KR101665269B1 - 폐질환 치료용 또는 증상완화용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 폐질환 치료용 또는 증상완화용 약학조성물은 V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함한다. 상기 약학조성물은 특히 폐질환 중에서 폐섬유화증 또는 흡연에 의한 폐기종의 치료 또는 증상 완화용으로 유용하다.

Description

폐질환 치료용 또는 증상완화용 약학조성물{Pharmaceutical Composition for treating lung disease comprising V-atpase B2 protein}

본 발명은 폐질환 치료용 약학조성물에 대한 것으로, V-atpase B2 단백질을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증, 흡연(간접흡연을 포함한다)에 의한 폐기종 치료용 또는 증상완화용 약학조성물에 관한 것이다.

Vacuolar type H+-ATPase(V-ATPase)는 세포막의 트랜스포터(transporter)로서 수소이온(H⁺ ion)을 세포 내로 유입하여 세포 내 pH를 산성으로 유지를 하는 작용을 하며 세포 내 환경의 항상성을 유지하는 역할을 하는 단백질이다.

V-ATPase 단백질은 위치하는 조직에 따라서 아이소폼(isoform)이 있으나 기본적으로 V0 및 V1 의 두 가지 다른 기능성 도메인(functional domain)로 구성된다. V0 도메인은 원형질막(plasma membrane)에 존재하며 V1 도메인은 세포질(cytoplasm)에 존재한다. V0 도메인은 H ion이 translocation 되는 부분으로 c, d, e의 3가지 서브유닛(subunit)으로 구성되어 있다. V1 도메인은 A3, B3, C, D, E2, F, G2, H의 8가지 서브유닛(subunit)으로 구성이 된다. ATP가 결합(binding)되는 부위는 A3B3로서 이 부위에서 ATP의 분해(hydrolysis)가 발생되는 것으로 알려져 있다.

V-ATPase의 세포 내에서 가장 기본적인 역할은 엔도솜(endosome), 라이소좀(lysosome) 등에서 세포 내 전달된 물질을 처리(process or degradation)할 수 있는 최적의 산성 pH를 유지하도록 하는 양성자 펌프(proton pumping) 역할을 한다. 그러나, 각 subunit의 구체적인 역할이나 그 활용에 대한 연구는 아직 명확하지 않은 것으로 보인다.

Milgrom E et al. J Biol Chem. 2007 Mar 9;282(10):7125-36, Loss of vacuolar proton-translocating ATPase activity in yeast results in chronic oxidative stress Geum-Hwa Lee et al. J Biol Chem. 2011 Jul 15; 286(28): 24743-24753, Enhanced Lysosomal Activity Is Involved in Bax Inhibitor-1-induced Regulation of the Endoplasmic Reticulum (ER) Stress Response and Cell Death against ER Stress.

본 발명의 목적은 V-atpase B2 단백질을 유효성분으로 포함하는 폐질환 치료용 또는 증상완화용 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 폐섬유화증 치료용 또는 증상완화용 약학조성물은 V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함한다.

상기 V-에이티피아제 B2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 hV-atpase B2일 수 있다.

상기 약학조성물은 비강내 투여용 또는 기관지내 투여용일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 흡연 또는 간접흡연에 의한 폐기종 치료 또는 증상완화용 약학 조성물은, V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 V-ATPase를 구성하는 서브유닛 중 하나인 V-ATPase B2 단백질이, 폐(lung) 질환, 특히 급성폐손상(acute lung injury), 폐섬유화증(pulmonary fibrosis), 폐기종(emphysema) 등의 폐 손상 질환의 치료와 증상 완화에 효과가 있음을 동물모델을 이용하여 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학조성물은, V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함하여 폐질환 치료용 또는 증상완화용으로 적용될 수 있다.

상기 V-에이티피아제 B2 단백질은 인간을 포함하는 포유동물의 V-에이티피아제 B2 단백질일 수 있고, 좋게는 인간 V-에이티피아제 B2 단백질일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1과 도 1에 표시되는 511개의 아미노산 서열을 가지는 V-에이티피아제 B2 단백질일 수 있다.

