KR101660259B1

KR101660259B1 - 돌돔 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101660259B1
Application number: KR1020140030006A
Authority: KR
Inventors: 박찬일; 최광민; 황성돈; 정지민; 배진솔; 김주원
Original assignee: 경상대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-09-27
Also published as: KR20150107305A

Abstract

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 어류 병원성 미생물에 대하여 효율적인 항미생물 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 인간 및 어류의 적혈구에 대한 용혈활성은 거의 없기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다.

Description

돌돔 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide from the Rock bream, Oplegnathus fasciatus and uses thereof}

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 돌돔 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

농어목(Perciformes) 돌돔과(Oplegnathidae)에 속하는 돌돔(Oplegnathus fasciatus)은 태평양과 인도양 등지에 광범위하게 분포하며, 우리나라에서는 주로 남부이남 해역에 분포하는 경제적으로 중요한 양식대상어종으로 여겨지고 있지만, 어류의 양식이 발전함에 따라 이리도바이러스(RSIV)에 의한 바이러스성 질병 등 많은 전염성 질병이 동반되어 왔으며, 여러 가지 제한적인 양식환경에 의한 스트레스 요인으로 인해 질병의 발생빈도가 높아져 돌돔 양식 산업에 있어서 막대한 경제적 피해를 입히고 있다(Ko et al., Fish Pathology 17(2):83-90, 2004).

