New! View global litigation for patent families

KR101632756B1 - Method for assessing cultured cell - Google Patents

Method for assessing cultured cell Download PDF

Info

Publication number
KR101632756B1
KR101632756B1 KR20107014637A KR20107014637A KR101632756B1 KR 101632756 B1 KR101632756 B1 KR 101632756B1 KR 20107014637 A KR20107014637 A KR 20107014637A KR 20107014637 A KR20107014637 A KR 20107014637A KR 101632756 B1 KR101632756 B1 KR 101632756B1
Authority
KR
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
method
assessing
cultured
cell
assessing cultured
Prior art date
Application number
KR20107014637A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20110116965A (en )
Inventor
히데아키 가가미
히데키 아가타
유스케 호리
사토시 오시마
Original Assignee
고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
가부시키가이샤 티이에스 홀딩스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by the preceding groups
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914Hydrolases (3)
    • G01N2333/916Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Abstract

본 발명은 개체에 의한 편차가 있으므로 일정한 기준으로는 판단이 곤란했던 배양 세포의 종류 및 기능을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 예를 들면 골형성능을 평가하는 방법을 제공한다. Since the present invention is a variation of the constant reference object provides a method for assessing, for example, bone formation performance relates to a method of evaluating the type and function of cultured cells which determines the difficulty. 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법은, 배양 세포로부터 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해, 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들의 조합에 의해 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하기 위한 평가 방법으로서, 각각의 검사값에 대하여 일정의 적합한 범위를 지정할 뿐만 아니라 적응 범위에서 벗어난 샘플이라도 다른 검사값 또는 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포인 것을 판정 가능한 것을 특징으로 한다. Evaluation of the cell culture method according to the invention, in order to determine the cells of interest from the cell culture, and measure a plurality of test values ​​or an index of cultured cells, predicting the function of precisely cells by a combination of both, is determined as an evaluation method for, characterized in that determining that the only possible to specify a suitable range of the predetermined value for each test sample, not for the purpose by any reference to the other test values ​​or index out of the range cell adaptation.

Description

배양 세포의 평가 방법{METHOD FOR ASSESSING CULTURED CELL} Evaluation of cultured cells {METHOD FOR ASSESSING CULTURED CELL}

본 발명은 배양 세포의 평가 방법에 있어서, 특히 배양된 골형성성 세포(骨形成性 細胞)의 새로운 평가 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel evaluation method in the evaluation method for culturing cells, especially bone-forming cells (骨 形成 性 細胞) culture.

결손된 생체 조직의 재생을 도모하는 재생 의료의 실현이 요구되고 있다. To promote the regeneration of a defective tissue in vivo can be realized in the health care is required. 재생 의료는 본래 생체가 갖고 있는 치유 능력으로는 회복할 수 없게 된 생체 조직을, 세포, 생체 재료, 세포 성장 인자를 사용하여, 원래의 조직과 동일한 형태나 기능을 만들어내는 의료 기술이다. Regenerative Medicine is a healing ability that has the original biometric is that using a biological tissue can not be recovered, cells, biomaterials, cell growth factors, produce the same form and function as the original organization of medical technology.

재생 의료에는 일반적으로 간엽계 간세포(mesenchymal stem cell, 間葉系 幹細胞)가 이용되고 있다. Regenerative medicine has generally been used a mesenchymal stem cell (mesenchymal stem cell, 間 葉 系 幹 細胞). 이 간엽계 간세포는 지방 세포나 골아세포 등의 여러 가지 세포로 분화 유도할 수 있는 것이 알려져 있지만, 수득된 세포가 목적으로 하는 기능을 갖고 있는지 여부를 사전에 판단하는 것은 곤란했다. The mesenchymal stem cells is to judge whether it is known that can be induced to differentiate into various cells such as fat cells and osteoblasts, has the function of the cells obtained in advance was difficult objective.

또한, 골의 재생 의료에서도 골수 유래의 간엽계 간세포가 중심으로 이용되고, 그 외 지방 유래 간세포, 골막 유래 간세포, 활막 유래 간세포 등의 보고가 있다. Also in bone regenerative medicine is derived mesenchymal stem cells in the bone marrow is used as the center, there are reports of such other fat-derived stem cells, periosteum-derived stem cells, synovial derived stem cells. 그 중에서도 골수 유래의 간엽계 간세포 또는 골수 간질 세포는, 채취가 비교적 용이하고 매우 높은 골형성능을 갖기 때문에, 현재 거의 모든 골 재생의 임상 응용에 이용되고 있다. Among the bone marrow mesenchymal stem cells or bone marrow-derived stromal cells, because harvesting is relatively easy to have a very high performance bone, it has been used in clinical applications of the current nearly every bone.

그러나 이제까지의 본 발명자들의 보고에서, 사람 유래의 골형성성 세포에서는 세포의 개체 차가 큰 것이 명확해졌다. But so far reported by the inventors of bone formation in human-derived cells in Castle became clear that the object of cells big difference. 또한 골형성능은 배양에 의해 빠르게 손실되는 것이 명확해졌다. In addition, bone formation performance has become clear that rapidly lost by the culture. 따라서 실제로 이식하는 세포가 골형성능을 갖는지 여부의 검토는 중요하지만, 이제까지 보고되어 있는 방법으로는 충분하지 않은 것으로 판명되었다. Therefore, the actual examination of whether the transplanted cells, bone formation has the performance is important, however, proved to be not enough in a way that is ever reported. 특히 종래에는 세포의 알칼리 포스파타제 활성(ALP 활성)(특허문헌 1), 골계 마커의 유전자 발현(비특허문헌 1) 등이 이용되고 있다. In particular, the prior art cell has been used, such as the alkaline phosphatase activity (ALP activity) (Patent Document 1), the gene expression of golgye marker (Non-Patent Document 1). ALP 활성은 골형성성 세포에 유용한 평가이지만, 그것만으로는 골형성성 세포를 정의하는 것은 곤란하다. ALP activity is a useful assessment of bone-forming cells, as it only is it difficult to define the bone-forming cells. 또한 골계 마커의 유전자 발현도 유용한 평가이지만, 본 발명자들의 연구 결과에서는 발현에 개체 차가 커서, 평가로서 이용할 경우에는 곤란한 경우도 인식되었다. In addition, but also useful for evaluating gene expression golgye marker, was also recognized as an evaluation is difficult when used in the study of the present inventors large individual differences in the expression. 특히 개체 차가 큰 사람 유래 세포의 평가를 위해서는, 하나의 기준으로는 충분하지 않고, 복수의 평가법을 조합하여 신뢰성을 높이는 것이 중요하다고 생각되지만, 이와 같은 평가법은 이제까지 보고되어 있지 않다. In particular, the car object to the evaluation of a large human-derived cells, as one of the criteria is not sufficient, by combining a plurality of evaluation that, but I think it is important to increase the reliability, such evaluation has not been reported so far.

골형성성 세포라는 것은 골아세포 등의 골 형성에 필수인 세포라고 정의하지만, 여기서는 특히 이소성(異所性)으로 골 형성을 할 수 있는 세포를 골형성성 세포라고 정의하고 있다. It is called bone-forming cell is defined as a cell required in bone formation such as osteoblasts, but in this case is defined as a particular ectopic (異 所 性) to the osteogenic bone-forming cells, the cells in the. 이소성이라는 것은, 본래 골이 없는 부분에서 골을 형성할 수 있는 능력이다. It is called ectopic, the ability to form bone in part without the original goal. 이소성의 골형성능은 예를 들면 사람 세포를 유지하는 담체와 함께 면역부전(免疫不全) 동물의 피하로 이식하는 것에 의해 검증된다. Ectopic bone formation performance of, for example, immunodeficiency (免疫 不全) with a carrier for holding the human cell is verified by implanted subcutaneously in the animal. 실제로 골 재생이 기대되는 부위는 골의 근방이지만, 골이 없는 부분을 향해 골 재생을 실시할 필요가 있으므로, 본래 골 재생에 필요해지는 능력은 이 이소성의 골형성능이 가장 적절한 평가법이라고 생각된다. But in fact the bone area is expected near the goal, it is necessary to perform bone towards the area do not have goals, becoming the ability required for the original bone is considered the most appropriate evaluation of the performance of ectopic bone formation. 그러나 이제까지 이와 같은 관점에서 제작된 세포의 평가 방법은 없다. But so far there is no evaluation of the cells produced in this same perspective.

일본 공개특허공보 제2005-58225호 Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2005-58225 No.

즉 이식에 의해 골 형성을 실시하기 위해서는, 도 1에 도시한 공정을 거친다. That is to conduct bone formation by implantation, subjected to the step shown in FIG. 도 1에 도시한 바와 같이, 이식 재료, 예를 들면 의사 골과립(擬似 骨顆粒)과 함께 골형성성 세포를 공존시켜 이식 부위에서 파골 세포에 의해 의사 골과립을 분해시키고, 한편 골아세포 등에 의해 진성골(眞性骨)을 재생시킨다. 1, the implant material, for example a doctor bone granules to co-exist with bone-forming cells with (擬 似 骨 顆粒) and decomposing the doctor bone granules by osteoclasts in the implant site, the other hand by the osteoblast play the intrinsic goals (眞 性骨). 이때 이식 재료중에서의 골형성성 세포의 수는 물론 중요한 인자이지만, 한편 적정한 골형성능이 유지되어 있는 것이 중요하다. At this time, although the number of bone-forming cells from the transplanted material, as well as an important factor, while it is important that a proper bone formation performance is maintained. 만약에 이들 골형성성 세포의 수가 적거나, 또는 골형성능이 열화된 세포를 이용한 경우에는 적정한 골 형성은 실시되지 않지만, 실제의 골 형성의 확인에는 상당히 장기간이 필요해진다. If in using these bone-forming or fewer, or bone cell performance is deteriorated in the cells is not performed is adequate bone formation, it is confirmed in the actual bone formation requires a considerably long period of time. 만약에 골 형성이 적정하게 실시되어 있지 않은 경우에는, 다시 간엽계 간세포의 채취, 배양부터 이식 수술, 재생 확인을 실시하지 않으면 안되고, 수개월의 기간을 쓸데없이 낭비하게 될 뿐만 아니라 이식 수술 등의 환자에게 부담을 주는 처치를 반복하게 된다. If the do not have the bone formation is carried out properly, the re-sampling of mesenchymal stem cells, if you do not perform transplants, play confirmed from cultures devised, as well as a waste of a period of many months needlessly patients such as transplant It is to repeat the treatment that burden. 따라서 배양 세포의 기능을 적절하게 평가하는 것이 중요하다. Therefore, it is important to properly evaluate the function of the cultured cells.

