KR101638106B1

KR101638106B1 - 형광 가교 폴리(n-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 센서

Info

Publication number: KR101638106B1
Application number: KR1020140082353A
Authority: KR
Inventors: 이택승; 김용균
Original assignee: 충남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2016-07-11
Also published as: KR20160004038A

Abstract

본 발명은 플루오레세인과 로다민 형광 단량체를 고분자 주쇄에 포함하는 가교 PNIPAM 마이크로젤 및 이를 제조하는 방법이며, 이를 이용하여 글루코스의 선택적 감지 및 농도 분석에 관한 것이다. GOx에 의해 글루코스가 산화되는 정도에 따라 형광 단량체를 포함한 가교 PNIPAM 마이크로젤의 형광 변화에 의해 감지 및 분석한다. 이때, 여러 단당류 중에서 글루코스를 선택적으로 감지한다는 것과 수용액 상에서 육안으로 식별이 가능한 형광의 변화를 통해서 손쉽게 활용이 가능하다는 것을 특징으로 한다. 글루코스를 선택적으로 감지할 수 있는 새로운 재료를 이용하여 글루코스 뿐만 아니라 pH의 변화를 야기하는 물질에 대한 센서 재료로 응용이 가능하며, 기존 센서 재료의 민감성, 안전성을 보완할 수 있으며, 휴대성 및 응답성 등의 센서 기능에 필수적인 특성까지 모두 가지고 있다. 따라서 pH 변화를 지닌 여러 분야에서 센서 재료로서 적용될 수 있다.

Description

형광 가교 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 센서{Fluorescent Poly(N-isopropyl acrylamide) Microgel, method for preparing of the same and sensor including the same}

본 발명은 서로 다른 pH 감지 범위를 가지는 두 형광 물질을 가교된 친수성 고분자 마이크로젤에 도입한 구형의 마이크로젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 구형의 마이크로젤을 포함하며, 물에 강한 친화력을 갖는 화학센서 및 바이오센서용 재료의 제조방법과 이를 이용한 단당류의 정량 및 정성 분석에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 염기성 영역의 pH를 감지할 수 있는 플루오레세인(fluorescein) 단량체와 산성 영역의 pH를 감지할 수 있는 로다민(rhodamine) 단량체를 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드(N,N'-methylenebisacrylamide, 이하 MBAA), 친수성 단량체인 N-아이소프로필 아크릴아마이드(N-isopropyl acrylamide, 이하 NIPAM)와 공중합 시켜 친수성 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드)(Poly(N-isopropyl acrylamide), PNIPAM) 공중합체인 구형의 마이크로젤을 제조하고, 글루코스 산화효소인 글루코스 옥시데이즈(glucose oxidase, 이하 GOx)를 PNIPAM 마이크로젤 수용액에 녹여 도입한 글루코스(glucose)를 첨가하여 글루코스가 GOx에 의해 산화됨에 따라 생성되는 수소이온에 의한 수용액의 pH변화를 형광의 변화로 측정하여, 글루코스를 정량 및 정성 분석하는 새로운 방법에 관한 것이다.

최근 유기 형광물질을 이용한 화학센서의 사용이 두드러지고 있으며, 측정을 원하는 타겟 물질은 이온뿐만 아니라 분자와 같은 다양한 화학 종으로 구성된다. 유기 형광물질은 화학신호를 측정 가능한 광학적 신호로 신호변환이 가능하고, 특히 표적 물질과의 상호작용에 대한 응답으로 형광 신호를 발현할 때, 강도가 증가하거나 감소하는 특징을 가지고 있어, 예전부터 금속이온 및 음이온 감지, 폭발물 감지 등의 센서재료로 널리 사용되고 있다(Y. -K. Yang, S. Shim and J. Tae, Chem. Commun., 46, 7766-7768, 2010; C. Zhao, K. Qu, Y. Song, C. Xu, J. Ren and X. Qu, Chem. Eur. J., 16, 8147-8154, 2010).