이러한 전염성 질병을 막기 위해 지금까지 다수의 항생제가 사용되어왔지만, 항생제의 오,남용에 의하여 기존의 항생제에 대해 저항성을 가지는 항생제 내성 균주의 출현은 양식 어류를 위협하는 가장 심각한 문제의 하나로 대두되고 있고 더욱 심각한 사실은 병원체의 항생제에 대한 내성을 획득하게 되는 능력 및 속도가 새로운 항생제 개발의 속도를 훨씬 앞지르고 있다는 것이다. 게다가 어체 내 항생제의 잔류에 의한 식품 위생상의 문제 및 환경으로의 확산에 의한 공중위생상의 문제를 내포하고 있으며(Karunasagar et al., Aquaculture 128:203-209, 1994), 항생제로는 치료할 수 없는 바이러스성 질병이 만연하여 대량폐사와 같은 심각한 사태가 발생하여 질병감염의 문제가 더욱 심화되고 있다(John et al., Journal of Life Science. 19:87-93, 2009). 따라서 기존의 항생제와는 다른 새로운 항생물질의 탐색 및 개발이 필수적이며, 이에 대한 대안으로 자연계에 존재하는 생명체들의 선천방어 기작 중 하나인 항균 펩타이드(Antimicrobial peptides, AMPs)가 많은 관심을 받고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 돌돔(Oplegnathus fasciatus)으로부터 유래한 항미생물성 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항생제 또는 사료첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 항미생물성을 나타내고, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 비인간 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 어류용 항생제 대체제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 돌돔으로부터 유래된 펩타이드는 항미생물 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 적혈구 세포에 대하여 용혈반응을 거의 나타내지 않기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 사람에게 적용할 수 있는 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 동정한 항균 펩타이드인 Rbpis(B)와 Rbmoro(A)의 cDNA 및 아미노산 서열이다. 신호 펩타이드는 밑줄로 표시하였고 항균 펩타이드 12 도메인은 회색 박스로 표시하였으며 polyadenylation signal(AATAAA)과 poly A-tail은 볼드체로 표시하였다.
도 2는 다른 어류의 AMPs 아미노산 서열과 함께 Rbpis와 Rbmoro의 아미노산 서열(A)의 Pairwise alignments 및 Rbpis(C)와 Rbmoro(B) multiple alignments를 서로 비교한 서열이다. 항균 펩타이드 12 도메인은 회색 박스로 표시하였다.
도 3은 어류에서 연역 piscidin family 아미노산 서열의 계통발생을 분석한 그림이다. MEGA 4 소프트웨어를 neighbour-joining 방법을 이용하여 계통수를 분석하였고 Bootstrap sampling을 2,000회 반복 수행하였다.
도 4는 Schiffer-Edmundson helical wheel diagram을 이용하여 Rbpis(B)와Rbmoro(A)의 예상되는 양친매성 α-나선형 형태를 나타낸 그림이다. 노란색 원들은 소수성 아미노산을 나타내고 있다. 아미노 말단으로부터 계산된 잔기번호를 표시하였다. H는 펩타이드의 소수성을 나타내고 μH는 amphipathicity의 정량적 측정인 hydrophobic moment를 나타내고 있다.
도 5는 I-Tasser 예측 서버에 의해 결정된 Rbpis(B)와 Rbmoro(A)의 삼차원 구조를 예측한 그림이다.
도 6은 실시간 PCR에 의해 정상 돌돔의 여러 조직에서 Rbpis(B)와 Rbmoro(A) 유전자의 발현 수준을 나타낸 그래프이다. EF-1α는 실시간 PCR 결과를 정규화하기 위해 사용되었다.
도 7은 세균과 바이러스(E. tarda, S. iniae 및 RSIV)를 돌돔에 인위감염 시킨 후 신장(A), 비장(B) 및 아가미(C) 조직에서 Rbpis 유전자의 발현 패턴을 확인한 그래프이다. Rbpis의 전사 수준은 EF-1α 수준을 상대적으로 정량화하였다.
도 8은 세균과 바이러스(E. tarda, S. iniae 및 RSIV)를 돌돔에 인위감염 시킨 후 신장(A), 비장(B) 및 아가미(C) 조직에서 Rbmoro 유전자의 발현 패턴을 확인한 그래프이다. Rbmoro의 전사 수준은 EF-1α 수준을 상대적으로 정량화하였다.
도 9는 돌돔 적혈구에 대한 Rbpis와 Rbmoro 항균 펩타이드의 용혈 활성을 확인한 그래프이다. 용혈의 비율은 0.2% Triton X-100(100% 용혈)을 처리한 적혈구 현탁액을 수득한 용혈을 상대적으로 정의하였다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "AMPs(Antimicrobial peptides)"는 항미생물성 펩타이드로 지구상에 있는 수많은 생물체가 그들이 처해진 환경으로부터 스스로를 보호할 수 있는 면역체계를 가지고 있어 병원성 미생물에 대하여 그들 스스로를 보호하기 위해 생산하는 항균활성을 가지는 일차방어수단의 다양한 생리활성물질로 선천면역반응에 중요한 역할을 하며, 천연의 항생제로써 포유류에서 곤충, 식물까지 지구상 거의 모든 생물체에 존재한다고 보고되어있다(Zasloff, Nature 415:389-395, 2002). 항균 펩타이드는 1962년 개구리(Bombina variegate)의 표피 분비액에서 처음으로 발견되었으며(Kiss and Michl, Toxicon 1:33-39,1962;Monatshefte fur Chemie-Chemical Monthly, 101:182-189.1970), 1971년 벌의 독소(bee venom) 등 여러 생물들로부터 다양한 항균 펩타이드가 동정되기 시작하여 그 후 특성 및 기능에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 지금까지 항균 펩타이드의 작용 기작 가설 중 가장 타당성 있게 제시되고 있는 것은 Shai-Matsuzaki-Huang(SMH) 모델로써, 체내에서 합성된 펩타이드는 소수성과 친수성의 부분으로 적당한 구조를 이루게 되고 양전하를 띤 친수성 부분이 음전하를 띤 박테리아의 세포막과 결합하게 된다(Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta 1462:1-10, 1999; Shai, Biochimica et Biophysica Acta, 1462:55-70, 1999; Huang, Biochemistry 39:8347-8352, 2000; Yang et al., Biophysical Journal, 79:2002-2009, 2000). 이 때 펩타이드와 세포막의 결합력은 일반적인 Ca²⁺, Mg²⁺ 등에 비해 약 2-3배 더 강한 것으로 알려져 있다. 그 후 세포막과 결합된 펩타이드의 소수성 부분이 세포막 인지질의 소수성 부분과 상호작용하며 구멍을 형성하게 되어 세포막의 투과도를 변화시키게 되고 결국 세포를 파괴시킨다(Christensen et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, 85:5072-5076, 1988).

본 문서에서 사용되는 용어 "Red seabream iridovirus(RSIV)"는 돌돔에서 발생하는 이리도바이러스로 정 20면체 모양을 하고 있고, 게놈의 크기가 170 내지 200 kb인 이중가닥 DNA 바이러스이다.

발명의 상세한 설명:

상기 펩타이드는 돌돔(Oplegnathus fasciatus)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 그람 양성균은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등이 포함되고, 상기 그람 음성균에는 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 캄벨리(Vibrio campbellii), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii), 비브리오 불리리쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 등이 포함될 수 있다.

상기 펩타이드는 사람과 어류의 적혈구 세포를 파괴하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 비인간 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 어류용 항생제 대체제가 제공된다.

2011년부터 가축 항생제 사용이 금지됨에 따라, 천연유래의 항생제 대체물질의 개발이 절실한 상황으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 항균 펩타이드는 항생제 대체물질로서 사용이 가능하다.

