KR101659659B1 - A pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising Sinomenium acutum extract - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 및 활성을 억제시키는 효과가 있어, 골손실로 인한 골질환을 억제할 수 있으므로, 이들 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a health functional food composition for preventing or treating osteoporosis comprising Sinomenium acutum extract, a fraction thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient More specifically, the composition of the present invention has an effect of inhibiting the differentiation and activity of osteoclasts, and can inhibit osteopathy due to bone loss, and thus can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating these diseases .

Description

방기 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising Sinomenium acutum extract}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a pharmaceutical composition for prevention or treatment of osteoporosis,

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 방기(Sinomenium acutum) 추출물 및 이로부터 분리한 화합물들의 용도에 관한 것이다.
The invention abandonment that can be useful in the prevention or treatment of bone disease (Sinomenium acutum extract and the use of the compounds isolated therefrom.

골조직은 연골 및 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 한다. 또한 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 골은 매일 조금씩 분해되고, 분해된 양에 비례하여 새로운 골이 형성됨으로써 항상성을 유지하는 매우 역동적인 조직이다. 구체적으로 골은 파골세포에 의한 골흡수, 골아세포에 의한 골형성 및 휴지기를 포함하여 약 120 내지 150일 주기의 순환을 반복하고 있다. 건강한 성인의 경우, 골흡수와 골형성은 엄밀하게 콘트롤되고, 종합 골량은 거의 변화하지 않고 일정 수준을 유지한다.The bone tissue constitutes the cartilage and skeletal system, and functions as a support and a muscle attachment by the mechanical function, and functions to protect the living organ and the bone marrow. It also functions to preserve calcium and phosphorus ions to maintain homeostasis. It is a very dynamic tissue that maintains homeostasis by breaking down little by little every day and forming new bone in proportion to the amount disintegrated. Specifically, the bone is repeatedly circulated for about 120 to 150 days including osteoclast-induced bone resorption, osteoblast-induced bone formation, and resting period. In healthy adults, bone resorption and bone formation are strictly controlled, and the total bone mass remains almost constant, with little change.

조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘형성과 같은 무기질화는 뼈의 강도를 유지시켜줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 한다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골형성은 세포 내에서 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 제1형 콜라겐(type 1 collagen) 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다(Pittenger, M. F. et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells, Science, 1999, 284: 143-147). 즉, 알칼린 포스파타제의 활성을 촉진하는 화합물들은 골세포의 분화를 촉진하므로 골질환 치료제의 표적이 될 수 있다.Osteoblasts originate from mesenchymal stem cells. Mineralization such as calcium formation by osteoblast differentiation not only maintains bone strength but also plays an important role in the homeostasis of calcium and hormone metabolism throughout the body. Calcium formation by osteoblast differentiation is regulated by vitamin D and parathyroid hormone. Bone morphogenesis by osteoblast differentiation induces bone morphogenetic protein (BMP), Wnt, MAP Related to the differentiation of osteoblasts by the cross-talk of various signal transduction systems such as kinase, calcineurin-calmodulin kinase, NF-κB and AP-1. phosphatase, and ALP are synthesized in the early differentiation stage and then osteopontin, osteocalcin, type 1 collagen, etc. associated with mineralization are synthesized (Pittenger, MF et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells, Science, 1999, 284: 143-147). That is, the compounds that promote the activity of the alkaline phosphatase promote bone cell differentiation and can be targets of therapeutic agents for bone diseases.

한편, 파골세포는 뼈가 성장하도록 하기 위하여 석회화한 연골 및 뼈조직을 녹이는 세포로서 다핵거대세포이다. 상기 파골세포는 조골세포에서 분비되는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)와 M-CSF(macrophage colony stimulating receptor)가 파골세포 표면에 있는 수용체와 결합하게 되어 분화가 일어난다.On the other hand, osteoclast is a polynuclear giant cell that melts calcified cartilage and bone tissue to allow bone to grow. The osteoclasts are differentiated by RANKL (receptor activator of NF-κB ligand) secreted from osteoblasts and M-CSF (macrophage colony stimulating receptor) binding to receptors on the osteoclast surface.

상기 조골세포와 파골세포의 상호작용의 균형이 깨지게 되면 전신적(systemic) 또는 국부적(local) 골질환을 일으키게 된다. 상기 질병들은 대부분 파골세포의 수와 활성의 증가로 인한 것으로 알려져 있다. 이러한 파골세포의 활성증가로 인해 야기되는 질환에는 골절, 류마티스 관절염, 원발성 골종양, 암의 골전이 등이 있다. 또한 나이든 사람에게 많이 나타나는 원활하지 못한 혈액순환으로 인하여 일시적 또는 만성적으로 산소장력(oxygen tension)이 정상 골보다 낮은 상태가 되는 현상인 저산소증(hypoxia)이 발생한 산소함량이 부족한 골에서 파골세포의 활성이 증가하여 골상태의 악화를 초래하기도 한다.When the balance between the osteoblast and osteoclast is broken, systemic or local bone disease is caused. Most of these diseases are known to be caused by an increase in the number and activity of osteoclasts. The diseases caused by the increased activity of osteoclasts include fractures, rheumatoid arthritis, primary bone tumors, bone metastasis of cancer, and the like. In addition, the activity of osteoclasts in osteoclast-poor bone, hypoxia, which is temporarily or chronicly oxygen tension lower than the normal bone due to non-smooth blood circulation, Which may lead to deterioration of the bone condition.

상기 골질환의 대표적인 예인 골다공증은 골형성과 골흡수의 평형이 깨져 골밀도가 약화되어 일어나는 질환으로, 현재 미국에서만 약 천 만명이 이미 골다공증 질환을 앓고 있으며, 1천 8백만명이 골다공증의 발생 위험에 놓여 있다. 또한, 일생 동안 여성 2명 중 1명, 남성의 경우 8명 중 1명이 골다공증과 관련된 골절을 경험하며, 이미 2백만명 이상의 미국 남성들이 골다공증 질환을 앓고 있다. 미국에서는 골다공증과 관련된 질병과 골절로 인한 직접적인 지출이 매년 140억 달러에 달하고 있으며, 국내에서의 경우에도 약 400백만 명이 골다공증에 걸려있거나 그 위험에 노출되어 있다. 이는 노령화 사회로 접어들면서 더욱 증가할 것으로 추정되어, 이로 인한 사회적 지출과 가족 구성원의 정신적, 경제적 지출이 증가할 것으로 예상된다.Osteoporosis, a typical example of the above-mentioned bone disease, is a disease caused by weakening of bone mineral density due to breakage of equilibrium between bone formation and bone resorption. Today, about 10 million people already suffer from osteoporosis disease in the United States, and 18 million people are at risk of osteoporosis have. In addition, one in two women and one in eight men experience lifelong fractures associated with osteoporosis, and over two million Americans already have osteoporosis. In the United States, direct spending on osteoporosis-related illnesses and fractures is about $ 14 billion annually, and about 400 million people in the country are exposed to or at risk for osteoporosis. This is expected to increase further as the society becomes more aged, and it is expected that social spending and mental and economic expenditure of family members will increase.

