KR101658972B1 - 플록사신 계열의 화합물을 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 근력 강화용 조성물 및 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용한 근원세포의 분화 촉진 방법, 분화된 근원세포의 제조방법 및 근력 약화 관련 질환의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 근원세포의 분화를 촉진하여 근관을 형성할 수 있으므로 근육 약화를 방지할 뿐만 아니라, 효과적으로 근육 기능을 개선할 수 있다. 따라서 이를 포함하는 약학 조성물은 근육 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

플록사신 계열의 화합물을 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness diseases comprising floxacin-based compounds}
본 발명은 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 근력 강화용 조성물 및 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용한 근원세포의 분화 촉진 방법, 분화된 근원세포의 제조방법 및 근력 약화 관련 질환의 치료방법에 관한 것이다.
근력의 약화를 유발하는 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증(sarcopenia), 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증(muscle atrophy), 기아, 소모성질환(암 등), 노화와 함께 진행되는 심위축증(acardiotrophy) 등이 있다.
근감소증(sarcopenia)은 노화가 진행되는 동안 근육량(skeletal muscle mass) 감소에 따른 근력의 저하를 일컫는다. 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량의 감소뿐만이 아니라, 근섬유의 종류 변화도 관찰된다. 나이가 들어가면 타입 1과 타입 2가 비슷한 비율로 감소하는데 반해, 근감소증이 오면 타입 2의 근섬유 두께에는 큰 변화가 없지만 타입 1 근섬유 두께는 눈에 띄게 감소한다. 이러한 근감소증은 노인들 사이에서 일어나는 노쇠와 기능 장애를 유발한다고 보고되고 있다(Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).
근감소증은 다양한 요인에 의해 유발되나, 각각의 요인들에 대한 연구는 아직 미진하다. 성장 호르몬의 감소 또는 신경학적 변화(neurological change), 생리 활성(physical activity)의 변화, 대사의 변화, 성호르몬의 양 또는 지방이나 카타볼릭 싸이토카인(catabolic cytokines)의 증가와 단백질의 합성과 분화의 균형 변화에 의해 유도된다(Roubenoff R. and Hughes V.A., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 55, M716-M724, 2000). 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량 감소의 원인으로는 위성 세포의 활성 (satellite cell activation) 감소가 중요한 원인으로 손꼽힌다. 위성 세포란, 기저막(basement membrane)과 근섬유의 근(sarcolemma) 사이에 위치하고 있는 작은 단핵 세포이다. 이들은 부상 또는 운동과 같은 자극에 의해 활성화되어 근원세포(myoblast)로 증식하며, 분화가 진행되면 다른 세포와 융합되어 다핵의 근섬유를 형성한다. 따라서 위성 세포의 활성이 감소함에 따라 손상된 근육을 재생하는 능력이나 분화 신호에 대한 반응이 떨어지게 되고 그 결과 근육 형성이 저하된다.
근위축증(Muscle atrophy)은 영양결핍이나 장기간 근육을 사용하지 않은 경우에 유발되는데 정상적인 단백질의 합성과 분해의 균형이 붕괴되어 단백질이 분해됨으로서 나타나게 된다.
한편, 심위축증(acardiotrophy)은 기아, 소모성질환(암 등), 노쇠했을 때 유발되는데 심근섬유는 마르고 가늘어 지고 핵은 농축되어 대소부동이 된다. 따라서 근속(muscle fascicle)도 용적이 줄고 심장 전체가 작아지며 심외막하의 지방조직은 뚜렷하게 감소하고 관상동맥은 굽어진다. 심근섬유의 핵 양단에 갈색의 색소로서 소모성 색소(리포푸스친)가 나타나고 지방조직의 감소와 함께 심장 전체가 갈색조를 나타낸다.
근감소증의 치료방법으로는 크게 3가지를 들 수가 있다. 첫 번째는 운동이다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시키며, 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 장기적 치료방법에 부적절하다(Timothy J. Doherty, J. Appl. Physiol. 95, 1717-1727, 2003). 두 번째는 약물 치료로서 테스토스테론(Testosterone) 또는 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid)의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상(prostate symptoms) 등 부작용을 나타낸다. 다른 승인된 처방법으로 DHEA(dehydroepiandrosterone) 와 성장 호르몬이 있는데 SARMs(Selective Androgen Receptor Modulators)을 포함하는 부위에서 치료법으로 가능하다는 연구가 보고된바 있다(D.D. Thompson, J. Musculoskelet Neuronal Interact 7, 344-345, 2007). 또한 식이요법이 치료법으로 알려져 있지만 영양평가에 의하면 영양실조나, 현대 식습관은 적당한 총체질량(total body mass)을 유지하기 위해 부적절하다.
최근에는 위성 세포를 분리하여 체외에서 분화시킨 후 체내에 도입시키는 줄기세포치료법(stem cell therapy)과 직접 체내의 위성 세포를 활성화하여 근육 분화(myogenesis)를 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시키는 방법이 근감소증과 같은 근력약화를 치료할 수 있는 방법으로 대두되고 있다 (Shihuan Kuang, and Michael A. Rudnicki, Trends in Molecular Medicine 14, 82-31, 2008).