한편, 세포의 배양 중에 골형성능의 판정을 실시할 때에도, 분화 유도중의 검사에 대해서는 필요한 시간도 수주일이 걸리므로 용이하게 반복할 수 없다. On the other hand, even when subjected to the determination of bone formation performance during the culturing of cells, it can not be easily repeated with the also takes the time required for the inspection of the week of the differentiation induction.

그러나 종래 실시되었던 목적으로 하는 세포, 예를 들면 골형성성 세포인지 여부의 평가는 전술한 바와 같이 단일 판정 수법에 의해 실시되고, 평가 기준을 올리면 이식 후의 재생률은 어느 정도 높아지지만, 본래 사용 가능했던 배양 세포를 부적절하다고 판정할 수 있는 것으로 생각되며, 한편 평가 기준을 낮추면 골형성 불능의 배양 세포를 이식에 이용하게 된다. However, for cells, for example, for the purpose of which was conventionally carried out the evaluation of whether the bone-forming cells is carried out by a single determination method as described above, raising the evaluation reference refresh rate after transplantation was higher to some extent, but the original available It is thought to be capable of determining that the cultured cells inappropriate, it becomes on the other hand lower the evaluation criteria used to culture cells of the bone formation in transplantation impossible. 또한 본 발명자들의 연구에 의해, 사람 세포에서는 거의 모든 검사값에 개체간의 편차가 크고, 일정한 기준값만으로 또는 단일 판정 기준만으로는 정확한 판단이 곤란하고, 현실적인 판정조차 곤란한 것이 명확해졌다. Further research by the present inventors, human cells in almost every test the deviation value between the large object, a single or only a certain reference value determined based on an accurate determination difficult alone, and has become clear that even realistic determination difficult.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 실시된 것으로서, 목적으로 하는 세포임을 판정할 수 있고 신뢰할 수 있는 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a evaluation method as in the embodiment in view of the above problems, can be determined that the cell for the purpose of a reliable. 본 발명에 따른 평가 방법은 골형성성 세포에 대해 적합하게 사용할 수 있지만, 사람 세포가 가진 편차의 문제는 골형성성 세포 이외에도 널리 재생 의료나 세포 치료의 대상이 되는 많은 세포에 공통적인 문제라고 생각된다. Can be used to evaluate the method according to the invention are suitable for bone-forming cells, the problem of deviations human cells with the idea that a common problem in many cells, which are the subject of widespread regenerative medicine and cell therapy in addition to bone-forming cells do. 따라서 본 발명의 효과는 골형성성 세포 뿐만 아니라 널리 사람 세포를 이용한 세포 치료에 있어서, 수득된 세포가 목적으로 하는 세포인지 여부, 그리고 치료에 필요한 기능을 갖고 있는지 여부에 대한 유효한 평가 방법을 제공하는 것이다. Thus, in effect the cell therapy using, as well as bone forming cells widely human cells of the invention, whether according to the obtained cell target cell, and if it has the functionality necessary for the treatment to provide a valid assessment of whether will be.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들이 예의 연구를 실시한 결과, 배양 세포에서 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해, 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들을 조합함으로써 신뢰할 수 있는 평가 방법을 작성할 수 있는 것을 발견했다. Conducted by the present inventors intensively studied to solve the above problem results, in order to determine the cells of interest in cell culture, and measure a plurality of test values ​​or an index of cultured cells, to write the evaluation reliable way by a combination of these It can be found at. 또한, 골형성성 세포(골형성 (+)세포)에 대해서는, 도 2에 도시한 골형성능 검사 수법을 개발하여 이식 후에 골형성이 적정하게 실시되는지 여부의 예측, 평가를 이식 수술 전에 적정하고 또 정밀하게 실시함으로써 유용한 골형성성 세포의 평가 방법을 작성할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. In addition, the bone-forming cells (bone formation (+) cells) to about, even prediction of whether or not to develop bone formation performance test method shown in the second embodiment to the bone formation proper after transplantation, appropriate and also an evaluation before transplantation by precisely performed by finding that can create a useful assessment of bone-forming cells, thus completing the present invention.

즉, 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법은, 배양 세포에서 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들의 조합에 의해 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하기 위한 평가 방법으로서, That is, the evaluation method for culturing cells according to the invention, in order to determine the cells of interest in cultured cells and measuring a plurality of test values ​​or an index of cultured cells, predicting the function of cells precisely by the combination thereof, as an evaluation method for determining,

각각의 검사값에 대하여 일정의 적합한 범위를 지정할 뿐만 아니라 적응 범위에서 벗어난 샘플이라도 다른 검사값 또는 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포임을 판정할 수 있는 것을 특징으로 한다. Only specify the preferred range of predetermined values ​​for each test sample as reference to any other check value or index out of the range of adjustment is characterized in that it can be determined that the cell of interest by.

또한, 본 발명의 배양된 골형성성 세포의 평가 방법은 1차 판정 기준, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 가진 배양 세포의 평가 방법에 있어서, In addition, the evaluation of cultured bone-forming cells, methods of the present invention, in the evaluation method of the cultured cells with the first criterion, the second judgment criterion, and the third criterion,

1차 판정을 실시한 세포를, 추가로 2차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하고, By the cells subjected to the first determination, the second embodiment is determined in addition to determining the bone formation (+) cells,

골형성 (+)세포인지의 여부를 판단하기 어려운 세포를, 추가로 3차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하는 것을 특징으로 한다. Bone formation (+) cells is difficult to determine whether the cells, characterized in that for determining the additional tertiary By performing the determination of bone formation (+) cells.

상기 1차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성(알칼리 포스파타제 활성), ALP 인덱스(분화 유도군의 ALP 활성값÷비분화 유도군의 ALP 활성값) 및 세포 증식능(분화 유도 후의 세포수÷초기 파종 세포수)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 1차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부인 것이 바람직하다. In the first judgment, the judgment criterion ALP activity (alkaline phosphatase activity), ALP index (differentiation inducing group of ALP activity value ÷ ALP activity value of the non-differentiation-inducing group) and cell proliferation (cell count ÷ initial seeding cells after differentiation induction it can) with at least one selected from the group consisting of whether or not satisfying the above reference value of the first determination are preferred.

상기 2차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능 전부가 2차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이고, In the second judgment, the judgment criterion whether the ALP activity, ALP index, cell proliferation altogether satisfy the reference value or more in the second decision,

1차 판정, 2차 판정 양쪽의 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포라고 판정하고, First determination, it is determined that the second determination forming one meets the criteria for both bone cells (+) cells,

1차 판정에서 기준을 만족하지 않았지만 2차 판정에서 기준을 만족한 세포에 대해서는 3차 판정 기준으로 이행하고, For one did not meet the criteria in the first determination meet the criteria in the second cell is determined, and proceeds to the third criterion,

2차 판정에서 기준을 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것이 바람직하다. Marrow cells did not meet the criteria in the second form is determined (-) is preferably determined to be cells.

상기 3차 판정에서, 판정 기준은 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색 및 알리자린레드 염색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 기준을 만족하는지 여부이고, And whether or not in the third judgment criterion is at least one selected from the group consisting of flow Saito meth Rie surface antigen (HLA-DR) by analysis, TRAP staining and alizarin red staining meet the criteria,

이 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포, 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것이 바람직하다. Is preferably determined to be cell-based bone formation is (+) for a cell satisfying the cell, the cell does not satisfy bone formation ().

상기 1차 판정에서, 기준값은 골형성 (-)세포의 각 (평균값+2SD)인 것이 바람직하다. In the first judgment, the reference value is a bone formation - preferably in each (mean + 2SD) of the cell ().

상기 2차 판정에서, 기준값은 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD) 또는 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값인 것이 바람직하다. In the second judgment, the reference value is preferably for bone formation (+), each of the cells (mean value -2SD) or bone formation (+) Measurement of the cell lower limit value.

상기 3차 판정에서, 표면 항원(HLA-DR) 해석의 기준은 측정된 HLA-DR 양성 세포가 약 6% 이상인 것이 바람직하다. In the third judgment, based on analysis of the surface antigens (HLA-DR) is preferably the measured HLA-DR-positive cells at least about 6%.

상기 1차 판정에서, ALP 활성의 기준값은 약 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다. In the first judgment, ALP is a reference value of the active is preferably in the range of about 166 units (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein).

상기 1차 판정에서, ALP 인덱스의 기준값은 약 3.95인 것을 특징으로 하는 배양된 골형성성 세포의 평가 방법. In the first judgment, the reference value of the index is ALP of the bone-forming cell culture evaluation method, characterized in that about 3.95.

상기 1차 판정에서, 세포 증식능의 기준값은 약 9.7인 것이 바람직하다. In the first judgment, the reference value of the cell proliferation is preferably about 9.7 in.

상기 2차 판정에서, ALP 활성의 기준값은 약 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다. In the second judgment, ALP is a reference value of the active is preferably in the range of about 67 unit (μmol p- nitrophenol produced / min / ㎍ protein).

상기 2차 판정에서, ALP 인덱스의 기준값은 약 1.01인 것이 바람직하다. In the second judgment, the reference value of the ALP index is preferably about 1.01.

상기 2차 판정에서, 세포 증식능의 기준값은 약 5.6인 것이 바람직하다. In the second judgment, the reference value of the cell proliferation is preferably about 5.6 in.