상기와 같은 골질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하며, 따라서 이에 대한 치료제로는 크게 골흡수 억제제 및 골형성 자극제가 있다. 일반적으로 상기 골흡수 억제제 또는 골형성 자극제 등의 골질환 치료제는 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적어야 하며, 투여의 번거로움을 해결하기 위하여 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로, 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 한편, 상기 골질환 치료제 중 조골세포를 활성화 시킴으로써 골형성을 촉진하는 골형성 자극제에 대한 연구가 보다 활발하게 진행되고 있으나, 골형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않는다. 한편 현제 사용되고 있는 파골세포의 활성을 억제하는 골질환 치료제로는 데노수맙(Denosumab; Prolia™, Amgen®) 등이 있으며 이외에도 다양한 약물들이 개발되고 있으나, 약물치료는 장기간 지속되어야 함을 고려할 때 아직 부작용 등이 충분히 검증되지 않았으며, 파골세포의 정확한 메커니즘은 아직까지 밝혀지지 않은 상태이다.
In order to treat the above-mentioned bone diseases, it is necessary to control the balance between osteoclasts and osteoblasts. Accordingly, there are a bone resorption inhibitor and a bone formation stimulator. In general, the therapeutic agent for bone diseases such as the bone resorption inhibitor or the bone formation stimulating agent should be administered to a patient for a long period of time, so that it should be low in toxicity. Oral administration is preferable to solve the complication of administration. It is true. On the other hand, studies on osteogenesis stimulants promoting osteogenesis by activating osteoblasts in the bone disease treatment agent have been actively carried out, but strengthening of bone mineral density due to osteogenesis stimulation does not necessarily mean reduction of fracture. On the other hand, Denosumab (Prolia ™, Amgen®), which is currently being used to treat osteoclast activity, has been developed and various drugs have been developed. However, considering that the drug treatment should be continued for a long time, Side effects have not been sufficiently verified, and the exact mechanism of osteoclasts has not yet been elucidated.

이에 본 발명자들은 파골세포 형성을 억제함으로써 골손실을 감소시켜 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 발병 또는 진행을 억제할 수 있는 천연물을 찾고자 예의 노력한 결과, 방기 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 파골세포의 형성 및 활성을 억제함으로써 골질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to find a natural product capable of inhibiting the onset or progression of a disease induced by bone loss or a bone loss induced by decreasing osteoclast formation by inhibiting osteoclast formation. As a result, It has been confirmed that one compound has a preventive or therapeutic effect on bone diseases by inhibiting the formation and activity of osteoclast, and the present invention has been completed.

본 발명의 하나의 목적은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for prevention or treatment of bone diseases comprising Sinomenium acutum extract, a fraction thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt of said compound as an active ingredient .

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating bone diseases, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a health functional food composition for preventing or ameliorating osteoporosis, which comprises a bran extract, fractions thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
As one aspect for solving the above problems, the present invention provides a method for preventing or preventing osteoporosis comprising an extract of Sinomenium acutum , a fraction thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt of the compound as an active ingredient, A pharmaceutical composition for therapeutic use is provided.

본 발명은 방기 추출물이 파골세포의 생성 및 이동을 억제함으로써 골질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 것을 최초로 확인한 것이 기초한다. 특히 이로부터 추출한 11종의 유효성분 중 4종의 화합물이 이러한 효과를 나타남을 확인하였다.The present invention is based on the first confirmation that the bran extract has an effect of preventing or treating bone diseases by inhibiting the production and migration of osteoclasts. In particular, four compounds out of the 11 active ingredients extracted from these compounds showed such an effect.

바람직하게, 상기 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물은 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 또는 다우리포핀(dauriporphine)일 수 있다.
Preferably, the compound isolated from the fragrance extract or its fractions may be salutaridine, dauricumine, cheilanthifoline or dauriporphine.

본 발명의 용어, "방기(Sinomenium acutum)"는 한국, 중국, 일본 등지에 분포하는 낙엽 덩굴식물로 길이가 7 m에 달하고 가지에 털이 없으며, 세로줄이 있다. 잎은 어긋나고 원형 또는 넓은 난형이며, 때로는 3개로 얕게 갈라진다. 잎 가장자리가 밋밋하거나 3 내지 7개의 얕은 결각이 있고 잎자루는 잎몸보다 짧다. 꽃은 2가화로 6월에 피고 연한 녹색이며 원추꽃차례에 달린다. 꽃받침조각과 꽃잎은 6개씩이고 수술은 9 내지 12개이지만 암꽃에서는 3개의 헛수술과 3개의 심피가 있다. 핵과는 10월에 검게 익는다. 맛은 쓰고 매우며 성질은 차다. 한방에서 줄기와 뿌리를 신경통 및 이뇨에 사용한다. 풍습을 제거함으로 사지관절의 동통을 가라앉힌다. 수족경련, 중풍, 구안와사에도 쓰인다. 수분의 배설작용이 현저하여 피부가 부었을 때, 복수가 찼을 때, 각기병 등의 증상에도 널리 활용된다. 진통제와 해열제로도 쓰인다. 임상적으로 혈압을 낮추는 효과도 보고되었으며, 항종양 효과를 나타내어 폐암 치료를 위한 정맥주사제로도 사용되었다. 물로 달여 먹거나 환을 짓거나 가루내어 먹는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이의 골질환에 대한 예방 또는 치료효과는 현재까지 개시된 바 없다.The term " Sinomenium " acutum "is a deciduous vine plant distributed in Korea, China, Japan, etc. It is 7 m long, has no hair on the branches, has vertical lines, leaves are alternate, round or wide ovate, occasionally shallowly divided into 3 pieces. The flower is bivalent, bloom in June, light green, and hangs on cones. It has 6 calyxes and petals and 9 to 12 stamens, but in female flowers There are 3 hunger and 3 heartbeats, and the nuclei are ripened black in October, and the taste is very high, and the quality is cold.The stem and roots are used for neuralgia and diuretic in one room. It is also used for athletic spasms, paralysis, and Guan-sha. Excretion of water is remarkable, and it is widely used for symptoms such as skin swelling, revenge, It has also been reported to lower blood pressure clinically, to have antitumor effects and to be used as an intravenous injection for the treatment of lung cancer.We have been known to eat, Its preventive or therapeutic effect on bone diseases has not been disclosed to date.

