KR101647183B1 - 치료약물 및 세포전달용 마이크로입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

치료약물 및 세포전달용 마이크로입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 지지체용 마이크로입자, 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이크로입자는 골 조직 공학에서의 치료학적 지지체로서, 치료용 약물인 단백질 분자 및 표면 증식된 줄기 세포를 표적 부위에 전달해 줄 수 있는 복합적 역할을 수행할 수 있다.

Description

치료약물 및 세포전달용 마이크로입자 및 이의 제조방법{Microspheres for co-delivery of therapeutic drugs and cells and method for preparing thereof}
본 발명은 치료용 약물 및 세포를 전달하기 위한 신규 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
뼈 재생을 증진시키기 위한 일반적인 전략은 지지체 물질(scaffolding material)의 사용이다. 지지체는 조직 및 지지체의 구성체를 생성하는 뼈를 3차원(3D)으로 성장시킬 수 있는 주형(template)으로의 역할을 수행한다. 한편 골 조직 공학에 있어서, 상기 지지체 물질로부터 특정 신호 분자(signaling molecule)를 방출시키는 기술은 조직 재생에 있어서의 중요 전략중 하나로 여겨지고 있다. 상기 신호 분자는 주로 지지체 상에서 탈체(ex vivo) 배양된 세포로 방출되거나, 또는 생체 내(in vivo)로 직접 이식되어 뼈 주위로 전달될 수 있다. 이러한 두 가지 경우 모두에 있어서, 상기 신호 분자가 지지체로부터 방출될 때 특정 기간 동안 제어된 방식으로 방출됨이 중요하다. 이로써 세포 증식, 골형성 분화 등을 최적화시킬 수 있다. 따라서, 현재의 골 조직 공학에 있어서의 중요 과제로는, 신호 분자를 효율적이며 안정적으로 탑재할 수 있으면서도 이를 지속적으로 제어방출 할 수 있는 지지체의 개발이 요청되고 있다.
한편 마이크로입자 지지체로, 즉, 마이크로전달체(microcarrier)는 3차원(3-D) 지지체로서 조직 세포의 3차원적인 배양 및 확장을 가능하게 한다는 점에서 큰 관심을 모으고 있다. 이는 등방성의 3차원 구 형태의 지지체로, 세포적 분포 및 증식을 위한 균일한 사이트를 갖는다. 이어서 세포들은 상기 마이크로전달체 상에 부착되어 손상 부위에 전달될 수 있으며, 이의 크기를 조절하여 전달 용량을 제어할 수 있다. 나아가 상기 마이크로전달체는 세포 배양뿐만 아니라 체내 주사 이식이 가능하며, 따라서 결손 부위에 효과적으로 체워져 세포-전달체 조직을 형성할 수 있다. 마이크로전달체는 일반적으로 마이크로 크기의 수백 마이크로미터의 직경을 갖는 구형 입자로써, 이에 대한 연구가 약물, 호르몬 및 성장인자와 같은 치료용 약물의 전달에 관해서도 확장되고 있다. 마이크로전달체가 치료용 약물의 전달에 사용되는 경우, 이식 전 탈체 배양동안 전달체 상의 세포들이 골 형성을 하며, 나아가 이식 후 골 조직의 재생을 위한 중요한 역할을 수행할 수 있다.
따라서, 골 조직 공학에 있어서 생체 외 줄기세포의 3-D 배양을 가능하게 함과 동시에 치료용 약물를 함입 및 방출하여 골 형성을 촉진시킬 수 있는 마이크로입자 내지 전달체의 개발이 중요하다 할 수 있다.
한편, 실리카 생체활성 글라스(silica-based bioactive glass, SBG)의 경우 골 조직 공학에 있어서 매우 유용하게 사용되고 있다. 이는 중합체 기반의 조성으로, 특히 치료적 목적으로, 생체분자를 내부에 함입할 수 있다. 나아가, SBG 조성물을 졸-겔 공정을 통하여 제조하는 경우, 종래 칼슘 포스페이트 및 용융-유도된 바이오세라믹에 비하여 다양한 이점이 있을 수 있다. 예를 들어, 가수분해 및 중축합과 같은 졸-겔 반응을 통하여 추가적인 가교 단계 없이 구조적 및 화학적으로 안정하면서 자체 경화된 생체활성 글라스 입자를 얻을 수 있다. 또한, 졸-겔 반응으로 유도됨으로써 다공성 구조를 갖는 입자가 얻어질 수 있으며, 칼슘 및 포스페이트 이온을 통하여 골-생체활성 물질로 불리우는 칼슘 포스페이트 결정을 만들어낼 수 있다.
종래 기술로, 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0091945호의 경우, 효소에 의해 생분해 가능한 유기 폴리머 및 졸-겔로 유래된 실리카 네트워크를 포함하는 다공성 무기/유기 하이브리드 나노스케일 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 이의 매크로다공성(macroporous) 지지체로써의 이용에 관한 내용이 기재되어 있다. 그러나 이는 구 형태의 미세 입자와 같은 지지체가 아니며, 또한 내부에 치료용 약물을 제어방출할 수 있는 복합적인 역할에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않다.
또한 대한민국특허 등록번호 제10-0799320호의 경우, 분사식 노즐을 이용한 쾌속 조형기로 제작되며, 생체 적합성 고분자로 이루어지고 비 구형의 3차원적 입체 구조를 가지는 세포배양 및 주사 이동용 지지체가 기재되어 있다. 그러나, 이 또한 세포 지지체의 역할에만 초점을 맞추고 있을 뿐, SBG 조성물을 사용한다거나 내부 약물 봉입 및 이의 제어방출을 통한 상승효과에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않다.
이와 같이, SBG 조성물 내 특정 무기물 조성, 예를 들어 칼슘의 함량을 조절하여 입자의 특성을 조절함으로써, 이를 바탕으로 세포가 효과적으로 지지 및 증식됨과 동시에 내부에 성장인자와 같은 치료용 약물를 봉입할 수 있으면서 이를 제어 방출할 수 있는 마이크로입자 내지 전달체에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.