본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에 있어서, 판정 기준으로서 이용되는 ALP 활성은 골형성성 세포, 예를 들면 골아세포에서 높은 활성이 인식된다. In the assessment of bone-forming cell method according to the invention, ALP activity to be used as the determination reference is recognized bone-forming cells, for example, high activity in osteoblasts. 분화 유도 후의 ALP 활성이 낮은 경우에는, 골형성성 세포를 포함하지 않거나 또는 골형성능을 갖지 않은 세포일 가능성을 생각할 수 있지만, 본 발명자들의 연구에 의해 분화 유도군과 비분화 유도군의 ALP 활성의 비율인 ALP 인덱스가 상승할 경우에는 골형성성 세포로서, 또한 골형성능을 가진 경우가 있는 것이 나타나 있다. Is differentiated if the ALP active low after induction, not contain bone-forming cells or or bone formation performance to be considered the possibility that does not have cells, but the ALP activity of the induced and non differentiation inducing group differentiated by the studies by the present inventors If the ratio of ALP index is rising to a bone-forming cells, also it is shown that there is a case with a bone formation performance. 한편, ALP 활성이 충분히 높으면 골형성성 세포의 분화 유도는 양호할 가능성이 매우 높다. On the other hand, ALP activity is sufficiently high bone-forming cells, induce differentiation of the very likely be good. 그러나 만약에 ALP 활성이 높아도 세포 증식능이 손실되면 골이식 후에 충분한 골형성을 기대할 수 없다. However, if the ALP activity nopahdo cell proliferation can not be expected for sufficient bone formation after bone grafting when the loss.

따라서 본 발명에 따른 평가 방법에서는, 세포 증식능의 평가도 실시하고 있다. Therefore, the evaluation method according to the present invention, the cells are also carried out the evaluation of proliferation.

상기 3가지 평가(ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능)를 조합해도 골형성성 세포의 유무를 판단하기 어려운 그룹에 대해서는, 보다 신중한 평가가 필요해진다. For even a combination of the three ratings (ALP activity, ALP index, cell proliferation) to determine the presence or absence of bone-forming cell groups difficult, it requires a more careful evaluation. 본 발명자들은 이와 같은 그룹에 대해서는, 추가로 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR)의 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색의 결과를 이용하여, 어떠한 것이라도 양성(플로우 사이토메트리에 의한 HLA-DR 분획 양성, TRAP 양성, 알리자린레드 양성)을 갖고 보조적으로 골형성성 세포가 있다고 판단함으로써, 거의 모든 개체 차를 가진 샘플에 타당한 근거를 부여하는 것이다. The present inventors of this analysis for the same group, the flow Saito meth Rie surface antigen (HLA-DR) by further, TRAP staining, alizarin red staining using the result of, any would even positive (HLA- by flow Saito meth Rie has a DR-positive fraction, TRAP-positive, alizarin red-positive), to determine, by that the adjuvant to bone-forming cells, given the reasonable based on samples having an almost any individual difference.

이 HLA-DR 양성 세포와 골형성능의 직접적인 관계는 불명확하지만, 본 발명자들이 확인한 바, HLA-DR 활성과 골형성능에는 명확한 상관 관계가 나타났다. This direct relationship between HLA-DR-positive cells in bone formation and performance is not clear, but the bar confirming by the present inventors, HLA-DR activity and bone formation, the performance was a clear correlation. 또한 TRAP 염색(주석산 내성 산성 포스파타제 염색)은 파골 세포 마커로서 이용되고 있지만, 파골 전구 세포로부터 파골 세포로의 성숙에는 골아세포(골형성성 세포)와의 상호작용(interaction)이 필요하므로, 간세포가 골형성성 세포로 분화되는 과정의 간접적인 지표로서 이용할 수 있다고 생각된다. In addition, TRAP staining (tartrate-resistant acid phosphatase staining) so from osteoclast and used as a marker, but osteoclast precursor cells require cross with the maturation into osteoclasts, the osteoblasts (bone forming cells) action (interaction), stem cells in bone It is thought to be used as an indirect indicator of the process of differentiation-forming cells. 또한, 알리자린레드 염색은 시험관내에서의 석회화능을 나타내고, 칼슘의 침착을 염색한 것이다. Further, alizarin red staining indicates the ability of calcification in vitro, to a dyeing the deposition of calcium. 본 발명자들이 확인한 바, 골형성능을 나타내는 세포에서는 알리자린레드 염색 양성이 되고, 골형성능이 많은 세포에서 손실되는 계대(繼代)가 진행된 세포에서는 염색 음성이 되는 것이 나타났다. The present inventors bar, the cells exhibiting bone formation performance and a positive alizarin red staining confirmed, the cells are passaged advanced (繼 代) this bone loss performance in many cell staining it appeared to be a voice.

이와 같이 본 발명에서는, 비교적 간단하고 명확한 수법인 ALP 활성 평가, ALP 인덱스, 세포 증식능 판정에 의해, 명확히 골형성능을 가진 것과 골형성능을 갖고 있지 않은 것을 선택하고, 이들 평가에서 명확하지 않은 군에 대해서는 HLA-DR 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색을 실시하여, 골형성능을 충분히 기대할 수 있음에도 불구하고 「골형성능 없음」으로 하여 파기되는 것을 방지하는 것이다. In this way the present invention, the selection that by relatively simple and clear method of ALP activity evaluation, ALP index, cell proliferation is determined, that is not clearly have a bone formation performance as with the bone formation performance, for unclear groups In these reviews Analysis carried out by the HLA-DR, TRAP staining, alizarin red staining, although to be fully expected performance and prevent bone destruction by a "bone No performance".

본 발명에 의하면, 개체에 의한 편차가 있으므로 일정의 기준으로 판단이 곤란했던 목적 세포의 종류 및 기능을 평가할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. According to the present invention, it is possible to provide a method for the determination on the basis of the schedule to evaluate the type and function of the target cells was difficult because a variation of the object. 또한 골형성성 세포의 평가를 실시하는 경우, 배양 세포의 골형성능에 대해 거의 확실히 평가하는 것이 가능해지고, 세포를 이용한 치료에 필수인 평가에 관한 방법을 제공할 수 있다. In addition, if an assessment of bone-forming cells, it is possible to provide a method according to the required rating in the treatment would be using, it becomes cells almost certainly evaluated for bone formation performance of the cultured cells.

도 1은 골형성능 검사 스케쥴, FIG. 1 is a bone scan performance schedule,
도 2는 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법을 나타내는 플로우차트, 2 is a flowchart showing the evaluation of bone-forming cell method according to the invention,
도 3은 본 발명이 바람직하게 적용되는 골형성성 세포의 배양 공정, 분화 유도 공정의 설명도, 3 is an explanatory view of the bone-forming cells of the culture process, a differentiation-inducing processes to which the present invention is preferably applied,
도 4는 사람 배양 골아세포 유사(樣) 세포의 ALP 활성의 분포를 도시한 도면, Figure 4 is a diagram showing the distribution of cultured human osteoblasts similar (樣) ALP activity of the cells,
도 5는 사람 배양 골아세포 유사 세포의 ALP 인덱스의 분포를 도시한 도면, 5 is a view showing the distribution of the index of the human ALP cultured osteoblast-like cells,
도 6은 사람 배양 골아세포 유사 세포의 증식능의 분포를 도시한 도면, 6 is a view showing the distribution of the proliferation of cultured human osteoblast-like cells,
도 7은 ALP 활성 측정 결과, Figure 7 ALP activity measurement results,
도 8은 세포 증식능 측정 결과, 8 is a cell proliferation measurement result,
도 9는 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석 결과, Figure 9 is a flow Saito meth Rie surface antigen analysis by,
도 10은 TRAP 염색 측정 결과, 및 10 is a TRAP staining measurement, and
도 11은 알리자린레드 염색 결과이다. 11 is a alizarin red staining.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다. Hereinafter, a description will be given of a preferred embodiment of the present invention. 이하, 목적으로 하는 세포가 골형성성 세포인 경우를 예로 들어 설명을 실시한다. For the case where the cell of less, it is an object of bone-forming cells to an example embodiment for explanation. 우선 본 발명의 골형성성 세포의 평가 방법에 의해 효과적으로 치료로 응용이 가능한 과립형 배양 골의 제조 방법에 대해, 도 3을 이용하여 설명한다. First, a method for manufacturing the present bone-forming cells, granular bone culture is effectively applicable to the treatment by the evaluation method of the invention will be described with reference to Fig. 과립형 배양 골은 골수액의 채취, 골수 유래 간엽계 간세포의 배양, 간엽계 간세포의 파종, 배양 골아세포 유사 세포로의 분화 유도를 실시함으로써 제조할 수 있다. Granular cultured bone can be prepared by carrying out the induction of differentiation in the bone marrow harvesting, bone marrow-derived mesenchymal stem cells in culture, the mesenchymal stem cells seeded, cultured osteoblast-like cells.

또한, 이하의 공정은 골수 유래 세포를 이용한 형태를 나타내고 있지만, 본 발명의 평가 방법은 골수 이외에도 골막, 지방, 말초혈 등으로부터 분리 배양하고, 동일한 방법으로 배양 골아세포 유사 세포로 분화 유도함으로써 제작되는 과립형 배양 골에서도 바람직하게 사용할 수 있다. Further, the step of, but shows a type using the bone marrow-derived cells, the evaluation method of the present invention is produced by culturing isolated from bone marrow, in addition to the periosteum, fat, peripheral blood or the like, and induce differentiation in the same manner as culturing osteoblast-like cells It can be preferably used in granular cultured bone.

·골수액의 채취 · Extraction of bone marrow

골수액은 수술 약 1개월 전에 채취한다. Bone marrow will be harvested about a month before the surgery. 우선 골수액 채취부에 국소마취를 실시하여, 후상장골능(後上腸骨稜)으로부터 무균적으로 흡인하여 회수한다. First, under local anesthesia performed on bone marrow harvesting unit, and then is recovered by aspiration with listed golneung (後 上 腸 骨 稜) aseptically from.