상기 폐질환은 급성폐손상, 폐섬유화증 또는 폐기종일 수 있고, 특히 산화적 스트레스와 관련된 세포손상이 동반되는 폐질환에 상기 약학조성물이 유용할 수 있다. 또한, 상기 폐질환은 담배연기로 유도된 폐기종일 수 있다.

본 발명의 약학조성물은, V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함하여 흡연 또는 간접흡연에 의한 폐손상 억제 또는 완화용으로 적용될 수 있다.

상기 약학조성물의 투여는, 위에서 언급한 약리 활성을 나타내는 약제의 투여 방법으로 일반적으로 인정되는 방식에 의할 수 있고, 구체적으로 경구, 비경구 또는 국소 투여, 다른 방법에 의한 전신 투여 등의 방법에 의할 수 있다. 상기 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 내에서의 비강내 투여 또는 기관지 투여의 방법으로 방법으로 환자에게 투여되는 것이 좋다. 또한, 상기 약학조성물은 환자에게 비경구적 투여, 예를 들어 정맥, 동맥, 척추 또는 복강 내 투여를 하기에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화 될 수도 있다.

상기 약학조성물은, 바람직하게는 정확한 용량의 투여에 적합한 단위 제제로서, 예를 들면, 알약, 캡슐, 분말, 액상, 현탁액 등과 같은 고체, 반고체 또는 액체 제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 약학조성물은 통상적인 약학적 담체 또는 부형제를 포함하며, 게다가 다른 의약제제, 약학제제, 담체, 부가제 등을 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들면, 인간 혈청 알부민 또는 플라즈마 단백질과 같은 다른 단백질을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것인 아니다.

바람직하게 상기 약학조성물은 상기 폐 질환의 치료시 기존의 치료제와 동시에 또는 별도로 투여되는 것일 수 있다.

상기 투여되는 약학조성물 또는 이의 제형물은, 치료받고 있는 피검자에게서 바람직한 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 유효성분의 양을 함유하며, 상기 환자에게 투여되는 활성성분의 양은, 피검자의 특성, 병의 심각성, 투여의 방식, 의사의 판단 등에 의하여 달라지나, 비교적 저농도의 단백질을 투여하는 것이 좋다. 예를 들어, 상기 약학조성물은 1 x 10⁵ IU/사람 내지 9 x 10⁶ IU/사람일 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 V-atpase B2 단백질을 유효성분으로 포함하여, 폐질환 치료 또는 증상완화용으로 유용하며, 특히 폐질환 중에서 폐섬유화증 또는 흡연(간접흡연을 포함한다)에 의한 폐기종의 치료 또는 증상 완화용으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 V-에이티피아제 B2 단백질의 서열 정보를 보여주는 그림.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조하는 유전자조작 마우스의 Vatpase B2 단백 발현 조절 여부를 확인한 IF staining 결과.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조하는 유전자조작 마우스의 Vatpase B2 단백 발현 조절 여부를 확인한 웨스턴 블로팅(Western blotting) 결과.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 V-atpase B2 TG mice에 유도 급성 폐손상 폐섬유화를 유도한 마우스 모델의 제조 과정을 설명하는 모식도.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 기관지폐포세척액(BALF)로부터 전체 폐염증세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 림프구 수를 측정한 결과를 보여주는 그래프.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 폐 조직 손상 정도를 보여주는 H&E 염색 결과.
도 7은 본 발명의 실시예 2에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 폐 조직 내에 콜라겐 축적 정도를 트리그롬 염색 결과.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 CS 유도 폐기종 마우스 모델의 기관지폐포세척액(BALF)로부터 전체 폐염증세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 림프구 수를 측정한 결과를 보여주는 그래프.
도 9는 본 발명의 실시예 3에서 CS 유도 폐기종 마우스 모델의 폐조직을 이용하여 lung mechanics(좌: 폐 유순도, 우: 폐탄성)를 측정한 결과.
도 10은 본 발명의 실시예 3에서 CS 유도 폐기종 마우스 모델의 폐포 조직을 H&E 염색으로 관찰한 결과.
도 11은 본 발명의 실시예 4에서 293T세포를 이용한 Vatpase B2 protein의 세포 내 유입을 IF staining으로 확인한 결과.
도 12는 본 발명의 실시예 4에서 293T세포를 이용한 Vatpase B2 protein의 세포 내 유입을 Immunoblotting으로 확인한 결과.
도 13은 본 발명의 실시예 4에서 293T세포 내의 V-atpaeB2 단백의 localization을 이중 면역형광 염색을 이용하여 확인한 결과.
도 14는 본 발명의 실시예 4에서 마우스 폐질환 모델에서의 V-atpase B2 단백 비강 투여의 효과를 시험하기 위한 과정을 설명하는 모식도.
도 15는 본 발명의 실시예 4에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 기관지폐포세척액(BALF)로부터 전체 폐염증세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 림프구 수를 측정한 결과를 보여주는 그래프.
도 16은 본 발명의 실시예 4에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 조직에 Vatpase B2가 유입되었음을 확인한 면역형광염색 결과.
도 17은 본 발명의 실시예 4에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 조직을 H&E 염색으로 관찰한 결과.
도 18은 본 발명의 실시예 4에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 조직을 Massons trichrome stain 하여 콜라겐 축적 정도를 확인한 결과.
도 19는 본 발명의 실시예 4에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 조직에 축적된 콜라겐 섬유의 양을 sircol assay를 통해 확인하고 정량화한 결과(* p<0.05 by Mann-Whitney U test).