본 발명은 졸-겔 반응으로 제조된 실리카 글라스로 이루어진 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 마이크로입자의 Ca 함량을 조절함으로써 줄기세포를 효과적으로 고정하고 이를 증식시킬 수 있는 3-D 지지체 메트릭스를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 마이크로입자 및 이의 내부에 탑재된 치료용 약물을 포함하는 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 마이크로입자의 Ca 함량을 조절함으로써 입자 표면에 증식된 세포와 함께 치료 약물을 전달할 수 있는 두 가지 기능을 수행할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 세포 지지체용 마이크로입자의 제조방법으로서, 실리카 전구체를 산성용액 및 물과 혼합하여 졸(sol)을 형성하는 제1단계; Ca 전구체를 상기 제1단계에서 형성된 졸에 첨가하는 제2단계; 염기성 용액을 첨가하여 pH를 5 내지 7로 조절하는 제3단계; 식물성 오일을 첨가하고 교반하여 겔화시키는 제4단계; 및 상기 제4단계에서 겔화된 용액을 침전시켜 마이크로입자를 수득하는 제5단계를 포함하고, 상기 마이크로입자는 실리카 글라스로 이루어지며 50 몰%이하의 Ca를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 지지체용 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로입자의 제조방법은 경질 조직을 타게팅 하기 위하여, 무기 조성을 갖는 실리카 생체활성 글라스를 선택하였으며, 나아가 이를 졸-겔 반응을 통하여 제조하였다. 상기 졸-겔 반응은 상온 및 수성에서 진행되는 반응이기 때문에 치료용 약물(성장인자 등)들을 손상 없이 반응과 함께 병합시킬 수 있으며, 조성물이 자체 경화함으로써 물리화학적 안정성이 높은 마이크로입자를 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 마이크로입자의 제조방법은 최종적으로 수득되는 마이크로입자 내의 칼슘 함량을 변화시킴으로써, 향상된 생체활성(골 세포 증식 및 아파타이트 형성에 의한 골 형성 분화 촉진)을 나타낼 수 있다. 본 발명의 실험예 2 및 실험예 4에 있어서, 30% Ca를 함유하는 마이크로입자가 Ca를 함유하지 않는 마이크로입자에 비해 입자 표면에 아파타이트 결정상이 현저하게 형성됨과 동시에 세포 증식률도 더 우수한 것을 확인하였다.
나아가 본 발명의 마이크로입자에 대하여 생체 외 및 생체 내에서의 MSC 세포 거동, 조직 반응 및 조직 적합성을 테스트해본 결과, 염증 반응은 최소화함과 동시에 섬유아세포가 마이크로입자 주위로 모여드는 것을 확인하였다(실험예 5). 이러한 결과를 통하여, 본 발명에 따른 마이크로입자는 생체적합성을 갖는 세포 지지체로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 세포 지지체용 마이크로입자에 있어서, 상기 세포 지지체는 세포가 자랄 수 있는 환경을 제공함으로써 조직 및 지지체의 구성체를 생성하는 뼈를 3차원(3-D)으로 성장시킬 수 있는 주형(template)이다.
본 발명의 세포 지지체용 마이크로입자를 제조함에 있어서, 상기 제1단계는 실리카 전구체를 산성용액 및 물과 혼합하여 졸(sol)을 형성하는 단계로, 산촉매화된 졸(acid catalyzed sol)을 제조하는 단계이다.
상기 실리카 전구체는 졸-겔 반응을 통한 생체활성 글라스에 있어서 실리카 네트워크를 형성할 수 있는 전 단계의 물질이다. 구체적으로, 상기 실리카 전구체는 알킬 실리케이트(Si(OR)4, 여기에서 R은 탄소수 1내지 5의 알킬기임)일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 TEOS 및 TMOS가 있다.
이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 알킬 실리케이트일 수 있다.
상기 산성용액은, 산으로서의 성질을 바탕으로 하여 졸 형성을 촉진하는 물질 또는 이를 함유하는 용액일 수 있다. 구체적으로, 상기 산성용액은 HCl 수용액, HNO3 수용액 또는 CH3COOH, H3PO4 수용액일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 물은 탈이온수일 수 있으며, 구체적으로 제1단계에 있어서, 상기 실리카 전구체 1몰을 기준으로 1 내지 20몰의 비율로 첨가될 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 제2단계는 Ca 전구체를 상기 제1단계에서 형성된 졸에 첨가하는 단계로서, 이를 통해 실리카 글라스 조성물 내에 Ca를 함유시킬 수 있다.
상기 Ca 전구체는 실리카 네트워크 내에 무기물인 Ca를 포함시킬 수 있는 전 단계의 물질이며, 구체적으로 상기 Ca 전구체는 CaCl2, Ca(NO3)2, CaSO4, Ca-acetate, Ca-methoxyethoxide 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 제2단계에 있어서, 졸에 첨가하는 Ca 전구체의 양을 조절함으로써, 최종적인 본 발명의 마이크로입자 내 Ca 함량을 조절할 수 있다. 본 발명의 마이크로입자는 실리카 네트워크 글라스로 이루어지며, 따라서 이의 내부에 50 몰%이하의 Ca가 함유되도록 Ca 전구체의 몰수를 조절하여 첨가할 수 있다. 즉, 첨가하는 Ca 전구체의 양은 최종적인 마이크로입자 내의 원하는 Ca 함량을 기준으로 하여 조절될 수 있으며, 이는 첨가되는 Ca 전구체의 양이 어떠한 전구체 물질을 사용하는지 및 졸-겔 반응에 있어서의 다양한 변수로 인해 변경될 수 있기 때문이다.
상기 제3단계는 염기성 용액을 첨가하여 pH를 5 내지 7로 조절하는 단계로서, 겔화를 촉진하는 단계이다.
구체적으로, 상기 염기성 용액은 NH4OH 수용액, NaOH 수용액, KOH 수용액 또는 Ca(OH)2 수용액일 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 제4단계는 식물성 오일을 첨가하고 교반하여 겔화시키는 단계로서, 첨가된 식물성 오일에 의해 졸이 겔의 형태로 변화하는 단계이다.
상기 식물성 오일은 식물에서 추출되거나 유래한 오일로서, 특별히 제한되는 것은 아니나 올리브 오일, 카스터 오일, 팜유, 코코넛유, 해바라기유, 미강유 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 제5단계는 상기 제4단계에서 겔화된 용액을 침전시켜 마이크로입자를 수득하는 단계로서, 상기 제4단계에서 형성된 겔을 일정 시간 이상 방치함으로써 용액 하부에 침전된 물질, 즉 마이크로입자를 수득하는 단계이다.
상기 제4단계의 겔화 과정까지 거침으로써 용액 내에 분산된 형태의 마이크로입자가 형성되고, 따라서 일정 시간 이상 방치함에 따라 상기 마이크로입자는 바닥으로 침전될 수 있다. 침전된 마이크로입자는 간단한 여과과정을 통해 수득될 수 있다.
상기 제5단계 이후에, 수득된 마이크로입자에 대하여 물 및 에탄올과 같은 유기용매로 세척하는 단계 및 세척된 마이크로입자를 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 설명한 단계들을 통하여 최종적으로 본 발명의 세포 지지체용 마이크로입자를 제조할 수 있다. 상기 제2단계를 통하여 본 발명의 마이크로입자는 50 몰%이하의 Ca를 함유한다. 바람직하기로, 본 발명의 마이크로입자는 0 초과 30 몰%이하의 Ca를 함유할 수 있다.