· 골수 유래 간엽계 간세포의 배양 , Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in culture

세포 배양용 배지로 4배 희석한 골수액(10)을 세포 배양용 플라스크(12)에 뿌려 도 3의 (A)와 같이 배양을 시작하고, 배양 개시 후 4일째에 전량 배지 교환을 실시한다. Sprinkle the bone marrow (10) was diluted four times with cell culture medium to the cell culture flask (12) as shown in (A) of Figure 3 starts the culture and subjected to total volume medium exchange on the fourth day from the initiation of culture. 또한, 세포 배양용 배지에는 1차 배양, 분화 배양 모두, 혈청이 들어간 αMEM 또는 무혈청 배지 중 어느 것을 사용할 수 있다. In addition, the cells may be used include the primary culture medium for culturing, both differentiation culture, any of αMEM or serum-free medium containing serum.

배양 과정에서의 일반 세균 및 진균에 감염되지 않은 상태의 확인은, 배지 교환시마다 배지를 관찰(감염되면 배지가 탁함)함으로써 실시하고, 또한 배양 개시시, 분화 유도전 및 배양 골아세포 유사 세포의 회수 시에 무균 시험(일본 약국방(藥局方)의 기준을 만족하는지 여부)으로 확인한다. Bacteria and verification of non-infected conditions in fungi in culture is observed whenever the medium was exchanged the medium carried out by (infection medium is turbid), and further recovery at the time of initiation of the culture, differentiation induction before and cultured osteoblast-like cells Make a sterility test (whether or not it meets the standards of the Japanese Pharmacopoeia (藥 局 方)) at the time.

그 후, 주 2회 전량 배지 교환을 실시한다. Then, the total volume subjected to twice a week medium exchange. 계대의 타이밍은 세포의 상태를 보고 판단하지만, 배양 개시부터 약 21~28일 후에 실시한다. The timing of the passage is determined to see the state of the cell, however, carried out in about 21-28 days from the initiation of the culture. 계대시에는 살아있는 세포수를 계측한다. The measurement is a living cell number during subculture.

· 간엽계 간세포의 파종 · Dissemination of mesenchymal stem cells

계대는 이하와 같이 실시한다. Subculture is performed as follows. 플라스크의 배지를 빼낸 후, 둘베코 인산 버퍼(D-PBS)로 세정하고, 그 후 D-PBS를 빼내고 세포 해리제를 첨가하여, 37℃에서 10분간 배양한다. After removing the medium of a flask, washed with Dulbecco's phosphate buffer (D-PBS), and then to pull out the D-PBS was added to the cells dissociated, and cultured at 37 ℃ 10 minutes. 세포가 해리되어 있는 것을 확인한 후, D-PBS 또는 배지를 첨가하여 세포를 회수한 후, 원심한다. Then after confirming that the cells are dissociated, by the addition of D-PBS or a culture medium the cells were collected and centrifuged. 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 계측한다. By re-suspended in culture medium and measuring the number of cells. 계측 후, 도 3의 (B)와 같은 다공질 의사 골과립(14)이 미리 투입된 심저 용기(16)에, 배양한 골수액(10)을 투입한다. After the measurement, the (B) and the porous pseudo bone granules downhole well vessel 16. 14 is pre-injected as in Figure 3, the input to the cultured bone marrow (10). 골수액(10)을 의사 골과립(14)이 들어간 심저 용기(16)에 투입하면, 도 3의 (C)와 같이 골수액(10) 및 의사 골과립(14)은 부유한다. When added to bone marrow 10 in the bone granules doctor downhole well vessel (16) (14) get, bone marrow (10) and the doctor bone granules 14, as shown in (C) of Figure 3 is suspended.

·배양 골아세포 유사 세포로의 분화 유도 Culture, induced differentiation of osteoblast-like cells

다공질 의사 골과립(14)에 세포를 파종하고 나서, 세포의 기능 회복을 위해 하룻밤 정치(靜置)한다. After seeding the cells on a porous bone doctor granules (14) and overnight (靜置) for the functional recovery of the cells. 1일 후에는, 도 3의 (D)와 같이 골 형성에 관여하는 세포 등의 세포 및 다공질 의사 골과립(14)은 심저 용기(16)의 하부에 침전되어 있다. After 1 day, bone granules 14 cells and porous cellular doctor, etc. involved in bone formation, such as (D) in Figure 3 is deposited on the lower portion of the downhole well container 16. 이를 확인한 후, 배지를 분화 유도 배지로 교환한다. After confirming this, the exchange medium with differentiation-inducing culture medium. 분화 유도 기간은 1~3 주일간이고, 배지 교환은 주 2회 정도 실시한다. Differentiation induction period is 1-3 weeks, medium exchange is carried out twice a week. 분화 유도가 진행되면, 도 3의 (E)와 같이 의사 골과립(14) 주위에 부착된 배양 골아세포 유사 세포의 형태가 변화되고, 골기질 단백을 분비하여 하나의 덩어리로 되어간다. When a differentiation inducing progress, also be a doctor in the form of bone granules (14) similar to the cultured osteoblasts attached around the cells changed as shown in the 3 (E), and secrete bone matrix proteins takes is a single loaf.

한편, 이 과정과 병행하여 평가하기 위해 세포를 12웰의 배양 접시에 파종한다. On the other hand, in order to evaluate in parallel with the process and seeding the cells into culture dishes of 12 wells. 세포는 1웰당 2×10 4 로 한다. Cells per well in 1, 2 × 10 4.

이하, 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에 대해, 도 2의 플로우차트를 이용하여 설명한다. Or less, for the assessment of bone-forming cell method according to the present invention will be described in reference to the flowchart of FIG. 도 2에 도시된 바와 같이, 골형성성 세포는 1차 판정 기준, 2차 판정기준, 3차 판정기준을 기초로 판정된다. 2, the bone-forming cell is determined to be the primary criteria, based on the second criterion, the third criteria. 또한, 도 2의 괄호 내의 비율은 당초의 세포에 대한 비율을 나타낸다. Further, the ratio in the parentheses denotes the ratio of 2 for the original cell. 그러나 이들 비율은 일례로서 특별히 한정되지 않고, 이용하는 세포의 선택에 따라 다르다. However, these ratios are not particularly limited as long as an example, depending on the choice of the used cells.

1차 판정 기준 Primary acceptance criteria

1차 판정은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능을 기초로 실시된다. First determination is carried out based on the ALP activity, ALP index, cell proliferation.

1차 판정에서, 상기 3가지 평가 방법 중 어느 하나의 기준값을 초과하는 경우에 세포는 1차 판정 기준(○)이라고 결정되고, 모든 기준값을 초과하지 않은 경우에 세포는 1차 판정 기준(×)이라고 결정된다. In the first judgment, in the case of more than any of the reference value of the three evaluation method cells are the primary criteria (○) is determined to be a cell in the case is not greater than all the reference values ​​are the primary criteria (×) it is determined.

2차 판정 기준 Secondary criteria

2차 판정도, 1차 판정과 마찬가지로 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능을 기초로 실시된다. Second determination also, is carried out based on the ALP activity, ALP index, cell proliferation, like the first determination. 그러나 하기에 나타내는 바와 같이 이들의 평가 기준값은 1차 판정과 다르다. However, these reference values ​​for evaluation, as shown below is different from the first determination.

1차 판정 기준(○) 세포는, 2차 판정에서 상기 3가지 평가 방법 전체에서 기준값을 초과하는 경우에 세포는 골형성 (+)세포라고 판정되고, 어느 하나의 기준값을 초과하지 않는 경우는 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다. The primary decision criteria (○) cells, 2 when the car is determined to exceeds the reference value throughout the three evaluation method cells are determined to be osteogenic (+) cells, that does not exceed the one reference value is cell is osteogenesis - it is determined that the cell ().

1차 판정 기준(×) 세포는, 2차 판정에서 상기 3가지 평가 방법 전체를 만족하는 경우에 세포는 3차 판정 기준으로 이행되고, 어느 하나의 기준값을 초과하지 않는 경우는 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다. If the primary criteria (×) cells, and proceeds to cells third criterion if satisfying the whole the three evaluation method in the second determination, that does not exceed the one reference value are cells of bone formation ( -), it is determined that the cell.

3차 판정 기준 Third criteria

3차 판정은, 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색을 기초로 실시된다. The third determination, the flow Saito meth Rie Surface Antigen Analysis by, it is performed based on the TRAP staining, alizarin red staining.

3차 판정 기준에서, 어느 하나가 양성인 경우에 세포는 골형성 (+)세포라고 판정되고, 모두 음성인 경우에 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다. It is determined that the cells in the third criteria, if any one in the positive cells are determined to be osteogenic (+) cells, all cells in the case where voice is osteogenesis ().

본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에서는, 이와 같이 복수의 판정 기준을 조합하여 골형성 (+)세포인지 여부를 판정하고 있다. The evaluation of bone-forming cell method according to the invention, and thus a combination of a plurality of criteria determined whether bone formation (+) cells. 이들 방법을 조합하는 것의 중요성은 이하와 같다. The importance of a combination of these methods are as follows.

전술한 바와 같이, 이제까지의 골형성능의 확인에도 ALP 활성이 이용되어 왔다. As described above, the ALP activity has been used to determine the performance of the far bone formation. 그러나 도 4에 도시한 바와 같이, ALP 활성의 분포에는 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다. However, as shown in Figure 4, it has been distributed in the ALP activity in a cell that does not have a close-up cells with bone formation performance, it was difficult to establish a clear boundary. 낮게 설정하면 골형성능을 갖지 않은 세포를 많이 혼입시키게 되고, 높게 설정하면 골형성능을 가진 세포를 제외하게 된다. If you set low, and thereby incorporated into the cell which does not contain a lot of bone formation performance, is, except for cells with bone formation performance is set high.

