KR101627043B1 - Method for preparing magnetic scaffold including nanoparticle with functionalized surface for bone regeneration and a magnetic scaffold obtained thereby - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표면 기능화된 나노입자를 포함하는 생체적합성 폴리머 자성 스캐폴드의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 자성 스캐폴드에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따른 자성 나노섬유 스캐폴드는 자성 나노입자를 혼입함으로써 균일하게 분포된 자성 나노입자의 구조적, 자기적 특성으로 인하여 기계적 특성 및 생물학적 특성이 향상되어 생체 내의 원하는 부위에 안전하고 효과적으로 뼈의 재생을 촉진시킬 수 있다. The present invention relates to a process for preparing a biocompatible polymer magnetic scaffold comprising surface-functionalized nanoparticles and a magnetic scaffold produced by the process.
The magnetic nanofiber scaffold according to the manufacturing method of the present invention improves the mechanical and biological properties due to the structural and magnetic properties of the magnetic nanoparticles uniformly distributed by incorporating the magnetic nanoparticles, It can promote bone regeneration.
Description
본 발명은 표면 기능화된 나노입자를 포함하는 생체적합성 폴리머 자성 스캐폴드의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 자성 스캐폴드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표면 기능화된 나노입자가 균일하게 분포하는 생체적합성 폴리머 혼합용액을 염추출법을 사용하여 제조하는 다공성의 자성 스캐폴드의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 자성 스캐폴드에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a biocompatible polymer magnetic scaffold including surface-functionalized nanoparticles and a magnetic scaffold prepared by the method, and more particularly, The present invention relates to a method for producing a porous magnetic scaffold in which a compatible polymer mixed solution is prepared by salt extraction, and a magnetic scaffold produced by the method.
조직 공학을 위한 스캐폴드는 줄기세포/간세포의 앵커리지(anchorage) 및 그들의 자기복제능력 및 가능한 계통 특이성 분화를 위한 사이트를 제공하는 중요한 역할을 한다. 이러한 스캐폴드는 적당한 분해성을 가지고, 독성이 없으며, 조직 치료 및 재생과정과 관련하여 활발한 활성을 가지는 것이 우선적으로 요구된다. 표면 화학 및 용해가능한 요소의 방출과 같은 스캐폴드에 의하여 제공되는 생화학적 신호에 대하여 광범위하게 연구되어져 왔다. 또한, 최근에 스캐폴드의 표면 거칠기, 위상 및 기질 탄성을 포함하는 바이오물리적 요소가 세포, 특히 줄기세포의 거동을 파악하고, 조직공학에 적용하기 위한 궁극적인 잠재성을 측정하기 위하여 연구되고 있다. Scaffolds for tissue engineering play an important role in providing sites for anchorage of stem cells / hepatocytes, their ability to self-replicate, and possible phagocytic differentiation. Such scaffolds are preferred to have moderate degradability, no toxicity, and active activity in connection with tissue treatment and regeneration processes. Biochemical signals provided by scaffolds such as surface chemistry and release of soluble elements have been extensively studied. Recently, bio-physics including the surface roughness, phase and substrate elasticity of the scaffold have been studied to understand the behavior of cells, especially stem cells, and to measure the ultimate potential for application to tissue engineering.
최근 대두되고 있는 하나의 흥미로운 신호는 자성 특성이다. 자성 스캐폴드 디자이닝이 상처 및 질병에서 조직의 재생 및 치료에 대하여 주목받고 있다. 이러한 연구에서 공정 전략은 우선적으로 산화철 나노입자(NPs)를 포함하는 수용성의 액체자석 내에서 스캐폴드의 딥-코팅(dip-coating)과 관련되어 있다. 특히, 자성 나노입자(NP)가 포함되어 있는 스캐폴드는 생체 외의 성장 요소 및 다른 바이오분자들을 끌어당긴다. 또한, 스캐폴드 내부에 MNP의 결합이 증가된 세포의 분열 및 뼈 분화와 관련된 다수의 유전자의 발현 레벨을 이끄는 유도자기 전압으로부터 변화된 기계적 응력과 같은 기계-전기적 변환을 인식하는 뼈 조직 능력 때문에 뼈 세포 성장 및 분화 속도를 증가시킨다.One interesting signal that is emerging in recent years is magnetic properties. Magnetic scaffold designing has attracted attention for tissue regeneration and treatment in wound and disease. In this research, the process strategy is primarily concerned with dip-coating of scaffolds in water-soluble liquid magnets containing iron oxide nanoparticles (NPs). In particular, scaffolds containing magnetic nanoparticles (NP) attract in vitro growth factors and other biomolecules. In addition, due to the ability of the bone tissue to recognize mechanical-electrical transitions, such as mechanical fragmentation of cells with increased binding of MNPs inside the scaffold and mechanical stresses induced from induced magnetic voltage leading to expression levels of multiple genes associated with bone differentiation, Increases growth and differentiation rate.