본 발명의 마이크로입자는 Ca 함량이 증가함에 따라 이의 입자 크기 뿐만 아니라 이의 기공 크기도 증가할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상기 마이크로입자는 10μm 내지 1000μm의 직경을 갖는 구(sphere)일 수 있다. 나아가 본 발명의 상기 마이크로입자는 2nm 내지 10nm의 평균 기공 크기를 갖는 중간다공성(mesoporous)일 수 있다. 특히 기공 크기가 증가함으로써, 마이크로입자 내부에 치료용 약물이 포함되는 경우, 이의 방출률이 더 증가할 수 있는 효과가 있으며, 이는 뒤에서 보다 상세히 설명한다.
또한 본 발명의 마이크로입자는 Ca 함량이 증가함에 따라 유사생체용액 내에서 표면에 아파타이트 결정이 형성될 수 있다. 상기 아파타이트는 대표적인 생체활성 물질이므로, 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 분화 및 증식을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 유사생체용액 내에 침지시킨 입자는 Ca가 포함되지 않은 입자에 비해 표면에 현저히 향상된 아파타이트 광화작용(mineralization)이 나타남을 확인하였다(실험예 2). 이는 칼슘이 포함된 실리카 글라스에서 칼슘 이온이 방출됨으로써 광물화 석출 과정을 촉진시킨 것으로 판단된다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로입자 내에 Ca가 함유됨으로써 그렇지 않은 경우와 비교할 때, 초기에는 세포 부착 수준이 더 낮았지만, 일정 기간 이후부터는 급격히 세포 증식이 향상되어 더 높은 세포수를 기록함을 확인하였다(실험예 4). 이는 입자에서 방출된 Ca 이온이 세포 증식에 상당한 영향을 미친 것에 기인한다.
본 발명의 마이크로입자는 골 조직 공학에 있어서의 세포 지지체로의 역할을 수행할 수 있다. 상기 세포는 인간 조직 유래 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽줄기세포(MSC), 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포, 치수유래 줄기세포 (DPSC), 전분화능 줄기세포(PSC)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 앞서 설명한 마이크로입자의 제조방법으로 제조되고, 실리카 글라스로 이루어지며 50 몰%이하의 Ca를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 지지체용 마이크로입자를 제공한다.
상기 마이크로입자에 관한 구체적은 설명은 앞서 제조방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명은 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자로서, 상기 마이크로입자는 내부에 치료용 약물을 포함하며, 상기 치료용 약물은 마이크로입자로부터 지속적으로 서방출되는 것을 특징으로 하는 마이크로입자를 제공한다.
상기 치료용 약물은 성장인자, 시토크롬, 사이토카인, 호르몬, 유전자, 천연물, 합성신약 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
나아가 본 발명의 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자는, 상기 마이크로입자로부터 치료용 약물의 방출 프로파일이 0차 키네틱(kinetic) 방출 양상을 나타낼 수 있다. 이는 약물의 방출이 매우 서서히 장기간에 걸쳐 일어나는 양상이며, 시간에 따라 일정한 비율의 약물이 용출되어 약물의 효능이 장기간 꾸준히 나타날 수 있다. 또한 약물의 방출을 쉽게 예측할 수 있는 장점이 있다.
나아가 본 발명은 상기 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자의 제조방법으로서, 실리카 전구체를 산성용액 및 물과 혼합하여 졸(sol)을 형성하는 제1단계; Ca 전구체를 상기 제1단계에서 형성된 졸에 첨가하는 제2단계; 염기성 용액을 첨가하여 pH를 5 내지 7로 조절하는 제3단계; 식물성 오일을 첨가하고 교반하여 겔화시키는 제4단계; 상기 제4단계에서 겔화된 용액을 침전시켜 마이크로입자를 수득하는 제5단계; 및 상기 제1단계 내지 제3단계 중 어느 한 단계 이후에 치료용 약물을 첨가하는 제6단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자는, 앞서 설명한 마이크로입자 내에 치료용 약물이 탑재된 형태로써, 입자 표면에 증식된 세포와 함께 치료 약물을 전달할 수 있는 두 가지 기능(지지체 및 전달체)을 동시에 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자의 제조방법은 온화한 조건의 졸-겔 반응으로 진행되기 때문에, 수용성 치료용 약물들이, 생성되는 입자의 구조 내에 용이하게 함입될 수 있다. 나아가 치료용 약물이 함입된 마이크로입자들을 간단한 여과 및 세척 과정을 통해 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 마이크로입자는 Ca 함량의 변화에 따라 앞서 마이크로입자에서 설명한 세포 지지체로서의 우수한 성능을 발휘할 뿐만 아니라, 이와 동시에 약물 전달체로서의 구별되는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자는, 내부의 Ca 함량이 증가할수록 마이크로입자의 기공 크기 및 기공 부피가 더 증가하며, 이와 동시에 내부에 탑재된 약물을 더 빠르게 방출하는 것으로 나타났다. 따라서, Ca 함량이 높은 마이크로입자는 큰 사이즈의 생체분자를 전달하는데 효과적이다. 즉, 예를 들어 골 형성 단백질과 같은 성장인자(직경 5>nm)의 경우, 본 발명에 따른 마이크로입자가 이러한 물질의 전달체로 사용됨에 적절할 수 있다. 하지만 반대로, 화학 약물과 같은 작은 크기의 분자를 탑재하고, 이를 전달하기 위해서는 Ca 함량을 줄인 마이크로입자를 사용함이 더 바람직할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 마이크로입자는 이의 내부의 Ca 함량을 조절함으로써, 전달하고자 하는 치료용 약물에 적합하도록 제어할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 탑재된 마이크로입자 상에 중간엽줄기세포(MSC)를 부착한 결과, MSC의 증식이 촉진된 것을 확인할 수 있었다(실험예 6). 이는 마이크로입자가 세포 증식을 위한 효과적인 3-D 지지체 구조를 제공할 뿐만 아니라, 내부에 탑재된 bFGF가 방출되어 표면에 부착된 MSC의 증식을 촉진시킨 결과이다.
본 발명의 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자의 제조방법에 있어서, 상기 제1단계 내지 제5단계는 앞서 설명한 마이크로입자의 제조방법과 동일하다.
단, 본 발명의 마이크로입자는 마이크로입자 내부에 치료용 약물이 탑재된 것으로, 상기 마이크로입자의 제조과정 중에 치료용 약물을 첨가함으로써 입자 내부에 이를 용이하게 함입시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 제6단계는 상기 제1단계 내지 제3단계 중 어느 한 단계 이후에 치료용 약물을 첨가하는 단계로서, 상기 제4단계에서 마이크로입자가 완전히 형성되기 이전에 치료용 약물을 용액 내에 첨가하여 최종적으로 입자 내부에 탑재하는 단계이다.