본 발명의 용어, "방기 추출물(extract)"은 방기의 다양한 부분, 예컨대, 방기의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃봉오리 및 꽃가루 중 적어도 한 부분을 추출하여 얻은 생성물을 의미한다. 바람직하게는 줄기, 뿌리 또는 둘 모두를 함께 추출하여 얻을 수 있다.The term "extract of the present invention " as used herein means a product obtained by extracting at least one part of the various parts of the barrier, for example, the stem, roots, leaves, buds and pollen of the barrier. Preferably by extracting stem, root or both together.

본 발명의 용어, "추출물"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 방기 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.The term "extract" of the present invention refers to a preparation which is prepared by squeezing a herbal medicine with an appropriate leaching solution and concentrating by evaporating the leaching solution. The diluent, concentrate or extract of the extract obtained by the extraction treatment is dried A dried product to be obtained, a controlled preparation thereof or a purified product thereof. The fragrant extract may be prepared by a common extraction method, separation and purification method known in the art. The extraction method may be, but not limited to, hot water extraction, hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, or ultrasonic extraction.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 방기 추출물은 일정 중량의 건조된 방기에 10 내지 20배의 용매를 가하여 추출하였다. 용매로는 유기 용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 C1 -4 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 또한 상기 추출은 바람직하게 냉침 추출법에 의해 수행될 수 있다. 상기 냉침 추출은 3 내지 15일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 추출은 수회 반복하여 수행될 수 있으며, 추출한 시료는 여과 후 진공회전증발기로 감압농축하였다.According to a specific embodiment of the present invention, the fragrant extract of the present invention is extracted by adding 10 to 20 times of a solvent to a predetermined weight of dried fragrance. As the solvent, an organic solvent may be used, and the organic solvent may be C 1 -4 lower alcohol or a mixture thereof, preferably methanol. Further, the extraction can be preferably carried out by a cold extraction method. The cold extraction may be carried out for 3 to 15 days, preferably 5 to 10 days, but is not limited thereto. The extraction can be repeated several times, and the extracted sample is filtered and concentrated under reduced pressure using a vacuum rotary evaporator.

본 발명의 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의해 얻어진 결과물을 의미한다. 상기 특정 성분 또는 특정 그룹의 분리는 특정한 성질의 용매, 또는 2종 이상의 용매를 함유하는 혼합용매 또는 이의 혼합비를 변화시켜 농도구배를 준 혼합용매를 이용하여 이들 용매에 대한 용해도 차이에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 방기 추출물의 분획물은 에틸아세테이트, C1 -4 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용성인 화합물을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 에틸아세테이트 또는 n-부탄올 가용성 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "fraction " of the present invention means a product obtained by a fractionation method for separating a specific component or a specific group from a mixture containing various constituents. The separation of the specific component or the specific group can be achieved by a difference in solubility in these solvents using a concentration gradient of a mixed solvent having a specific property or a mixed solvent containing two or more kinds of solvents, But is not limited thereto. Preferably, the fragrant extract fraction of the present invention may comprise a compound soluble in ethyl acetate, C 1 -4 lower alcohol or a mixed solvent thereof. More preferably, it may include, but is not limited to, ethyl acetate or n-butanol soluble compounds.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 방기의 메탄올 추출물을 에틸아세테이트와 n-부탄올로 차례로 추출하여 에틸아세테이트 가용 분획 및 n-부탄올 가용 분획을 수득하고 이들의 혼합물에 대해 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수개의 분획을 획득하였다. 이때, 이동상인 디클로로메탄/메탄올 혼합용매의 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식을 적용하였다.
In a specific example of the present invention, the methanol extract of the crude product is sequentially extracted with ethyl acetate and n-butanol to obtain an ethyl acetate soluble fraction and an n-butanol soluble fraction, and the mixture is subjected to column chromatography using a mixed solvent of dichloromethane and methanol Chromatography was performed to obtain several fractions. At this time, a concentration gradient elution system in which the mixing ratio of the dichloromethane / methanol mixed solvent, which is a moving phase, was sequentially increased from 100: 1 to 1: 1 was applied.

본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 또한, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합하거나 집합으로 사용될 수 있다.Compounds isolated from the fragrance extract or fractions thereof of the present invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts. Salts are useful as acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acids. The term "pharmaceutically acceptable salt" of the present invention means a concentration that has a relatively nontoxic and harmless effective action in a patient, and that the side effect caused by the salt is not a deleterious effect of the compound of the present invention Means any organic or inorganic addition salt of the compound. In addition, the compounds of the present invention may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds or in aggregates.

상기 본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 하기 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.The pharmaceutically acceptable salt of the compound of the present invention isolated from the fragrance extract or the fractions thereof means a salt prepared according to a conventional method in the art, and such a preparation method is well known to those skilled in the art. In particular, the pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts derived from inorganic and organic acids and bases which are pharmacologically or physiologically acceptable.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.The acid addition salt is prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an acid aqueous solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. The same molar amount of the compound and the acid or alcohol (e.g., glycol monomethyl ether) in water may be heated and then the mixture may be evaporated to dryness, or the precipitated salt may be subjected to suction filtration. As the free acid, organic acids and inorganic acids can be used. As the inorganic acids, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid and the like can be used. Examples of the organic acids include methanesulfonic acid, p- toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, mandelic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycollic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, hydroiodic acid and the like can be used , But are not limited to these.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. The alkali metal salt or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the non-soluble salt salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically acceptable to produce sodium, potassium, or calcium salt, but not limited thereto. The corresponding silver salt can also be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (e.g., silver nitrate).

상기 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.Pharmaceutically acceptable salts of the compounds separated from the fragrance extract or its fractions include salts of acidic or basic groups which may be present in the compounds isolated from the fragrance extract or fractions thereof, unless otherwise indicated. For example, pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of hydroxy groups, and the other pharmaceutically acceptable salts of amino groups include hydrobromides, sulphates, sulphates, phosphates, hydrogen phosphates (Hydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts and the like, ≪ / RTI >

본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 화합물 유도체와 동등한 파골세포생성 또는 이동 억제효과를 나타내는 상기 화합물 유도체의 이성질체의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.
The salt of the compound of the present invention isolated from the fragrance extract or the fractions thereof is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt and isomeric isomers of the compound derivatives exhibiting osteoclast generation or migration inhibitory effect equivalent to the compound derivatives It is possible.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method of preventing or treating bone diseases, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

본 발명의 조성물은 필요 이상의 파골세포의 존재로 인해 발생하는 골질환에 제한없이 사용될 수 있다.The composition of the present invention can be used without limitation in bone diseases caused by the presence of more osteoclasts than necessary.