외부의 물리적 또는 화학적 자극에 반응하여 구조 및 특성이 변하는 자극 감응형 고분자는 항공, 전자 분야뿐만 아니라 최근 들어 생체 재료 및 기술 분야에서 매우 흥미로운 재료로 지속적인 관심을 받고 있었다. 이러한 자극 감응형 고분자는 pH, 온도, 전기장 그리고 빛 등의 환경적인 요인에 변화를 줄 수 있는 자극에 의해 감응하여 체내 단백질 감지, 약물 및 유전 물질의 전달 등의 많은 생물학적 연구에 응용되고 있다(Y. Zhang and A. L. Yarin, J. Mater. Chem., 19, 4732-4739, 2009; K. Gawlitza, C. Wu, R. Georgieva, D. Wang, M. B. Ansorge-Schumacher and R. V. Klitzing, Phys. Chem. Chem. Phys., 14, 9594-9600, 2012).

외부의 자극에 의해 감응하는 고분자 물질에는 다양한 종류가 있다. 그 중에서 가장 많이 이용되는 물질은 PNIPAM이다. PNIPAM은 온도에 감응하는 고분자로서 많이 알려져 있으며, 온도가 높아지면 소수성이 증가하면서 분자쇄 간 간격이 줄어들어 수축하는 현상을 보이는 반면, 온도가 낮을때는 친수성이 증가하면서 분자쇄 간의 간격이 넓어져 팽창하는 현상을 보이는 물질이다. 이러한 특성을 가지는 PNIPAM은 다른 지지체 물질에 연결하기 위해 선형 고분자 형태로 사용하거나, 가교제를 이용하여 구형의 마이크로젤 형태로 사용된다. 선형 고분자 형태로 사용하는 경우는 다른 지지체 물질에 온도에 대한 특성을 부여하기 위해 사용하는 경우가 대부분이며, 구형의 마이크로젤 형태로 사용하는 경우는 PNIPAM 마이크로젤 자체가 지지체로서 역할을 하여 내부에 약물, DNA, 단백질, 센서물질 등을 넣어 약물 전달 물질, 화학센서, 바이오센서로서 많이 사용되어 왔다(L. Peng, M. You, Q. Yuan, C. Wu, D. Han, Y. Chen, Z. Zhong and W. Tan, J. Am. Chem. Soc., 134, 12302-12307, 2012; L. Tang, J. K. Jin, A. Qin, W. Z. Yuan, Y. Mao, J. Mei, J. Z. Sun and B. Z. Tang, Chem. Commun., 4974-4976, 2009 ).

인체는 주위환경이 변하면 체내의 여러 조직과 기관들이 상호 연관되어 조절함으로써 체내의 상태를 거의 일정하게 유지한다. 이러한 항상성에 의해 조직 세포는 온도, 압력, 산소, 성분, 농도 등 모든 조건을 일정하게 유지할 수 있게 된다. 항상성의 필요성은 세포 내 또는 체내 조건에만 제한되는 것이 아니라 단당류, 다당류, 효소, 호르몬 등 체내에 존재하는 대부분의 물질에서도 중요하다. 이러한 항상성의 파괴는 단백질 및 효소의 변성, 부적합한 세포의 기능 유발 등으로 인하여 종양, 알츠하이머 병 등과 같은 많은 질병에 영향을 미친다. 이러한 많은 이유로 인하여 병리학 분야에서는 체내 조건 및 물질 감지에 대한 중요성이 나날이 강조되고 있다(M. H. Lee, J. H. Han, J. H. Lee, N. Park, R. Kumar, C. Kang and J. S. Kim, Angew. Chem. Int. Ed., 52, 1-5, 2013; R. J. Youle, D. P. Narendra, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 12, 9-14, 2011).