따라서 근육의 근력약화 관련 질환을 치료하기 위해 보다 근본적이며 부작용이 없는 치료방법으로 근원세포를 분화하는 방법이 요구되며, 이에 따라 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 물질의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 근원세포의 분화를 촉진함으로써 근육량을 증가시키고, 근육기능을 효과적으로 회복시키는 근육의 근력 약화 관련 질환 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물이 근원세포의 분화를 촉진하여 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근원세포의 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분화된 근원세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근력 강화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
구체적으로 상기 플록사신 계열의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)은 하기 화학식 1 내지 5에 각각 순서대로 나타내었다.
[화학식 1]
Figure 112015000209102-pat00001

[화학식 2]
Figure 112015000209102-pat00002

[화학식 3]
Figure 112015000209102-pat00003

[화학식 4]
Figure 112015000209102-pat00004

[화학식 5]
Figure 112015000209102-pat00005

토수플록사신은 7-(3-아미노피롤리딘-1-일)-1-(2,4-디플로로페닐)-6-플로로-4-옥소-1,4-디하이드로-1,8-나프티리딘-3-카복시산, 발로플록사신은 1-사이클로프로필-6-플로로-8-메톡시-7-(3-메틸아미노피페리딘-1-일)-4-옥소퀴놀린-3-카복시산, 레보플록사신은 (S)-9-플로로-2,3-디하이드로-3-메틸-10-(4-메틸피페라진-1-일)-7-옥소-7H-피리도[1,2,3- de]-1,4-벤족사진-6-카복시산, 목시플록사신은 1-사이클로프로필-7-[(1S,6S)-2,8-디아자바이사이클로[4,3,0]논-8-일]-6-플로로-8-메톡시-4-옥소-퀴놀린-3-카복시산, 및 제미플록사신은 7-[(4Z)-3-(아미노메틸)-4-메톡시이미노-피롤리딘-1-일]-1-사이클로프로필-6-플로로-4-옥소-1,8-나프티리딘-3-카복시산으로 명명된다.
본 발명에서 플록사신 계열의 토수플록사신, 발로플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신 및 제미플록사신은 모두 플루오로퀴놀론 항생제(fluoroquinolone antibiotic)로 알려진 바 있으나, 근원세포 분화와의 연관성에 대해서는 알려진 바가 없었다. 이에, 본 발명자들은 상기 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 근원세포 분화 용도가 있음을 최초로 규명하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예로서 상기 염은 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate), 목시플록사신 하이드로클로라이드(Moxifloxacin Hydrochloride) 또는 제미플록사신 메실레이트(Gemifloxacin Mesilate)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 토수플록사신 토실레이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "근원세포 분화"란, 단핵인 근원세포(myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관(myotube)를 형성하는 과정이다. 근육 전구체 세포에 해당하는 근원세포는 자기복제(self-renewal) 하는 경우에는 Pax7+ 마커를 나타내며, 증식하는 경우 Pax7+/MyoD+를 나타낸다. 근관을 형성하는 분화단계의 세포는 Pax7-, MHC+, Troponin C+, myogenin+ 마커를 이용하여 구분할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 MCK(muscle creatine kinase)의 프로모터 활성과 관련하여 토수플록사신, 발로플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신 및 제미플록사신의 루시퍼라아제 활성을 확인함으로써, 상기 다섯 가지 화합물의 근육 분화 촉진능이 우수함을 확인하였으며, 특히 토수플록사신 토실레이트의 근원 세포 분화 촉진능을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 일구현예는 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.001μM 내지 5.0μM 의 농도로 포함하는, 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 혈청이 포함된 DMEM 분화용 배지일 수 있으나, 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 배지 또는 조성물이면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 조성물에 있어서, 더욱 구체적으로 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.005 μM 내지 2.5μM의 농도로 포함할 수 있으며, 가장 구체적으로 0.01μM 내지 0.5μM의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 세포배양 또는 분화에 필요한 부가적인 물질을 더욱 포함할 수 있다.
플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.001 μM 미만으로 포함하는 경우, 농도가 너무 낮아 분화촉진 효과가 떨어지는 문제가 생길 수 있으며, 5.0 μM 초과로 포함하는 경우 독성을 야기할 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 근원세포(myoblast)에 처리하는 단계를 포함하는, 근원세포의 분화 촉진 방법을 제공한다. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다. 구체적으로, 상기 근원세포의 분화 촉진 방법은 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 또는 체내 근원세포에 처리하여 분화를 촉진할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포의 제조방법을 제공한다.
플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 상기 제조방법은 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 또는 체내 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate)를 각각 근원세포에 (1㎍/㎖)의 농도로 처리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 근세포 분화와 관련된 단백질 발현을 확인한 결과, 근세포 분화 촉진 효과가 매우 높음을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명은 근관을 형성할 수 있으며 α-MHC, α-트로포닌(Troponin) C 및 α-마이오제닌(myogenin) 단백질을 발현하는 분화된, 근원세포를 체외 또는 체내에서 제조할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "근력 약화"란 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 의학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.