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: 폐포(type II pneumocyte )에 Vatpase B2 단백이 과발현되는 유전자조작 마우스의 제조

폐질환인 급성 폐손상(acute lung injury), 폐섬유화증(lung fibrosis), 폐기종(cigarette smoke induced emphysema)에 대한 동물모델에서의 Vatpase B2 단백의 치료 효과를 검증하기 위하여, 폐포(type II pneumocyte)에 Vatpase B2 단백이 과발현되며, 과발현시기를 DOXY로 조절할 수 있는 double transgenic mice를 제작하였다. 구체적으로, hVatpase B2 construct는 RT-PCR을 이용하여 TRE-tight vector에 1x flag sequene가 포함된 VATPaseB2 cDNA construct을 subcloning하여 제작하였으며, V-atpase B2 단백발현을 Flag Ab.로 정확히 detection할 수 있도록 하였다. 두 가지 construct를 C57/BL6 마우스의 난자에 주입하여 교배하여 만든 double transgenic mice를 이하 실험에 적용하였다.

제조된 유전자조작 마우스는 DOXY로 Vatpase B2 단백 발현이 조절되는지 여부를 Flag Ab.를 이용하여 IF staining과 Western blotting으로 확인했고 그 결과를 각각 도 2와 도 3에 나타내었다.

상기 도 2와 도 3을 참조하면, 이하 실험 진행을 위해서 제조된 유전자조작 마우스는 DOXY 도입 유무에 따라서 flag tagged hVatpase B2 단백이 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 유전자조작 마우스를 이용한 유도 급성 폐손상 마우스 모델에서 과발현된 V- atpase B2의 효과 실험

1) 실험과정

위에서 제조한 V-atpase B2 TG mice의 기관지(intratracheal) 내로 블레오마이신(Bleomycin)을 투여하여 실험동물에 급성 폐손상/폐섬유화증을 유도하였다. 구체적으로, 아래 도 4에 나타난 것처럼 블레오마이신 투어 5일 전에 Doxy water를 투여하여 V-atpase B2의 과발현을 유도하고 블레오마이신을 투여한 후 14일째에 희생하여 기관지 폐포세척액(BALF), 기관지 및 페소 조직 등을 확보하여 이후 실험을 진행했다.

1. 대조군: Doxy(-) + Bleomysin(3 mg/kg) 투여군

2. 실험군: Doxy(+) + Bleomysin(3 mg/kg) 투여군

2) 기관지 폐포세척액( BALF ) 분석

마우스의 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar labage fluid; BALF)은 37℃에서 주사기로 PBS 1000 μl를 상기 질환이 유도된 마우스의 기도에 반복하여 주의 깊게 넣고 흡입시킴으로써 수득하였으며. 2% FCS(fetal calf serum)을 함유한 HBSS(Hank’s balanced salt soulution)으로 세척하고 lysis buffer를 이용하여 적혈구를 제거한 후, 원심분리하여 상층액을 따로 모았다.