탄수화물은 생명체가 활동을 하기 위해 꼭 필요한 에너지이며 인체에 흡수되는 과정에서 글루코스로 분해되어 근육세포나 간에 저장된다. 글루코스는 혈액을 통해 온몸의 근육에 근수축에 필요한 에너지를 공급해주는 에너지원으로 사용된다. 글루코스가 효소작용에 의해서 에너지원으로서 분해되는데, 최종적으로 TCA 회로를 거쳐서 물과 이산화탄소로 분해되고 ATP의 형태로 저장된다. 글루코스 1분자당 270 kcal의 에너지를 생성하는데, 이 에너지는 발효, 호흡 등 체내 필수적인 대사작용의 주에너지원으로 사용된다. 이러한 글루코스는 산소 존재 하에서GOx에 의해서 산화되어 글루코노락톤을 생성 하는데, 이 때 과산화수소가 생성되고, 과산화수소는 산화되어 산소와 수소이온을 내놓는다. 이러한 부가생성물을 이용한 감지와 글루코스와 선택적 작용을 하는 단백질을 이용하는 감지 방법 등 글루코스 감지에 대한 많은 연구들이 진행되어 왔다(J. C. Pickup, F. Hussain, N. D. Evans, O. J. Rolinski and D. J. S. Birch, Biosens. Bioelectron., 20, 2555-2565, 2005; N. S. Oliver, C. Toumazou, A. E. G. Cass and D. G. Johnston, Diabetic Med., 26, 197-210, 2009).

글루코스는 인체의 에너지원으로 매우 중요한 물질이기 때문에 체내 글루코스 수치의 확인 역시 중요하게 여겨져 왔다. 오래 전부터 체내 글루코스의 양을 확인 할 수 있는 글루코스 센서 물질과 이를 이용한 기기가 발전되어 왔다. 특히, 당뇨병 환자를 위해 글루코스 센서 물질이 많이 발전되었는데, 당뇨병 환자는 정상적인 사람에 비해 체내 글루코스 수치가 높기 때문에 정확한 양의 글루코스을 감지하는 것이 중요하다. 정상적인 사람의 혈액 내 글루코스 농도는 3.9 mM~7.8 mM이며, 오줌 내 글루코스 농도는 0~0.8 mM이다. 반면에 당뇨병 환자의 혈액 내 글루코스 농도는 10 mM~21.1 mM이며, 오줌 내 글루코스 농도는 1.0 mM~2.8 mM 이다. 이러한 당뇨병 환자와 정상적인 사람의 글루코스의 농도 범위 내에서 정확하고 빠르게 감지할 수 있는 센서 물질의 발명이 당뇨병 환자의 응급상황을 대비하기 위해서 필수적이다(E. A. Moschou, B. V. Sharma, S. K. Deo and S. Daunert, J. Fluoresc, 14, 535-547, 2004; R. Ahmad, N. Tripathy, J. H. Kim and Y. -B. Hahn, Sensor Actuat B-Chem, 174, 195-201, 2012).

분석대상 물질의 감지에는 수많은 방법들이 사용되지만, 최근들어 유기 형광물질을 사용해 자극에 대한 형광의 색, 강도의 변화를 통하여 간접적으로 측정하는 방법이 주로 사용된다. pH변화를 형광감지하는 대표적인 형광물질은 플루오레세인과 로다민이다. 이 두 물질은 높은 생체 적합성과 환경적인 변화에 따른 민감도가 높다는 장점을 가지고 있다. 중성 또는 염기성인 pH 환경에서 플루오레세인은 강한 녹색 형광을 나타내며, 이는 락탐 환이 열리면서 나타나는 현상이며, 산성 pH 환경에서는 급격하게 환이 닫히게 됨에 따라서 형광이 감소하게 된다. 반면, 로다민은 산성 pH 환경에서 강한 적색 형광을 나타내며, 이는 산성 pH 환경에서 락탐 환이 열리면서 나타나는 현상이며, 중성 및 염기성 pH에서는 환이 닫힘에 따라서 형광을 내지 않는다. 이러한 특징을 토대로 금속이온 감지, 세포 내 소기관 이미징, 암세포 이미징 등 많은 연구에서 플루오레세인과 로다민이 사용되어 왔다(J. Hu, X. Zhang, D. Wang, X. Hu, T. Liu, G. Zhang and S. Liu, J. Mater. Chem., 21, 19030-19038, 2011; M. Beija, C. A. M. Afonso and J. M. G. Martinho, Chem. Soc. Rev., 38, 2410-2433, 2009).