본 발명에서 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 조성물은 근원세포의 분화 촉진을 통해 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 근감소증이란, 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종신체 기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.
또한 근위축증은 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.
근육 퇴행 위축(muscle dystrophy)이란, 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다.
본 발명의 심위축증은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠했을 때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위하여, 상기 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용 가능하나, 비경구용으로 제조하는 것이 바람직하다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
주사형 제형으로 제제화하기 위해서는 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제할 수 있다.
본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학 조성물은 근력 약화 관련 질환이 발병한 개체 또는 발병 가능성이 있는 개체의 근력 강화가 필요한 부위에 직접 주입될 수 있으며, 체외 또는 체내 근원세포에 적용하여 분화된 근원세포를 제조한 후, 분화된 근원세포를 근력 약화 관련 질환이 발병한 개체 또는 발병 가능성이 있는 개체의 근력 강화가 필요한 부위에 주입할 수 있다.
또한, 상기 조성물에는 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 방해가 되지 않는 한, 추가 성분 예를 들어, 근력 약화 관련 질환의 치료제로 알려져 있는 물질들이 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 근원세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate)를 근원세포에 (1㎍/㎖)의 농도로 처리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 근세포 분화와 관련된 단백질 발현을 확인한 결과, 근세포 분화 촉진 효과가 매우 높음을 확인하였다(도 6). 또한, 앞 정강근 근육의 움직임을 3일간 제한 (muscle immobilization)하여 근육손상을 유도한 후 다시 풀어주고 근육이 재생되도록 하여 7일 후에 동일한 운동능력 향상 테스트를 통하여, 토수플록사신 토실레이트를 투여한 실험군에서 근육 운동제한(muscle immobilization) 후에 대조군에 비해 평형감각을 유지하는 운동능력이 향상된 것을 확인하였고, 지구력이 향상된 것을 확인하였다(도 10).
이러한 결과를 통하여, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 근원세포의 분화를 촉진하는데 효과적이며 근육 약화 관련 질환의 예방 치료에 유용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 근육 약화 관련 질환을 예방 또는 개선하기 위하여 근육 약화 관련 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염의 농도는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 또는 심위축증을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 식품 조성물은 근원세포(Myoblasst)의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함 한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 강화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 강화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "근력 강화"란 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육 피로의 감소, 에너지 수지의 개선 또는 이들의 조합 효과를 말한다.
본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 강화용 조성물은 근원세포를 근육 세포로 분화시키는 능력을 통하여 근육량을 증가시켜 전체 근육량을 증가시킬 수 있으며, 최대 지구력이 강화되고, 이에 따라 신체 수행이 강화되고 근육 피로도 감소할 수 있다. 또한, 근육 세포가 빠르게 대체될 수 있기 때문에 근육의 손상에 대하여 빠르게 치유될 수 있다.
본 발명의 근력 강화용 조성물은 투여를 위하여, 상기 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 상기 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명의 근력 강화용 조성물은 식품조성물 또는 식품첨가제 형태로 제조될 수 있으며, 특히 건강식품 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 상기 식품조성물은 상기 설명한 바와 같다. 따라서, 본 발명의 근력 강화용 조성물은 노화에 의한 근육 감소 뿐 아니라 일반인의 근육 생성, 근력 강화에 대한 보조제 등의 형태로 이용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 토수플록사신 토실레이트를 마우스에 처리하여, 로타로드 테스트, 트레이드밀 테스트를 진행하여, 이의 근력 강화능을 확인함으로써, 근력 강화 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에서, "사료"란, 동물의 생명을 유지하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 상기 사료는 가축 등의 동물이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 포함하며, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질 등의 동물성 사료가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "사료 첨가제"란, 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해 사료에 첨가되는 물질을 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않으나 성장촉진, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 더욱 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 포함되는 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.001 내지 1%(w/w)일 수 있고, 바람직하게는 0.005 내지 0.9%(w/w)일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.5%(w/w)일 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육의 근력 약화 관련 질환의 치료방법을 제공한다.
상기 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 또는 심위축증을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 근원세포의 분화를 촉진하여 근관을 형성할 수 있으므로 근육 약화를 방지할 뿐만 아니라, 효과적으로 근육 기능을 개선할 수 있다. 따라서 이를 포함하는 약학 조성물은 근육 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 근육 분화 촉진능을 평가하기 위한 MCK 리포터 카세트의 구조 및 실험 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 토수플록사신(Tosufloxacin)의 처리에 의한 마우스의 운동능력향상 확인 실험에 대한 개괄적인 그림이다.
도 3은 트레이드밀(Treadmill) 테스트를 수행하기 위한 장치의 사진이다.
도 4는 트레이드밀 테스트 수행 과정을 나타낸 그래프이다.
도 5는 로타-로드(Rota-rod) 테스트를 수행하기 위한 장치의 사진이다.
도 6은 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate)를 처리한 근원세포주 C2C12에서의 α-MHC, α-트로포닌(Troponin) C 및 α-마이오제닌(myogenin)의 발현을 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. DM0, DM1, DM3 및 DM5는 각각 분화 배지에서 각각 0일, 1일, 3일 및 5일째에 회수한 세포를 의미한다.