상기 제6단계의 치료용 약물은 생체적합성을 갖는 약물로서 체내 세포 및 손상 조직 부위에 치료학적인 효과를 줄 수 있는 물질일 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 치료용 약물은 성장인자, 스토크롬, 사이토카인, 호르몬, 유전자, 천연물, 합성신약 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 성장인자는 조직재생에 효과를 나타내는 bFGF(basic fibroblast growth factor), IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β1(transforming growth factor-beta 1), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor), PDGF, aFGF, FGF18, BMP7 및 BMP9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자일 수 있다. 상기 성장인자와 같이 상대적으로 큰 사이즈를 갖는 치료용 약물들은 마이크로입자 내의 Ca 함량을 높게 하여 이들의 방출 및 전달을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, bFGF를 탑재한 마이크로입자의 방출 분석을 실시한 결과, 35일이 넘는 기간 동안 지속적으로 0차 키네틱 방출 양상을 나타냄을 확인하였다(실험예 6). 나아가 입자로부터 bFGF 방출로 인해 입자 표면에 부착된 중간엽줄기세포(MSC)의 증식을 촉진시킴과 동시에 주변 세포로 지속적인 성장인자 서방출이 가능함을 확인하였다(실험예 7).
본 발명의 일 실시예에 있어서, cyt C(시토크롬 C)를 치료용 약물의 단백질 모델로 사용한 마이크로입자의 방출 패턴을 분석한 결과, 0차 키네틱 방출 양상을 나타냄을 확인하였다. 또한, 입자 내의 Ca 함량이 증가할수록 cyt C의 방출률도 증가하였는데, 이는 입자의 기공 크기가 커짐으로 인한 것도 있지만, 칼슘이 실리카-글라스 네트워크를 붕괴시키는 역할을 수행함으로써 입자 분해로 인해 방출률이 더 커진 것으로 판단된다(실험예 4).
상기 치료용 약물은 친수성 약물이 바람직하며, 본 발명의 마이크로입자의 치료학적 목적에 따라 적절한 약물을 내부에 탑재시킬 수 있다. 만약 상기 약물의 분자 사이즈가 작은 경우에는, 마이크로입자 내 Ca 함량을 작게 조절함으로써 약물의 방출률을 낮출 수 있으며, 이로써 보다 오랜 기간 동안 지속적인 약물 서방출 수행이 가능하다.
본 발명에 따른 세포 지지체용 마이크로입자, 치료용 약물과 세포의 동시 전달을 위한 마이크로입자 및 이들의 제조방법은 Ca 함량을 조절함으로써 기공 크기, 부피 및 표면적을 조절할 수 있는 중간 공극을 가지며, 표면에 생체활성 아파타이트 결정상을 형성할 수 있다. 이로써 생체적합한 세포 지지체로서 세포 증식을 촉진할 수 있다. 나아가 졸-겔 반응으로 제조됨으로써 조성물의 자체 경화로 마이크로입자를 수득할 수 있으며, 성장인자와 같은 생체 분자를 용이하게 탑재시킬 수 있고, 나아가 탑재된 분자들을 지속적으로 서방출할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로입자는 골 조직 공학에서의 치료학적 지지체로서, 치료용 약물인 단백질 분자 및 표면 증식된 줄기 세포를 표적 부위에 전달해 줄 수 있는 복합적 역할을 수행할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 SEM 이미지를 나타내고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 크기 분포에 대한 결과 그래프이고, 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 X-선 회절 분석(XRD) 결과를 나타낸 것이고, 및 도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 FTIR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 N2 흡착-탈착 등온선을 나타낸 것이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 기공 사이즈 분포를 나타낸 것이고, 및 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 Ca 포함 여부에 따른 다공성을 비교한 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 아파타이트 형성 능력의 결과를 나타낸 것이다. 도 3a는 본 발명의 비교예 1에 따른 마이크로입자의 SEM 이미지이고, 도 3b는 본 발명의 실시예 3에 따른 마이크로입자의 SEM 이미지이고, 도 3c는 본 발명의 비교예 1에 따른 마이크로입자의 XRD 패턴이고, 및 도 3d는 본 발명의 실시예 3에 따른 마이크로입자의 XRD 패턴이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 cyt C를 단백질 모델로한 방출 패턴 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 조골세포 배양 결과를 나타낸 것이다. 도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 세포 증식률을 나타낸 것이고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 SEM 이미지이고, 및 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 CLSM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에 따른 마이크로입자에 대한 레트 피하 조직 이식 후의 H&E-염색 이미지를 시계열적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자의 bFGF 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 MSC 증식에 대한 bFGF 방출 효과의 직접적인 분석 결과이다. 도 8a는 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자 및 bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자에 대한 CLSM 이미지를 나타낸 것이고, 도 8b는 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자 및 bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자에 대한 입자 상에 스프레드 되거나 그렇지 않은 세포들의 비율을 측정한 결과이고, 도 8c는 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자 및 bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자에 대한 세포 증식률을 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로입자의 MSC 증식에 대한 bFGF 방출 효과의 간접적인 분석 결과이다. 도 9a는 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자 및 bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자에 대하여 전-침지를 수행한 이후의 세포 증식률을 나타낸 것이고, 도 9b는 본 발명의 실시예 9에 따른 마이크로입자 및 bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자에 대한 CLSM 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예1 내지 3 및 비교예 1: 실리카 생체활성 글라스 마이크로입자의 제조
본 발명에 따른 실리카 생체활성 글라스(silica-based bioactive glass, SBG) 마이크로입자를 하기에 따른 방법으로 준비하였다.
탈이온수를 첨가하면서 테트라에틸 오르소실리케이트 (TEOS, C8H20O4Si, 98%, Sigma.Aldrich) 10ml를 0.1M HCl 2.4ml와 혼합함으로써 산촉매화된 졸(sol)을 형성하였다. 첨가된 물의 총량은 TEOS에 대한 몰비가 8이 되도록 하였다. 마이크로 입자에 칼슘 이온이 포함되도록 CaCl2(Sigma.Aldrich)를 상기 형성된 졸에 첨가하였다. 이때 마이크로입자에 도핑되는 칼슘이 0몰% 내지 30몰%가 되도록 CaCl2의 첨가량을 변경시켜가며 첨가하였다. 이와 같이 얻어진 졸을 수조(water bath) 내에서 4℃ 까지 냉각시켰다. 그 후 상기 졸을 교반하면서 0.08M NH4OH(Sigma.Aldrich)를 적가하여 첨가하였고, 졸의 pH는 5 내지 5.5로 조절되었다. 5ml의 졸에 올리브오일 100ml를 첨가하였고, 이를 95rpm으로 교반하면서 겔화시켰다. 겔화된 용액을 침전시켜 침전된 마이크로입자를 모으고, 이를 감압여과하고, 물 및 에탄올로 세척한 뒤, 하룻밤 동안 건조시켰다.