상기와 같은 자극 감응형 물질들을 통해 형광 변화에 의한 화학 감지 방법으로 pH를 감지하려는 노력이 저분자와 고분자 등의 여러 가지 물질로 다양하게 시도되었다. 본 발명에서는 pH 6에서 12까지 감지할 수 있는 플루오레세인 단위체와 pH 3에서 8까지 감지할 수 있는 로다민 단위체를 도입하여 넓은 범위의 pH를 감지할 수 있는 재료를 제조하였다. 여기에 GOx를 첨가해주고, GOx가 글루코스를 산화시켜 과산화수소가 생성되며, 이렇게 생성된 과산화수소가 산소의 존재 하에서 수소이온을 생성한다. 생성된 수소이온에 의해 pH환경이 달라짐에 따라서 플루오레세인과 로다민 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤의 형광 변화가 일어나 글루코스의 정량 및 정성 분석이 가능하다.

(비특허 문헌 1) Rhodamine-sugar based turn-on fluorescent probe for the detection of cysteine and homocysteine in water, Y. -K. Yang, S. Shim and J. Tae, Chem. Commun., 46, 7766-7768, 2010. (비특허 문헌 2) A Reusable DNA Single-Walled Carbon-Nanotube-Based Fluorescent Sensor for Highly Sensitive and Selective Detection of Ag+ and Cysteine in Aqueous Solutions, C. Zhao, K. Qu, Y. Song, C. Xu, J. Ren and X. Qu, Chem. Eur. J., 16, 8147-8154, 2010. (비특허 문헌 3) Stimuli-responsive copolymers of n-isopropyl acrylamide with enhanced longevity in water for micro- and nanofluidics, drug delivery and non-woven applications, Y. Zhang and A. L. Yarin, J. Mater. Chem., 19, 4732-4739, 2009. (비특허 문헌 4) Immobilization of lipase B within micron-sized poly-N-sopropylacrylamide hydrogel particles by solvent exchange, K. Gawlitza, C. Wu, R. Georgieva, D. Wang, M. B. Ansorge-Schumacher and R. V. Klitzing, Phys. Chem. Chem. Phys., 14, 9594-9600, 2012. (비특허 문헌 5) Macroscopic Volume Change of Dynamic Hydrogels Induced by Reversible DNA Hybridization, L. Peng, M. You, Q. Yuan, C. Wu, D. Han, Y. Chen, Z. Zhong and W. Tan, J. Am. Chem. Soc., 134, 12302-12307, 2012 (비특허 문헌 6) A fluorescent thermometer operating in aggregation-induced emission mechanism: probing thermal transitions of PNIPAM in water, L. Tang, J. K. Jin, A. Qin, W. Z. Yuan, Y. Mao, J. Mei, J. Z. Sun and B. Z. Tang, Chem. Commun., 4974-4976, 2009 (비특허 문헌 7) Two-Color Probe to Monitor a Wide Range of pH Values in Cells, M. H. Lee, J. H. Han, J. H. Lee, N. Park, R. Kumar, C. Kang and J. S. Kim, Angew. Chem. Int. Ed., 52, 1-5, 2013. (비특허 문헌 8) Mechanisms of mitophagy, R. J. Youle, D. P. Narendra, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 12, 9-14, 2011. (비특허 문헌 9) Fluorescence-based glucose sensors, J. C. Pickup, F. Hussain, N. D. Evans, O. J. Rolinski and D. J. S. Birch, Biosens. Bioelectron., 20, 2555-2565, 2005. (비특허 문헌 10) Glucose sensors: a review of current and emerging technolohy, N. S. Oliver, C. Toumazou, A. E. G. Cass and D. G. Johnston, Diabetic Med., 26, 197-210, 2009. (비특허 문헌 11) Fluorescence Glucose Detection: Advances Toward the Ideal In Vino Biosensor, E. A. Moschou, B. V. Sharma, S. K. Deo and S. Daunert, J. Fluoresc., 14, 535-547, 2004. (비특허 문헌 12) Highly selective wide linear-range detecting glucose biosensors based on aspect-ratio controlled ZnO nanorods directly grown on electrodes, R. Ahmad, N. Tripathy, J. H. Kim and Y. -B. Hahn, Sensor Actuat B-Chem, 174, 195-201, 2012. (비특허 문헌 13) Ultrasensitive ratiometric fluorescent pH and temperature probes constructed from dye-labeled thermoresponsive double hydrophilic block copolymers, J. Hu, X. Zhang, D. Wang, X. Hu, T. Liu, G. Zhang and S. Liu, J. Mater. Chem., 21, 19030-19038, 2011 . (비특허 문헌 14) Synthesis and applications of Rhodamine derivatives as fluorescent probes, M. Beija, C. A. M. Afonso and J. M. G. Martinho, Chem. Soc. Rev., 38, 2410-2433, 2009.