이들의 생체적합적이고 무독성의 특성 때문에, MNP, 주로 초상자성의 산화철 나노입자(NPs)는 MRI(magnetic resonance imaging), 약물전달, 세포 및 조직 타겟팅 및 발열요법과 같은 다양한 바이오메디컬 분야에서 사용되어지고 있다. 특히 발열 요법에 대하여, 외부 교류의 자기장의 적용에 의해 원거리에서도 활성을 가질수 있는 나노수준의 열-발생원의 디자인은 매력적이다. 이러한 비침투성의 기법은 특이적 조직의 성장 및 분화를 유도하는 국소적 요법 및 조절된 약물방출을 제공할 수 있다. 그러나 표적 요법을 위한 자기장의 치료적 분야는 몇몇의 한계를 가지고 있다. 이러한 관점에서, MNP의 적절한 디자인으로 이식 가능한 바이오재료 또는 조직공학 스캐폴드의 제형화는 뼈를 포함하는 조직의 치료 및 재생에 있어 가장 매력적인 연구분야 중 하나로 여겨진다. 환자 개인적 필요에 자기적 활성을 제공하는 스캐폴드는 세포에 대하여 기질을 가이딩하고 자극하는 역할을 한다. Because of their biocompatible and non-toxic properties, MNP, primarily superparamagnetic iron oxide nanoparticles (NPs), have been used in a variety of biomedical fields such as magnetic resonance imaging (MRI), drug delivery, cell and tissue targeting and fever therapy have. In particular, for heat therapy, the design of a nano-level heat-source that can be active at a long distance by application of the external alternating magnetic field is attractive. This non-invasive technique may provide localized therapy and controlled drug release leading to the growth and differentiation of specific tissues. However, the therapeutic field of magnetic fields for targeted therapy has some limitations. In this regard, the formulation of implantable biomaterials or tissue engineering scaffolds into the appropriate design of MNPs is considered one of the most attractive areas of research for the treatment and regeneration of bone-containing tissues. Scaffolds that provide magnetic activity to the patient's individual needs serve to guide and stimulate the substrate to the cells.
최근에, MNP는 스캐폴드에 자기적 특성을 추가로 제공하기 위하여 고분자 스캐폴드 안에 혼입될 수 있는 나노구성물로서 소개되어 왔다. MNP를 포함하는 무기 나노입자의 혼입은 기계적 및 생물학적 측면에서 골 복구 및 재생에 더 적합한 특성을 갖는 폴리머 기반 뼈 재생 스캐폴드를 생산하기 위한 유용한 전략으로 여겨진다. 스캐폴드에 혼입된 MNP는 뼈 형성 및 질병 치료에 유리한 세포 반응의 자극 및 변화에 수많은 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다. 이는 자기장 하에, 골 세포의 자기-기계적 유도 또는 암 세포의 온도로 유도되는 고열 치료법은 스캐폴드의 유용성이 설명 가능한 이유이다. Recently, MNP has been introduced as a nanocomposite that can be incorporated into the polymer scaffold to provide additional magnetic properties to the scaffold. The incorporation of inorganic nanoparticles, including MNP, is considered a useful strategy for producing polymer-based bone regeneration scaffolds with properties more suitable for bone repair and regeneration in terms of both mechanical and biological aspects. MNPs incorporated into the scaffold are believed to play a number of important roles in stimulating and changing cellular responses favoring bone formation and disease treatment. This is the reason why the scaffold's usefulness can be explained by the high-temperature treatment induced by the magnetic-mechanical induction of bone cells or the temperature of cancer cells under a magnetic field.
이에 기초하여, 본 발명자들은 뼈 회복의 목적으로 MNP가 혼입된 자성 생체적합성 폴리머 스캐폴드를 개발하였다. 표면이 기능화된 MNP가 폴리카프로락톤(PCL)에 첨가되고 염류 용탈(salt-leaching) 방법으로 발포(foam) 스캐폴드를 생산하였다. PCL-MNP 스캐폴드의 물리-화학적, 기계적 및 자기적 특성을 확인하고, 뼈 조직공학에 유용성을 발견하기 위하여 쥐의 골 세포의 반응뿐 아니라 조직 적합성을 분석하였다.
Based on this, the present inventors have developed a magnetic biocompatible polymer scaffold incorporating MNP for bone restoration purposes. Surface-functionalized MNP was added to polycaprolactone (PCL) and a foam scaffold was produced by a salt-leaching method. The physico-chemical, mechanical, and magnetic properties of the PCL-MNP scaffolds were examined, and tissue compatibility was assessed as well as bone cell responses in rats to find usefulness in bone tissue engineering.
본 발명의 하나의 목적은 자성 나노입자를 제조하는 제1단계; 생체적합성 폴리머 용액을 제조하는 제2단계; 상기 자성 나노입자를 생체적합성 폴리머 용액에 균일하게 분산시키는 제3단계; 및 상기 자성 나노입자가 균일하게 분산된 생체적합성 폴리머 용액을 염이 첨가된 몰드(mold)에 투입하여 동결건조하는 제4단계를 포함하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a magnetic nanoparticle comprising: a first step of preparing magnetic nanoparticles; A second step of preparing a biocompatible polymer solution; A third step of uniformly dispersing the magnetic nanoparticles in a biocompatible polymer solution; And a fourth step of injecting a biocompatible polymer solution in which the magnetic nanoparticles are uniformly dispersed into a salt-added mold and freeze-drying the magnetic composite nanoparticles, and a fourth step of preparing the magnetic scaffold for bone regeneration.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 자성 나노입자가 생체적합성 폴리머에 균일하게 분산된 뼈 재생용 자성 스캐폴드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a magnetic scaffold for bone regeneration wherein the magnetic nanoparticles produced by the above-described method are uniformly dispersed in the biocompatible polymer.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 자성 스캐폴드를 유효성분으로 하는 뼈 재생용 조성물.