BALF에 함유된 전체 폐염증세포를 계산한 후, 상기 수득된 폐포 세척액에 포함된 각종 면역 세포를 사이토스핀 챔버(cytospin chamber)를 사용하여 1000 rpm에서 슬라이드 글라스 위에 도말하고 Diff-Quik로 염색한 다음, 대식세포, 림프구, 중성구 및 호산구의 세포수를 400배 비율의 광학현미경(Nicon, Japan)으로 관찰하였으며, 500개의 세포를 무작위로 선택하여 각각의 세포수를 계산하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과를 참조하면, Doxy (+), 즉 VAtpase B2의 과발현이 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시킨다는 점을 보여주고 있으며, 특히 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시킴을 확인하였다.

3) H&E 염색을 통한 폐손상 평가

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플로 제조하였다. 조직 샘플은deparaffinization 과정을 거친 후 Hematocyline 200μl로 1분간 염색하고 10분간 수세하였다. 이어서, Eosin 200μl로 1분간 염색하였고 10분간 수세 한 후 Dehydration 과정을 거쳐서 마운팅하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6을 참조하면, Doxy(+)로 V-atpase B2 단백이 과발현된 실험군의 샘플들에서 조직 손상이 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

4) 트리크롬 염색( Trichrome stain)을 이용한 콜라겐 형성 억제능 평가

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플을 제조하였다. 조직 샘플은deparaffinization 과정을 거친 후 흐르는 물에 수세하고 Bouin solution을 200μl 처리하여 56도의 인큐베이터에서 1시간 매염하였다. 흐르는 물에 수세하고 Weigrt iron hematoxylin 200μl로 상온에서 10분간 염색을 진행하였다. Bibrich scarlet 200μl로 상온에서 10분간 염색한 후 수세하고, Phosphomoybdic-phosphotungstic acid를 상온에서 10분간 처리한 후, Aniline blue 200μl로 상온에서 2시간 염색하는 과정을 거쳤다. 이렇게 처리된 조직 샘플은 흐르는 물에 수세하고 Dehydration 과정을 거친 후 마운팅하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 참조하면, Doxy(+)로 V-atpase B2 단백이 과발현된 실험군의 샘플들에서 파란색으로 나타나는 콜라겐 축적이 현저하게 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 V-atpase B2 단백의 과발현이 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 3: 유전자조작 마우스를 이용한 CS(cigarette smoke) 유도 폐기종(emphysema) 마우스 모델에서 과발현된 V- atpase B2의 효과 실험

1) 실험과정

위의 실시예 1에서 제조한 유전자 조작 마우스(Vatpase B2 과발현 mice)를 6개월 동안 담배 연기에 하루 3시간씩 주 5회 노출시켜 CS(cigarette smoke) 유도 폐기종(emphysema) 마우스 모델을 제작하였다.

구체적으로, Vatpase B2 과발현 mice를 6개월간 plexiglass chamber(16x 25x 16cm)에서 smoking tester system (ThreeShineCom, Daejeon, Korea)을 이용하여 CS에 노출시켰다. CS에 노출시킨 첫날로부터 희생 전까지 Doxy containing water(50mg/ml)를 투여하여 V-atpase B2의 과발현을 유도하였고, CS는 3R4F burning reference cigarette를 이용하였으며, 하루 3시간씩 주 5회, 6개월 동안 담배 연기에 노출시켰다.

CS 노출 없이 air에만 노출한 Vatpase B2 과발현 실험군(VATPaseB2 air)과 Vatpase B2 과발현을 유도하지 않고 CS만 위와 동일한 조건으로 노출한 실험군(WT_CS)을 대조군으로 적용하였다.

이렇게 CS 유도 폐기종(emphysema) 마우스 모델을 제조한 후, 희생하여 기관지폐포세척액(BALF), 기관지 및 폐포 조직 등을 확보하여 이후 실험을 진행하였다.