본 발명에서 사용된 용어, "골질환"은 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 골량 저하 질환을 포함한다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 열화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미하는 것으로, 이의 비제한적인 예로는 골다공증(osteoporosis), 파제트병(Paget's disease), 치주질환, 골성장장애 및 류마티스관절염 등이 있다. 또한 암세포에 의해 활성화되는 파골세포에 의한 골손실도 본 발명의 범주에 포함된다.As used herein, the term "bone disease" refers to a condition or disease caused by excessive production and / or migration of osteoclasts, including bone loss diseases. The term "lowering bone disease" refers to a condition or disease in which a decrease in bone mass accompanied by a symptom such as a decrease in bone density and a deterioration of a bone tissue is present. Examples of the disease include osteoporosis, Paget's disease, Periodontal disease, bone growth disorders, and rheumatoid arthritis. Bone loss by osteoclasts activated by cancer cells also falls within the scope of the present invention.

바람직하게 본 발명의 조성물은 골다공증 또는 골감소증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 용어, "골다공증"은 골량이 감소하고 질적인 변화로 인해 골절이 일어날 가능성이 있는 상태를 의미하며, "골감소증"이란 골다공증의 초기 증세를 의미한다. 일반적으로 골밀도 수치(T 수치)를 기준으로 -1.0 내지 -2.5인 경우 골감소증, -2.5 이상인 경우 골다공증으로 분류한다.Preferably, the composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of osteoporosis or osteopenia. Specifically, the term "osteoporosis" used in the present invention means a condition in which bone mass is decreased and fracture is likely to occur due to a qualitative change, and "osteopenia" means an initial symptom of osteoporosis. In general, osteopenia is classified as -1.0 to -2.5 based on the bone mineral density (T value), and osteoporosis is classified as -2.5 or more.

본 발명에서 사용된 용어, "골질환의 예방 또는 치료"는 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 달성되는 상기 골질환의 예방 및 완전한 또는 부분적인 치료를 포함한다. 이는 또한 골질환 증상의 감소, 개선, 그 증상의 고통 경감, 골질환 발생율 감소 또는 치료결과를 증가시키는 환자의 어떠한 다른 변화를 포함한다.As used herein, the term "prevention or treatment of bone disease" includes prevention and complete or partial treatment of the bone disease achieved by administering a composition according to the present invention to a subject. It also includes reduction or amelioration of symptoms of bone disease, relief of the symptoms of pain, reduction in the incidence of bone disease, or any other change in the patient that increases the outcome of the treatment.

본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에게 투여하여 상기 골질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 골질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, who have developed or are capable of developing bone disease. The composition of the present invention can be administered to an individual to effectively prevent or treat the bone disease. The composition of the present invention may be administered in combination with a conventional bone disease therapeutic agent.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.As used herein, the term "administering " means introducing a predetermined substance into a patient in an appropriate manner, and the administration route of the composition of the present invention is administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue . But are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrathecal, rectal.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성물질을 약 0.01 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 50 내지 500 mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며, 1일 1회 이상 투여할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects, and the effective dose level is determined by the patient's sex, Including, but not limited to, medicaments and other medical fields that are used in combination, or in combination with, or in combination with, a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, Can be readily determined by those skilled in the art according to known factors. Generally, the active substance may be administered at a dose of from about 0.01 mg / kg / day to 1000 mg / kg / day. When administered orally, a dose of 50 to 500 mg / kg may be appropriate, and may be administered at least once a day.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 파골세포의 생성 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용된 용어, "파골세포(osteoclast)"는 뼈가 자라도록 하기 위하여 석회화한 연골과 뼈조직을 녹이는 세포로 골 재흡수에 관여하는 다핵거대세포(large multinuclear cell)이다. 2 내지 100개의 조밀하게 들어찬 타원형의 핵을 가지고 있으며 지름은 20 내지 100 μm이고 전형적인 파골세포는 자기자신에 의해 형성된 뼈 표면의 얕고 작은 홈에 존재한다. 뼈 흡수면에 위치한 파골세포는 밝은 띠와 파도모양의 가장자리가 관찰되며 상기 파골세포에 의해 분비된 가수분해효소에 의한 유기기질의 소화흡수, 산에 의한 무기질 용해와 흡수에 의하여 뼈흡수가 일어나는 것으로 알려져 있다. 뼈를 형성하는 조골세포와 뼈를 재흡수하는 파골세포의 활성이 유기적으로 균형을 이루어 골조직의 양을 조절한다.Preferably, the composition of the present invention is characterized by inhibiting the production or migration of osteoclasts. As used herein, the term "osteoclast" is a large multinuclear cell that engages in bone resorption and is a cell that melts calcified cartilage and bone tissue to allow bone growth. It has 2 to 100 densely packed oval nuclei with a diameter of 20 to 100 μm, and typical osteoclasts are present in shallow, small grooves of the bone surface formed by oneself. The osteoclast located on the bone resorption surface has a bright band and a wave-like edge, and the absorption of the organic substrate by the hydrolytic enzyme secreted by the osteoclast, absorption of the inorganic matter by the acid, and absorption of the bone occur It is known. The activity of osteoblasts forming bones and osteoclasts reabsorbing bones is organically balanced to regulate the amount of bone tissue.

파골세포는 화학주성(chemotaxis)에 의해 뼈에서 미세골절부위로 이동한다. 단핵세포-대식세포주의 세포 융합에 의해 형성되며 TRAP(Tartrate Resistant Acid Phosphatase)과 카텝신 K(cathepsin K)를 높은 수준으로 발현하는 특징을 갖는다. 또한 고농도의 소포(vesicles)와 공포(vacuoles)로 인한 균일한 표말형 외관(homogeneous, foamy appearance)을 갖는 세포질을 특징으로 한다. 상기 공포는 산성 포스파타제(acid phosphatase)로 채워진 라이소좀이다. 파골세포의 내형질의 망상조직(endoplasmic reticulum)은 성글며(sparse), 골지 복합체는 광범위하다. 뼈와 같은 기질의 제거에 유용한 주름잡힌 경계부분은 활발하게 골을 재흡수하는 파골세포의 형태적 특징이다. 수산화인회석(hydroxyapatite)이라 불리는 기질의 무기질 부분(mineral portion)은 칼슘과 인산 이온을 포함하며 상기 이온들은 세포내 섭취(endocytosis)에 의해 작은 소포 내로 흡수되어 세포를 가로질러 이동하여 결과적으로 세포외액(extracellular fluid)으로 방출되어 혈액 중 이온의 농도를 증가시킨다.The osteoclasts migrate from the bone to the microfracture site by chemotaxis. It is formed by cell fusion of mononuclear-macrophage cell line and has the characteristic of expressing TRAP (Tartrate Resistant Acid Phosphatase) and cathepsin K at a high level. It is also characterized by cytoplasm with a homogeneous (foamy appearance) appearance due to high concentrations of vesicles and vacuoles. The fear is a lysosomes filled with acid phosphatase. The endoplasmic reticulum of osteoclasts is sparse, and the Golgi complex is extensive. The corrugated border that is useful for the removal of bone-like matrix is a morphological feature of osteoclasts that actively resorb bone. The mineral portion of the substrate, called hydroxyapatite, contains calcium and phosphate ions, which are absorbed into small vesicles by endocytosis and migrate across the cell, resulting in extracellular fluid extracellular fluid to increase the concentration of ions in the blood.