실제로 ALP 활성을 이용하여 판정 기준을 생각하는 경우, 예를 들면 골형성을 나타낸 세포의 ALP 활성의 평균값-2SD로 경계를 설정하는 것을 생각할 수 있다. When actually think the criteria using the ALP activity, for example, it is conceivable to set the boundary to an average value of -2SD ALP activity of showing the bone-forming cells. ALP 활성값이 정규 분포를 한다고 상정한 경우, 실제로 골형성능을 가진 세포의 95.45%를 회수할 수 있지만, 도 4를 보면 한편 골형성능을 갖지 않은 세포도 대부분 회수해버릴 가능성이 있다. If the ALP activity value is assumed that a normal distribution, but to actually recover the cells of 95.45% with a bone formation performance, it is possible to discard Referring to FIG. 4, most number of cells while having no bone formation performance.

또한, 골형성 (+)세포의 하한값으로 설정하는 것도 생각할 수 있다. Further, it is conceivable to set the lower limit of the bone formation (+) cells. 그러나 도 4를 보면 골형성 (+)세포의 하한값 이상에서도 골형성능을 갖지 않은 세포도 다수 존재한다. However, looking at the Figure 4 and there are many cells having no bone formation performance even more than the lower limit of the bone formation (+) cells.

전술한 바와 같이, 본 발명자들에 의해 골형성능의 판정에 ALP 인덱스의 유용성이 보고되어 있다. As described above, the usefulness of the ALP index are reported on the determination of bone formation performance by the present inventors. 그러나 도 5를 보면 ALP 인덱스의 분포도 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다. However, there are close to even look at the five cells in the cell does not have a distribution with bone ALP performance of the index, it was difficult to set clear boundaries.

또한, 이제까지 골형성능의 판정에는 사용되고 있지 않지만, 본 발명자들에 의해 세포 증식능 중 특히 분화 유도 시의 증식능이 골형성능과 관계가 있는 것이 명확해지고 있다. In addition, so far the determination of bone formation, but its performance is not being used, it is becoming clear that the proliferation is related to bone formation performance at the time of induction of differentiation in particular cell proliferation by the present inventors. 그러나, 도 6을 보면 세포 증식능의 분포도 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다. However, there is a 6 cell look up from cells that do not have a cell with the performance of the distribution of bone proliferation, and it is difficult to set clear boundaries.

이상과 같기 때문에, 종래 이용되어 온 지표나 그 단순한 조합으로는 골형성 (+)세포의 적절한 판정은 곤란한 것을 알 수 있다. Since the same as those described above, the surface or the simple combination that has been conventionally used is appropriate determination of bone formation (+) cells can be seen that difficult.

따라서, 본 발명자들은 상기 판정 방법으로는 골형성 (+)세포와 골형성 (-)세포의 데이터에서 겹치는 부분이 많기 때문에, 골형성 (+)세포만을 회수할 수 있는 엄격한 기준(1차 판정 기준)을 처음으로 마련한 것이다. Thus, the present inventors have found that the above determination method, osteogenesis (+) cells and bone formation (-) because of the large overlap in the data of the cells, bone formation (+), high standards that can be recovered and cells (primary criteria ) to be provided to the first.

그러나 1차 판정 기준에서는 선택되지 않은 부분에 골형성 (+)세포를 많이 포함하므로, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 이용하여 이들의 구제(救濟)를 실시하고 있다. However, because the primary criteria in including a lot of bone formation (+) cells in non-selected portion, and subjected to these relief (救濟) using a second criterion and a third criterion.

또한, 1차 판정 기준을 만족하는 세포에도 약간은 골형성 (-)세포가 포함될 가능성이 있다. Further, even cells that meet the first criteria is slightly osteogenesis - there are likely to contain cells (). 이 때문에, 이들 세포에 대해서도 2차 판정 기준을 실시하고 있다. Thus, it is subjected to a second criterion even for these cells.

이와 같이 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에서는 1차 판정 ~ 3차 판정이 실시되지만, 그 결과로서 판정된 골형성 (+)세포는 본 발명자들에 의해 거의 100% 골형성 (+)세포라는 것이 명확해지고 있다. In this manner, assessment of bone-forming cells according to the invention primary is determined - the third determination is however carried out, the bone formation (+) cells is determined as the result is almost 100% by the inventors of bone formation (+) it has become clear that cell.

계속해서, 1차 판정 및 2차 판정에서 이용되는 기준에 대해 설명한다. Next, a description is given to the criterion used in the first determination and the second determination. 우선 기준값, 평가 방법(ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능)에 대해 상세히 설명한다. First will be described in detail in the reference value, the evaluation method (ALP activity, ALP index, cell proliferation).

본 발명에서 1차 판정의 기준값은 골형성 (-)세포의 각 (평균값+2SD)로 설정했다. A reference value of the first determination in the present invention, bone formation - was set to each (average + 2SD) of the cell (). 이 때, 표본 데이터가 정규 분포를 한다고 가정한 경우, 골형성능을 갖지 않은 세포가 잘못 포함될 확률은 (100-95.45)/2 =2.275%이다. At this time, assuming that the sample data is the normal distribution, the probability of a cell which does not contain a bone formation include performance fault (100-95.45) / a 2 = 2.275%.

또한, 2차 판정의 기준값은 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD) 또는 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값으로 설정했다. Further, the reference value of the second determination is made set to the lower limit of the bone formation (+) angle (average value -2SD) of cells or bone formation (+), each measured value of the cell.

상기 기준값은, 세포를 채취하는 환자의 모집단(성별, 연령, 인종 등)에 따라서 변화되는 것도 생각할 수 있다. The reference value, it is conceivable that changes in accordance with the patient population of the collected cells (sex, age, race, etc.). 즉, 기준값은 환자에게 맞는 적절한 값을 선택하는 것이 중요하다. That is, the reference value, it is important to select an appropriate value to fit for the patient. 따라서 이하에 나타내는 기준값은 본 발명자들이 채취한 환자의 세포에 의해 결정된 것이며, 이들에 한정되는 것이 아니다. Therefore, a reference value described below will determined by the patient's cells were collected by the present inventors, though not particularly limited thereto. 또한 많은 데이터에 의해 이 수치를 보다 엄밀히 설정하는 것도 가능하다. It is also possible to more precisely set this value by the number of data.

또한, 이하에 나타내는 2차 판정의 구체적인 기준값은, 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값을 예로 들고 있지만, 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD)를 이용해도 타당한 결과가 얻어진다. In addition, two specific reference value of the difference determined is shown below, but the lower limit of holding respective measurements of bone formation (+) cells, for example, be used for each (average -2SD) of bone formation (+) cell obtained reasonable results It is.

·ALP 활성 · ALP activity

ALP 활성의 측정에는, 예를 들면 p-니트로페닐포스페이트 정제 세트(Sigma-Aldrich사)와 세포 집계 키트인 WST-8(도진카가쿠 겐큐죠사제)을 이용할 수 있다. For the measurement of ALP activity, for example, may be used p- nitrophenyl phosphate tablets set (Sigma-Aldrich, Inc.) and cell counting kit, WST-8 (Dojin Kagaku Gen kyujyo Co., Ltd.).

이하, ALP 활성 측정을 상기 제품으로 실시하는 경우를 예로 측정 방법을 나타낸다. Below, it shows the measuring method for the case of performing the ALP activity was measured by the product as an example. 우선 WST-8 용액을 각 웰에 100㎕씩 첨가한다. First, a WST-8 solution by 100㎕ added to each well. 탄산가스 인큐베이터 내에서 1~4시간 정색(呈色) 반응을 실시한 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정한다. And the absorbance is measured using a micro plate reader and then subjected to 1-4 hours colored (呈色) reaction in a carbon dioxide incubator. WST-8 분석 후, 세포막 단백을 용해 추출하고, 그 용해액에 p-니트로페닐포스페이트 용액을 첨가하고, 실온에서 10분간 정치 후, 반응을 NaOH로 중단하고, p-니트로페놀(p-니트로페닐포스페이트의 ALP에 의한 분해 산물)의 흡광도를 측정한다. WST-8 after analysis, extracting the cell membrane protein is dissolved, the addition of p- nitrophenyl phosphate solution in the dissolved solution, and after 10 minutes at room temperature, stop reaction with NaOH, and p- nitrophenol (p- nitrophenyl measure the absorbance of the decomposition products of the phosphate by the ALP). ALP 활성은 시간당 p-니트로페놀의 몰수/단백질의 질량(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)으로 표시된다. ALP activity is expressed by the mass (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein) of the mole number / protein of p- nitrophenol per hour. 또는 p-니트로페놀 흡광도(OD; 405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)로서 나타낼 수도 있다. Or p- nitrophenol absorbance can be expressed as;; (450nm OD) (OD 405nm) / WST-8 absorbance.

도 7에 ALP 활성 측정 결과의 예를 나타낸다. 7 shows an example of ALP activity measurements.

골형성 (-)세포의 ALP 활성 평균값+2SD는 2.31{p-니트로페놀 흡광도(OD;405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)}이었다. Bone formation (-) ALP activity mean + 2SD of the cells was 2.31 {p- nitrophenol absorbance;; (450nm OD) (OD 405nm) / WST-8 absorbance}. 이 값은 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)에 상당한다. This value corresponds to 166 units (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein). 이 때문에 본 발명자들은 ALP 활성의 1차 판정의 기준값을 약 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로 설정했다. For this reason, the present inventors have set a reference value of the first determination of ALP activity of about 166 units (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein). 즉, ALP 활성의 1차 판정의 기준값은 166±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다. That is, it is preferable that the first reference value of the primary determination of ALP activity was 166 ± 5 units (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein).

이러한 세포 당 ALP 활성의 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로의 환산식은 본 연구에 이용한 세포로부터 본 발명자들에 의해 구해진 것이다. These cells converted to units of ALP activity (μmol p- nitrophenol produced / min / ㎍ protein) per expression is obtained by the present inventors from the cells used for this study.