본 발명은 단당류 종류 중에서 글루코스를 정량 및 정성 분석을 가능하게 하는 센서 재료를 제조하기 위하여, pH 감응성을 지닌 형광 단량체를 포함하는 가교된 고분자 마이크로젤 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 형광 변화로써 글루코스에 대한 감지신호를 나타낼 수 있도록 GOx를 고분자 마이크로젤 수용액 상에서 처리하여, GOx에 의한 글루코스 산화의 부산물로서 수소 이온이 생성되도록 유도했으며, 생성된 수소 이온 때문에 일어나는 pH의 변화에 따른 고분자 마이크로젤의 형광 변화를 통해, 단당류 종류 중 선택적으로 글루코스를 감지할 수 있는 센서를 제공하는 것도 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되고, 플루오레세인 단량체와 로다민 형광 단량체가 공중합된 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, l, m, n, o의 값은 각 반복 단위의 조성을 몰분율로 나타낸 것으로서, l는 0.87 내지 0.98의 실수이고, m은 0.018내지 0.039의 실수이고, n은 0.001내지 0.009의 실수이고, o는 0.001내지 0.082의 실수이다.)

이때, 상기 마이크로젤은 200 내지 1200nm의 크기의 구형인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 플루오레세인 단량체와 로다민 단량체를 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드 및 친수성 단량체인 N-아이소프로필 아크릴아마이드와 공중합시켜 상기 화학식 1의 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 제조하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 포함하는 센서를 제공한다.

여기서, 상기 센서는 형광 광도계를 이용한 단당류의 정량 및 정성 분석용인 것이며, 상기 단당류는 글루코스인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 센서는 상기 글루코스가 글루코스 산화효소에 의해 산화됨에 따라 생성되는 수소 이온에 의한 수용액의 pH 변화를 형광의 변화로 측정하는 것을 특징으로 한다.

이상과 같이, 본 발명은 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 및 이를 제조하는 방법과, 이를 바탕으로 형광 변화 시스템을 통해 글루코스에 대한 마이크로젤의 형광 변화를 관찰하는 것이다. 산성 또는 염기성 조건 중에서 하나의 pH 조건에서만 의존성을 지닌 pH 센서물질은 감지 pH 범위가 한정적이라는 한계를 지니고 있다.