It is still another object of the present invention to provide a bone regeneration composition comprising a magnetic scaffold prepared by the above production method as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 자성 나노입자를 제조하는 제1단계; 생체적합성 폴리머 용액을 제조하는 제2단계; 상기 자성 나노입자를 생체적합성 폴리머 용액에 균일하게 분산시키는 제3단계; 및 상기 자성 나노입자가 균일하게 분산된 생체적합성 폴리머 용액을 염이 첨가된 몰드(mold)에 투입하여 동결건조하는 제4단계를 포함하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a magnetic nanoparticle comprising: a first step of preparing magnetic nanoparticles; A second step of preparing a biocompatible polymer solution; A third step of uniformly dispersing the magnetic nanoparticles in a biocompatible polymer solution; And a fourth step of injecting a biocompatible polymer solution in which the magnetic nanoparticles are uniformly dispersed into a salt-added mold and freeze-drying the magnetic biocompatible polymer solution.
이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
본 발명의 뼈 재생용 자성 스캐폴드는 생체적합성 폴리머에 균일하게 분포된 자성나노입자의 구조적, 자기적 특성을 이용하여 친수성, 물에 의한 스캐폴드의 팽창성 및 기계적 강도를 포함하는 기계적 특성 및 미네랄화, 세포부착, 조직 적합성 등의 생물학적 특성이 향상된 뼈 재생용 자성 스캐폴드를 제조하는 것을 특징으로 한다.
The magnetic scaffold for bone regeneration according to the present invention uses mechanical and magnetic properties of magnetic nanoparticles uniformly distributed in a biocompatible polymer, and has mechanical properties including hydrophilicity, swellability of scaffold by water and mechanical strength, and mineralization , Cell adhesion, tissue compatibility, and the like, is improved by preparing a magnetic scaffold for bone regeneration.
본 발명의 "자성 나노입자"는 자성을 띄는 물질로서 극미세 영역의 물질이다. 자성나노입자는 구조적, 자기적 특성 때문에 다양하게 응용될 수 있는데, MRI 조영제, 생체진단 기기, 위조방지잉크, 스피커 내부의 기기 조절 장치 등이 그 예이다. 대부분 전기를 사용하는 장치가 많은 실생활에서, 자기에 의해 조절이 가능한 자성 나노입자의 도입은 편리함을 주고 비용 절감에 효과적이다.The "magnetic nanoparticle" of the present invention is a substance having magnetic properties and is a substance in a very fine region. Magnetic nanoparticles can be applied in a variety of applications due to their structural and magnetic properties, such as MRI contrast agents, bio-diagnostic devices, anti-fake inks, and device control devices within speakers. In most practical applications where many electric devices are used, the introduction of magnetically tunable magnetic nanoparticles is convenient and cost effective.
특히, bio 분야의 응용되는 자성나노입자들은 각각의 용도에 맞게 다양한 작용기를 함께 결합시킬 수 있다. 그 중 생체 진단 시약이나 DNA, RNA분리 정제, MRI 조영제 등은 생체 환경에서 안정성이 요구되는 수산화기(OH), 아민기(NH2), 카르복실기(COOH) 등의 작용기를 결합시켜 반응성과 안정성을 높인다. 각각의 작용기는 생체 내 특이적 결합이나 안정성을 고려하여 선택된다. In particular, the magnetic nanoparticles used in the bio field can bind various functional groups together for each use. Among them, bio-diagnostic reagents, DNA, RNA separation and purification, and MRI contrast agents enhance the reactivity and stability by binding functional groups such as hydroxyl group (OH), amine group (NH 2 ) and carboxyl group (COOH) . Each functional group is selected in consideration of specific binding or stability in vivo.
이러한 자성나노입자는 응용시 자기장에 민감해야 하기 때문에 입자 하나하나를 분산시키는 처리 과정이 필요하다. 자성현탁액은 자성나노입자를 용매에 분산시킨 것으로 자기장의 세기와 방향에 따라 조절이 가능하다. 자성현탁액 조제 시 자성나노입자가 용매 내에서 응집하지 않도록 하는 처리 기술은 매우 중요하다.Since these magnetic nanoparticles must be sensitive to the magnetic field during application, it is necessary to dispose the particles one by one. Magnetic suspensions are magnetic nanoparticles dispersed in a solvent and can be adjusted according to the strength and direction of the magnetic field. The treatment technique for preventing the magnetic nanoparticles from aggregating in the solvent during the preparation of the magnetic suspension is very important.
상기 자성 나노입자는 철 (Fe)을 포함하는 초상자성을 띠는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 철 함유 자성 나노입자로서 마그네타이트 나노입자(magnetite, Fe3O4)를 사용하였다. The magnetic nanoparticles may have a superparamagnetic property including iron (Fe). In one embodiment of the present invention, magnetite nanoparticles (Fe 3 O 4 ) were used as iron-containing magnetic nanoparticles.
또한, 상기 자성 나노입자의 평균 직경은 5 내지 20㎚일 수 있으며, 바람직하게는 8 내지 15㎚, 더욱 바람직하게는 10 내지 11 ㎚일 수 있다.In addition, the average diameter of the magnetic nanoparticles may be 5 to 20 nm, preferably 8 to 15 nm, and more preferably 10 to 11 nm.
또한, 상기 자성 나노입자는 계면활성제로 표면개질되어 있는 것을 특징으로 하는 바, 상기 계면활성제는 1,2-헥사데칸다이올(1,2-hexadecanediol), 올레산(oleic acid), 올레일아민(oleylamine) 및 벤질에터(benzyl ether)로 이루어진 군에서 선택된 1종이상인 것을 사용할 수 있다.Also, the magnetic nanoparticles are surface-modified with a surfactant, and the surfactant is selected from the group consisting of 1,2-hexadecanediol, oleic acid, oleylamine ( oleylamine, and benzyl ether may be used.