상기 파골세포는 부갑상선으로부터 분비되는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH), 갑상선으로부터 분비되는 칼시토닌(calcitonin) 및 성장인자 인터루킨 6(interleukin 6; IL-6)에 의해 조절된다. 상기 IL-6는 골재흡수와 골형성 간의 불균형에 의한 골다공증과 같은 질환의 요인 중 하나이다. 또한 파골세포의 활성은 조골세포에 의해 생성되는 두 가지 분자, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin) 및 RANK 리간드의 상호작용에 의해 매개되며, 따라서 파골세포의 분화는 상기 두 가지 분자에 의해 조절된다. 이러한 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동은 다양한 골질환의 원인이 되며 본 발명의 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 혀용가능한 염에 의해 파골세포의 생성 또는 이동을 억제하여 치료될 수 있다.
The osteoclast is regulated by parathyroid hormone (PTH) secreted from the parathyroid gland, calcitonin secreted from the thyroid gland, and growth factor interleukin 6 (IL-6). IL-6 is one of the factors of diseases such as osteoporosis due to an imbalance between aggregate absorption and osteogenesis. Also, the activity of osteoclasts is mediated by the interaction of two molecules, osteoprotegerin and RANK ligand, produced by osteoblasts, and osteoclast differentiation is regulated by these two molecules. Excessive production and / or migration of osteoclasts may cause various bone diseases. The fragments of the present invention, fractions thereof, the compounds isolated therefrom, or the pharmaceutically acceptable salts of the compounds or the compounds, Can be treated by inhibiting the production or migration.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명에 따른 방기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 중 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 또는 다우리포핀(dauriporphine)을 처리하여 배양하는 경우, M-CSF 및 RANKL을 배지에 첨가하여 배양하는 파골세포 분화를 유도하는 배양 조건 하에서도 파골세포로의 분화가 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 아울러 이들 추출물 또는 화합물은 10 μg/ml 농도까지 처리하여도 세포 독성을 나타내지 않으므로, 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이나 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
In a specific embodiment of the present invention, the antimicrobial extract according to the present invention or a compound isolated therefrom is treated with salutaridine, dauricumine, cheilanthifoline or dauriporphine , It was confirmed that the differentiation into osteoclasts was remarkably inhibited even under culture conditions inducing osteoclast differentiation in which M-CSF and RANKL were added to the culture medium. In addition, since these extracts or compounds do not exhibit cytotoxicity even when treated to a concentration of 10 μg / ml, they can be effectively used as a pharmaceutical composition or a health functional food composition for preventing, ameliorating or treating bone diseases.

바람직하게, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 1 중량% 함유할 수 있다.Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.001 to 1% by weight of the above-mentioned fragrance extract, fractions thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt of the compound or the compound.

또한, 상기 본 발명에 따른 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간 등의 개체에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the above-mentioned effective ingredient. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" means that the composition is free of toxicity to an individual such as a cell or human being exposed to the composition. Such carriers may be used without limitation as long as they are known in the art such as buffers, preservatives, wetting agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients and lubricants. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

또한, 본 발명의 조성물을 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.When the composition of the present invention is formulated, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, and surfactants which are usually used.

경구 투여를 위하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 고형 제제로 제조할 수 있다. 이러한 고형제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 활성 성분이 산에 의해 분해되기 쉬운 경우, 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 활성 성분의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스, 덱스트란 등의 카보하이드레이트, 아스코르빅산, 글루타치온 등의 항산화제, 킬레이팅 물질, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제들을 사용할 수 있다.For oral administration, solid preparations such as tablets, pills, powders, granules, and capsules can be prepared. Such a solid preparation is prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. in addition to the above composition. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agent sweeteners, fragrances and preservatives are included . If the active ingredient is susceptible to degradation by an acid, the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation from above. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of suppository bases include withexol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like. Carbohydrates such as glucose, sucrose, and dextran, antioxidants such as ascorbic acid, glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins, or other stabilizers may be used to increase stability or absorbency of the active ingredient.

또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.The composition of the present invention may also be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell. The preferred modes of administration and formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and drip injections. The injectable solution may be a non-aqueous solvent such as an aqueous solvent such as a physiological saline solution or a ring gel solution, a vegetable oil, a higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), an alcohol (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.) (For example, ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrophosphate, BHA, tocopherol, EDTA and the like), an emulsifier, a buffer for pH control, a microbial growth inhibitor And a pharmaceutical carrier such as a preservative (e.g., mercury nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.).

따라서, 본 발명은 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
Accordingly, the present invention provides a method for treating a bone disease comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising the above-mentioned fragrant extract, fractions thereof, a compound isolated therefrom, or a compound or a pharmaceutically acceptable salt of said compound as an active ingredient Of the invention.

또 다른 양태로서, 본 발명은 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating osteoporosis, which comprises a bran extract, fractions thereof, a compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 위하여 골 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환의 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.The composition of the present invention can be used simultaneously or separately with a medicament for the treatment of a disease before or after the onset of osteopathy to prevent or ameliorate a bone disease.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "improvement" means any action that at least reduces the degree of symptom associated with the condition being treated.

또한 본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 방기 추출물, 이의 분획물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.When the health functional food composition of the present invention is used as a food additive, the above-mentioned fragrant extract, its fractions or a compound isolated therefrom may be directly added or used together with other food or food ingredients, . The amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use such as prevention, health, or therapeutic treatment. In general, the composition of the present invention is added in an amount of not more than 15% by weight, preferably not more than 10% by weight based on the raw material, in the production of food or beverage. However, in the case of long-term ingestion intended for health and hygiene purposes or for the purpose of controlling health, it may be below the above range.