따라서, 상기와 같이 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤은 산성 또는 염기성 조건 중에서 하나의 pH 조건에서만 의존성을 지닌 pH 센서물질의 한계를 극복하기 위하여 로다민과 플루오레세인이라는 서로 다른 pH 감지 범위를 가진 두 가지 유기 형광물질을 하나의 고분자 쇄에 도입하여 제조되었다. 로다민은 pH 3 ~ 8, 플루오레세인은 pH 6 ~ 12까지의 범위를 각각 감지할 수 있다.

따라서, pH 감지 범위가 서로 다른 두 유기 형광물질을 이용하여 보다 넓은 범위의 pH를 다양한 형광색으로 나타낼 수 있다. 그리고 제조한 마이크로젤이 포함된 수용액상에서 GOx의 첨가만으로도 손쉽게 글루코스를 정량 및 정성 분석이 가능하다는 장점을 지니고 있다. 이러한 장점을 토대로 하여 센서로서의 잠재적인 기능과 더불어 응용분야를 더 넓힐 수 있다.

이를 바탕으로 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤을 이용하면 글루코스 감지에 국한되지 않고, pH의 변화를 일으키는 모든 물질에 대해 형광의 변화를 유도함으로써, 해당되는 물질을 정량 및 정성 분석하는데 이용할 수 있기 때문에 응용성이 뛰어난 센서 재료의 제조에 대하여 본 발명에서 제시하고자 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 마이크로젤 및 이의 제조방법

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 마이크로젤은, PNIPAM 주쇄에 플루오레세인과 로다민 유도체를 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 마이크로젤의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 5,000 내지 15,000인 것이 바람직하다.

또한, 상기 마이크로젤은 n과 m이 비율 조절로 인하여 200 내지 1200nm의 크기의 구형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 마이크로젤의 제조방법은 특별히 한정되지 않으나, 단량체와 가교제의 비율을 조절하여 다양한 크기와 조성비의 마이크로젤을 제조할 수 있다.

상기 화학식 1의 플루오레세인 단위와 로다민 단위를 갖는 가교 공중합체 형태의 고분자 화합물은 여러 가지 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상기 화합물의 제조방법에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 제조예에서는 플루오레세인과 로다민 유도체를 조성 몰분율을 다르게 하여 NIPAM 단량체와 가교제와 함께 라디칼 중합에 의해 제조하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일례에 따르면, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 마이크로젤은 플루오레세인 단량체와 로다민 단량체를 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드 및 친수성 단량체인 N-아이소프로필 아크릴아마이드와 공중합시켜 제조될 수 있다.

2. 센서

본 발명은 상기 마이크로젤을 포함하는 센서를 제공한다.

본 발명의 센서는 형광 광도계를 이용한 단당류의 정량 및 정성 분석용으로, 상기 단당류는 글루코스인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 센서 및 이의 검출방법을 설명하면 하기와 같다.

먼저, 가교 PNIPAM 마이크로젤에 글루코스 산화효소(GOx)를 도입하고 글루코스를 첨가하게 되면, 글루코스가 GOx에 의해서 산화되면서 글루코노락톤과 과산화수소를 형성하게 되고, 과산화수소에 의해 생성된 수소이온이 일으키는 pH변화에 따른 형광 변화를 감지하여 글루코스의 농도를 분석할 수 있다.

이와 같은 본 발명의 센서는 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤이 분산된 수용액에서 pH에 대한 감지능력을 확인할 수 있으며, GOx를 첨가하여 글루코스를 간편하고 손쉽게 감지할 수 있는 센서로서 유용하다. 또한, 상기 글루코스의 선택적 형광 감지 방법은 형광 광도계를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 한다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 제조예 및 실시예에서 사용한 NIPAM, 플루오레세인 그리고 로다민의 공중합 비율은 고정된 것이 아니며 NIPAM, 가교 단량체, 플루오레세인 단량체, 로다민 단량체가 같은 분자쇄에 존재하는 고분자 화합물이면 가능하다.