상기 어류용 항생제 대체제는 가축, 가금류 또는 어류의 사육에 있어서 큰 피해를 주는 다양한 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항미생물 활성을 나타낼 수 있다. 상기 그람 양성균은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등이 포함되고, 상기 그람 음성균에는 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 캄벨리(Vibrio campbellii), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii), 비브리오 불리리쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 등이 포함될 수 있다.

상기 어류용 항생제 대체제는, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 천연유래의 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 어류용 항생제 대체제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 유효 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 대상 동물의 연령, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 항생제 대체제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하나, 사료첨가제 형태로 경구투여되는 것이 더 바람직하며, 어류 양식의 경우 수조의 물에 일정 농도로 살포되어 사용될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 천연유래의 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 항균 활성 펩타이드의 동정과 분자적 특성

1-1: Expressed Sequence Tags(ESTs) 분석

돌돔 유래의 항균 펩타이드를 동정하기 위하여 지질다당류(LPS)로 자극시킨 돌돔의 간으로부터 cDNA 라이브러리를 제작하였으며, ESTs 분석을 통해 Rbpis(Accession number BAM99884) 및 Rbmoro(Accession number BAM99885)의 cDNA full-length를 동정하였다.

구체적으로, 항균 펩타이드 Rbpis와 Rbmoro의 cDNA full-length의 염기서열과 예상 아미노산 서열은 GENETYX ver. 8.0 프로그램(SDC Software Development, Tokyo, Japan)과 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 BLASTX program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 분석하였다. 분자중량(Molecular weight, MW)과 등전점(Isoelectric point, pI)은 ExPASy Proteomics Serve의 ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)을 이용하여 예상하였으며, 신호 펩타이드와 특정 도메인의 위치는 Simple Modular Architecture Research Tool(SMART) (http://smart.embl-heidelberg.de/)로 확인하였다.

그 결과, Rbpis와 Rbmoro cDNA의 full-length는 각각 486 bp, 567 bp이었다. Rbpis는 57 bp의 5'-UTR과 70 aa을 암호화하는 213 bp의 ORF 그리고 216 bp의 3'-UTR으로 이루어져 있다(도 1B). 두 돌돔 항균 펩타이드의 cDNA는 3'-UTR에 모두 polyadenylation signal(AATAAA)과 poly A-tail을 포함하고 있다. 또한 Rbmoro는 60 bp의 5'-untranslated resion(UTR)과 303 bp의 3'-UTR 그리고 204 bp의 open reading frame(ORF)로 이루어져 있었으며, 이것은 67 아미노산(aa)을 암호화하였다(도 1A). 본 발명자들은 상기 Rbpis와 Rbmoro 아미노산 서열을 2013년 3월 15일자로 NCBI Genbank에 각각 등록번호 BAM99884 및 BAM99885로 등록하였다.

Rbpis의 예상 아미노산은 19 aa의 신호 펩타이드(1-19 aa)와 42 aa의 항균 펩타이드 12 도메인(1-42 aa)을 가지며, Rbmoro의 예상 아미노산은 22 aa의 신호 펩타이드(1-22 aa)와 42 aa의 항균 펩타이드 12 도메인(1-42 aa)을 포함한다(도 1). Rbpis와 Rbmoro의 mature peptides의 등전점(pI)은 각각 5.29와 10.27이었으며, 분자중량은 각각 5.66 kDa과 5.22 kDa이었다.

또한 Rbpis와 Rbmoro의 신호 펩타이드를 제외한 항균 펩타이드 12 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 합성된 펩타이드의 분자중량은 각각 2.35 kDa과 2.56 kDa이었다.

1-2: Alignment 분석

상기 동정된 Rbpis와 Rbmoro의 Alignment 분석은 NCBI의 펩타이드 시퀀스 데이터베이스에 등록되어있는 다른 어류들의 항균 펩타이드의 아미노산 서열과 multiple sequence alignment는 ClustalW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 돌돔의 moronecidin과 piscidin을 pairwise alignments 분석하였을 때, 서로의 상동성은 57.81% 이었으며, 비교적 항균 펩타이드 12 도메인에서 상동성의 차이를 나타내었다(도 2A). 뿐만 아니라 Rbpis와 Rbmoro의 아미노산 서열과 다른 어류 AMPs의 아미노산 서열을 multiple alignments 분석한 결과 Rbpis는 Hong Kong grouper의 piscidin과 62.86%의 상동성을 나타냈으며, Hybrid striped sea-bass의 piscidin와의 상동성은 32.86%에 불과하여, 종래에 보고된 piscidin과 상동성이 낮은 것을 확인하였다. Multiple alignments에서 또한 signal peptide에 비해 항균 펩타이드 12 도메인에서 상동성의 차이를 나타내었다(도 2C). 또한 Rbmoro는 Mandarin fish와 Sable fish의 moronecidin과 67.16%의 상동성을 나타낸 반면, Sable fish의 decentracin과의 상동성은 47.76%에 불과하여, 이 역시 종래에 보고된 moronecidin과의 상동성은 낮은 편이었다(도 2B).