또한, 상기 제3단계에서 자성 나노입자가 분산된 생체적합성 폴리머 용액 중 자성 나노입자의 함량은 전체 혼합용액의 중량 기준으로 1 내지 20중량%일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10중량%일 수 있다.
In addition, the content of the magnetic nanoparticles in the biocompatible polymer solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed in the third step may be 1 to 20 wt%, preferably 5 to 10 wt% have.
본 발명의 "생체적합성"는 생체재료가 생체조직이나 체액 등과 접촉하였을 때 거부반응을 나타내지 않아야 하는 특성으로, 생체 내에서 세포독성, 생체조직 자극, 염증 유발, 알레르기 유발, 혈전형성 등을 나타내지 않는 특성을 말한다. 즉, 생체조직과의 상호작용으로 정상적인 대사와 생리적인 과정 등에 부정적인 영향을 미치지 않는 것을 가리킨다.
&Quot; Biocompatibility "of the present invention is a characteristic that a biomaterial should not exhibit a rejection reaction when it comes into contact with a living body tissue or a body fluid. The biomaterial is a substance that does not exhibit cytotoxicity in vivo, biological tissue stimulation, inflammation induction, allergen induction, Characteristics. In other words, it does not negatively affect normal metabolism and physiological process by interaction with living tissue.
본 발명의 "생체적합성 폴리머"는 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. The "biocompatible polymer" of the present invention may be a polymeric material such as polyimides, polyamix acid, polycarprolactone, polyetherimide, nylon, polyaramid, But are not limited to, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenyleneterephthalamide, polyaniline, polyacrylonitrile, polyethylene Polyolefins such as polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, polymethylmethacrylate, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) , Copolymers of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly {poly (ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate} (PEOT / PBT) Polyesters such as polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), polyorthoester (POE), poly (propylene fumarate) propylene fumarate-diacrylate (PPF-DA) and poly (ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA)
본 발명의 생체적합성 폴리머는 바람직하게는 폴리카프로락톤 (polycarprolactone)일 수 있다.The biocompatible polymer of the present invention may preferably be polycarprolactone.
또한, 상기 제2단계에서 생체적합성 폴리머 용액의 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 디옥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일수 있으며, 바람직하게는 클로로포름일 수 있다.In the second step, the solvent of the biocompatible polymer solution may be at least one selected from the group consisting of acetonitrile, dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran and dioxane, preferably chloroform.
또한, 상기 제4단계에 있어서, 다공성의 지지체 구조물을 제조하기 위하여 염추출법을 사용하고 동결건조하여 뼈 재생용 자성 스캐폴드를 제조할 수 있다. In the fourth step, a magnetic scaffold for bone regeneration can be prepared by using a salt extraction method and lyophilization to prepare a porous support structure.
구체적으로, 일정한 크기로 걸려진 염 입자를 플라스틱 몰드 안으로 부은 후, 압력을 가하여 밀폐시키고, 상기 제3단계에서 제조된 혼합용액을 한 방울씩 첨가한 후 1 내지 5일 동안 동결건조할 수 있다. 이후 염의 완전한 제거를 위하여 증류수로 여러차례 세척할 수 있다.Specifically, the salt particles suspended in a predetermined size may be poured into a plastic mold, and then the mixture may be sealed by applying pressure. The mixed solution prepared in the third step may be added dropwise and then lyophilized for 1 to 5 days. It can then be washed several times with distilled water for complete removal of the salt.
상기 염추출법에서 염은 NaCl을 사용할 수 있다.In the salt extraction method, NaCl may be used as a salt.
또한, 상기 염은 200 내지 500㎛의 평균입경을 가진 것을 사용할 수 있다. The salt may have an average particle diameter of 200 to 500 mu m.
또한, 상기 제4단계에서 동결건조는 - 90 ~ - 60 ℃의 온도 및 3 ~ 8 Torr의 압력 조건에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 -75 ~ -64 ℃의 온도 및 4~5 Torr의 압력 조건에서 실시될 수 있다. In the fourth step, freeze-drying may be performed at a temperature of -90 to -60 ° C and a pressure of 3 to 8 Torr, preferably at a temperature of -75 to -64 ° C and a pressure of 4 to 5 Torr . ≪ / RTI >
또한, 상기 제4단계의 동결건조는 테프론, 폴리에틸렌 및 초고분자량 폴리에틸렌 및 벤질에터(benzyl ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 재질의 몰드를 사용할 수 있다.
The lyophilization of the fourth step may be performed using a mold selected from the group consisting of Teflon, polyethylene, ultrahigh molecular weight polyethylene, and benzyl ether.
본 발명의 "스캐폴드"는 조직 공학(tissue engineering) 분야에서 사람이나 동물의 조직의 세포를 생체 외에서 배양하여 다시 인체나 동물 내에 이식하기 위한 지지체이다. 구체적으로, 상기 스캐폴드는 사람이나 동물의 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리시킨 후, 상기 스캐폴드에 배양하여 세포-스캐폴드 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-스캐폴드 복합체를 다시 인체나 동물 내에 이식하기 위하여 사용된다.The "scaffold" of the present invention is a support for culturing cells of human or animal tissues in vitro in the field of tissue engineering and transplanting them back into human or animal. Specifically, the scaffold is obtained by collecting a human or animal tissue, separating the cells from the tissue, culturing the scaffold in the scaffold to prepare a cell-scaffold complex, It is used to transplant in animals.