[제조예 1] 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤의 제조

N-아이소프로필 아크릴아마이드 2.25 g (19.88 mmol)과 MBAA 0.03 g (0.19 mmol), 플루오레세인 O-메타크릴레이트 0.01 g (0.025 mmol), 로다민 B 에틸 메타크릴아마이드 0.138 g (0.25 mmol), 그리고 소듐도데실설페이트 0.73 g (2.53 mmol)를 습기가 제거된 35 mL의 N,N'-다이메틸포름아마이드와 55 mL의 증류수에 용해시키고 교반하면서 70 ℃로 승온시켰다. 70 ℃에 도달하면 암모늄퍼설페이트 0.64g (2.8 mmol)를 10 mL의 증류수에 용해시켜 넣은 후 4시간 동안 교반 가열한다. 반응 후 상온으로 냉각하고 과량의 증류수에 부어 수세한다. 20분 수세 후 14000 rpm으로 원심분리 후 회수하여 다시 증류수에서 수세한다. 수세 후 다시 원심분리 후 회수하여 플루오레세인과 로다민 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤을 얻었다.

FT-IR (cm^-1): 3437 (O-H), 3300 (N-H), 3076 (sp² C-H), 2972 (sp³ C-H), 1649 (C=O), 1367 (C-N), 1128 (C-O).

[응용예] 글루코스 센서로서 감지 성능평가

[응용예 1] 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤의 pH에 대한 감응 평가

제조예 1에 의하여 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤의 pH에 대한 응답성을 확인하기 위하여, 증류수 10 mL에 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 16.4 mg을 분산시켜 pH의 변화에 따른 형광의 변화를 자외선 분광기와 형광 광도계를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 제조예 1의 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤이 분산된 수용액의 pH의 변화에 따른 흡수 파장 및 형광 변화를 자외선 분광기와 형광 광도계를 이용하여 측정하였다.

자외선 분광기에 의한 흡수 파장을 측정한 결과, 산성 pH 조건하에서는 563 nm에서 최대흡수 파장을 가지고, 염기성 pH 조건하에서는 491 nm에서 최대흡수 파장을 가진다. 형광 광도계에 의한 형광을 측정한 결과, 산성 pH 조건하에서는 514 nm에서의 녹색 형광이 감소하는 동시에 586 nm에서의 적색 형광이 증가하고, 염기성 pH 조건하에서는 514 nm에서의 녹색 형광이 증가하는 동시에 586 nm에서의 적색 형광이 감소함을 확인할 수 있었다.

형광 광도계를 이용하여 측정한 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액의 pH 범위는 pH 3에서 pH 12까지 측정하였다. 그리고 pH에 대한 가역성을 확인하기 위해서 하나의 표본에서 pH 조절을 하였다.

형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액의 pH를 pH 4와 pH 12로 교대로 조절하면서 형광을 측정한 결과, pH 4일 때는 586 nm에서의 적색 형광의 증가와 동시에 514 nm에서의 녹색 형광의 감소를 측정했고, pH 12일 때는 514 nm에서의 녹색 형광의 증가와 동시에 586 nm에서의 적색 형광의 감소를 측정함으로써 pH에 대한 가역성을 확인하였다. 제조된 가교 마이크로젤을 입도 분석기와 전자 현미경을 사용하여 크기와 형태를 측정했을 때, 약 683 nm의 크기이며 구형의 마이크로젤이 형성된 것을 확인하였다.

[응용예 2] 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤을 이용한 글루코스 감지

제조예 1에 의하여 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 4.92 mg을 증류수 3 mL에 분산시킨 후, GOx 10 mg을 첨가하여 1시간 교반 후 pH 및 형광의 변화를 pH 미터기와 형광 광도계를 이용하여 측정하였다. 그 결과, GOx가 포함된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액의 pH는 6에서 7사이의 값을 나타내고, 491 nm에서 여기하였을 때, 514 nm와 586 nm의 파장에서 비슷한 강도의 형광을 확인할 수 있었다.