도 7은 근원세포의 분화로 인한 근관(myotube) 형성을 확인하기 위한 에오신(Eosin) Y 염색 사진이다.
도 8은 마우스의 다리를 고정시키고 10일이 경과한 후, 증류수를 경구투여한 고정군과 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군간의 체중 당 앞 정강근 무게를 비교한 그래프이다.
도 9는 마우스의 다리를 고정시키고 10일이 경과한 후, 3일 동안 다시 움직이도록 한 뒤에, 증류수를 경구투여한 고정군과 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군간의 체중당 앞 정강근의 무게를 비교한 그래프이다.
도 10은 운동능력 테스트를 통해 토수플록사신 토실레이트의 운동능력 회복 효과를 확인한 것이다. 구체적으로 트레이드밀(좌), 로타-로드(우) 테스트를 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 토수플록사신 토실레이트의 근섬유 증가 효과를 확인하기 위한 라미닌 염색 사진이다.
도 12는 토수플록사신 토실레이트 처리에 따른 근섬유 횡단면 면적을 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : 세포 배양 및 약물 처리
토수플록사신 토실레이트(tosufloxacin tosylate) 및 4종의 플록사신(floxacin) 계열의 항생제를 DMEM에 희석하여 최종적으로 1 ㎍/㎖ 농도의 약물을 세포주에 처리하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
먼저, 분비형(Secreted) MCK C2C12 세포를 96-웰에 5×10³으로 접종하였다. 다음날 오전에 DMEM 배지에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 섞은 배지로 바꿔 주었다. 상기 배지는 성장 배지로서, 오후에 상기 배지를 회수하였으며, DM0(Differentiation Medium day 0)로 명명하였다. 배지 회수 후, 2% 말 혈청(horse serum)이 첨가된 DMEM 배지 120 ㎕를 분주하고, 최종적으로 1 ㎍/㎖이 되도록 각각의 약물을 처리하였다. 하루 경과 후, 배지를 회수하고 DM1(Differentiation Medium day 1)으로 명명하였고, 전날과 같이 새 배지를 분주하고 약물을 처리하였다. 다시 하루 경과 후, 배지를 회수하고 DM2(Differentiation Medium day 2)로 명명하였다.
실시예 2 : 분비형( secreted ) MCK C2C12 루시퍼라아제 ( luciferase ) 분석
본 발명에서는 근육 분화를 평가하기 위한 리포터 시스템(secreted MCK luciferase assay system)을 사용하였다. 근육 분화 시 전사가 증가하는 단백질인 MCK(muscle creatine kinase)의 프로모터 부분을 분비형 루시퍼라아제 벡터 조절 영역(secreted luciferase vector regulatory region)에 클로닝하여 분화 시, 그 프로모터가 활성화되면서 루시퍼라아제 효소가 배지로 분비되는 시스템을 이용한 것이다(도 1).
근육 분화 시, 리포터 유전자로 루시퍼라아제가 분비된 배지로 DM0, DM1 및 DM2를 회수한 뒤, 상기 회수한 각각의 배지에 루시퍼라아제 효소 50㎕ 및 기질 5㎕를 넣어 반응시켜 생성되는 빛을 루미노미터(luminometer)를 이용해 측정하였다. DM1과 DM2의 측정값을 합하고 DM0의 측정값으로 나눠서 각 약물에 대한 근육 분화 촉진능을 정량화하였다. DMSO 1 ㎍/ml을 넣은 대조군의 수치를 1로 보았을 때, 각 약물 1 ㎍/ml을 넣은 군의 증감 수치를 비교하여 약물의 근육 분화 촉진능을 평가하였다. 루시퍼라아제 분석 키트로는 Ready-To-Glow™ 분비형 루시퍼라아제 리포터 시스템(clontech)을 사용하였다. 각각의 실험은 세 번씩 반복 수행하였다.
실시예 3 : 웨스턴 블랏( Western blot )
전기영동이 끝난 뒤, 단백질을 85V에서 1시간 30분 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 상기 니트로셀룰로스 막에 5% 스킴 밀크(Tween 20이 들어있는 TBS에 스킴 밀크를 섞은 것)로 30분 동안 블록킹시켰다. 일차 항체(α-MHC, α-Troponin C, α-Myogenin, α-GAPDH)는 5% 스킴 밀크에 1:1000으로 희석하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, TBS로 5분 간격으로 5 내지 7 회 세척하였다. 이차 항체는 5% 스킴 밀크에 1:5000 또는 1:2000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, TBS로 5분 간격으로 5 내지 7 회 세척하였다. 현상액을 니트로셀룰로스 막에 뿌리고 암실에서 현상하였다.
실시예 4 : 에오신( Eosin ) Y 염색
먼저, C2C12 세포를 6-웰에 5×10⁴으로 접종하였다. 이틀 뒤, 2% 말 혈청이 첨가된 DMEM 배지 2㎖를 분주하고, 최종적으로 1 ㎍/ml이 되도록 각각의 약물을 처리하였다. 이틀간 상기와 동일한 조건으로 매일 배지를 교체하였다. 그 다음날, DM3가 되었을 때 에오신(Eosin) Y 염색을 수행하였다.