본 발명에서 사용되는 용어, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.The term "health functional food" used in the present invention refers to a food prepared by processing a specific ingredient as a raw material for the purpose of health assisting or by extracting, concentrating, refining, or mixing a specific ingredient contained in the raw material Refers to foods that are designed and processed so that the body control function such as bio-defense, regulation of biorhythm, prevention and recovery of disease, and the like can be sufficiently exhibited to a living body by the above components. And the like.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 화합물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 이외에도 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.There is no limitation on the kind of health food to which the composition of the present invention can be used. In addition, the composition comprising the compound of the present invention as an active ingredient can be prepared by mixing other suitable auxiliary ingredients and known additives, which may be contained in health functional foods, according to the selection of a person skilled in the art. Examples of foods that can be added include dairy products, such as meat, sausage, bread, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Vitamin complex, and the like, and can be prepared by adding to the juice, tea, jelly, and juice prepared from the extract of the present invention as a main component. In addition, it includes all the health foods in the ordinary sense.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient such as ordinary beverages. Such natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, synthetic sweeteners such as saccharine and aspartame, and the like . The ratio of the natural carbohydrate can be appropriately determined by a person skilled in the art.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
In addition to the above, the composition of the present invention may further contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, A carbonating agent used in a carbonated beverage, and the like. In addition, the composition of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The ratios of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명의 방기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 천연 한약재를 원료로 하므로 약학적 조성물 또는 식품 첨가물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.
The fragrant extract of the present invention, its fractions or the compounds isolated therefrom are used as a raw material for natural herbal medicine, so that they can be less harmful than general synthetic compounds even when they are used as pharmaceutical compositions or food additives, And can be usefully used.

본 발명에 따른 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 특히, 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 및/또는 다우리포핀(dauriporphine) 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 파골세포의 분화 및 활성을 억제시킴으로써, 골손실로 인한 골질환을 억제할 수 있으므로, 다양한 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
The extract of Sinomenium acutum according to the present invention, its fractions and the compounds isolated therefrom, especially salutaridine, dauricumine, cheilanthifoline and / or dauriporphine, Or a pharmaceutically acceptable salt of said compound as an active ingredient inhibits osteoclastosis due to bone loss by inhibiting the differentiation and activity of osteoclast, Can be usefully used.

도 1은 본 발명에 따른 방기 추출물 나타낸 도이다. 상기 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP 활성을, (c)는 상기 세포들에 대한 생존율을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 유효성분(화합물 1 내지 11)의 구조식 및 명칭을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 4, 8, 10 및 11의 처리에 따른 RANKL-유도 파골세포 형성에 대한 효과를 나타낸 도이다. 상기 화합물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP 활성을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 화합물 5, 8, 10 및 11의 처리에 따른 RANKL-유도 파골세포 형성 억제효과를 나타낸 도이다. 상기 화합물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP-양성 다핵성 파골 세포(MNC)의 수를, (c)는 상기 세포들에 대한 생존율을 나타낸다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. (A) shows a microscope image for TRAP staining, (b) shows TRAP activity, and (c) shows survival rate for the cells.
2 is a diagram showing the structural formulas and names of the active ingredients (Compounds 1 to 11) isolated from the fragrance extract according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the effect of RANKL-induced osteoclast formation according to the treatment of Compounds 1 to 4, 8, 10, and 11 isolated from the fragrance extract according to the present invention. (A) shows a microscope image for TRAP staining and (b) shows TRAP activity for the cells cultured and treated with the above compound in concentration.
FIG. 4 is a graph showing RANKL-induced osteoclast formation inhibitory effects of Compounds 5, 8, 10, and 11, which were isolated from the fragrance extract of the present invention. (B) shows the number of TRAP-positive polynucleated osteoclasts (MNC), (c) shows the number of TRAP-positive cells in the cells . ≪ / RTI >

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1:  One: 방기Bangui 추출물 및 이의  Extract and its 분획물의Fraction 제조 Produce

건조된 방기(Sinomenium acutum) 6 kg을 칭량하여 추출용기에 넣고 메탄올 90 L를 가하여 7일 동안 냉침시켜 추출하고 여과하였다. 상기 수득한 추출액을 진공회전증발기를 이용하여 감압농축하였다. 상기 추출 및 농축 과정을 2회 반복하여 737 g의 방기 추출물을 수득하였다.Dried bran ( Sinomenium acutum ) 6 kg were weighed, placed in an extraction container, and 90 L of methanol was added thereto. The mixture was then cooled by freezing for 7 days and filtered. The obtained extract was concentrated under reduced pressure using a vacuum rotary evaporator. The above extraction and concentration process was repeated twice to obtain 737 g of a crude extract.

상기 수득한 방기 메탄올 추출물을 4 L의 증류수에 현탁시킨 후, 1N NaOH를 첨가하여 pH 12.0으로 조절한 후 동량의 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하여 얻어진 추출액을 합쳐서 다시 감압농축하여 84 g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 상기 추출 과정으로부터 수득한 여액을 동량의 n-부탄올로 3회 반복하여 추출하고 추출액을 감압농축하여 72 g의 부탄올 분획물을 수득하였다.
The resultant fragrant methanol extract was suspended in 4 L of distilled water, adjusted to pH 12.0 with 1N NaOH, and extracted with an equal volume of ethyl acetate. The extract obtained by repeating the extraction process three times was combined and concentrated under reduced pressure to obtain 84 g of ethyl acetate fraction. The filtrate obtained from the extraction process was repeatedly extracted three times with the same amount of n-butanol, and the extract was concentrated under reduced pressure to obtain 72 g of a butanol fraction.

실시예Example 2:  2: 방기Bangui 추출물로부터 유효성분의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Active Ingredients from Extracts

상기 실시예 1로부터 제조한 방기 추출물로부터 유효성분으로서 11종의 화합물을 분리하였으며, 이들 화합물의 구조식과 명칭을 도 2에 나타내었다.Eleven kinds of compounds as active ingredients were isolated from the fragrant extract prepared in Example 1, and the structural formula and the names of these compounds are shown in Fig.