1-3: 계통발생학적 분석

상기 Rbpis와 Rbmoro의 어류 항균 펩타이드와의 계통발생학적 위치를 확인하기 위해 Mega 4 program을 neighbor-joining(NJ)법을 이용하여 계통수를 제작하였으며, bootstrap sampling은 2,000번 반복 수행하였다.

그 결과, Rbpis는 piscidin group에 속하였으며, longtooth grouper의 piscidin-like와 가장 밀접한 유연성을 보였다. Rbmoro는 moronecidin 및 dicentracin group에 속하였으며, sable fish의 dicentracin과 계통학적 거리가 가장 가까웠다. 또한 Rbpis와 Rbmoro는 Pleurocidin과는 다른 cluster를 형성함을 확인하였다(도 3).

1-4: 분자구조 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 Rbpis와 Rbmoro의 Shiffer-Edmundson helical wheel diagrams과 소수성,친수성의 비율은 ExPASy(http://expasy.org/tools)의 HeliQuest를 이용하여 예측하였으며(Roy et al., Nature Protocols. 5:725-738.2010), 삼차구조는 I-Tasser server(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 이용하여 예측하였다(Zhang, BMC Bioinformatics 9:40-48.2008, Proteins 77:100-113. 2009).

그 결과, 두 펩타이드는 항균 펩타이드 12 도메인에서 맞은편에 소수성과 친수성 잔기를 나타내는 양친매성 구조를 가진다. 두 펩타이드의 소수성(H)은 Rbpis와 Rbmoro 각각 0.602와 0.623 이였고 hydrophobic moment(μH)는 각각 0.273과 0.534이었으며(도 4) 예상 net charge는 0과 +1이었다. 또한, I-Tasser를 이용하여 Rbpis와 Rbmoro의 3차원 구조를 추정한 결과, 두 항균 펩타이드는 α-나선형 구조로 예상되었다(도 5). 각 펩타이드의 첫 번째 모델의 TM-score는 Rbpis가 0.60 ± 0.14 (RMSD 2.9 ± 2.1 A), Rbmoro가 0.76 ± 0.10(RMSD 0.7 ± 0.7 A)였으며, C-score는 각각 -0.93와 0.32이었다.

실시예 2: 정상 어체의 조직별 유전자 발현분석

2-1: 조직 및 혈구 분리

본 발명의 일 실시예에 따른 Rbpis와 Rbmoro의 돌돔의 조직별 유전자 발현을 분석하기 위하여 정상 어체로부터 조직 및 혈구를 분리하였다.

구체적으로, 돌돔(Oplegnathus fasciatus)은 경상남도수산자원연구소로부터 체장 14.3 ± 1 cm, 체중 68.5 ± 10 g인 것을 제공받아 0.5 톤 수조에 20-23℃에서 2주간 순치하였으며, 사료는 1일 1회 포만감이 들 때까지 급이 하였다. 상기 돌돔 중 건강한 3 어체를 벤조카인(Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 마취하고, 각각 혈구와 조직을 표본화하였다. 말초혈액백혈구(Peripheral blood leukocytes, PBLs)와 적혈구(Red blood cells, RBCs)를 분리하기 위해, 헤파린을 처리한 주사기를 이용하여 미부정맥으로부터 말초혈액을 채혈하였다. 채혈된 말초혈액은 RPMI1640(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 첨가하여, 51% Percoll density gradients(Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 혈구를 분리하였다. 즉, Percoll : 10 × 인산완충식염수(PBS) : 1 × PBS를 51 : 9 : 40의 비율로 혼합한 Percoll solution 5 ml과 RPMI1640에 현탁시킨 혈액 5 ml를 층이 나누어지도록 분주한 후, 15℃, 400 g에서 20분간 원심분리 하였다. 분리한 PBLs와 RBCs는 1 × PBS로 3회 세척한 후 원심분리를 통해 얻은 펠렛을 실험에 사용하였다. 또한, 체혈을 마친 어체는 해부하여 두신, 신장, 비장, 간, 장, 아가미, 근육, 심장, 피부 및 위를 적출하고 이 때, 상기 3 어체 각 장기의 같은 위치에 있는 조직을 무균적으로 표본화하였다.