2) 기관지 폐포세척액( BALF ) 분석

위의 실험동물로부터 얻은 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증 세포들의 분획을 위에서 설명한 것과 동일한 방법으로 측정하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8을 참조하면, 기관지폐포세척액에서 염증 세포들의 분획을 측정한 결과, 측정된 대식세포, 호산구, 중성구, 림프구 수치 중에서 VatpaseB2과발현의 경우 대식세포, 호중구의 수가 흡연군에 비해 현저히 감소되는 것으로 나타났다. CS로 인한 폐기종의 특징은 폐포 내 대식세포와 호중구의 증가라는 점을 고려하면 위의 실험 결과는 VatpaseB2과발현이 CS로 인한 폐기종 발생을 치료 또는 예방하는 결과라 생각된다.

3) 폐 조직의 기계적 특성 평가

폐기종은 폐유순도(static compliance)증가 및 탄성(elastance)의 감소를 특징으로 하므로, Flexi-vent기기를 이용하여 희생된 마우스 폐조직의 lung mechanics를 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9를 참조하면, CS로 인해 증가된 폐 유순도 및 감소된 폐탄성이 Vatpase B2과발현으로 정상화되는 결과를 보여주었다.

4) H&E 염색을 통한 폐손상 평가

CS(cigarette smoke) 유도 폐기종(emphysema) 마우스 모델의 폐조직을 이용하여 위에서 설명한 것과 동일하게 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 관찰을 실시하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

상기 도 10을 참조하면, Doxy(+)/CS, 즉 Vatpase B2 과발현쥐가 흡연을 한 경우에, 흡연으로 인한 폐기종(air space enlargement(중간 칸그림, Doxy(-) CS)이 나타나지 않는 정상 폐포의 모습을 나타낸다는 점을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과들을 종합하면, Vatpase B2을 과발현시킬 경우, CS로 유도되는 동물 폐기종이 현저히 감소됨을 확인하였으며, VatpaseB2가 CS에 대항하는 폐보호 작용이 있고, 폐기종의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있음을 보여주는 결과로 생각된다.

실시예 4: 마우스 폐질환 모델에서의 V- atpase B2 단백 비강 투여와 급성 폐손상 /섬유화증 치료효과

1) 293T세포를 이용한 Vatpase B2 protein의 세포 내 유입 시험.

< Immunofluorescence stain 실험>

Vatpase B2 단백(ORIGENE, USA, flag tagged recombinant protein, 56K.D.)을 293T세포에 투여하여 상기 단백이 endocytosis과정으로 세포에 유입됨을 아래와 같은 방법으로 확인하였다.

293T세포 (ATCC 번호: CRL-3216)를 37℃, 5% CO₂의 습윤 분위기 하에서 10 % (v/v) 열-불활성화된 태아 소혈청, 10,000U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin in 0.85% NaCl을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 배양하였고, 배양된 293T세포에 Vatpase B2 단백을 2 ng/well로 투여한 후 위와 동일한 조건에서 17 시간 배양한 후, IF staining을 실시하였다.

구체적으로, 배양액을 제거하고 DPBS로 수세한 후 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정시킨 후 깨끗하게 수세하고 Triton X-100을 사용하여 permiabilization 과정을 수행하였다. DPBS로 수세하고 5% goat normal serum 으로 상온에서 1시간 블로킹하고 1차 안티바디 (anti-flag)를 10ug/ml로 블로킹 용액에 희석하여 4℃에서 17시간 인큐베이션 시켰다. 이어서 2차 안티바디 (Anti-Rabbit FITC)를 1:1000으로 희석하여 처리하고 빛을 차단한 채로 상온에서 1시간동안 인큐베이션 시키고 DAPI로 핵 염색을 수행하였다. 이렇게 처리된 샘플은 형광 염색용 마운팅 용액으로 마운팅하고 형광현미경으로 결과를 확인했으며 도 11에 나타냈다.