골형성 (+)세포의 ALP 활성 측정값의 하한값은 0.93{p-니트로페놀 흡광도 (OD;405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)}이었다. Bone formation (+) ALP activity lower limit for the measurement of the cell was 0.93 {p- nitrophenol absorbance;; (450nm OD) (OD 405nm) / WST-8 absorbance}. 이 값은 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)에 상당한다. This value corresponds to 67 unit (μmol p- nitrophenol produced / min / ㎍ protein). 이 때문에 본 발명자들은 ALP 활성의 2차 판정의 기준값을 약 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로 설정했다. For this reason, the present inventors have set a reference value of the second determination of ALP activity of about 67 unit (μmol p- nitrophenol produced / min / ㎍ protein). 즉, ALP 활성의 2차 판정의 기준값은 67±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다. That is, it is preferable that the second reference value of the primary determination of ALP activity was 67 ± 5 units (generated μmol p- nitrophenol / min / ㎍ protein).

·ALP 인덱스 · ALP index

ALP 인덱스는 분화 유도 배지를 첨가한 세포(분화 유도군)와, 컨트롤로서 통상 배지를 넣은 세포(비분화 유도군)에 대해 ALP 활성을 측정하고, (분화 유도군의 ALP 활성/비분화 유도군의 ALP 활성)에 의해 산출된다. ALP index cells was added to differentiation induction medium (differentiation inducing group), the cells into a normal culture medium as a control (non-differentiation-inducing group) measuring the ALP activity, and (induced ALP activity / non-differentiation of the differentiation-inducing group for the group a is calculated by the ALP activity).

골형성 (-)세포의 ALP 인덱스 평균값+2SD는 3.95이었다. Bone formation (-) ALP was the mean value + 2SD index of 3.95 cells. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 인덱스의 1차 판정의 기준값을 약 3.95로 설정했다. For this reason, the present inventors have set a reference value of the first determination of ALP index of about 3.95. 즉, ALP 인덱스의 1차 판정의 기준값은 3.95±0.15인 것이 바람직하다. That is, the first reference value of the primary determination of ALP index is preferably 3.95 ± 0.15.

또한, 골형성 (+)세포의 ALP 인덱스 측정값의 하한값은 1.01이었다. Furthermore, the lower limit value of the index ALP measurements of bone formation (+) cells was 1.01. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 인덱스의 2차 판정의 기준값을 1.01로 설정했다. For this reason, the present inventors have set a reference value of the second determination of ALP index to 1.01. 즉, ALP 인덱스의 2차 판정의 기준값은 1.01±0.15인 것이 바람직하다. That is, the second reference value of the primary determination of ALP index is preferably 1.01 ± 0.15.

·세포 증식능 · Cell proliferation

세포 증식능은 배양 전후에서의 세포 수의 비율, 즉 (분화 유도 후의 세포 수/초기 파종 세포 수)에 의해 구할 수 있다. Cell proliferation can be determined by the ratio of the number of cells in the culture before and after, that is, (number of cells after the differentiation inducing / initial cell seeding number). 실제로는 분화 유도 기간 종료 후에 세포 수를 측정함으로써 수득되지만, 파종한 세포를 일정하게 함으로써 (회수된 세포 수/파종한 세포 수)로서 산출하는 것이 가능하다. But the actually obtained by measuring the number of cells after differentiation induction period is terminated, it is possible to calculate by a constant the inoculated cells (number of recovered cells / number of cells seeded). 여기서는 분화 유도 기간 중의 세포 증식률을 세포 증식능이라고 정의한다. Here, the cell growth rate of the cell differentiation induction period is defined as proliferation. 또한 예를 들면 상기 세포 집계 키트(WST-8)의 OD값의 비로 판정할 수 있다. In addition, it is possible to determine for example the ratio of the OD value of the cell counting kit (WST-8). 즉, 상기 정색 반응을 실시한 후, 450nm의 흡광도(OD값)를 측정하고, 분화 유도 전의 세포 수에 대한 WST-8의 OD값으로 나눠 분화 유도 중의 세포 증식률을 구할 수 있다. That is, after performing the color intensity response can be determined by the cell growth rate in the measurement of absorbance (OD value) of 450nm, and differentiation-induced divided by the OD value of the WST-8 for inducing differentiation can before cell. 또한, 본 발명에 따른 세포 증식능 판정은 1계대에서 4계대까지에 대해 적용할 수 있다. In addition, the cell proliferation is determined according to the present invention can be applied for from 1 to 4 passaged subculture.

도 8에 세포 증식능 측정 결과의 예를 도시한다. Figure 8 shows an example of the cell proliferation measurement results.

골형성 (-)세포의 증식능 평균값+2SD는 9.7이었다. Bone formation (-) was the proliferation of the cells, the mean value + 2SD is 9.7. 이 때문에 본 발명자들은 세포 증식능의 1차 판정의 기준값을 약 9.7로 설정했다. For this reason, the inventors have set the first reference value of the difference of cell proliferation is determined to be about 9.7. 즉, 세포 증식능의 1차 판정의 기준값은 9.7±0.3인 것이 바람직하다. That is, the first reference value of the difference determined in cell proliferation is preferably 9.7 ± 0.3.

또한, 골형성 (+)세포의 증식능 측정값의 하한값은 5.6이었다. Furthermore, the lower limit of the measurement of the proliferative capacity of bone formation (+) cells was 5.6. 이 때문에 본 발명자들은 세포 증식능의 2차 판정의 기준값을 약 5.6으로 설정했다. For this reason, the inventors have set the second reference value of the difference determined in cell proliferation by about 5.6. 즉, 세포 증식능의 2차 판정의 기준값은 5.6±0.3인 것이 바람직하다. That is, the second reference value of the difference determined in cell proliferation is preferably 5.6 ± 0.3.

계속해서 3차 판정에서 이용되는 기준, 평가 방법(플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색)에 대해 상세히 설명한다. Next will be described in detail reference to be used in determining the third evaluation method (Saito flow meth Rie surface antigen (HLA-DR) analysis, TRAP staining, alizarin red staining).

본 발명에서 3차 판정의 기준은 표면 항원(HLA-DR) 양성 세포가 6% 이상, TRAP 양성, 알리자린레드 양성이라고 설정했다. Based on the third determination in the present invention it was set up as a red-positive-positive cells at least 6%, TRAP-positive, alizarin surface antigen (HLA-DR).

·플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석 And surface antigen analysis by flow Saito meth Rie

6색 플로우 사이토메트리 분석은 기존의 플로우 사이토미터를 사용할 수 있지만, 여기서는 FACS Aria 플로우 사이토미터(BDIS사)를 사용했다. 6-color flow Saito methoxy tree analysis can be used a conventional flow cytometer, in which used a FACS Aria flow cytometer (BDIS, Inc.).

항체에는 이하의 물질이 사용되었다. Antibody, the following materials were used. 형광 이소티오시아네이트 복합체(FITC-), 피코에리트린 복합체(PE-), 페리디닌클로로필 단백질 복합체(PerCP-Cy5.5-), 아로피코시아닌 복합체(APC-), Alexa Fluor 405 복합체가 사용되었다. Using fluorescent isothiocyanate conjugate (FITC-), phycoerythrin conjugate (PE-), Ferry dinin chlorophyll-protein complex (PerCP-Cy5.5-), aroyl Pico complex (APC-), Alexa Fluor 405 conjugate, not during the It was.

또한 상기 복합체 외에, 항체로서 HLA-ABC, HLA-DR, CD3, CD14, CD19, CD34, CD73, CD90, CD106, CD146, 마우스-IgG1k, 마우스-IgM에 대한 비오틴화 항체(모두 BD Pharmingen사), CD10 및 CD 29에 대한 비오틴화 항체(Dako사), CD45에 대한 비오틴화 항체(인비트로젠사)도 사용되었다. In addition, in addition to the complex, HLA-ABC, HLA-DR, CD3, CD14, CD19, CD34, CD73, CD90, CD106, CD146, mouse -IgG1k, biotinylated antibody to mouse -IgM (all BD Pharmingen, Inc.) as an antibody, biotinylated antibodies to CD10 and CD 29 (Dako, Inc.), biotinylated antibody (Invitrogen) for CD45 was also used. FITC를 공유 결합시킨 CD105 항체(Immunotech사)도 사용되었다. CD105 antibody was covalently bound to FITC (Immunotech, Inc.) were also used. 상기 비오틴화 항체는 스트렙토아비딘퍼시픽블루(인비트로젠사) 또는 스트렙토아비딘 PerCP-Cy5.5(BD Pharmingen사) 복합체에 의해 검출되었다. The biotinylated antibody was detected by the streptavidin Pacific Blue (Invitrogen) or streptoavidin Cy5.5-PerCP (BD Pharmingen, Inc.) conjugate.

STRO-1 항체(R&D Systems사제)는 PE-결합 항마우스 IgM으로 검출되었다. STRO-1 antibody (R & D Systems, Inc.) was detected with PE- coupled anti-mouse IgM. 또한, 요오드화 프로피디움(도진카가쿠 켄큐죠사)이 죽은 세포를 검출하기 위해 이용되었다. In addition, propidium iodide (Dojin Kagaku kenkyu Shuzo) was used to detect dead cells.

상기 수십종류의 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석을 실시했다. Using the several types of antibody and subjected to surface antigen analysis by flow Rie Saito meth. 본 발명자들이 검토한 결과, 골수 유래의 간엽계 간세포에는 동일한 수법으로 배양되어도 골형성능을 가진 세포가 수득되는 경우와 수득되지 않는 경우가 있는 것이 명확해졌지만, HLA-DR에 대한 항체 이외의 상기 항체의 발현에 있어서, 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서는 차이가 나타나지 않았다. After a review of the present inventors, may be cultured by the same method mesenchymal stem cells of bone marrow-derived is that there is a case that is not obtained in the case where the cells with bone formation performance obtained but apparent, the antibody of the antibody than for the HLA-DR in the expression, in cells that do not have the cell with bone formation performance it did not differ. 그러나 유일하게 HLA-DR에 대한 항체의 발현만 유의적인 차이가 있는 것이 명확해졌다. However, only the expression of only antibodies to HLA-DR it became clear that there is a significant difference. 이 때문에 본 발명에 따른 표면 항원 해석에서는 항체로서 HLA-DR에 대한 비오틴화 항체를 사용하고 있다. Therefore, in the surface antigen analysis according to the invention and an antibody using biotinylated antibodies to HLA-DR.