조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관 및 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기에 적용되고 있는데, 이러한 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 스캐폴드가 제공되어야 한다. 이상적인 스캐폴드의 기본 요건은 크게 무독성, 기계적 물성 그리고 다공성을 들 수 있다.
Tissue engineering techniques have been applied to almost all organs of human body such as artificial skin, artificial bone, artificial cartilage, artificial cornea, artificial blood vessel and artificial muscle. In order to optimize the regeneration of such living tissues and organs, basically, Folds shall be provided. The basic requirements of an ideal scaffold are largely non-toxic, mechanical properties and porosity.
무독성은 세포-지지체 복합체를 생체조직 내 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 것을 말하며, 지지체의 기계적 물성은 세포의 성장을 충분히 지지할 수 있는 강도 등을 말하며, 지지체의 다공성은 지지체에 세포의 접착이 잘 일어날 뿐만 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고 또 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조를 말한다. 기본적으로 세포는 2차원적인 배양이 이루어지는데 이를 조직이나 장기의 형태로 배양하기 위해서는 3차원의 스캐폴드가 필요하다. 이러한 스캐폴드는 수많은 기공을 가지고 있어 세포들이 내 외부에 부착할 수 있어야 하며 세포의 성장에 필요한 양분을 공급받고 노폐물을 배출하기 위해 열린 구조를 가져야 한다. 즉 다공성의 3차원 스캐폴드가 필요한 것이다.
The non-toxic refers to the absence of blood coagulation or inflammation after transplantation of the cell-support complex into a living tissue, the mechanical properties of the support refers to the strength sufficient to support the growth of the cell, and the porosity of the support Adhesion occurs well, and sufficient space is secured between cells and cells, and oxygen and nutrients are supplied well by diffusion of body fluids, and neovascularization is smoothly performed, thereby successfully growing and differentiating cells. Basically, the cells are cultured in two dimensions. In order to cultivate them in the form of tissue or organ, a three-dimensional scaffold is necessary. These scaffolds must have numerous pores to allow cells to attach to the interior and exterior, and to have an open structure to feed the nutrients needed to grow the cells and to drain away waste products. That is, a porous three-dimensional scaffold is required.
따라서 상기 기본적 요건을 만족하는 스캐폴드로는 동물 체내의 세포외 기질과 유사한 것이 적합하며, 상기 세포외 기질과 같은 다공성을 가진 지지체를 제조하는 방법이 연구되어 왔다. 대표적인 방법으로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.Accordingly, scaffolds satisfying the above-mentioned basic requirements are preferably similar to extracellular matrix in the animal body, and a method for producing a porous support such as the extracellular matrix has been studied. Representative methods include particulate leaching, emulsion freeze-drying, high pressure gas expansion, phase separation, and electrospinning.
본 발명의 상기 요건을 만족하는 자성 스캐폴드를 제조하기 위하여 염 입자 추출법 또는 동결 건조법을 사용할 수 있다.
Salt particle extraction or lyophilization may be used to produce a magnetic scaffold that meets the above requirements of the present invention.
한편, 스캐폴드는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 스캐폴드 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 스캐폴드는 생체외 또는 생체내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있다. 이러한 특성을 갖는 스캐폴드를 제조하기 위해 생체적합적이며, 생분해성인 폴리머를 사용한다.On the other hand, the scaffold should be biocompatible and the cell should be able to attach and propagate on the scaffold to form tissue or organ equivalents. Thus, the scaffold can be considered as a substrate for cell growth in vitro or in vivo. Biocompatible, biodegradable polymers are used to prepare scaffolds with these properties.
또한, 전술한 다공성 구조를 가지는 생분해성 폴리머로 이루어진 스캐폴드에 이식되는 조직세포는 계속적인 성장에 의하여 일련의 조직을 형성하게 되는데, 일반적인 생체조직의 재생은 재생하고자 하는 생체조직 형태로 스캐폴드 모양을 제조한 후, 상기 스캐폴드 내부에 조직세포를 이식하고, 이식된 조직세포를 성장시키는 방법을 이용할 수 있다.
In addition, tissue cells implanted into a scaffold made of a biodegradable polymer having the above-described porous structure form a series of tissues by continuous growth. Regeneration of a general biotissue is performed by a scaffold shape And then transplanting the tissue cells into the scaffold and growing the transplanted tissue cells.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 기술한 제조방법에 의하여 제조된 자성 나노입자가 생체적합성 폴리머에 균일하게 분산된 뼈 재생용 자성 나노섬유 스캐폴드를 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides a magnetic nanofiber scaffold for bone regeneration wherein the magnetic nanoparticles produced by the above-described production method are uniformly dispersed in the biocompatible polymer.
상기 제조된 스캐폴드에서 자성 나노입자의 함량은 전체 혼합용액의 중량기준으로 1 내지 20중량%일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 10중량%일 수 있다.
The content of the magnetic nanoparticles in the prepared scaffold may be 1 to 20 wt%, preferably 5 to 10 wt%, based on the weight of the total mixed solution.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 기술한 제조방법에 의하여 제조된 자성 나노섬유 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는 뼈 재생용 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a bone regeneration composition comprising the magnetic nanofiber scaffold prepared by the above-described production method as an active ingredient.