상기의 제조방법으로 수득된 마이크로입자의 Ca 및 Si 함량을 하기 표1에 나타내었다.
Ca Si
비교예1 0 100
실시예1 10 90
실시예2 20 80
실시예3 30 70
실시예 4 내지 6 및 비교예 2: Cyt C가 탑재된 마이크로입자의 제조
시토크롬 C (cyt C)가 탑재된 마이크로입자를 하기와 같이 준비하였다.
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 동일한 방법으로 마이크로입자를 준비하되, cyt C (Sigma.Aldrich)를 마이크로입자를 준비하는 과정 중에 첨가하여 입자 내부에 봉입시켰다. 이를 위하여, cyt C를 증류수 내에 용해시키고, 이이서 초기 졸에 2.14 mg(cyt C)/g(TEOS)의 비율로 첨가하여 혼합하였다. 졸-겔 반응이 종결된 후, cyt C가 탑재된 마이크로입자를 모으고 건조시켜 수득하였다.
실시예 7 내지 9 및 비교예 3: bFGF 가 탑재된 마이크로입자의 제조
염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 탑재된 마이크로입자를 하기와 같이 준비하였다. 상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 동일한 방법으로 마이크로입자를 준비하되, 초기 졸에 0.3 mg(bFGF)/g(TEOS)의 양으로 bFGF를 첨가하여 이를 입자 내부로 병합하였다.
상기 bFGF는 재조합 인간 bFGF를 사용하였으며, 아래와 같이 준비하였다.
bFGF의 cDNA를 성인 인간 cDNA 라이브러리에서 증폭시켰다. 유전자은행 서열(GeneBank 수납 번호 NM002006)에 따라, 한쌍의 프라이머 5'-CGAGATCTCAGCCGGGAGCATCAC-3' 및 5'-TGCAGATCTCGCTCTTAGCAGACATTG-3'을 사용하였다. PCR 생성물을 NH2-terminal 6X His tag을 이용하여 pBAD/His A(Invitrogen, Carlsbad, CA) 속으로 클로닝하였다. poly-His tag을 함유하는 재조합 bFGF 단백질을 변성 조건 하에서 Ni affinity 컬럼을 이용하여 정제하였다.
통계적 분석
본 발명의 하기 실험예에 있어서 데이터들을 평균 ±1 표준 편차로서 나타내었다. 통계적 분석은 일원 분산 분석을 사용하였고 유의성은 P<0.05로 정하였다.
실험예 1: 마이크로입자의 특성 분석
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에 따른 마이크로입자에 대하여 아래와 같은 방법으로 입자의 특성을 분석하였다.
상기 마이크로입자의 크기 분포를 laser diffraction granulometry (Malvern, APA5001SR)를 이용하여 분석하였다.
상기 마이크로입자의 기공 크기 분포 및 비표면적은 자동 표면적 및 기공 크기 분석기 Quadrasorb SI (Quantachrom Instruments)를 이용하여 측정하였다. 분석을 수행하기에 앞서 상기 마이크로입자들을 300℃ 진공분위기 하에서 12시간 동안 탈기하였다. 비표면적은 BET법(Brunauer.Emmett.Teller)을 따라 결정하였으며, 기공 크기 분포는 범밀도함수 이론을 바탕으로 하여 N2 흡착-탈착 등온선의 탈착 지점으로부터 결정되었다. 총 기공 부피는 최대 상대 압력에서의 흡착된 양(P/P0))에 따라 계산되었다.
마이크로입자의 형태와 크기를 관측하기 위하여 SEM 이미지를 촬영하였다(JEOL JSM-6510). 또한 이의 특성을 분석하기 위해 X-선 회절 분석(XRD)을 수행하였다. X-선을 40mA 및 40kV에서 발생시켰고, 데이터는 4 내지 45°의 회절각(2Θ)에서 스텝 사이즈 0.02° 및 스캐닝 속도를 5°/min으로 하여 얻었다. 마이크로입자 내 화학적 결합 상태를 FTIR (Varian 640-IR)을 이용해 분석하였다. 마이크로입자의 제타전위(ξ potential)는 Zetasizer Nano ZS laser Doppler electrophoresis 기기 (Malvern Instruments)를 이용하여 측정하였다. 제타전위의 측정은 25℃에서 20V/cm의 필드 세기로 5번 반복하여 측정하였고, 이를 평균±표준편차(n=5)로 계산하였다. 전기영동 이동도(U) 및 제타전위는 Helmholtz-Smoluchowski식에 따라 자동적으로 계산되었다. 상기 Helmholtz-Smoluchowski식은 아래와 같다.
ξ=Uη/ε (ξ: 제타전위, U: 전기영동 이동도, η: 점도, ε: 유전상수)
상기 마이크로입자의 SEM 이미지를 도 1a에 나타내었다. 상기 도 1a는 마이크로입자의 전형적인 SEM 형태를 나타내고 있다. 구 형태의 마이크로입자가 모든 조성(비교예 1: 0% Ca, 실시예 3: 30% Ca)에 대하여 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있다.
마이크로입자의 크기 분포에 대한 결과를 도 1b에 나타내었다. 상기 도 1b에 나타난 바와 같이, 마이크로입자의 사이즈 분포는 0% Ca(비교예 1)에서 30% Ca(실시예 1)로 갈수록 상당히 증가하고 있음을 확인할 수 있다. 구체적으로, 비교예 1(0% Ca)의 경우 ~200μm의 직경임에 반해, 실시예 3(30% Ca)의 경우 ~300μm까지 증가하였다. 이는 입자 내에 칼슘이 더 많이 포함될수록 입자의 크기가 증가함을 나타낸다.
X-선 회절 분석(XRD) 결과를 도 1c에 나타내었다. 상기 도 1c에 나타난 바와 같이, XRD 패턴은 모든 조성(실시예 1 내지 3 및 비교예 1)에 대하여 완전한 비정질 실리카 유리상임을 2Θ ~ 22°에서 보여주었다. 또한 칼슘이 포함됨과 함께 피크 강도가 조금 감소함을 보여주었으며, 이는 칼슘이 실리카 네트워크를 붕괴시킴으로 인한 환원된 실리카 유리질 구조에 기인한 것이다.