상기 도 11을 참조하면, 위에서 설명한 방법으로 293T세포의 세포질에 Vatpase B2 단백이 잘 도입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

< Immunoblotting 실험>

위의 실험에서 사용한 것과 동일한 293T세포에 Vatpase B2 단백(2 μg/ml)을 도입한 후, lysis buffer를 가하여 세포용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 10% SDS-PAGE를 이용하여 이 단백질을 전개하고, 5% 탈지유(skim milk)로 브로킹한 후 1차 항체로 anti-FLAG 항체(SIGMA, 1:5000)를, 2차 항체로 anti-rabbit IgG(1:5000)을 이용하여 반응시킨 후 detecting 과정을 수행하여, 그 결과를 하기 도 12에 나타내었다. 양성대조군으로 베타액틴을 적용하였다.

상기 도 12를 참조하면, Vatpase B2 단백이 도입된 실험군(+)에서 Vatpase B2 단백의 크기에 해당하는 56.3kDa 밴드가 대조군(-)과 비교하여 진하게 나타나서, 실험군의 경우, Vatpase B2 단백이 잘 도입되었다는 것을 확인할 수 있었다.

< double IF staining 을 이용한 세포 내 Vatpase B2 단백의 localization 확인 실험 >

293 T cell에 2 μg/ml로 투여한 V-atpaeB2 단백의 세포 내 localization을 확인하기 위하여, FITC-flag 과 PE- LAMP-1으로 이중 면역형광 염색한 V-atpaeB2 단백이 도입된 293 T cell을 형광현미경을 이용하여 관찰하였고 그 결과를 도 13에 나타내었다.

상기 도 13을 참조하면, PE- LAMP-1으로 표시된 리소좀(lysosome) 위치에 V-atpaeB2 단백에 의한 초록색 형광의 발현이 일부 겹쳐서 나타나 Vatpase B2가 세포내 lysosome에 주로 존재함을 확인할 수 있었다.

2) 블레오마이신 유도 폐손상 / 섬유화증 모델에서 Vatpase B2 단백의 치료효과 검증 시험 .

<실험동물의 준비 및 실험방법>

웅성 C57BL/6 마우스를 오리엔탈 바이오에서 분양받아 실험실에서 5일 동안의 적응기간을 거친 후 이후 블레오마이신(Bleomycine)으로 폐손상을 유도한 후 Vatpase B2 단백의 치료효과를 확인하는 실험에 적용하였다(도 14 참조).

적응기간을 거친 마우스는 블레오마이신을 기도 내로 투여하여 급성 폐손상, 섬유화증을 유도하고, 4일 경과 후부터 7일 경과 후까지 비강을 통해서 V-atpase B2 단백을 각각 500 ng 투여하였다.

1. 정상대조군(PBS, Phosphate buffer saline 투여, n=8, CTL)

2. 폐손상유도군(블레오마이신 3 mg/kg 투여, n=8, BLM)

3. 실험군(블레오마이신 3 mg/kg, V-atpase B2 단백 0.5 mg/100 μl, n=8, BLM+B2)

4. B2 단백투여군(V-atpase B2 단백 0.5 mg/100 μl, n=8, B2)

블레오마이신을 투여한 후 2주가 경과한 시점에서 마우스를 희생하고 기관지 폐포세척액(BALF), 기관지 및 폐포 조직 등을 확보하여 이후 실험을 진행했다.

< 기관지 폐포세척액(BALF) 분석>

위의 실험동물로부터 얻은 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증 세포들의 분획을 측정하였다. BALF을 얻고 이로부터 폐염증세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 림프구 수 등을 측정하는 방법은 위에서 설명한 방법과 동일한 방법을 적용하였고, 그 결과를 아래 도 15에 나타내었다.

상기 도 15를 참조하면, v-atpase B2 단백 투여로 인하여 유도된 폐손상으로 인한 염증이 완화 또는 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 구체적으로 전체 폐염증세포, 호중구, 대식세포의 수가 폐손상유도군에 비해 실험군에서 현저히 저하됨을 관찰할 수 있었다.