앞서 설명한 바와 같이 상기 뼈 재생용 스캐폴드는 결손 부위로의 이식을 통해 뼈 결손치료를 수행하기 위한 유효성분으로서 사용된다.
As described above, the bone regeneration scaffold is used as an active ingredient for performing bone defect treatment through transplantation to a defect site.
본 발명에 따른 뼈 재생용 스캐폴드는 중간엽 줄기세포 등이 스캐폴드에 탑재된 즉시 이식할 수도 있고, 일정 기간의 배양을 통해 스캐폴드 상에서 세포를 증식시킨 후 생체 내로 이식할 수 있다.
The scaffold for bone regeneration according to the present invention can be transplanted immediately after the mesenchymal stem cells are loaded on the scaffold or can be transplanted into the living body after proliferation of the cells on the scaffold through a certain period of culture.
상기 뼈 재생용 조성물은 본 발명에 따른 뼈 재생용 스캐폴드뿐만 아니라 이를 이식에 적절한 상태로 유지하기 위한 수용액, 예를 들어 완충액 또는 주사제용 수용액 등을 포함할 수 있다.
The bone regeneration composition may include not only a scaffold for bone regeneration according to the present invention but also an aqueous solution for maintaining it in a state suitable for transplantation, for example, a buffer solution or an aqueous solution for injections.
본 발명의 제조방법에 따른 자성 나노섬유 스캐폴드는 자성 나노입자를 혼입함으로써 균일하게 분포된 자성 나노입자의 구조적, 자기적 특성으로 인하여 친수성 및 물에 대한 스캐폴드의 팽창성을 증가시키고, 미네랄 유도를 향상시키고, 기계적 강도를 향상시키는 등 기계적 특성이 향상되는 효과를 갖는다. 또한, 생체외 아파타이트(apatite) 형성/분해, 세포접착력, 세포침투, 생체적합성 및 생체 내 골 형성 능력 등의 생물학적 특성이 향상되어 생체 내의 원하는 부위에 안전하고 효과적으로 뼈의 재생을 촉진시킬 수 있다.
The magnetic nanofiber scaffold according to the manufacturing method of the present invention increases the hydrophilicity and expandability of the scaffold to water due to the structural and magnetic characteristics of the uniformly distributed magnetic nanoparticles by incorporating the magnetic nanoparticles, And mechanical properties such as mechanical strength are improved. In addition, biological properties such as in vitro apatite formation / degradation, cell adhesion, cell penetration, biocompatibility, and in vivo bone formation ability can be improved to promote safe and effective bone regeneration at a desired site in the living body.
도 1은 표면 기능화된 MNP의 특성 측정 결과이다. 이 때, (a)는 TEM 결과이고, (b)는 히스테리시스 루프를 나타낸다.
도 2는 매우 다공성의 구조 및 스캐폴드 내에 MNP의 분산을 보여주는 EDS 맵핑 이미지를 나타내는 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 스캐폴드의 특성을 측정한 결과이다; PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 (a) XRD 패턴, (b) FT-IR 스펙트럼 및 (c) TG 분석을 나타낸다.
도 4는 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 (a) 수 접촉각, (b) 물 흡수 능력 및 (c) 팽윤 부피를 나타낸다.
도 5는 스캐폴드의 시간- 및 MNP-의존 아파타이트 형성능력을 측정한 결과이다; SBF에 1일, 3일 및 7일 동안 담근 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 (a) SEM 몰폴로지 및 (b) XRD 패턴을 나타낸다. SEM 이미지에서 스캐일 바는 5㎛이고, XRD에서 별표된 회절 피크는 아파타이트의 특징적인 밴드를 나타낸다.
도 6(a)는 상온에서 측정된 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 자기장-의존 자화 곡선을 나타내고, 도 6(b)는 정적 자기장 하에서 영구 자석과 이러한 자화된 스캐폴드 사이에 자기적 거리를 나타낸다. 사진은 영구자석과 스캐폴드의 자기적 상호작용을 보여준다.
도 7은 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드에 대하여 (a)전형적인 압축 응력-변형도 곡선에 의하여, (b)는 (a)의 삽도에서의 초기 선형 지역으로부터 얻어진 탄성계수에 의하여 정적 기계적 특성을 나타낸다.
도 8은 주파수 스윕동안 실행된 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드에서 기록된 저장 탄성율(E'), 손실 모듈러스(E"), 탄젠트 델타(E"/E') 및 이들의 평균값을 동적 기계적 분석으로 나타낸다.
도 9는 1,3 및 24시간동안 스캐폴드에 세포접착력; (a) SEM 세포 몰폴로지 및 (b) CCK 분석을 나타낸다. SEM에서 스캐일바는 50㎛이고, 원-웨이 ANOVA 테스트에서 *p<0.05 및 **p<0.01이다.
도 10은 스캐폴드에서의 골 형성 세포의 증가; (a) 배양 14일 째 SEM 측정 및 (b) 3, 7, 14 및 21일 배양기간에 세포의 CCK 분석을 나타낸다.
도 11은 (a) 배양 7, 14 및 21일째 칼슘 축적의 ARS 정량적 측정에 의한, (b) 21일 동안 PCL-MNP10 스캐폴드에 배양된 세포에 축적된 Ca(녹색) 및 P(청색)의 EDS 맵핑 및 Ca 및 P 신호의 EDS 스팩트럼에 의한 세포 미네랄화 분석을 나타낸다.원-웨이 ANOVA 테스트에서 *p<0.05 및 **p<0.01이다.