이하, 본 발명에 바람직한 HLA-DR에 대한 비오틴화 항체를 이용하는 경우의 표면 항원 해석 방법에 대해 나타낸다. It is shown below for surface antigen analysis method of the case of using a biotinylated antibody to a preferred HLA-DR in the present invention. 계대수 0 및 3의 세포는 트리프신-EDTA에 의해 검출되고, 1×10 6 의 세포는 50㎕의 빙냉(氷冷)한 인산 완충 생리식염수(PBS:닛수이 세이야쿠사)중에 현탁시켰다. Passage number of the cells 0 and 3 is detected by the tree peusin -EDTA, of 1 × 10 6 cells were ice-cooled (氷冷) a phosphate-buffered physiological saline 50㎕: was suspended in (PBS units Sui Seiya flexors). 계속해서 세포는 빙상에서 20분간, HLA-DR에 대한 비오틴화 항체와 함께 배양되었다. Subsequently cells were incubated with 20 minutes in the ice sheet, biotinylated antibodies to HLA-DR. 그 후 세포는 세정되고, 빙상에서 20분간 스트렙토아비딘 복합체와 함께 배양되었다. Subsequently cells are washed, and were incubated with streptavidin conjugate for 20 minutes in ice. 마지막으로 세포는 세정되고, 200㎕의 빙냉한 PBS에 재현탁시키고, 요오드화 프로피디움으로 염색되어 플로우 사이토미터에 의해 분석되었다. Finally, the cells are washed, resuspended in ice-cold PBS in 200㎕, are stained with propidium iodide were analyzed by flow cytometer. 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어(TreeStar사)를 이용하여 실시했다. Analysis of the data was performed using the FlowJo software (TreeStar, Inc.).

도 9는 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석 결과를 도시하고 있다. Figure 9 shows a flow Saito meth Rie surface antigen analysis result by. 도 9의 X축, Y축은 다른 항체(각각 HLA-DR, CD14)에 대한 반응을 나타내고 있다. X-axis, Y-axis in Figure 9 shows a reaction to other antibodies (HLA-DR, CD14, respectively). 우측 하부의 수치는 Y축의 항체(CD14) 음성, X축의 항체(HLA-DR) 양성의 분획을 나타내고 있다. Value of the lower right shows the fraction of the positive Y axis, the antibody (CD14) negative, X axis antibodies (HLA-DR).

도 9의 (A)에 도시한 바와 같이, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 이상인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 세포 분획이라고 판정된다. As shown in FIG. 9 (A), not less than the measured HLA-DR-positive cells (6%), it is determined that a cell fraction containing the osteogenic (+) cells. 그러나 도 9의 (B)에 도시한 바와 같이, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 미만인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획으로서 판정된다. But is determined as the case where the measuring HLA-DR-positive cells is less than 6%, and most likely will not include the osteogenesis (+) cell fraction, as shown in Fig. 9 (B).

이 HLA-DR 양성 세포의 6%라는 하한값은 본 발명자들이 많은 피험자에게서 발견한 경험적으로 정한 값이지만, 본 발명은 이 수치에 한정되지 않는다. The lower limit of 6% of the HLA-DR-positive cells, but is a value empirically determined in a number of subjects are detected in the present inventors, the present invention is not limited to this number. 즉, 추가로 많은 샘플의 데이터에 의해 이 수치를 더 엄밀히 설정하는 것은 가능하며, 그 경우에는 구체적으로는 골을 형성한 세포의 평균값에서 2SD 등을 뺀 값과, 골을 형성하지 않은 세포의 평균값에 2SD 등을 더한 값 중, 보다 높은 수치로서 근사할 수 있다. That is, it is possible to by the data of the number of samples to add more precisely set this value, in that case specifically minus 2SD such as in the average value of the formation of bone cell value and the cell average of the non-formation of bone of the sum of such 2SD value it can be approximated as a higher value.

·TRAP 염색 · TRAP staining

TRAP 염색은 예를 들면 고정액이 50mM 주석산 함유 완충액(pH5.0, 발색 기질 30mg/vial)인 TRAP 염색 키트(와코 준야쿠 고교사)를 사용할 수 있다. TRAP staining, for example, the fixing solution may be a buffer solution containing 50mM of tartaric acid (pH5.0, chromogenic substrate 30mg / vial) TRAP staining kit (Wako Junya ku Kogyo) a. 이하에 상기한 TRAP 염색 키트를 이용한 경우의 TRAP 염색 평가 방법을 나타낸다. It shows TRAP staining evaluation method in the case of using the above-TRAP staining kit below.

우선 D-PBS를 워터배스로 데우고, α-MEM에 10% 혈청, 1% 페니실린스트렙토마이신, 1% 암포테리신 B와 덱사메타손, β글리세로인산, 아스코르브산을 포함하는 분화 유도 배지에서 배양을 실시한다. First, warm up the D-PBS to a water bath, subjected to culture in a differentiation-inducing culture medium containing 10% serum, 1% penicillin-streptomycin, and 1% amphotericin B, dexamethasone, phosphate, ascorbic acid as a β glycerophosphate in α-MEM do.

또한 엄밀함을 수득하기 위해서는, 상기 배지 이외에 배지로서 Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(-), RANKL(-), Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(+), RANKL(+)를 사용하여 결과를 비교하는 것이 바람직하다. Also, to give the rigor, Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF as a medium other than the medium results using, Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF (+), RANKL (+) (- -), RANKL () it is preferable to compare.

계속해서, 배양 중의 96 웰 플레이트의 배지를 제거하고 D-PBS를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하고, D-PBS를 제거한다. Subsequently, removing the culture medium of a 96-well plate in the culture, and the D-PBS wash is added 250㎕ / welssik, removing the D-PBS. 계속해서 TRAP 염색 키트의 고정액을 50㎕/웰씩 첨가하고, 5분간 고정을 실시한다. Subsequently 50㎕ / welssik addition of fixing solution of TRAP staining kit, and subjected to 5 minutes fixed. 5분 후, 고정액을 제거하여 증류수를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하고, 증류수를 제거한다. After 5 minutes, washed to remove fixative 250㎕ / welssik adding the distilled water, removing the distilled water. 이 증류수에서의 세정을 3회 반복하여 실시한다. It is carried out by three cycles of washing in distilled water. 3회째의 증류수를 제거하기 전에 클린벤치의 전기를 끄고, TRAP 염색 키트의 발색 기질에 50mM 주석산 함유 완충액을 5㎖ 첨가하고 볼텍스로 혼합하여, 발색 기질의 조제를 실시한다. Before removing the distilled water for the third time, turn off the electricity of the clean bench, a buffer solution containing 50mM of tartaric acid 5㎖ added to a chromogenic substrate for TRAP staining kit, were mixed in a vortex, and subjected to preparation of a chromogenic substrate. 발색 기질의 조제 후, 증류수를 제거하고 발색 기질을 100㎕/웰씩 첨가하여, CO 2 5%, 37℃(습도 95% rH 이상)에서 1시간 인큐베이트를 실시한다. After preparation of a chromogenic substrate, by removing the distilled water and 100㎕ / welssik addition of a chromogenic substrate, it is carried out for 1 hour incubation in CO 2 5%, 37 ℃ (moisture more than 95% rH). 인큐베이트 후, 발색기질을 제거하고, 증류수를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하며, 증류수를 제거한다. After incubation, remove the chromogenic substrate, and the distilled water and the washing was added 250㎕ / welssik to remove the distilled water. 이 증류수에서의 세정을 2회 반복하여 실시한다. It is carried out by repeated twice washed in the distilled water. 세정 후 증류수를 50㎕/웰씩 첨가하고, 현미경 하에서 염색된 세포가 있는지 검경(檢鏡)하고, 세포 사진의 촬영을 실시한다. 50㎕ / welssik adding the distilled water after washing, and the speculum (檢 鏡) that the stained cells under a microscope, and subjected to photographing of the picture cell.

도 10의 (A)와 같이 측정된 TRAP 염색이 양성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 분획이라고 판정된다. When the TRAP-positive staining is measured as (A) in Fig. 10, it is determined that the fraction containing the osteogenic (+) cells.

그러나, 도 10의 (B)와 같이 측정된 TRAP 염색이 음성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획이라고 판정된다. However, in the case of the measured TRAP staining as negative (B) of Figure 10, is determined to be most likely not include bone formation (+) cell fraction.

·알리자린레드 염색 · Alizarin red staining

알리자린레드 염색을 실시하기 위해, 세포를 2.0×10 4 /웰의 밀도로 12웰 디시에 파종한다. To carry out the alizarin red staining, the cells sown on a 12-well dish at a density of 2.0 × 10 4 / well. 익일, 분화 유도 배지로 교환하고, 이후 배지는 주에 2회씩 교환하여 3주간 분화 유도를 실시한다. Next day, exchange with differentiation-inducing medium, since the medium is exchanged to 2 times a week to carry out differentiation induction for 3 weeks.

계속해서, 배지를 빼내고(흡인(吸引)하고), 세포를 D-PBS로 2회 세정한다. Next, remove the medium (suction (吸引) and), and washed twice the cells with D-PBS. 그 후, 고정액(70% 에탄올)에 의해 -20℃에서 1시간 세포를 고정한다. Thereafter for 1 hour at -20 ℃ cells by the fixative (70% ethanol) it is fixed. 고정액을 흡인하고, 증류수로 2회 세정을 실시한다. Sucking the fixing solution, and subjected to washing twice with distilled water.

계속해서, 알리자린레드 S 용액(40mM, pH4.2)을 첨가하여 실온에서 10분간 염색을 실시한다. Subsequently, the addition of alizarin red S solution (40mM, pH4.2) is performed for 10 minutes at room temperature dyeing. pH는 25% 암모늄 수용액으로 조정한다. pH is adjusted to 25% ammonium aqueous solution. 염색액을 흡인하고, 세포를 증류수로 비특이적 염색이 완전히 없어질 때까지 세정한다. Sucking the staining solution and rinse until the quality non-specific staining is not completely the cells with distilled water. 그 후 마크로 및 현미경 사진을 촬영한다. Thereafter, the shooting macro and microscopic pictures.