< 마우스 폐조직에서 세포내 v-atpase B2 단백 유입 확인>

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플을 제조하고 immunofluoroscence stain을 진행하였다. 조직 샘플은 deparaffinization 과정을 거친 후 흐르는 물에 수세하고 Triton X-100을 사용하여 permiabilization 과정을 수행했다. DPBS로 수세하고 5% goat normal serum 으로 상온에서 1시간 블로킹하고 1차 안티바디 (anti-flag)를 10ug/ml로 블로킹 용액에 희석하여 4℃에서 17시간 인큐베이션 시켰으며, 이어서 2차 안티바디 (Anti-Rabbit FITC)를 1:1000으로 희석하여 처리하고 빛을 차단한 채로 상온에서 1시간동안 인큐베이션 시키고 DAPI로 핵 염색을 수행한다. 형광 염색용 마운팅 용액으로 마운팅하고 형광현미경으로 관찰해 결과를 확인했으며 도 16에 나타냈다.

상기 도 16을 참조하면, Vatpase B2가 폐의 기관지, 폐포세포 내부로 잘 유입되었음을 Flag-FITC Ab를 이용한 immunofluoroscence stain을 통해서 확인할 수 있었다.

< 마우스 폐조직에서 폐손상 완화 효과 확인>

위에서 기재한 것과 동일하게 희생된 마우스 폐조직으로 조직 샘플을 제조한 후, H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색하여 관찰하고 그 결과를 도 17에 나타내었다.

상기 도 17을 참조하면, V-atpase B2 단백의 투여로 블레오마이신으로 인한 폐손상이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다.

< 마우스 폐조직에서 폐섬유화 억제 효과 확인>

트리크롬 염색(Trichrome stain)을 이용해 마우스 폐조직에서 V-atpase B2 단백의 폐섬유화 억제 효과 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰고, 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플을 제조하였다. 조직 샘플은 deparaffinization 과정을 거친 후 흐르는 물에 수세하고 Bouin solution을 200μl 처리하여 56 ℃의 인큐베이터에서 1시간 매염하였다. 흐르는 물에 수세하고 Weigrt iron hematoxylin 200μl로 상온에서 10분간 염색하였다. 이후, Bibrich scarlet 200μl로상온에서 10분간 염색한 후 수세하고 Phosphomoybdic-phosphotungstic acid를 상온에서 10분간 처리하고 Aniline blue 200μl로 상온에서 2시간 염색하였다. 흐르는 물에 수세하고 Dehydration 과정을 거친 후 마운팅하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 18에 나타냈다.

Sircol assay를 이용해서 마우스 폐조직에서 V-atpase B2 단백의 폐섬유화 억제 효과 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직을 lysis buffer를 가하여 폐조직 용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 단백질 용해물과 standard 용액을 각각 실험 tube에 넣고 sircol dye를 넣은 후, 30분간 상온에서 반응시켰다. 14000rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 pellet을 washing buffer로 깨끗하게 워싱하였다. 다시 14000rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 alkari reagent로 pellet을 충분히 풀어주었다. ELISA reader 기계로 540nm의 파장에서 collagen 양을 측정하고, protein을 정량하여 보정한 값을 표 19에 나타냈다.

위의 도 18과 도 19의 결과를 참조하면, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양이 V-atpase B2 단백의 투여로 정상군과 비슷하게 억제된다는 점을 확인할 있었고, sircol assay을 이용한 정량적 평가에서도 통계적으로 유의미한 수준(* p<0.05 by Mann-Whitney U test)으로 폐손상 유도군(BLM)과 비교한 실험군(BLM+B2)의 콜라겐의 양이 억제되어 V-atpase B2 단백이 급성 폐 손상에 의한 폐 섬유화를 억제한다는 결과를 얻을 수 있었다.