도 12는 쥐의 피하조직에 2주동안 이식된 스캐폴드의 염색된 조직을 나타낸다. 모든 그룹은 스캐폴드 주변에 온화한 염증 반응과 얇은 캡슐의 유사한 재생 패턴을 보여준다. 그룹들에 대한 생물학적 호스트 반응은 최소화되었다(F: 섬유화 캡슐, P : 폴리머 및 R: 잔여물).Fig. 1 shows the measurement results of the surface-functionalized MNP. At this time, (a) shows a TEM result and (b) shows a hysteresis loop.
Figure 2 shows a SEM image of the PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds showing EDS mapping images showing the highly porous structure and dispersion of MNP in the scaffold.
3 shows the result of measuring the characteristics of the scaffold; (A) XRD pattern, (b) FT-IR spectrum and (c) TG analysis of PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds.
Figure 4 shows (a) water contact angle, (b) water absorption capacity and (c) swelling volume of PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds.
Figure 5 is the result of measuring the time-and the MNP-dependent apatite formation ability of the scaffold; (A) SEM morphology and (b) XRD patterns of PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds submerged in SBF for 1, 3 and 7 days. In the SEM image, the scale bar is 5 μm, and the diffraction peaks starred in XRD represent characteristic bands of apatite.
Figure 6 (a) shows the magnetic field-dependent magnetization curves of the PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds measured at ambient temperature, Figure 6 (b) It represents the enemy distance. The photograph shows the magnetic interaction between the permanent magnet and the scaffold.
Fig. 7 is a graph showing the relationship between (a) the typical compressive stress-strain curves for PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds, (b) Mechanical properties.
Figure 8 shows the storage elastic modulus (E '), loss modulus (E "), tangent delta (E" / E') and their average values recorded in the PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds performed during the frequency sweep Indicated by dynamic mechanical analysis.
Figure 9 shows cell adhesion to scaffolds for 1, 3, and 24 hours; (a) SEM cell morphology and (b) CCK analysis. The scale bar in the SEM is 50 탆, and * p < 0.05 and ** p < 0.01 in the one-way ANOVA test.
Figure 10 shows an increase in osteogenic cells in the scaffold; (a) SEM measurement at 14 days of culture and (b) CCK analysis of cells at 3, 7, 14 and 21 days of culture.
Figure 11 shows (a) the amount of Ca (green) and P (blue) accumulated in the cells cultured in the PCL-MNP10 scaffold for 21 days by (a) quantitative measurement of ARS on
Figure 12 shows the stained tissue of a scaffold implanted in the subcutaneous tissue of rats for two weeks. All groups show a mild inflammatory reaction around the scaffold and a similar regeneration pattern of thin capsules. The biological host response to the groups was minimized (F: fibrous capsules, P: polymer and R: residue).
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
본 발명의 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시하였으며, 통계적 분석은 원-웨이 ANOVA 분석을 사용하여 실행하였다. 독립적인 샘플 그룹과 비교하여. p < 0.05 또는 p < 0.01가 유의한 것으로 고려되었다.
The data of the present invention are expressed as mean ± standard deviation, and statistical analysis was performed using one-way ANOVA analysis. Compared to independent sample groups. p <0.05 or p <0.01 was considered to be significant.
실시예Example 1: One: MNPMNP 및 And PCLPCL -- MNPMNP 스캐폴드의Scaffold 제조 Produce
MNP는 공지된 방법을 사용하여 합성하였다(S.Sun et al, J.Am.Soc.,2004). 구체적으로, MNP는 질소분위기 하에 3.5318 g의 Fe(acac)3 (iron(III) acetylacetonate), 3.9123 g의 1,2-hexadecanediol, 10 ml의 올레산(oleic acid), 10 ml의 올레일아민(oleylamine) 및 40 ml의 벤질 에터(benzyl ether)를 혼합하여 제조했다. 상기 혼합물은 교반하는 동시에 30분 동안 200 ℃에서 환류(reflux)하기 위해 예열된 후, 질소에서 추가적으로 2시간 동안 300 ℃로 가열하였다. 상기 흑갈색 혼합물은 상온에서 냉각하였고, 침전물에 50 ml의 에탄올을 첨가하였다. 상기 생성물을 5분 동안 10000 rpm의 원심분리로 수집한 후, 에탄올로 4회 세척하고, 50 ℃에서 건조하였다. MNP의 몰폴로지 및 자기적 특성은 투과 전자 현미경(TEM; 7100, JEOL, USA) 및 진동 시료 자력계(VSM; Quantum MPMS-XL7, USA)를 이용하여 측정하였다.MNP was synthesized using known methods (S. Sun et al, J. Am. Soc., 2004). Specifically, MNP was prepared by reacting 3.5318 g of Fe (acac) 3 (iron (III) acetylacetonate), 3.9123 g of 1,2-hexadecanediol, 10 ml of oleic acid, 10 ml of oleylamine ) And 40 ml of benzyl ether. The mixture was preheated to reflux at 200 [deg.] C for 30 minutes while stirring, and then heated to 300 [deg.] C in nitrogen for an additional 2 hours. The dark brown mixture was cooled at room temperature and 50 ml of ethanol was added to the precipitate. The product was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes, washed four times with ethanol and dried at 50 < 0 > C. The morphology and magnetic properties of the MNPs were measured using a transmission electron microscope (TEM; 7100, JEOL, USA) and a vibrating sample magnetometer (VSM; Quantum MPMS-XL7, USA).