2-2: Total RNA 분리

상기 정상 돌돔 3 어체로부터 분리한 혈구와 적출한 조직들은 모두 pooling하여 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 법으로 total RNA를 분리하였다.

구체적으로, 각 샘플에 TRIzol 500 μl를 첨가하고 균질기(homogenizer)로 마쇄하여 균질화하였다. 그리고 클로로포름(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 100 μl 첨가하여 vortex한 후, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮긴 후 PCI(Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol)를 동량 첨가하여 14,000 rpm에서 다시 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮긴 후, 이소프로판올(Sigma, St. Louis, MO, USA) 500 μl, Dr.Gen (TaKaRa, Shiga, Japan) 5 μl 및 3M 아세트산 나트륨(TaKaRa, Shiga, Japan) 50 μl를 첨가하여 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 모두 제거한 후, 75% DEPC 에틸 알코올 600 μl를 첨가하여 14,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 마지막으로 상층액을 모두 제거하고 상온에서 10-15분간 자연 건조한 후, DEPC DDW 30-40 μl를 첨가하여 용해하였다.

2-3: cDNA 합성

상기 실시예 2-2에서 분리한 total RNA로 부터 cDNA를 합성하였다.

구체적으로, 상기 분리한 total RNA는 RQ1 RNase-free DNase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 DNase 처리하였으며 그 후, total RNA 1 μl, Anchored-oligo(dT)18 프라이머 1 μl 및 증류수 11 μl를 포함하는 총 량 13 μl를 혼합하여 65℃에서 10분간 반응 후, 얼음상에서 5분간 반응시켰다. 그리고 Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 4 μl, Protector RNase Inhibitor 0.5 μl, Deoxynucleotide Mix 2 μl 및 Transcritor Reverse Transcriptase 0.5 μl를 혼합한 총량 20 μl를 55℃에서 30분, 85℃에서 5분간 반응시켰다. 상기 처리된 total RNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA로 합성하였다.

2-4: 프라이머 제작

양적 실시간 PCR을 위해 사용된 특이적 프라이머 세트는 본 발명의 일 실시예에 따른 Rbpis와 Rbmoro의 cDNA full-length 서열에 기초하여 Primer3 ver. 0.4.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용하여 디자인하였다. 상기 디자인한 프라이머 세트를 하기 표 1에 표시하였다.

프라이머 명칭	유전자	프라이머	서열 번호
Rbpis F	Rbpis	5'- GAACCTGGAGAGGGCTTTTT -3'	3
Rbpis R		5'- CCTGGGTTGTAATCGACTGA -3'	4
Rbmoro F	Rbmoro	5'- GTCGTCCTCATGGCTGAAC -3'	5
Rbmoro R		5'- CGTCCCCCAGTGATAAGTCT -3'	6
EF-1α F	EF-1α	5'- CCCCTGCAGGACGTCTACAA -3'	7
EF-1α R		5'- AACACGACCGACGGGTACA -3'	8

2-5: Quantitative real-time PCR

본 발명의 일 실시예에 따른 Rbpis와 Rbmoro의 발현 수준을 돌돔의 정상 어체에서 알아보기 위해 SYBR Green Master Mix(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 양적 실시간 PCR을 수행하였다.

구체적으로, cDNA template 1 μl, 포워드와 리버스 프라이머 각각 1 μl, SYBR Green 12.5 μl 및 2차 증류수 9.5 μl를 총량 25 μl가 되도록 혼합하였다. 증폭조건은 50℃에서 4분 및 95℃에서 10분간 초기 변성단계 후에(initial denaturation) 95℃에서 20초, 60℃에서 1분을 1회로 하여 총 45회 반응시켰으며, 마지막으로 95℃ 에서 15초, 60℃에서 30초 및 95℃에서 15초간 분리단계(final dissociation)를 수행하였다. Rbpis와 Rbmoro mRNA 발현 수준은 EF-1α mRNA 발현 정도와 비교하여 나타내었으며, 실험의 정확성을 위해 각각의 유전자 당 3회 반복 수행하였다. 각 유전자의 발현 수준은 2-^ΔΔCT 방법(Livak and Schmittgen, Methods 25:402-8. 2001)에 의해 계산되었으며, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 조직들 간의 유의적 차이는 one-way analysis of variance(ANOVA) test에 의해 확인되었다(p < 0.05).