구체적으로, 상기 실시예 1로부터 수득한 방기 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(84 g)과 n-부탄올 추출물(72 g)을 알카로이드 분획(156 g)이라 명명하였다. 또한, 에틸아세테이트 분획물 중에서 시노메닌(도 2의 화학식 1) 5.5 g을 결정 상태로 분리하였다. 상기 시노메닌을 제외한 알카로이드 분획물 150.5 g을 대상으로, 디클로로메탄/메탄올 혼합 용액을 이동상으로 흘려주되 디클로로메탄/메탄올의 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 5개 분획(제1분획 내지 제5분획)을 획득하였다.Specifically, the ethyl acetate fraction (84 g) and the n-butanol extract (72 g) of the fragrant methanol extract obtained from Example 1 were named as an alkaloid fraction (156 g). In addition, in the ethyl acetate fraction, 5.5 g of synomenine (Formula 1 in Fig. 2) was separated into a crystalline state. 150.5 g of the alkaloid fraction except for cinomenine was flowed into a mobile phase with a dichloromethane / methanol mixed solution, and the concentration ratio of dichloromethane / methanol was sequentially increased from 100: 1 to 1: 1, Chromatography was performed to obtain a total of five fractions (fractions 1 to 5).

수득한 제1분획을 대상으로 아민겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: n-헥산/에틸아세테이트=10:1)를 실시하여 3.1 mg의 다우리포핀(도 2의 화학식 11)을 분리하였다. 제2분획을 대상으로는 역상 컬럼 크로마토그래피(매직: 리버스페이스 카본-18, 이동상: 30~90% 메탄올)를 실시하여 8-데메톡시루나닌(도 2의 화학식 4) 37.1 mg과 헤일란티폴린(도 2의 화학식 10) 6.0 mg을 각각 분리하였다. 또한 제3분획을 대상으로 제2분획에서와 동일한 조건의 역상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 14-에피시노메닌(도 2의 화학식 2) 23.8 mg, 살루타리딘(도 2의 화학식 5) 37.2 mg, 아쿠투민(도 2의 화학식 6) 58.7 mg, 아쿠투미딘(도 2의 화학식 7) 7.4 mg 및 다우리쿠민(도 2의 화학식 8) 9.3 mg을 각각 분리하였다. 아울러 제4분획을 대상으로 아민겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: n-헥산/에틸아세테이트=5:1)를 실시하여 시노메닌 N-옥사이드(도 2의 화학식 3) 92.4 mg을 분리하고, 남은 분획으로부터 마그노플로린(도 2의 화학식 9) 2.1 g을 분리하였다.The obtained first fraction was subjected to amine gel column chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate = 10: 1) to separate 3.1 mg of dauripopine (Formula 11 of FIG. 2). The second fraction was subjected to reverse phase column chromatography (magic: river space carbon-18, mobile phase: 30 to 90% methanol) to obtain 37.1 mg of 8-demethoxyaraninine (formula 4 in FIG. 2) (Formula 10 in Fig. 2) of 6.0 mg. The third fraction was subjected to reverse phase column chromatography under the same conditions as in the second fraction to obtain 23.8 mg of 14-epithinomenine (Formula 2 in Fig. 2), 37.2 mg of salutaridine (Formula 5 in Fig. 2) 58.7 mg of acutumine (Formula 6 of FIG. 2), 7.4 mg of acutumidine (Formula 7 of FIG. 2), and 9.3 mg of dauricumin (Formula 8 of FIG. In addition, the fourth fraction was subjected to amine gel column chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate = 5: 1) to separate 92.4 mg of synomene N-oxide (Formula 3 in FIG. 2) 2.1 g of magnesium fluorine (Formula 9 in Fig. 2) was isolated.

분리된 각각의 화합물들은 1H-NMR 및 13C-NMR을 사용하여 구조를 확인하였다.
The separated compounds were identified by 1 H-NMR and 13 C-NMR.

실시예Example 3:  3: 방기Bangui 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 파골세포 형성 억제 효과 평가 Evaluation of inhibitory effect on osteoclast formation of extracts and compounds isolated therefrom

5주령의 수컷 ICR 마우스를 구입하여 대퇴골(fermur) 및 경골(tibia)을 취하고 항생제(100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM으로 세척하여 골수세포(bone marrow cell)를 획득하였다. 상기 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/ml)를 포함하는 α-MEM에 1일간 배양하였다. 비부착(non-adherent) 골수세포를 페트리접시에 분주하고 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 3일간 배양하였다. 비부착세포를 세척한 후 부착세포(adherent cell)를 골수-유래 마크로파지(bone marrow-derived macrophage; BMM)로 사용하였다. BMM 세포를 RANKL(10 ng/ml) 및 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 DMSO 또는 실시예 1로부터 제조한 방기 추출물을 농도별(1, 3 및 10 μg/ml)로 처리하여 4일간 배양하였다. 음성대조군으로는 RANKL 없이 M-CSF만을 처리한 세포를 사용하였다. 다핵성 파골세포(multinucleated osteoclast)를 3.7% 포르말린으로 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 세포를 TRAP 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 다핵성 파골세포를 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 염색으로 가시화하였다(도 1a). 방기 추출물 농도에 따른 TRAP 활성을 확인하고 이를 도 1b에 나타내었으며, 이로부터 특히 10 μg/ml 농도의 방기 추출물을 처리하였을 때 30~40% 수준으로 TRAP 활성이 효과적으로 감소한 것을 확인하였다. 또한, 상기 방기 추출물이 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 동일한 농도로 방기 추출물을 처리한 세포에서 세포생존율을 계산하여 도 1c에 나타내었다. 도 1c에 나타난 바와 같이, 방기 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 방기 추출물을 1 내지 10 μg/ml 농도로 처리한 세포군에서 오히려 세포생존율이 증가하였음을 확인하였다. 이는 해당 농도 범위 내에서 방기 추출물은 세포 독성을 나타내지 않음을 나타낸다.Five-week-old male ICR mice were purchased and the femur and tibia were taken and washed with α-MEM containing antibiotics (100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin) to form bone marrow cells ). The bone marrow cells were cultured in α-MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and M-CSF (macrophage colony-stimulating factor; 10 ng / ml) for 1 day. Non-adherent bone marrow cells were seeded in Petri dishes and cultured for 3 days in the presence of M-CSF (30 ng / ml). Adherent cells were used as bone marrow-derived macrophages (BMM) after washing nonadherent cells. BMM cells were treated with DMSO or the bran extract prepared in Example 1 (1, 3 and 10 μg / ml) in the presence of RANKL (10 ng / ml) and M-CSF Lt; / RTI > Cells treated with M-CSF without RANKL were used as negative controls. Multinucleated osteoclasts were fixed with 3.7% formalin for 10 minutes and treated with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes to have permeability. Cells were stained with TRAP solution (Sigma-Aldrich). Multinucleated osteoclasts were visualized by TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) staining (Fig. 1A). The TRAP activity was determined according to the concentration of the extract, and FIG. 1b shows that the TRAP activity was effectively reduced to 30 ~ 40% when 10 .mu.g / ml of the extract was treated. The cell viability was calculated in the cells treated with the same concentration of the phytotoxic extract in order to confirm whether the phytotoxic extract had cytotoxicity and is shown in FIG. 1C. As shown in FIG. 1C, it was confirmed that the cell survival rate was increased in the cell group treated with 1 ~ 10 μg / ml of the extract of Bombyx mori than in the control group without Bombyx mori extract. This indicates that the bran extract does not show cytotoxicity within the concentration range.