에오신 Y 염색은 다음과 같이 진행되었다. 6-웰에 있는 배지를 제거한 뒤, 1X PBS 1㎖을 넣고 세척하였다. 100% 메탄올 1㎖을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 5분 경과 후 메탄올을 제거하고 1X PBS 1㎖을 넣고 다시 한 번 세척하였다. 핵을 염색하기 위해 메틸렌 블루(methylene blue) 1㎖를 첨가 한 뒤, 제거하고 1X PBS 1㎖를 이용하여 5회 세척하였다. 에오신을 넣고 30분 동안 염색하였다. 에오신 제거 후, 오렌지색이 적당히 빠질 때까지 증류수를 이용하여 세척하였다. 마지막으로, 현미경을 이용하여 사진을 찍었다.
실시예 5 : 동물의 운동능력 향상 확인 실험 준비
본 동물실험에서는 총 45마리의 5주령 수컷 C57BL/6 마우스(대한바이오링크)를 사용하였다. 전체 계획은 도 2에서 보여주는 바와 같다. 2 주 동안 주변 환경에 적응시킨 뒤, 7 주령이 되었을 때부터 약물을 경구 투여하였다. 대조군은 200㎕ (물)/ 20g (마우스) 을 투여하고 토수플록사신 토실레이트군은 농도 의존도(dose dependency)를 보기 위하여 1 : 3 : 10의 비율로 0.123 ㎎ / 200 ㎕ / 20 g (마우스), 0.369 ㎎ / 200 ㎕ / 20 g (마우스), 1.230 ㎎ / 200 ㎕ / 20 g (마우스) 을 경구 투여하였다. 8 주가 되었을 때, 수술용 스테이플(Autosuture Royal 35W stapler)을 이용하여 마우스의 두 뒷다리(both hindlimbs)를 10일 동안 고정시켰다(A novel hindlimb immobilization procedure for studying skeletal muscle atrophy and recovery in mouse. J Appl Physiol 106: 2049.2059, 2009).
그 후, 손상된 근육이 약물에 의해 회복 효과를 보이는지 확인하기 위해 앞 정강근(Tibialis anterior muscles)을 추출하였다. 구체적으로 수술용 스테이플을 제거하고 3일 동안 다시 움직이도록 한 뒤, 운동능력 향상 확인 실험(treadmill, rota-rod)을 수행하고, 앞 정강근을 추출하였다.
다음과 같이 약물의 사람 경구투여량을 마우스 경구투여량으로 환산하였다(표 1 내지 3)(Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. July 2005 Pharmacology and Toxicology).
Figure 112015000209102-pat00006
사람 상수 kmhuman과 마우스 상수 kmmouse는 각각 37과 3이다.
Figure 112015000209102-pat00007
[NOAEL(무독성량)] ÷ [kmhuman/kmmouse] = HED(human equivalent dose)로서 사람의 경구투여량에 12.3(kmhuman/kmmouse = 37/3)을 곱하면 마우스의 경구투여량으로 환산할 수 있다.
토수플록사신 토실레이트의 사람(60kg 기준) 경구 투여량을 마우스(20g 기준) 경구 투여량으로 환산하여 계산하면 다음과 같다(표 3).
사람 경구투여량 기준 30mg/60kg 90mg/60kg 300mg/60kg
0.5mg/kg 1.5mg/kg 5mg/kg
마우스 경구투여량 기준 0.123mg/20g 0.369mg/20g 1.230mg/20g
상기 약물 투여량을 기반으로 하여, 약물에 의한 운동능력 평가를 위해 마우스의 운동능력 향상 확인 실험(Treadmill, Rota-rod)을 수행하였다.
실시예 6 : 트레이드밀 테스트( Treadmill test )
트레이드밀 테스트에는 도 3에서 보이는 것과 같은 장비가 사용되었다.
The protocol used for the treadmill test (DOI 10.1016/j.cell.2006.11.013 _ Cell, Volume 127 Supplemental Data)의 트레이드밀(treadmill) 프로토콜을 참고하여 도 4와 같이 트레이드밀 테스트를 수행하였다.
트레이드밀 테스트를 수행하기 하루 전에 6m/분의 속도로 10분 동안 워밍업시켰다. 시작점에는 전기 자극이 흐르도록 되어 있다. 다음 날, 8 m/분의 속도로 시작하여 매 20분마다 속도를 2 m/분 씩 올려준다. 트레이드밀 테스트를 시작하고 1시간이 되었을 때는 12 m/분의 속도는 유지하고 각도를 5° 올려주고 전기 자극을 꺼주었다. 20분 뒤에는 각도 5°를 계속 유지하며 속도만 2 m/분 씩 더 올려주었다. 상기 조건에서 마우스의 달리는 시간을 측정 및 기록하였다.
실시예 7 : 로타로드 ( Rota - rod ) 테스트
로타로드 테스트에는 도 5에서 보이는 것과 같은 장비가 사용되었다.