그 결과, 돌돔 정상 어체의 여러 조직에서 Rbpis와 Rbmoro의 mRNA 발현량을 확인한 결과, Rbpis는 근육에서 가장 낮게 발현하였으며, 근육을 기준으로 아가미(4389.99배)에서 가장 높게 발현하였다. 그 외에 피부(12.73배), 심장(8.57배), RBCs (7.66배), 위(5.59배), 간(4.89배), 두신(1.91배), 장(1.73배), 신장(1.68배), 비장(1.64배) 및 PBLs (1.56배)에서 발현이 확인되었다(도 6B). 또한, Rbmoro의 mRNA 역시 가장 낮게 발현된 근육을 기준으로 아가미에서 343.30배로 가장 높은 발현량을 나타내었다. 그 이외에 장(280.14배), RBCs (222.35배), 위(192.67배), 심장(149.43배), 간(137.19배), 신장(102.30배), 피부(71.01배), 비장(74.37배), 두신(64.45배) 및 PBLs (46.10배)로 다양한 장기에서도 높은 유전자의 발현이 확인되었다(도 6A).

실시예 3: 병원체 인위감염 후 시간별 발현분석

본 발명의 일 실시예에 따른 Rbpis와 Rbmoro의 항미생물 활성을 조사하기 위하여 세균과 바이러스를 돌돔에 인위감염(experimental infection) 시킨 후 신장, 비장 및 아가미에서 Rbpis와 Rbmoro 유전자의 발현 패턴을 양적 실시간 PCR로 확인하였다.

구체적으로, 그람양성균(Streptococcus iniae), 그람음성균(Edwardsiella tarda) 및 red seabream iridovirus(RSIV)를 PBS로 현탁하여 각각 1.5 × 10⁵ cells/fish, 1.5 × 10⁵ cells/fish 및 1 × 10⁴ copies/fish가 되도록 돌돔의 복강에 주사 하였으며, 대조군은 PBS 동량을 복강주사 하였다. 각 실험군과 대조군은 1.5 톤 수조에 90마리씩 수용하였으며, 수온은 23-26℃로 유지하였다. 상기 병원체와 PBS를 주사한 후 1, 3, 5 및 7일차에 각각의 실험군과 대조군으로부터 무작위로 3마리를 선정하여 신장, 비장 및 아가미의 조직을 적출한 후 실험에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. 상기 실험군과 대조군의 Total RNA 분리와 cDNA 합성은 상술한 정상 어체의 조직별 발현 수준에서 설명한 것과 같은 방법으로 수행하였다. 또한, 다양한 병원체에 대한 Rbpis와 Rbmoro의 면역반응을 분석하기 위한 양적 실시간 PCR 및 이에 따른 각 유전자의 발현 수준 및 조직들 간의 유의적 차이도 상술한 실험방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, Rbpis는 신장과 비장에서는 대조군과 비교하여 오히려 감소하는 양상을 나타내었다. 신장에서는 E. trada, S. iniae 및 RSIV 감염 후 모두에서 유의적으로 감소하였으며(도 7A), 비장에서 또한 감염 후 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다. RSIV 감염 7일 후에는 1.69배 증가하였지만, 유의적인 차이는 보이지 않았다(도 7B). 하지만 아가미에서는 E. tarda 감염 후 점점 증가하여 5일차에 5.92배, 7일차에 9.34배까지 상향조절 되었으며, S. iniae 감염 후 또한 점차 증가하여 감염 7일 후 5.38배 증가하였다. RSIV 감염 후에는 7일 후 2.84배 증가하여, 대조군과 유의적인 차이를 나타내었다(도 7C).

한편, Rbmoro는 신장에서 E. tarda 감염 1일 후에 증가하여 5일차까지 유지되었다가 7일 후에 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 특히 S. iniae 감염 후 3일 후에 대조군과 비교하여 10.04배까지 증가하였으며, 그 후 점차 감소하였다. RSIV 감염 후에는 대조군보다 낮게 발현하다가 감염 5일 후에 2.25배로 증가하였지만, 유의적인 차이는 보이지 않았다(도 8A). 비장에서는, E. tarda 감염 후 점차 증가하기 시작하여 7일 후에 대조군과 비교하여 6.23배 증가하였으며, S. iniae 감염 후 역시 점차 증가하기 시작하여 7일 후에 16.25배까지 상향조절 되었다. RSIV 경우, 감염 7일 후에 4.30배 증가함을 보였다(도 8B). 아가미에서 Rbmoro는 E. tarda와 S. iniae 감염 후 점차 증가하여 7일 후에 대조군과 비교하여 각각 3.97배와 11.29배 증가함을 나타내었으며, RSIV 감염 후에는 큰 변화를 관찰할 수 없었다(도 8C).