도 11에 알리자린레드의 염색 결과를 도시한다. It shows the results of alizarin red staining in Fig. 또한 좌측은 분화 유도를 실시하지 않은 시료(컨트롤), 우측은 분화 유도 후의 시료이다. In addition, the left side is the sample not subjected to differentiation induction (control), the right side is the sample after the differentiation induction.

도 11의 (A)와 같이, 측정된 알리자린레드 염색이 양성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 분획이라고 판정된다. As it is shown in (A) of Figure 11, when the measured positive alizarin red staining, is determined to be the fraction containing the osteogenic (+) cells.

그러나 도 11의 (B)와 같이, 측정된 알리자린레드 염색이 음성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획이라고 판정된다. However, it is determined that as shown in (B) of Figure 11, if the measured alizarin red staining is a negative, most likely not include bone formation (+) cell fraction.

본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법에서는, 복수의 검사값, 또는 지표에 대한 적응 순서, 판정 기준을 설정한 후 이들을 플로우차트화함으로써, 경험의 유무에 상관없이 정밀하게 세포의 골형성능을 판정하는 것이 바람직하다. The evaluation of the cell culture method according to the invention, after setting the adaptive procedure, the criteria for a plurality of test values, or the surface by screen these flow charts, to accurately determine the bone formation performance of the cells with or without experience it is desirable. 특히 적어도 3 이상의 검사값, 지표를 포함하고, 이들 조합에 의해 통계학적인 근거를 가지고 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하는 것이 바람직하다. In particular, it is preferred to include at least three or more test values, indicators, predict, determine the function of the precise cell has a statistical basis by combination thereof. 본 발명에서는 편차를 가진 사람 세포에 대해 복수의 검사값, 지표를 플로우차트화하여 평가함으로써,편차의 영향을 임상상 문제없는 정도까지 개선하는 것을 가능하게 하고 있다. By evaluating the present invention, the flow chart for a plurality of test values, an indicator for a person with a deviation cell screen, and make it possible to improve the extent no clinical problem, the effect of the deviation.

또한, 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법에서는, 각각의 검사값에 대하여 적응 범위에 포함되는 샘플이라도, 다른 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포가 아닌 것이 판정될 수도 있다. Further, in the evaluation of the cell culture method according to the invention, even if the sample contained in the adjustment range for each of the check value may be determined is not the cell of interest by referring to the other indicators.

10 : 골수액 10: bone marrow
12 : 세포 배양용 플라스크 12: a cell culture flask.
14 : 다공질 의사 골과립 14: granular porous bone doctor
16 : 심저 용기 16: downhole well container

Claims (14)

  1. 1차 판정 기준, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 가진 배양 세포의 평가 방법에 있어서, In the first determination reference, evaluation of the cultured cell, which contains a secondary criteria and the third criterion,
    1차 판정을 실시한 세포를, 추가로 2차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하고, By the cells subjected to the first determination, the second embodiment is determined in addition to determining the bone formation (+) cells,
    골형성 (+)세포인지 여부를 판단하기 어려운 세포를, 추가로 3차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하는, 배양된 골형성성 세포의 평가 방법으로서, As an evaluation of bone formation (+), cultured bone-forming cells, the cells are difficult to determine whether the cells, to determine bone formation (+) cells by carrying out the third determination methods in addition,
    상기 1차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성(알칼리 포스파타제 활성), ALP 인덱스(분화 유도군의 ALP 활성값÷비분화 유도군의 ALP 활성값) 및 세포 증식능(분화 유도 후의 세포수÷초기 파종 세포수)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 1차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이며, 각 기준값은, 각각, 166±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질), 3.95±0.15, 9.7±0.3이고, In the first judgment, the judgment criterion ALP activity (alkaline phosphatase activity), ALP index (differentiation inducing group of ALP activity value ÷ ALP activity value of the non-differentiation-inducing group) and cell proliferation (cell count ÷ initial seeding cells after differentiation induction the number) with any one or more selected from the group consisting of a whether or not satisfying the above reference value of the first determination, the respective reference values, respectively, 166 ± 5 (unit generated μmol p- nitrophenol / min / protein ㎍), 3.95 and ± 0.15, 9.7 ± 0.3,
    상기 2차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능 전부가 2차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이고, 각 기준값은, 각각, 67±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질), 1.01±0.15, 5.6±0.3이며, In the second determination, the determination reference is active ALP, ALP index, and cell proliferation whether or not all satisfy the reference value or more in the second decision, each reference value, respectively, 67 ± 5 units (p- nitrophenol generated μmol / min / protein ㎍), 1.01 ± 0.15, and 5.6 ± 0.3,
    1차 판정, 2차 판정 양쪽의 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포로 판정하고, Determining the first determination, the cell meets the criteria for both a secondary determination in bone formation (+) cells,
    1차 판정에서 기준을 만족하지 않았지만, 2차 판정에서 기준을 만족한 세포에 대해서는 3차 판정 기준으로 이행하며, Did not meet the criteria in the first determination, and proceeds to the third criterion for satisfying the criteria in the second cell is determined,
    2차 판정에서 기준을 만족하지 않았던 세포를 골형성 (-)세포로 판정하고, The cells that did not meet the criteria in the second determination of bone formation (-) is determined by the cell, and
    상기 3차 판정에서, 판정 기준은 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색 및 알리자린레드 염색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 기준을 만족하는지 여부이고, 각 기준은, 각각, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 이상, 양성, 양성이며, In the third judgment criterion is whether the at least one selected from the group consisting of flow Saito meth Rie surface antigen (HLA-DR) by analysis, TRAP staining and alizarin red staining meet the criteria, each criterion, respectively, the measured HLA-DR positive cells are positive, positive, and more than 6%,
    이 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포, 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 배양된 골형성성 세포의 평가 방법. Evaluation of that determined that the cell which is characterized, in cultured bone forming cells - the content of the reference cells of bone formation (+) cells, the cells are not satisfied bone formation ().
  2. 삭제 delete
  3. 삭제 delete
  4. 삭제 delete
  5. 삭제 delete
  6. 삭제 delete
  7. 삭제 delete
  8. 삭제 delete
  9. 삭제 delete
  10. 삭제 delete
  11. 삭제 delete
  12. 삭제 delete
  13. 삭제 delete
  14. 삭제 delete
KR20107014637A 2009-01-23 2010-01-22 Method for assessing cultured cell KR101632756B1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009013385 2009-01-23
JPJP-P-2009-013385 2009-01-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110116965A true KR20110116965A (en) 2011-10-26
KR101632756B1 true KR101632756B1 (en) 2016-06-22

Family

ID=42355995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20107014637A KR101632756B1 (en) 2009-01-23 2010-01-22 Method for assessing cultured cell

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP5701614B2 (en)
KR (1) KR101632756B1 (en)
WO (1) WO2010084943A1 (en)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001076A3 (en) * 2003-06-27 2005-03-31 Ethicon Inc Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making and using the same
JP2005058225A (en) * 2003-07-30 2005-03-10 Asahi Techno Glass Corp Method for relative measurement of cell having alkaline phosphatase activity
US20070105165A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Charles Goolsby Composite profiles of cell antigens and target signal transduction proteins for analysis and clinical management of hematologic cancers
JP5243021B2 (en) * 2006-12-28 2013-07-24 三菱化学メディエンス株式会社 Genetic marker for detection of cells such as mesenchymal stem cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biomed. Mater. Res. A., Vol. 87, No. 4, pp. 903-912 (2008.12.15.)*
J. Bone Miner. Metab., Vol. 19, No. 6, pp. 352-358 (2001)*
J. Periodontol., Vol. 71, No. 4, pp. 614-617 (2000.04.)*

Also Published As

Publication number Publication date Type
KR20110116965A (en) 2011-10-26 application
JP5701614B2 (en) 2015-04-15 grant
JPWO2010084943A1 (en) 2012-07-19 application
WO2010084943A1 (en) 2010-07-29 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jones et al. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis
George et al. Comparative analysis of methods for assessment of circulating endothelial progenitor cells
Planat-Benard et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells
Horsley et al. IL-4 acts as a myoblast recruitment factor during mammalian muscle growth
Samaranayake et al. Factors affecting the phospholipase activity of Candida species in vitro
Hansen et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue
Stewart et al. Further characterization of cells expressing STRO‐1 in cultures of adult human bone marrow stromal cells
US20040197310A1 (en) Compositions and methods for using umbilical cord progenitor cells in the treatment of myocardial infarction
US5965436A (en) Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes
Hilkens et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells
Sun et al. Rescuing replication and osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a young extracellular matrix
Smits et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology
Corvece et al. Epidemiology and new developments in the diagnosis of prosthetic joint infection
Maeno et al. The effect of calcium ion concentration on osteoblast viability, proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture
Blasi et al. Dermal fibroblasts display similar phenotypic and differentiation capacity to fat-derived mesenchymal stem cells, but differ in anti-inflammatory and angiogenic potential
Lohmann et al. Donor age of human platelet lysate affects proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells
US20050106724A1 (en) Pluripotent embryonic-like stem cells derived from teeth and uses thereof
Ishaug-Riley et al. Three-dimensional culture of rat calvarial osteoblasts in porous biodegradable polymers
US20050233450A1 (en) Methods of inducing hair growth
US20030113812A1 (en) Proliferation and differentiation of stem cells using extracellular matrix and other molecules
US20050079606A1 (en) Pluripotent stem cells originating in skeletal muscle intestinal tissue
Mauney et al. Matrix‐mediated retention of in vitro osteogenic differentiation potential and in vivo bone‐forming capacity by human adult bone marrow‐derived mesenchymal stem cells during ex vivo expansion
Danoviz et al. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system
Yang et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix-based scaffold
Jakobson et al. Cytokine production in nickel‐sensitized individuals analysed with enzyme‐linked immunospot assay: possible implication for diagnosis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
GRNT Written decision to grant