마우스를 각 원판 구획으로 나누어진 원통기둥에 올려놓고, 마우스가 매달린 상태에서 약 10초간 워밍업 시켰다. 그 후, 5 rpm에서 최대 40 rpm까지 시간의 흐름에 따라 회전 속도를 증가시켰다. 마우스가 원통에 매달리는 시간을 측정함으로써 근력과 균형감각을 평가하였으며, 시간은 최대 5분으로 하였다.
실시예 8 : 라미닌 ( Laminin ) 염색
라미닌은 대부분의 세포와 조직 간의 단백질 네트워크의 기반으로 기저 막에 형성된 큰 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 당단백질이다. 라미닌은 세포 표면 수용체와 상호 작용 및 배아 발달과 조직 형성 동안 세포 이동의 역할을 한다. 뿐만 아니라, 세포 분화, 이동, 표현형, 생존 그리고 부착에 영향을 미친다. 본 발명에서는 라미닌을 이용해서 기저막에 형성된 큰 세포외기질 당단백질을 염색하여 구획이 나누어진 골격근 섬유의 횡단면을 보고자 하였다.
2-메틸부탄(JUNSEI)과 드라이아이스를 반응시켜 낮은 온도를 유지하면서 앞 정강근(Tibialis anterior muscle)을 Tissue Tek OCT 화합물(Sakura Finetek)에 고정시키고 얼려서 절단할 표본을 만들고, 냉동절단기 (Sakura Tissue Tek Cryo3)를 이용하여 앞 정강근을 5 μm로 절단하였다.
라미닌 염색의 방법으로는 절단한 앞 정강근을 4% 파라포름 알데하이드로 10분간 고정한 뒤, PBS와 0.1% Triton-X 100을 섞어서 만든 PBST로 5분씩 2회 세척하였다. 그 후, 3% BSA가 포함된 PBST로 45분간 절편을 블록킹하고 PBST로 5분씩 3회 세척한 뒤, 일차 항체로 α-라미닌을 4℃에서 하루 동안(overnight) 인큐베이션시켰다. 다음날, PBST로 3번씩 5분간 세척하고 3% BSA가 포함된 PBST에 항-토끼 IgG TRITC(red)-이차 항체로 60분 동안 인큐베이션시켰다. PBST로 세척 후, DAPI로 5분 동안 인큐베이션시켰다. PBST로 5분씩 2회 세척한 뒤 슬라이드 유리에 VectaShield 마운트 배지를 떨어뜨리고 커버슬립을 올려 마운트하였다. 이렇게 제조한 표본을 현미경 및 카메라(Nikon ECLIPS Ni, Nikon DS-Qi1Mc)를 이용해 관찰하였다. 프로그램은 NIS-Elements BR 4.20.00 64-bit를 사용하였다.
실시예 9 : 근섬유 횡단면 면적( cross - sectional area , CSA ) 및 섬유 수(%)
근섬유의 면적 및 개수를 측정하기 위한 방법으로 Image J 프로그램을 이용하여 앞 정강근의 횡단면 면적을 측정하였다. (Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol 49: 907-914, 2007.) (Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastruct Pathol 31: 401-407, 2007.) (Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol 114: 148-155, 2013.)
2-메틸부탄(JUNSEI)과 드라이아이스를 반응시켜 낮은 온도를 유지하면서 앞 정강근을 Tissue Tek OCT 화합물(Sakura Finetek)에 고정시키고 얼려서 표본을 만들었다.
실험예 1 : 분비형 루시퍼라아제 리포터 시스템( Secreted luciferase reporter systems )을 이용한 근원세포( myoblast ) 분화 촉진 후보 약물 탐색 및 선별
의약품에서 추출한 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin tosylate) 및 플록사신(floxacin) 계열의 항생제에 대한 근육 분화 촉진능을 평가하였다. 그 결과, 대조군 대비 분화 촉진능이 관찰된 후보 약물로서 총 5종을 선별하였다.
대조군의 값을 1로 기준 삼았을 때, 약물을 처리한 루시퍼라아제 활성이 3반복 실험 중 1번 이상 1.2 배 이상 또는 근사치 값을 나타난 약물을 선별하였다.
선별된 약물의 루시퍼라아제 활성은 다음과 같다(표 4).
약물 이름 1st 2nd 3rd 평균
tosufloxacin tosylate 1.425175 1.945846 1.5489 1.639974
balofloxacin 0.874525 1.582214 1.554476 1.337071
levofloxacin 1.819719 1.0682057 1.28183 1.396653
moxifloxacin HCL 1.829166 0.997163 1.045582 1.290637
FACTIVE
(=Gemifloxacin mesilate)		 1.817406 1.518823 1.28479 1.54034
후보 약물 모두가 루시퍼라아제 활성이 높게 나타나 근육 분화 촉진능이 우수함을 확인하였으며, 그 중에서 3 반복의 실험 모두 1.2 이상의 값인 1.425175, 1.945846, 1.5489를 나타내며 높은 루시퍼라아제 활성을 나타낸 토수플록사신 토실레이트를 이용하여 동물실험을 진행하기로 결정하고 이 약물을 대상으로 좀 더 구체적으로 시험관 내 및 생체 내 실험을 하고 근육 분화 촉진 및 손상된 근육 회복 효과를 확인하고자 하였다.