실시예 4: 펩타이드 합성

본 발명의 일 실시예에 따라 동정한 Rbpis와 Rbmoro의 아미노산 서열을 이용하여 항미생물성 펩타이드를 합성하였다.

구체적으로, Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)를 이용하여 Rbpis와 Rbmoro의 신호 펩타이드와 항미생물성 펩타이드 12 도메인을 확인하였으며, 신호 펩타이드를 제외한 항미생물성 펩타이드 12 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 GL biochem(Shanghai, China)에 의뢰하여 펩타이드를 합성하였다. 상기 합성된 펩타이드는 고속액체 크로마토그래피(HPLC)로 95%까지 정제하였으며, 아세토나이트릴(ACN)과 멸균된 2차 증류수를 1 : 9로 희석한 용매에 용해하여 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 상기 합성한 펩타이드를 하기 표 2에 표시하였다.

이름	화학식	중량(kDa)	순도(%)	아미노산 서열	서열번호
Piscidin	C₁₀₇H₁₆₈N₃₂O₂₆S₁	2.35	95.86	GEGFLGMLLHGVGHAIHGLIHGK	1
Moronecidin	C₁₂₁H₁₈₄N₃₄O₂₈	2.56	95.41	GEAFFHHIFNGLVGVGKTIHRLI	2

실험예 1: 합성 펩타이드의 항균활성

1-1: 항균활성(Antimicrobial Activity) 분석

상기 합성한 항균 펩타이드 Rbpis와 Rbmoro의 그람양성과 음성균에 대한 항균활성을 분석하였다.

구체적으로, 여러 균주에 적합한 배양온도와 배지에서 액체 배양한 병원균을 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였으며, 각 균의 농도를 약 5 × 10⁶ cfu/ml으로 하기 위해 540 nm에서 흡광도 0.15가 되도록 brain heart infusion broth(BHIB)로 희석하여 10-3까지 재현탁하였다. 두 합성 펩타이드의 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)는 broth microdilution법으로 결정되었다(Otvos and Cudic, Methods in Molecular Biology. 386:309-320. 2007). 10% ACN에 용해시킨 합성 펩타이드를 96 well-plate에서 BHIB로 2배씩 단계 희석하였다. 다양한 농도의 합성 펩타이드 50 μl와 각각의 균 50 μl를 96 well-plate(microreader plate)에서 혼합한 후 27℃에서 12시간동안 진탕배양하였다. 이 때, 대조군은 펩타이드를 제외한 10% ACN 용매만을 BHIB로 단계 희석하여 균을 혼합, 배양한 것으로 하였다. 실험의 정확성을 위해 본 실험은 3회 반복 수행하였다. 배양 후, VICTOR3 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였으며, MIC의 범위는 세균의 성장이 억제되기 시작하는 펩타이드의 가장 낮은 농도로 하였다. MIC 뿐만 아니라 대조군과 비교하여 세균의 성장이 50%가 되는 반수억제농도(Half maximal Inhibitory Concentration, IC₅₀)를 확인하였다.

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 실험에 사용된 병원균에 대한 두 항균 펩타이드의 다양한 항균활성이 확인되었으며, Rbpis의 합성 펩타이드는 S. iniae, V. harveyi 및 V. ordalli에 높은 감수성을 보였지만, E. tarda 에는 비교적 낮은 항균활성을 나타내었다. 특히 Rbmoro의 합성 펩타이드는 E. coli, V. alginolyticus, V. harveyi 및 V. vulnificus에 대해 높은 감수성을 나타내었다. 하지만 E. tarda에 대해서는 비교적 낮은 항균활성을 보였으며 V. ordalii에 대해서는 거의 항균활성을 나타내지 않았다(표 3 참조).

박테리아 균주	Gram	℃	Moronecidin		Piscidin
박테리아 균주	Gram	℃	MIC	IC ₅₀	MIC	IC ₅₀
Escherichia coli (JM109)	(-)	37	1.9-3.9	7.8	1.9-3.9	125-250
Edwardsiella tarda	(-)	27	7.8-15.6	>1000	250-500	>1000
Streptococcus iniae (FP5228)	(+)	27	1.9	125-250	<0.9	15.6-31.2
Vibrio alginolyticus (KCCM2928)	(-)	27	<0.9	15.6-31.2	0.9-1.9	31.2
V. campbellii (KCCM40684)	(-)	27	0.9	125-250	1.9	125-250
V. harveyi (ATCC14126)	(-)	27	<0.9	0.9-1.9	<0.9	31.2-62.5
V. ordalii (KCCM41669)	(-)	27	>1000	-	0.9	7.8-15.6
V. vulnificus (KCTC2982)	(-)	27	1.9-3.9	7.8-15.	3.9-7.8	250-500

1-2: 세포독성(Cytotoxicity) 분석

상기 합성한 항균 펩타이드 Rbpis와 Rbmoro의 세포독성을 조사하기 위하여 용혈활성(Hemolytic Activity)을 분석하였다.