GOx가 포함된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액에 각각 1 μM부터 100 mM까지의 글루코스 수용액 10 μL씩 첨가하여 형광의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 글루코스가 GOx에 의하여 산화됨에 따라서 발생하는 수소 이온에 의하여 GOx가 포함된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액의 형광이 주황색으로 변하는 것을 육안으로 식별이 가능했으며, 형광 광도계로 측정한 결과, 글루코스의 농도가 증가함에 따라서 514 nm 파장에서의 형광 강도가 최대 84 %만큼 감소하면서 동시에 586 nm 파장에서의 형광 강도가 최대 220 %만큼 증가했으며 검출한계는 3.09 x 10^-5 mM 이다.

[응용예 3] 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤을 이용하여 글루코스에 대한 선택적 감지 성능 평가

제조예 1에 의해서 제조된 형광 단량체가 공중합된 PNIPAM 마이크로젤의 글루코스에 대한 선택성을 확인하기 위하여 글루코스 대신 글루코스와 구조가 유사한 다른 단당류인 갈락토스(galactose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose)를 같은 몰농도로 사용하였다. 제조예 1에 의하여 제조된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 4.92 mg을 증류수 3 mL에 분산시킨 후, GOx 10 mg을 첨가하여 1시간 교반 후 pH 및 형광의 변화를 pH 미터기와 형광 광도계를 이용하여 측정하였다. 그 결과, GOx가 포함된 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤 수용액의 pH는 6에서 7사이의 값을 나타내고, 491 nm에서 여기하였을 때, 514 nm와 586 nm의 파장에서 비슷한 강도의 형광을 확인할 수 있었다. 여기에 각각 갈락토스, 프록토스, 만노스 수용액 10 μL씩 첨가에 의하여 514 nm와 586 nm의 파장에서 형광 강도의 변화가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이것으로 구조가 유사한 다른 단당류가 본 발명에서 사용된 시스템에 상호작용이 없음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 형광 단량체가 공중합된 가교 PNIPAM 마이크로젤과 GOx를 혼합한 수용액은 글루코스의 존재와 농도에 따라 형광세기의 변화가 나타나며, 글루코스에 대하여 선택적인 화학 센서로 이용될 수 있음을 확인하였다.

Claims

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플루오레세인 단량체와 로다민 단량체를 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드 및 친수성 단량체인 N-아이소프로필 아크릴아마이드와 공중합시켜 200 내지 1200nm의 크기의 구형이며,
pH 4일 때 586 nm에서의 적색 형광의 증가와 동시에 514 nm에서의 녹색 형광의 감소를 측정되고, pH 12일 때는 514 nm에서의 녹색 형광의 증가와 동시에 586 nm에서의 적색 형광의 감소를 측정되는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 제조하는 방법.
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, l, m, n, o의 값은 각 반복 단위의 조성을 몰분율로 나타낸 것으로서, l는 0.87 내지 0.98의 실수이고, m은 0.018내지 0.039의 실수이고, n은 0.001내지 0.009의 실수이고, o는 0.001내지 0.082의 실수이다.)
제3항의 제조방법으로 제조된 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드) 마이크로젤을 포함하는 센서에 있어서,
상기 센서는 형광 광도계를 이용한 단당류의 정량 및 정성 분석용이며,
상기 단당류는 글루코스이고,
상기 글루코스가 글루코스 산화효소에 의해 산화됨에 따라 생성되는 수소 이온에 의한 수용액의 pH 변화를 형광의 변화로 측정하며,
514 nm 파장에서의 형광 강도가 84 % 감소하면서 동시에 586 nm 파장에서의 형광 강도가 220 % 증가하며 검출한계는 3.09 x 10^-5 mM인 것을 특징으로 하는 센서.
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