아울러 상기 실시예 2로부터 분리한 11종의 화합물(도 2)을 각각 농도별로 처리하여 배양하였다. 상기 방기 추출물을 처리하여 배양한 세포와 동일한 방법으로 배양하여 TRAP 염색하였다. 상기 11종의 화합물 중 TRAP 활성 억제효과가 미미한 화합물들(화합물 1 내지 4, 6, 7 및 9)에 대한 결과를 도 3에, 우수한 TRAP 활성 억제효과를 나타내는 화합물들(화합물 5, 8, 10 및 11)에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.The 11 compounds (FIG. 2) isolated from Example 2 above were each treated at different concentrations and cultured. The cells were cultured in the same manner as the cells cultured and treated with the repellent extract to perform TRAP staining. The results for the compounds (compounds 1 to 4, 6, 7 and 9) of which the effect of inhibiting TRAP activity is insignificant among the above 11 compounds are shown in Fig. 3, and the compounds (compounds 5, 8 and 10 And 11) are shown in Fig.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 화합물 1 내지 4, 6, 7 및 9는 분리하여 정제된 화합물임에도 불구하고 3 μg/ml 처리 농도까지도 비처리군인 양성대조군과 유사한 수준의 TRAP 활성을 나타내어 이에 대한 억제 효과를 나타내지 못함을 확인하였다.As shown in FIG. 3, the compounds 1 to 4, 6, 7, and 9 exhibited TRAP activity at a level similar to that of the non-treated group, even at a treatment concentration of 3 μg / ml, It was confirmed that it did not show the effect.

반면, 화합물 5, 8, 10 및 11은 3 μg/ml 농도부터 육안상으로도 확인할 수 있을 만큼 눈에 띄는 TRAP 활성 억제효과를 나타내었다(도 4a). 이들 세포 중, TRAP-양성 다핵성 파골세포(TRAP-positive multinucleated osteoclast cells; MNC)라고 표현하는 TRAP 염색되고 핵을 3개 이상 갖고 있는 다핵세포를 별도로 계수하여 도 4b에 나타내었으며, 본 발명의 화합물의 파골세포 형성 억제 효과를 평가하였다. 육안상으로도 확인된 바와 같이, 3 μg/ml 농도로 처리한 실험군부터 MNC의 수는 급격히 감소하기 시작하여 10 g/ml 농도로 처리한 실험군에서는 4가지 화합물 모두에 대해 거의 MNC가 나타나지 않았다. 나아가 이들 TRAP 활성 억제 효과를 나타내는 화합물들에 대해서도 세포생존율을 측정하여 세포 독성을 나타내는지를 확인하고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 4가지 화합물 모두에 대해 5 μg/ml까지는 100% 이상의 생존율을 나타내었으며, 화합물 10 및 11을 10 μg/ml 농도로 처리한 세포군에서 다소 세포생존율이 감소하였으나, 여전히 70% 이상의 수준을 유지하였으며, 화합물 5 및 8은 10 μg/ml 농도에서도 100% 이상의 생존율을 나타내었다.Compounds 5, 8, 10, and 11, on the other hand, exhibited remarkable TRAP activity inhibitory effects (Fig. 4A), which can be confirmed visually even at a concentration of 3 μg / ml. Of these cells, TRAP-expressing TRAP-positive multinucleated osteoclast cells (MNCs) and multicellular cells having three or more nuclei were counted separately and shown in FIG. 4b, and the compound of the present invention Of osteoclast formation was evaluated. As is apparent from the naked eye, the number of MNCs began to decrease rapidly from the experimental group treated with 3 μg / ml concentration, and almost no MNC appeared in all four compounds in the experimental group treated with 10 g / ml concentration. Furthermore, the compounds showing the TRAP activity inhibitory effect were also measured for cell viability to determine whether they exhibited cytotoxicity, and the results are shown in FIG. 4C. As shown in FIG. 4C, the survival rate of 100% or more was observed up to 5 μg / ml for all four compounds. The cell survival rate was slightly decreased in the cells treated with 10 μg / ml of the compound 10 and 11, %, And compounds 5 and 8 showed a survival rate of 100% or more even at a concentration of 10 μg / ml.

Claims (8)

방기(Sinomenium acutum) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된, 하기의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
Figure 112016038337106-pat00009
(살루타리딘; salutaridine),
Figure 112016038337106-pat00010
(다우리쿠민; dauricumine),
Figure 112016038337106-pat00011
(헤일란티포린; cheilanthifoline),
Figure 112016038337106-pat00012
(다우리포핀; dauriporphine).
A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis comprising, as an active ingredient, the following compounds, their pharmaceutically acceptable salts, or a mixture thereof, isolated from a Sinomenium acutum extract or a fraction thereof:
Figure 112016038337106-pat00009
(Salutaridine),
Figure 112016038337106-pat00010
(Dauricumine),
Figure 112016038337106-pat00011
(Cheilanthifoline),
Figure 112016038337106-pat00012
(Dauriporphine).
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
파골세포의 생성 또는 이동을 억제하는 것인 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition inhibits osteoclast formation or migration.
제1항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 파제트병(Paget's disease), 치주질환, 골성장장애 및 류마티스관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the bone disease is selected from the group consisting of osteoporosis, Paget's disease, periodontal disease, bone-growth disorder, and rheumatoid arthritis.
제1항에 있어서,
상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 1 중량% 함유하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
A pharmaceutical composition containing the compound or a pharmaceutically acceptable salt of the compound in an amount of 0.001 to 1% by weight.
방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된, 하기의 화합물, 이의 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
Figure 112016038337106-pat00013
(살루타리딘; salutaridine),
Figure 112016038337106-pat00014
(다우리쿠민; dauricumine),
Figure 112016038337106-pat00015
(헤일란티포린; cheilanthifoline),
Figure 112016038337106-pat00016
(다우리포핀; dauriporphine).
A health functional food composition for preventing or ameliorating a bone disease comprising, as an active ingredient, the following compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a mixture thereof:
Figure 112016038337106-pat00013
(Salutaridine),
Figure 112016038337106-pat00014
(Dauricumine),
Figure 112016038337106-pat00015
(Cheilanthifoline),
Figure 112016038337106-pat00016
(Dauriporphine).
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