FTIR 분석 결과를 도 1d에 나타내었다. 도 1d에 나타난 바와 같이, FTIR 스팩트럼은 모든 조성(실시예 1 내지 3 및 비교예 1)에 대하여 실리카 기반의 글라스에 해당하는 전형적인 화학적 밴드를 나타내었다(478cm-1에서 Si-O-Si 구부림 진동, 819cm-1에서 Si-O-Si 비대칭 늘임 진동, 1103cm-1 및 1230cm-1에서 Si-O-Si 대칭 늘임 진동 및 971cm-1에서 Si-OH 늘임 진동). 3484cm-1에서 브로드 밴드는 O-H 늘림 진동에 할당된 것이고, 2888 및 2962 cm-1에서의 피크는 비대칭 및 대칭 C-H 늘임 진동에 관한 것이다. 처음 시약에 대한 반응 완결을 의미하는 메톡시 그룹에 관한 것은 나타나지 않았다.
졸-겔 반응으로 인하여, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1의 SBG 마이크로입자는 높은 수준의 중간기공(mesoporosity)을 갖는다.
다공성 특징을 도 2a에 나타난 N2 흡착-탈착 등온선 및 도 2b에 나타난 기공 사이즈 분포를 바탕으로 하여 평가하였다. 상기 마이크로입자의 N2 흡착-탈착 등온선은 히테리시스 루프를 보여주며, Ca를 함유하는 실시예 1 내지 3의 마이크로입자들은 다공성 물질에서 전형적으로 나타나는 타입 IV 등온선(IUPAC)을 보여주었다.
0% Ca인 비교예 1의 경우, 히테리시스 루프가 타입 I 등온선을 보인다. 기공 사이즈 분포는 조성에 따라 명백히 달라짐을 확인할 수 있다. 마이크로입자 내 칼슘 함량이 증가할수록 기공 사이즈는 증가한다. 비교예 1의 평균 기공 사이즈는 2.2nm이지만, 실시예 3의 평균 기공 사이즈는 6.3nm로 증가하였다. 이는 히테리시스 루프 거동의 차이가 기공 사이즈의 차이로도 반영된 것임을 알 수 있다.
실시예 1 내지 3 및 비교예 1의 마이크로입자의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적을 포함한 중간기공 특성을 아래의 표 2에 정리하였다.
기공 크기 BET 기공 부피 제타 전위
비교예1 2.2 713 0.34 -39.7
실시예1 4.7 493 0.35 -17.1
실시예2 5.1 364 0.40 -12.2
실시예3 6.3 418 0.53 -9.9
상기 결과는 칼슘의 포함이 기공 사이즈 및 비 기공 부피를 증가(비교예 1: 0.34cm3/g vs. 실시예 3: 0.53cm3/g)시킴과 동시에 이와 대응하여 비표면적이 감소(비교예 1: 713m2/g vs. 실시예 3: 417cm2/g)함을 보여준다. 즉 도 2c에 나타난바와 같이, 칼슘-함유 마이크로입자가 더 큰 기공 및 기공 부피를 가짐과 동시에 더 낮은 표면적을 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 상기 표 2에는 마이크로입자의 표면 전하 특성을 측정한 제타 전위가 나타나있다. 0% Ca인 비교예 1의 경우, 높은 음성값(-39 mV)을 나타내었고, 칼슘이 함유된 실시예 3으로 갈수록 이러한 음성값이 점점 줄어들었다(30% Ca: -9 mV). 이는 음성 전하를 띄는 실리카 네트워크가 Ca2+가 점점 포함되면서 중화되었기 때문이다.
실험예 2: 생체 외( in vitro ) 아파타이트( Apatite ) 형성 능력
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에 따른 마이크로입자의 생체 외 아파타이트 형성 능력과 관련하여, 유사생체용액(simulated body fluid, SBF) 내에서 입자 표면에 아파타이트가 형성되는지를 측정하여 분석하였다.
200μm 내지 500μm의 직경을 갖는 상기 마이크로입자 100mg을, 농축된 유사생체용액(2×SBF) 50ml에 침지하여 인큐베이트(incubate)하였다. 상기 유사생체용액을 50mM 트리스(TRIS) 및 45mM HCl을 이용하여 pH 7.4로 완충하였고, 37℃로 온도를 유지하였다. SBF에 3 내지 7일간 침지한 후 상기 마이크로입자를 용액에서 여과로 분리하고, 증류수로 세척하여 잔해를 제거하였다. 그 후 상기 마이크로입자 표면에 형성된 아파타이트를 XRD 및SEM을 이용하여 분석하였다.
SBF에 3일간 침지시켜가며 확인한 생체 외 아파타이트 형성 능력의 결과를 도 3에 나타내었다. 0% Ca인 비교예 1의 경우, 도 3a의 SEM 이미지에 나타난 바와 같이, 미네랄이 몇몇 부분에서 관찰되었으나, XRD 패턴(도 3c)에서 명확한 결정 상태를 나타내진 못하였다.
한편, 30% Ca인 실시예 3의 경우, 도 3b의 SEM 이미지에 나타난 바와 같이, 마이크로입자 표면에 미네랄이 완벽하게 덮여있음을 볼 수 있다. 도 3d에 나타난 XRD 패턴에서 확인할 수 있는바와 같이, 2Θ=32°에서 피크가 관측되었으며, 이는 아파타이트 결정상과 대응하는 것이다.
실험예 3: 생체 외( in vitro ) 단백질 및 시토크롬 C의 탑재 및 방출 실험
상기 실시예 4 내지 6 및 비교예 2에 따른 마이크로입자의 생물학적 분자 탑재용량 및 이의 서방적·지속적 방출 능력을 분석하였다. 생물학적 분자의 모델 단백질로는 생물학적 성장인자와 분자 크기 및 전하 특성이 유사한 시토크롬 C (cyt C)를 사용하였다.
방출 실험을 위하여, 상기 cyt C가 탑재된 마이크로입자 100mg을 24-웰 플레이트에 있어서 1 ml의 인산완충식염수(PBS)가 들어있는 각각의 웰에 적용하였다. 37℃에서 인큐베이션 한 뒤, 상층액을 기설정된 시간대에서 샘플로 채취하였고, 이를 408 nm의 UV 분광기를 이용하여 분석하였다. 각각의 시간대에서, PBS를 다음 인큐베이션 전에 다시 보충하였다. 이와 같은 방법으로 마이크로입자로부터 cyt C의 방출 프로파일을 6주 동안 관측하였다.
cyt C를 단백질 모델로 한 마이크로입자의 방출 패턴 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 실험 기간인 6주 동안 0% Ca(비교예2) 및 30% Ca(실시예 6)에서 모두 지속적인 cyt C 방출이 관측되었다. 이들은 거의 0차 키네틱 방출의 형태로 처음 7일간은 2% 가량 방출되었고, 42일 뒤에는 ~11%(비교예 2) 및 14%(실시예 6)가량 cyt C가 방출되었다. 이는 본 발명에 따른 마이크로입자가 단백질 분자를 오랜 기간 동안 지속적인 서방출로 전달할 수 있음을 나타낸다.