상기 실험 결과들을 종합하면, 1)V-atpase B2 단백은 in vitro 또는 생쥐의 기도를 통한 투여 시 세포 내 lysosome으로 endocytosis를 통해 유입이 되며, 2) V-atpase B2 단백은 bleomycin으로 유도된 급성 폐손상 및 폐섬유화증의 동물모델에서 폐의 염증 및 섬유화를 효과적으로 억제하는 기능이 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical Composition for treating lung disease comprising V-atpase B2 protein <130> DP20150334 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 511 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Arg Ala Met Arg Gly Ile Val Asn Gly Ala Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Pro Val Pro Thr Gly Gly Pro Ala Val Gly Ala Arg Glu Gln Ala 20 25 30 Leu Ala Val Ser Arg Asn Tyr Leu Ser Gln Pro Arg Leu Thr Tyr Lys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Val Asn Gly Pro Leu Val Ile Leu Asp His Val Lys 50 55 60 Phe Pro Arg Tyr Ala Glu Ile Val His Leu Thr Leu Pro Asp Gly Thr 65 70 75 80 Lys Arg Ser Gly Gln Val Leu Glu Val Ser Gly Ser Lys Ala Val Val 85 90 95 Gln Val Phe Glu Gly Thr Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Thr Ser Cys 100 105 110 Glu Phe Thr Gly Asp Ile Leu Arg Thr Pro Val Ser Glu Asp Met Leu 115 120 125 Gly Arg Val Phe Asn Gly Ser Gly Lys Pro Ile Asp Arg Gly Pro Val 130 135 140 Val Leu Ala Glu Asp Phe Leu Asp Ile Met Gly Gln Pro Ile Asn Pro 145 150 155 160 Gln Cys Arg Ile Tyr Pro Glu Glu Met Ile Gln Thr Gly Ile Ser Ala 165 170 175 Ile Asp Gly Met Asn Ser Ile Ala Arg Gly Gln Lys Ile Pro Ile Phe 180 185 190 Ser Ala Ala Gly Leu Pro His Asn Glu Ile Ala Ala Gln Ile Cys Arg 195 200 205 Gln Ala Gly Leu Val Lys Lys Ser Lys Asp Val Val Asp Tyr Ser Glu 210 215 220 Glu Asn Phe Ala Ile Val Phe Ala Ala Met Gly Val Asn Met Glu Thr 225 230 235 240 Ala Arg Phe Phe Lys Ser Asp Phe Glu Glu Asn Gly Ser Met Asp Asn 245 250 255 Val Cys Leu Phe Leu Asn Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ile Glu Arg Ile 260 265 270 Ile Thr Pro Arg Leu Ala Leu Thr Thr Ala Glu Phe Leu Ala Tyr Gln 275 280 285 Cys Glu Lys His Val Leu Val Ile Leu Thr Asp Met Ser Ser Tyr Ala 290 295 300 Glu Ala Leu Arg Glu Val Ser Ala Ala Arg Glu Glu Val Pro Gly Arg 305 310 315 320 Arg Gly Phe Pro Gly Tyr Met Tyr Thr Asp Leu Ala Thr Ile Tyr Glu 325 330 335 Arg Ala Gly Arg Val Glu Gly Arg Asn Gly Ser Ile Thr Gln Ile Pro 340 345 350 Ile Leu Thr Met Pro Asn Asp Asp Ile Thr His Pro Ile Pro Asp Leu 355 360 365 Thr Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Gln Ile Tyr Val Asp Arg Gln Leu His 370 375 380 Asn Arg Gln Ile Tyr Pro Pro Ile Asn Val Leu Pro Ser Leu Ser Arg 385 390 395 400 Leu Met Lys Ser Ala Ile Gly Glu Gly Met Thr Arg Lys Asp His Ala 405 410 415 Asp Val Ser Asn Gln Leu Tyr Ala Cys Tyr Ala Ile Gly Lys Asp Val 420 425 430 Gln Ala Met Lys Ala Val Val Gly Glu Glu Ala Leu Thr Ser Asp Asp 435 440 445 Leu Leu Tyr Leu Glu Phe Leu Gln Lys Phe Glu Arg Asn Phe Ile Ala 450 455 460 Gln Gly Pro Tyr Glu Asn Arg Thr Val Phe Glu Thr Leu Asp Ile Gly 465 470 475 480 Trp Gln Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Glu Met Leu Lys Arg Ile Pro 485 490 495 Gln Ser Thr Leu Ser Glu Phe Tyr Pro Arg Asp Ser Ala Lys His 500 505 510

Claims (3)

1. V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 폐섬유화증 치료 또는 증상완화용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 약학조성물은 비강내 투여용 또는 기관지내 투여용인, 약학조성물.
3. V-에이티피아제 B2(V-atpase B2, Vacuolar-type H⁺-ATPase B2) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흡연 또는 간접흡연에 의한 폐기종 치료 또는 증상완화용 약학조성물.

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