.8 strain culture ceramic aggregate of 1.26kg (about 10 8 cells / ml) And the total volume was adjusted to about 3 L. The mixture was mixed at room temperature for 4 hours and adsorbed.

  적점토 Red spot 석분오니 Sirloin 폐백토 Lung white EAF더스트 EAF dust 석탄회 Coal fly ash 세라믹담체-1Ceramic carrier-1 60 중량%60 wt% 30 중량%30 wt% 10 중량%10 wt% - - - - 세라믹담체-2Ceramic Carrier -2 독일Liapor제품(팽창혈암) Liapor products from Germany (expanded shale) 세라믹담체-3Ceramic Carrier -3 GETPC(화산석) GETPC (volcanic stone) 세라믹담체-4Ceramic Carrier-4 60 중량%60 wt% 25 중량%25 wt% 10 중량%10 wt% 5 중량%5 wt% - - 세라믹담체-5Ceramic Carrier -5 50 중량%50 wt% - - - - - - 50 중량%50 wt%

그 중 바닷물 위에 뜨고 균주의 흡착률이 가장 좋은 세라믹 담체 4의 담체를 이용하여 살조능 실험을 진행하였다.
Among them, the carrier of the ceramic carrier 4 which floated on the seawater and had the best adsorption rate of the strain was used to carry out the experiment.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세라믹 담체 4의 담체는 비중이 1 이하이며 20% 이상의 흡수율과 60% 이상의 공극률(겉보기 기공률)을 가지고 있다. 한편, 제조예 4의 담체와 살조능이 가장 높은 2R1 균주를 흡착하였을 때, 평균적으로 2.31x107cells/g의 균들이 흡착되어 있음을 확인하였고, 따라서 이를 조류에 적용하거나 현장 적용하였을 때에도 지속적으로 살조 균주를 공급하여 살조능을 유지할 수 있을 것으로 예상되었다.
4, the carrier of the ceramic carrier 4 has a specific gravity of 1 or less and an absorption rate of 20% or more and a porosity (apparent porosity) of 60% or more. On the other hand, when the carrier of Production Example 4 and the 2R1 strain having the highest lyophilicity were adsorbed, it was confirmed that an average of 2.31x10 7 cells / g of the bacteria was adsorbed. Therefore, when applied to algae or applied in the field, It was expected that it would be possible to maintain the survival ability by supplying strains.

6. 본 발명의 균주를 이용한 적조 제거 실험6. Red tide removal experiment using the strain of the present invention

본 발명의 균주를 이용한 적조 제거 실험을 위해 유입조, 반응조 및 유출조를 마련하고, 유입조에 2,961 cells/ml의 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 유입하였다. 반응조에는 세라믹 담체 2에 흡착된 본 발명의 살조 해양 미생물 균주 2R1를 배치하였으며, 그 결과 반응조에서는 80.2% 살조 효과를 획득할 수 있었다. 한편, 결국 최종적으로 유출조에는 반응조에 통과되어 제거된 해수를 담아내어 최종 방류하였다. 그 결과 최종적으로 97.2%의 살조 효과를 획득할 수 있었다.
For the red tide removal experiment using the strain of the present invention, an inlet tank, a reaction tank and a flow-out tank were provided, and 2,961 cells / ml of Cochlodinium polykrikoides was introduced into the inlet tank. In the reaction tank, the salted and marine microorganism strain 2R1 of the present invention adsorbed on the ceramic carrier 2 was disposed, and as a result, 80.2% salivation was obtained in the reaction tank. Finally, finally, the effluent tank was passed through the reaction tank to contain the removed seawater and finally discharged. As a result, it was finally able to obtain a killing effect of 97.2%.

도 4는 살조균 넵튜노모나스 속(Neptunomons sp. 2R1)이 적조 발생 조류 중 특이적으로 코클로디늄 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 대해 선별적 살조능이 있음을 확인한 그래프로, 도 4(a)는 코클로디늄 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(b)는 차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(c)는 프로로센트럼 미니멈 (Prorocentrum minimum)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(d)는 헤테로카파사 트리퀘트라(Heterocapasa triquetra)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(e)는 헤테로시그마 아카시오 (Heterosigma akashiwo)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(f)는 스케레토네마 코스타튬 (Skeletonema costatum)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과, 도 4(g)는 스크립시엘라 트로코이드 (Scrippsiella trochoides)에 대한 넵튜노모나스 (Neptunomons sp. 2R1)의 살조능 결과를 나타낸 것이다.
FIG. 4 is a graph showing that Neptunomons sp. 2R1 has a selective lyophilicity against Cochlodinium polykrikoides in red tide occurrence birds. FIG. 4 (a) ) Shows the results of the live performance of Neptunomons sp. 2R1 against Cochlodinium polykrikoides and Fig. 4 (b) shows results of Neptunomons sp. 2R1 against Chattonella marina Figure 4 (c) shows the results of the live performance of Neptunomons sp. 2R1 against the Prorocentrum minimum, Figure 4 (d) shows the results of the live performance of Heterocarpa triquatra (Neptunomons sp. 2R1) against Heterocapasa triquetra, Fig. 4 (e) shows the result of the firing of Neptunomons sp. 2R1 against Heterosigma akashiwo, FIG. 4 (f) (g) of the Neptunomons sp. 2R1 against the Scorpioella sp. costatum, and Figure 4 (g) shows the spawning performance of Neptunomons sp. 2R1 against the Scrippsiella trochoides .