실험예 4: 마이크로입자 상의 세포 거동
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에 따른 마이크로입자에 있어서, 생체 외(in vitro) 배양 시 초기 조직 세포의 정착 및 이어지는 조직 세포의 증식 능력을 조사하였다. 대상 세포로는 전-조골세포 M3CT3-E1을 사용하였다. 2% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 소태아혈청의 보충과 함께 5% CO2를 함유하는 가습된 공기 분위기 하에서, 상기 세포를 α-MEM(minimal essential medium) 내에서 유지시켰다. 배양 배지는 매 이틀마다 교환하였다. 세포들이 컨플루언스(confluence)되었을 때, FBS로 불활성화 시킨 뒤 상기 세포들을 최소량의 trypsin.EDTA (Gibco)를 이용하여 분리하였다. 이어서 이를 부-배양(sub-culture)하거나 또는 다음 실험에 사용하였다.
약 40mg의 마이크로입자를 24-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 들어있는 트렌스웰 멤브레인 상에 단일층이 형성되도록 도포하였다. 이어서 각각의 웰 당 20,000개의 세포들을 상기 마이크로입자 위에 시딩하였다. 1, 3 및 7일이 지난 후, 세포의 숫자를 cell counting kit (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies)를 이용하여 측정하였다. 각각의 시간대에서, 배지를 200μl의 무혈청 배지로 교환하였고, 이어서 20μl의 CCK-8용액을 첨가하였다. 상기 시약을 2시간 동안 반응시켰고, 반응물을 450 nm에서 UV-vis 분광기를 이용하여 측정하였다.
세포의 형태는 SEM 및 공초점 주사 레이져 현미경(CLSM; LSM 510, Zeiss)을 이용하여 관측하였다. CLSM 관측에 있어서, 분자 프로브인 Alexa Fluor 546 복합된 Phalloidin 및 Prolong Gold antifade-DAPI 시약을 이용하여 형광신호를 시각화하였다.
위와 같은 방법을 통해 마이크로입자의 세포 지지체(scaffold)로서의 수용능력을 살펴보았으며, 구체적으로 마이크로입자 상에 조골세포를 배양한 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 도 5는 마이크로입자 상에서 7일간의 세포 증식을 CCK-8 시약을 이용하여 측정한 결과이다. 0% Ca(비교예 1) 및 30% Ca(실시예 3)의 두 마이크로입자 모두에 있어서 세포는 활발히 증식함을 볼 수 있었다. 처음 1일째에는 비슷한 세포 숫자가 마이크로입자 표면에 접착되어 있었다. 3일 후에는, 0% Ca(비교예 1)가 30% Ca(실시예 3)에 비해 다소 높은 세포증식을 나타내었지만, 7일 후에는 반대로 30% Ca(실시예 3)가 더욱 높은 세포 증식을 보여주었다. 도 5b(SEM 이미지) 및 도 5c(CLSM 이미지)에서 나타난 세포 성장의 양상을 보더라도 도 5a에 나타난 세포 증식률을 그대로 반영한 배양 결과가 나타남을 확인할 수 있었다. 상기 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 마이크로입자들은 3-D 지지체로서 세포를 잡아주고, 스프레드하고 및 증식할 수 있게 하는 효과적인 환경을 제공하며, 따라서 골 조직 공학에서의 캐리어로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5: 생체 내( In vivo ) 피하 이식
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에 따른 마이크로입자의 생체 내 조직반응을 레트의 피하 조직을 이용하여 간단하게 평가하였다. 실험에는 2주된 레트를 사용하였다.
레트를 케타민/자일라진을 주사하여 마취시켰다. 레트의 등 부위의 피부를 면도하고 소독하였다. 다음, 피부를 절개하고 비절개박리로 레트 척추로부터 측면으로 작은 주머니를 네 개 만들었다. 이와 같이 준비된 공간에 마이크로입자를 이식하고 절개부위를 봉합사로 봉합하였다.
레트가 회복한 뒤, 레트를 사육하였고, 수술 후 2주 뒤에 레트를 죽였다. 시간 경과에 따른 샘플을 확보하기 위해, 레트로부터 조직 구조체를 채취하여 이를 배양하였다. 표본을 10% 완충 중성 포르말린에 24시간 동안 침지하고, 점진적 고농도 에탄올(70, 80, 90, 95 및 100%)로 탈수하였다. 다음, 상기 표본을 이등분하여 파라핀 내에 넣었다. 이후 ~5μm의 두께로 연속적으로 자르고 이를 현미경용 슬라이드에 부착하였다. 조직 부분이 부착된 슬라이드를 탈파라핀화하고 자일렌 및 점진적 고농도 에탄올을 이용하여 수화시켰다. 다음 헤마톡실린-에오진(H&E)으로 염색하고 이를 광학 현미경으로 시각화하였다.
상기와 같이 마이크로입자의 생체 내 조직 적합성을 레트 피하 조직에 대해 살펴보았으며, 이식 후 2주가 지난 뒤, H&E-염색 이미지를 시계열적으로 살펴보았고, 이를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 마이크로입자는 많은 수의 섬유아세포를 불러모으고 주변 세포들을 통합해나갔으며, 동시에 염증 세포의 개수는 많지 않았다. 이로써 본 발명의 마이크로입자는 우수한 조직 적합성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 6: bFGF 의 탑재 및 전달 실험
상기 실시예 7 내지 9 및 비교예 3에 따른 마이크로입자의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)에 대한 탑재 및 전달 용량을 실험해보았다.
마이크로입자로부터 bFGF의 방출을 측정하기 위하여, 100mg의 마이크로입자를 24-웰 플레이트에 있어서 1ml의 PBS가 들어있는 각각의 웰에 넣었다. 기설정된 각각의 시간대에서 상측액을 모아 bFGF 효소면역측정법(ELISA, Perrotech)을 통하여 분석하였다. 방출 분석을 7주 동안 계속하였고, 각각의 시간대에서 PBS를 교환하였다.
상기 실험의 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 30% Ca 마이크로입자(실시예 9)의 bFGF 방출 프로파일을 나타낸 것이다. bFGF 방출은 실험 기간인 5주 동안 지속적으로 방출되었으며, 거의 0차 키네틱 방출 형태를 보여주었다. 7일 동안은 ~5%의 방출이 이루어졌고, 35일에선 ~20%의 방출이 이루어졌으며, 이는 그 이후에도 방출이 지속될 수 있음을 나타낸다.