실험예 2 : 토수플록사신 토실레이트의 근원세포 분화 촉진 확인
토수플록사신 토실레이트의 근원세포 분화 촉진 효과를 확인하기 위하여 먼저, 웨스턴 블랏을 통하여 토수플록사신 토실레이트에 의한 C2C12 세포의 분화 정도를 알아보았다(도 6).
DM0(Differentiation Medium day 0), DM1, DM3 및 DM5에서의 약물에 의한 분화 정도를 보았다. 약물을 DMSO에 녹였기 때문에 DMSO만 처리한 표본, 토수플록사신 토실레이트를 처리한 표본, 그리고 DMSO 자체만으로 분화가 촉진된다는 보고가 있는 바(Induced Muscle Differentiation in an Embryonal Carcinoma Cell Line. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Dec. 1983, p. 2280-2286), 아무것도 처리하지 않은 2% 말 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 회수한 표본을 가지고 웨스턴 블랏을 실시하였다.
근육 분화 마커인 α-MHC, α-Troponin C, α-Myogenin, 그리고 정량을 알아보기 위한 α-GAPDH를 찍었다.
대조군(아무것도 처리하지 않은 2% 말 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 회수한 표본)과 DMSO(DMSO를 처리한 표본)간의 분화 차이는 없었다. 다만, α-Troponin C의 경우는 DM5 보다 DM3에서 더 많은 발현증가를 보였다.
대조군과 DMSO 표본과 비교하여 토수플록사신 토실레이트를 처리한 표본에서는 DM3와 DM5에서 근육 분화에 의한 발현 증가를 확인할 수 있었다. 특히 α-MHC 및 α-Myogenin에서는 DM3보다 DM5에서 발현이 더 증가되었다. 결과적으로 토수플록사신 토실레이트는 C2C12 세포에서 α-MHC, α-Troponin C, α-Myogenin 단백질의 발현을 증가시켜, 근원세포의 분화를 촉진시킨다는 것을 확인하였다.
한편 근원세포의 분화로 인한 근관(myotube) 형성을 확인하기 위하여 에오신(Eosin) Y 염색을 수행하였다(도 7).
에오신 Y는 H&E 염색에 사용하는 시약으로 단백질이 분홍색으로 염색되는데, 단핵인 근원세포는 연한 분홍색으로 염색되고 단백질이 근원세포보다 상대적으로 풍부한 근관은 진한 분홍색으로 염색되므로, 근원세포의 분화정도를 확인할 수 있다. 이를 위해 각각 DMSO와 토수플록사신 토실레이트를 처리하면서 분화시킨 C2C12 세포를 메탄올에 고정시킨 후, 에오신 Y로 염색하였다. 그 결과, DMSO를 처리한 대조군에서는 연한 분홍색으로 염색된 근원세포가 많이 나타났다. 반면, 토수플록사신 토실레이트를 처리한 C2C12 세포에서는 진한 분홍색으로 염색된 근관이 다수 관찰되었다.
상기와 같이 에오신 Y 염색을 통하여 세포 형태를 관찰한 결과 토수플록사신 토실레이트에 의한 근육 분화가 촉진되어 근관 형성을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
종합하면, 웨스턴 블랏 분석 및 에이오신 Y 염색을 통해 토수플록사신을 처리했을 때, 근원세포의 분화가 촉진되어 근관 형성이 증가한다는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 근원세포의 분화 촉진용 조성물로 사용할 수 있다.
실험예 3 : 동물 실험을 통한 토수플록사신 토실레이트의 운동능력 증가 효과 확인
전체적인 동물 실험 계획은 도 2에서 나타낸 바와 같다.
구체적으로 먼저, 마우스의 다리를 고정시키고 10일이 경과한 직후에, 증류수를 경구투여한 고정군과 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군간의 체중당 앞 정강근 무게를 비교하고자 하였다. 수술용 스테이플(surgical staple)을 이용하여 10일 동안 마우스의 다리를 고정시킨 뒤 스테이플을 제거하자마자 마우스의 앞 정강근을 추출하였다. 그 후, 추출한 앞 정강근의 무게와 마우스의 무게를 측정하였다. 토수플록사신 토실레이트에 의한 효과로서 체중당 앞 정강근 무게의 감소폭이 좀 더 적지 않을까 기대하였으나, 토수플록사신 토실레이트의 효과는 보이지 않았다. 다만, 대조군 대비 스테이플 고정에 의한 앞 정강근 무게의 감소는 확인할 수 있었다(도 8).
다음으로, 마우스 다리 고정 후 3일 동안 다시 움직이도록 한 뒤에, 증류수를 경구투여한 고정군과 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군간의 체중당 앞 정강근의 무게를 비교하고자 하였다. 이는 토수플록사신 토실레이트에 의한 효과로서 근육 분화 및 손상된 근육 회복 촉진에 의한 체중당 앞 정강근 무게의 재생 정도를 확인하기 위한 것으로, 3일 동안 다시 움직이도록 한 후 추출한 앞 정강근의 무게와 마우스의 무게를 측정하였다.