도 5는 이와 같이 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한, 적조 방제를 위한 바이오/에코 반응기 시스템의 다이아그램 및 그 결과를 도시한 것이다.
FIG. 5 shows a diagram and a result of a bio / eco reactor system for controlling red tide, applying the shale and marine microorganism strain of the present invention and a ceramic carrier.

도 6은 이와 같이 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한, 적조 방제를 위한 바이오/에코 반응기 시스템의 사진이다.
FIG. 6 is a photograph of a bio / eco reactor system for red tide control applying the salmon and microbial strains of the present invention and a ceramic carrier as described above.

도 7은 상기 실험의 본 발명의 살조 해양 미생물 균주와 세라믹 담체를 적용한 실험군에 있어서, 담체에 살조균이 흡착된 실험군(Ceramic+Bacteria)에서 반응조와 유출조에서의 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides) 살조율을 나타낸 것이다.
FIG. 7 is a graph showing the results of a comparison between the results of the experiment (Ceramic + Bacteria) adsorbed on the carrier and the contents of the clodroid policycloides Cochlodinium polykrikoides) .

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, It will be obvious to those of ordinary skill in the art.

이 발명을 지원한 국가연구개발사업National R & D project supporting this invention

과제고유번호: NRF-2013M3A2A1067498Assignment number: NRF-2013M3A2A1067498

부처명: 미래창조과학부Department: Future Creation Science Division

연구관리전문기관: 한국연구재단Research Management Institution: Korea Research Foundation

연구사업명: 원천기술개발사업 > 공공복지안전기술개발사업Research Project Name: Source Technology Development Project> Public Welfare Safety Technology Development Project

연구과제명:  바이오/나노세라믹 막을 이용한 육상가두리양식장 오염해수 정화 및 적조방제 시스템 개발Research title: Development of system for pollution control and red tide control of polluted aquaculture farms using bio / nano ceramic membrane

기여율: 80Contribution rate: 80

주관기관:  경기대학교Host organization: Kyonggi University

연구기간:  2013.10.01-2018.07.31
Research period: 2013.10.01-2018.07.31

과제고유번호: NRF-2015M3A9B8029697    Assignment number: NRF-2015M3A9B8029697

부처명: 미래창조과학부Department: Future Creation Science Division

연구관리전문기관: 한국연구재단Research Management Institution: Korea Research Foundation

연구사업명: 원천기술개발사업 > 바이오·의료기술개발사업 > 연구소재지원사업Research Project Name: Source Technology Development Project> Bio / Medical Technology Development Project> Research Material Support Project

연구과제명:  환경 산업 미생물 및 유전자 보존센터Research Project: Microbiology and gene conservation center for environmental industry

기여율: 20Contribution rate: 20

주관기관:  경기대학교Host organization: Kyonggi University

연구기간:  2015.05.01-2020.04.30Research period: 2015.05.01-2020.04.30

Claims (7)

적조 발생 조류들 중 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 선별적 살조능을 갖는 넵튜노모나스(Neptunomonas) 속. 2R1 (Neptunomonas sp. 2R1, 기탁번호KACC92080P) 해양 미생물 균주가,
적점토 60 중량%, 석분오니 25 중량%, 폐백토 10 중량% 및 전기로 더스트 5 중량%를 포함하는 담체에 고정된, 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 조류에 의해 발생한 적조 제거용 미생물 제제.
Neptunomonas spp., With selective fungicidal action against cochlodinium polykrikoides, among red tide outbreaks. 2R1 (Neptunomonas sp. 2R1, Accession No. KACC92080P)
A red tide generated by an algae including cochlodinium polykrikoides, which is fixed on a carrier containing 60 wt% of red mud, 25 wt% of sludge sludge, 10 wt% of scavenged soil and 5 wt% of electric furnace dust Microbial preparation for removal.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항의 미생물 제제를 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 조류에 의해 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 조류에 의해 발생한 적조 제거 방법.
CLAIMS What is claimed is: 1. A method for producing a microorganism, comprising the step of introducing the microorganism preparation of claim 1 into a watershed where the blooming occurs by an algae comprising Cochlodinium polykrikoides, A method of removing red tide caused by.
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