실험예 7: 중간엽줄기세포에 대한 bFGF 방출의 생물학적 효과
상기 실시예 7 내지 9 및 비교예 3에 따른 마이크로입자의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 방출 효과를 레트 골수에서 유래한 중간엽줄기세포(MSC)에 대하여 검사해보았다.
MSC는 성체 레트(180.2g)의 대퇴골 및 경골로부터 수득하였다. 수득된 생성물을 원심분리하고, 상등액을 모아서 일반 배양 배지(10% 소태아혈청, 100U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM)가 담겨있는 배양 플라스크에 CO2를 함유하는 가습된 37℃ 공기 분위기 하에서 분산시켰다. 하루 동안 인큐베이션 한 뒤, 배지를 교환하고 세포가 컨플루언스(confluence)에 거의 도달할 때까지 배양하였다. 부배양(subculture)후에 일반 배양 조건 하에서 유지시키고, 추후 테스트를 위해 2 내지 3의 세포 계대배양을 사용하였다. MSC 증식에 대한 bFGF 방출 효과를 두 가지 다른 실험 세트로 평가하였다. 하나는 직접적 분석 및 다른 하나는 간접적 분석이다.
직접적 분석의 경우, 트렌스웰 멤브레인 내에 함유된 40mg의 마이크로입자(실시예 7 내지 9 및 비교예 3)를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 넣었고, 이어서 20,000 MSC들을 직접 마이크로입자 위에 시딩하였다. 세포들을 7일 동안 스타베이션(starvation) 배지(1% FBS) 내에서 배양하였다. 세포 생존능은 cell counting kit 분석(CCK-8 reagent)으로 측정하였다.
간접적 분석의 경우, 트렌스웰 멤브레인 내에 함유된 마이크로입자를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 시딩된 MSC와 상호작용 할 수 있도록 하였다. 구체적으로, 마이크로입자를 배양 배지에 14일 또는 21일 동안 연장하여 전-침지하였다. 이어서 배양 배지를 교환하고, MSC들이 6,000까지 증식한 이후 간접적으로 마이크로입자와 상호작용하도록 하였다. 추가적으로 5 또는 7일간 스타빙(starving) 조건에서 배양한 뒤, 세포 수를 CCK 분석으로 카운팅하였다. 세포 카운팅은 모든 실험에 대하여 세차례 수행되었다.
상기와 같은 실험을 통해 마이크로입자의 bFGF 방출이 MSC 증식을 자극하는 효과가 있는지 확인하였다. 구체적으로, bFGF가 탑재된 30% Ca 마이크로입자(실시예 9) 상에 시딩된 MSC를 CLSM을 통하여 각기 다른 배양 기간 동안 관찰한 결과를 도 8a에 나타내었다. 도 8a에 나타난 바와 같이, 상기 마이크로입자 상에서의 세포 배양은 더 높은 세포 골격 확장 및 입자 표면 덮임을 나타내었다. CLSM 이미지를 바탕으로 하여 입자 상에 스프레드 되거나 그렇지 않은 세포들의 비율을 측정하여 도 8b에 나타내었다. bFGF가 탑재되지 않은 마이크로입자의 경우에는 2일에서 스프레드 세포의 비율이 ~30%였고, 7일에서 ~55%가 되었다. 반면, bFGF가 탑재된 마이크로입자(실시예 9)에서는 2일에서 스프레드 세포 비율이 ~75%였고 7일에서는 90%가까이 증가하였다. 세포 퍼짐 거동뿐만 아니라 세포 증식률에 있어서도, 도 8c에 나타난 바와 같이 bFGF가 탑재된 마이크로입자는 그렇지 않은 마이크로입자에 비해 4일 및 7일에서 각각 현저한 차이를 나타내었다.
한편, 간접적인 분석에 있어서 bFGF 방출에 따른 MSC 반응을 살펴보았고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 트렌스웰 멤브레인 내에 함유된 마이크로입자는 웰에 시딩된 MSC와 분리되어 위치하였고, 방출된 bFGF 분자들이 MSC와 자유롭게 상호작용하였다.
마이크로입자를 연장하여 전-침지한 이후(각각 14일 또는 21일), MSC를 추가적으로 5일 또는 7일간 배양하였고, 이때 마이크로입자와 간접적으로 상호작용하도록 하였다. 도 9a에 나타난 바와 같이, 오랜 전-침지를 수행한 이후 모든 배양 조건에서 bFGF를 탑재한 마이크로입자에 대한 세포 증식이 상당히 촉진된 것으로 나타났다. 이는 bFGF의 지속적 서방출에 기인한 효과였다. 도 9b에 나타난 형광 이미지는 마이크로입자로부터 bFGF 방출에 의해 세포 골격이 보다 확장됨을 잘 보여주었다.

Claims (9)

  1. 하기의 단계를 포함하는 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자의 제조방법으로서,
    실리카 전구체를 산성용액 및 물과 혼합하여 졸(sol)을 형성하는 제1단계;
    Ca 전구체를 상기 제1단계에서 형성된 졸에 첨가하는 제2단계;
    염기성 용액을 첨가하여 pH를 5 내지 7로 조절하는 제3단계;
    식물성 오일을 첨가하고 교반하여 식물성 오일이 형성한 마이크로쉘 내부에서 겔화시켜 마이크로입자를 형성시키는 제4단계; 및
    상기 제4단계에서 겔화된 용액을 침전시켜 마이크로입자를 수득하는 제5단계를 포함하고,
    상기 마이크로입자는 실리카 글라스로 이루어지며 30 몰%의 Ca를 함유하고,
    상기 제1단계 내지 제3단계 중 어느 한 단계 이후에 약물을 첨가하되,
    상기 약물이 성장인자 또는 시토크롬이고,
    상기 마이크로입자는 10μm 내지 1000μm의 직경을 갖는 구(sphere)이고,
    상기 마이크로입자는 2nm 내지 10nm의 평균 기공 크기를 갖는 중간다공성(mesoporous)인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 유사생체용액 내에서 표면에 아파타이트 결정이 형성되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1단계의 실리카 전구체는 알킬 실리케이트(Si(OR)4)이며, 여기서 상기 R은 탄소수 1 내지 5의 알킬기인 것인, 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 Ca 전구체는 CaCl2, Ca(NO3)2, CaSO4, Ca-아세테이트, Ca-메톡시아세테이트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자의 제조방법.
  7. 제1항, 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고,
    실리카 글라스로 이루어지며 30 몰%의 Ca를 함유하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 마이크로입자는 내부에 약물을 포함하며,
    상기 약물은 마이크로입자로부터 지속적으로 서방출되며,
    상기 약물은 성장인자 또는 시토크롬인 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 세포 지지체 마이크로입자.
  9. 삭제
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