구체적으로, 돌돔의 적혈구를 분리하기 위해, 헤파린을 처리한 주사기를 이용하여 미부정맥으로부터 말초혈액 3 ml을 채혈하였다. 채혈된 말초혈액으로부터 적혈구만을 분리하여 PBS로 3회 세척한 후 적혈구 1 ml을 PBS 9 ml(10%)로 재현탁하였다. 또한, 상기 분리한 어류의 적혈구를 마이크로원심분리기 튜브에서 PBS로 2배씩 단계 희석하였으며, 다양한 농도의 합성 펩타이드 50 μl와 재현탁시킨 적혈구 50 μl를 혼합한 후 37℃에서 30분 동안 진탕배양하였다. 음성대조군과 양성대조군은 각각 적혈구 50 μl에 PBS(용혈 0%)와 0.2% Triton X-100(용혈 100%) (Sigma, St. Louis, MO, USA) 50 μl를 첨가한 것으로 하였다. 배양 후 각 샘플은 400 g에서 15분간 원심 분리하였으며, 상층액 70 μl를 microreader plate에 옮겨 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용혈율(%)은 양성대조군(0.2% Triton X-100 첨가)과 각 샘플의 용혈성을 비교하여 결정하였고 실험의 정확성을 위해 본 실험은 3회 반복 수행하였다.

그 결과, 합성된 Rbpis와 Rbmoro 펩타이드는 높은 농도에서 돌돔 적혈구에 대해 용혈현상을 보였다. Rbpis는 250-1000 μM에서 38.93-65.05%의 용혈을 보였으며, 63 μM 이하의 농도에서는 거의 용혈을 일으키지 않았다. Rbmoro는 500-1000 μM에서 15.27-61.98%의 용혈을 나타내었으며, 250 μM 이하의 농도에서는 용혈이 거의 나타나지 않았다(도 9).

상기 결과들을 종합해보면, 돌돔으로부터 동정된 항균 펩타이드 Rbpis는 어체 조직중 아가미에서 높은 발현을 나타내었고 세균과 바이러스 감염 후에도 아가미에서 유의적으로 발현이 증가하였다. Rbmoro는 돌돔의 정상 어체 조직에서 높은 발현을 나타내었고, 병원체 인위감염 후 신장, 비장 및 아가미에서 발현이 증가하였다. 따라서 상기 항균 펩타이드는 어류의 면역 시스템에 있어서 항균활성뿐만 아니라 면역시스템의 매개자로써 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 또한 항균 펩타이드 12 도메인에 기초하여 합성한 두 펩타이드는 다양한 그람음성과 양성균에서 항균활성을 나타내었고 어류 적혈구에 대한 용혈반응을 거의 나타내지 않기 때문에 결론적으로 어류 양식에 사용되고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 항균제를 위한 중요한 기초자료로써 제시될 수 있을 것이다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel antimicrobial peptide from the Rock bream, Oplegnathus fasciatus, and uses thereof <130> PD14-1269 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Piscidin <400> 1 Gly Glu Gly Phe Leu Gly Met Leu Leu His Gly Val Gly His Ala Ile 1 5 10 15 His Gly Leu Ile His Gly Lys 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Moronecidin <400> 2 Gly Glu Ala Phe Phe His His Ile Phe Asn Gly Leu Val Gly Val Gly 1 5 10 15 Lys Thr Ile His Arg Leu Ile 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rbpis F <400> 3 gaacctggag agggcttttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rbpis R <400> 4 cctgggttgt aatcgactga 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rbmoro F <400> 5 gtcgtcctca tggctgaac 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rbmoro R <400> 6 cgtcccccag tgataagtct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1a F <400> 7 cccctgcagg acgtctacaa 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1a R <400> 8 aacacgaccg acgggtaca 19

Claims

항미생물성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 돌돔(Oplegnathus fasciatus)으로부터 유래한 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제3항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 비인간 형질전환체.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 어류용 항생제 대체제.
제5항에 있어서,
그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 항균활성을 갖는, 어류용 항생제 대체제.
제6항에 있어서,
상기 그람 음성균에는 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 캄벨리(Vibrio campbellii), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii), 비브리오 불리리쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)인, 어류용 항생제 대체제.
제6항에 있어서,
상기 그람 양성균은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인, 어류용 항생제 대체제.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.