증류수를 경구투여한 고정군에 비해 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군에서 좀 더 많은 체중당 앞 정강근 무게의 재생 및 회복을 확인하였다. 또한 3 가지 용량(30mg, 90mg, 300mg; 사람 투여량 기준)에 대한 용량 의존성을 보이며 회복 효과를 나타냈다(도 9).
마지막으로, 3일간 마우스를 다시 움직이도록 한 후, 운동능력(locomotion) 테스트를 통해 운동능력을 평가하였다. 운동능력 테스트로는 트레이드밀(treadmill) 및 로타-로드(rota-rod) 테스트를 수행하였다. 트레이드밀 테스트는 운동능력 및 지구력 평가, 로타-로드 테스트는 근력 및 균형감각을 측정 및 평가하는 것이다. 운동 테스트 결과는 다음과 같다(도 10).
트레이드밀 측정 결과, 증류수를 경구투여한 고정군보다 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군에서 3가지 용량(30 mg, 90 mg, 300 mg ; 사람투여량 기준) 모두 더 오랜 달리기 시간을 기록하였다. 특히 토수플록사신 토실레이트 90 mg(사람투여량 기준)을 경구투여한 마우스군에서 가장 오랜 달리기 시간을 기록하였다. 고정을 하지 않은 대조군과 비교해보면 토수플록사신 토실레이트의 손상된 근육 회복에 대한 효과를 확인할 수 있다.
로타-로드의 측정 결과, 토수플록사신 토실레이트에 의한 근력 및 균형감각의 향상 효과를 확인해 볼 수 있었다. 특히 3가지 용량(30 mg, 90 mg, 300 mg ; 사람투여량 기준)에서는 용량 의존성을 보였다.
종합하면, 토수플록사신 토실레이트를 경구투여한 고정군에서 대조군에 비해 더 많은 체중당 앞 정강근 무게의 재생 및 회복을 확인하였으며, 트레이드밀 테스트 및 로타-로드 테스트에서 근육 회복에 대한 효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 또는 근력 강화용 조성물로 사용될 수 있다.
실험예 4 : 토수플록사신 토실레이트의 근섬유 증가 효과 확인
상기 트레이드밀 측정 결과, 토수플록사신 토실레이트 90mg(사람 투여량 기준)에서 가장 긴 달리기 시간을 기록하며 운동능력 향상 효과를 보였는 바, 라미닌 염색을 통하여 증류수를 경구투여한 대조군과 고정군 및 토수플록사신 토실레이트 90mg을 경구투여한 고정군 간의 앞 정강근 섬유 횡단면 면적(cross section area, CSA)를 비교 확인하고자 하였다. 육안으로 확인했을 때, 증류수를 경구투여한 고정군에 비하여 토수플록사신 토실레이트 90mg을 경구투여한 고정군에서 더 큰 앞 정강근 섬유 CSA가 많이 관찰되었다(도 11).
정량적인 분석을 위하여 근섬유 CSA의 개수를 세어서 비율(%)로 확인해 보았다(도 12). 증류수를 경구투여한 고정군은 근섬유 크기 0 ~ 300㎛2에 많이 분포하고 있는 것에 비하여, 증류수를 경구투여한 비고정군(대조군)과 토수플록사신 토실레이트 90mg을 경구투여한 고정군은 근섬유 크기 500 ~ 800 ㎛2에 많이 분포하고 있는 것을 확인하였다.
결론적으로 본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 근섬유의 크기를 증가시켜 운동능력 향상 효과를 가지는 바, 상기 조성물은 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 또는 근력 강화용 조성물로 사용될 수 있다.
상기 실시예들을 통해서 알 수 있는 것처럼, 본 발명의 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 근육 분화를 촉진하고 손상된 근육의 회복을 촉진시키는 효과가 있으므로, 근원세포의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 근력 강화용 조성물로 이용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 플록사신(floxacin) 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 분리된 근원세포(myoblast)의 분화 촉진용 조성물로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 플록사신 계열의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin)인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염은 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate), 목시플록사신 하이드로클로라이드(Moxifloxacin Hydrocloride), 제미플록사신 메실레이트(Gemifloxacin Mesilate)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 염은 토수플록사신 토실레이트(Tosufloxacin Tosylate)인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 0.001μM 내지 5.0μM인, 조성물.
  7. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을, 분리된 근원세포(myoblast)에 처리하는 단계를 포함하는, 근원세포의 분화 촉진 방법으로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인, 방법.
  8. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을, 분리된 근원세포(myoblast)에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포의 제조방법으로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인, 방법.
  9. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이고,
    상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증인, 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 근원세포(Myoblast)에서 근세포로의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이고,
    상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증인, 조성물.
  13. 삭제
  14. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 강화용 조성물로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인, 조성물.
  15. 플록사신 계열의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제로서,
    상기 플록사신 계열의의 화합물은 토수플록사신(Tosufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 및 제미플록사신(Gemifloxacin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인, 사료 또는 사료 첨가제.
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