PCL-MNP 스캐폴드를 제조하기 위해, 우선 10% w/v의 PCL (약 80 kDa, Sigma-Aldrich, USA)을 클로로포름(CHCl3)에 용해시킨 후, 상기 제조된 MNP를 PCL 용액에 첨가하였다. MNP의 농도는 0, 5 및 10 wt%로 제조하였고, 각각을 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10로 명명하였다. 상기 혼합 용액을 균일하고 안정하게 하기 위해 초음파 처리하였다. 걸러진(sieved) NaCl 입자 (200 내지 500 μm의 직경)를 원통형 플라스틱 몰드 안으로 부은 후, 압력을 가하여 단단히 밀폐시켰다. 그 후에 상기 혼합액을 NaCl로 가득찬 몰드 안으로 한 방울씩 떨어뜨린 후, -70 ℃에서 얼려서 3일 동안 동결건조시켰다. 상기 과정을 거친 시료는 염을 완전히 침출(leach out)시키기 위해 100 rpm으로 교반하면서 10분 동안 증류수에서 9회 세척한 후, 다시 건조시켰다.
To prepare the PCL-MNP scaffold, firstly 10% w / v PCL (about 80 kDa, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in chloroform (CHCl 3 ) and the MNP prepared was added to the PCL solution . The concentrations of MNP were 0, 5 and 10 wt%, respectively, and named PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10, respectively. The mixed solution was sonicated to make it uniform and stable. Sieved NaCl particles (200-500 μm in diameter) were poured into the cylindrical plastic molds and tightly sealed with pressure. The mixture was then dropped by one drop into a mold filled with NaCl, frozen at -70 DEG C and lyophilized for 3 days. The sample thus obtained was washed 9 times in distilled water for 10 minutes while stirring at 100 rpm to leach out the salt, and dried again.
실험예Experimental Example 1 : One : PCLPCL -- MNPMNP 스캐폴드의Scaffold 물리화학적 특성 조사 Investigation of physical and chemical properties
스캐폴드의 몰폴로지를 주사 전자 현미경(SEM; S3000H, Hitachi, Japan)으로 관찰하였고, 이의 원자적인 조성은 에너지 분산 분광기(energy dispersive spectroscopy, EDS; Bruker, USA)로 분석하였다. 스캐폴드의 상은 X-ray 회절분석기(XRD, Rigaku, Japan)로 측정하였다. 스캐폴드는 40 kV 및 40 mA 전류강도에서 Cu Kα1를 사용하여 2°/min의 속도에서 0.02°, 2θ의 스텝 간격으로 2θ = 10 내지 60°의 회절각 범위에서 주사하였다. 스캐폴드의 화학적 상태를 관찰하기 위하여 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transformed infrared spectroscopy, FT-IR; Perkin-Elmer, USA)를 사용하였다. 열적 거동 및 스캐폴드 구성의 비율을 분석하기 위해 열 중량 분석(Thermogravimetric, TGA)을 수행하였다. 상기 시료는 질소 분위기 하에서 실온에서부터 500 ℃까지 10 ℃/min의 승온속도로 가열하였다. 스캐폴드가 물 또는 에탄올을 흡수하는 능력은 ΔWS (%) = ((WS - W0)/W0) × 100의 식을 따라 용매에 담그기 전과 후의 중량 변화로 측정하였다. W0 및 WS는 각 담그기 전 및 후의 스캐폴드 중량이다. 스캐폴드의 공극도 및 밀도는 기공도 측정기(mercury porosimeter; PM33, Quantachrome,USA)를 이용하여 측정하였다. 특이적 표면적은 질소 가스 하에서 Brunauer-Emmett-Teller (BET) 방법으로 분석되었다. 스캐폴드의 친수성은 Phoenix300 분석기로 접촉각을 측정함으로서 확인하였다. 스캐폴드 표면에 만들어진 물방울 이미지는 25 ℃에서 도달되는 평형 상태까지 뷰잉(viewing) 시스템을 사용하여 얻었다. 평형 상태에서의 물방울의 전형적인 사진을 각 시료에서 얻었고, 각 그룹에 대해 5개의 시료를 테스트하였다. 스캐폴드의 아파타이트(apatite) 형성 능력은 아파타이트 유도 과정의 속도를 높이고, 생체활성 물질의 아파타이트 형성 능력의 평가기간을 줄이기 위해 2배 농축된 SBF에 스캐폴드를 담궈 확인하였다. 각 시료(5 mm의 직경 및 3 mm의 두께)는 10 ml의 2배 종축된 SBF에 넣은 후, 주어진 기간(1, 3 및 7일) 동안 37℃에서 배양하였다. 각 시점에서 시료를 수집한 후, 증류수로 세척하고 상온에서 건조하였다. 상기 아파타이트 형성 능력을 SEM 및 XRD를 사용하여 분석하였다.The morphology of the scaffold was observed with a scanning electron microscope (SEM; S3000H, Hitachi, Japan) and its atomic composition was analyzed by energy dispersive spectroscopy (EDS; Bruker, USA). The image of the scaffold was measured with an X-ray diffractometer (XRD, Rigaku, Japan). Scaffolds were scanned at 40 kV and 40 mA current intensity using Cu Kα1 at a rate of 2 ° / min at a diffraction angle range of 2θ = 10 to 60 ° at step intervals of 0.02 °, 2θ. Fourier transformed infrared spectroscopy (FT-IR; Perkin-Elmer, USA) was used to observe the chemical state of the scaffold. Thermogravimetric (TGA) was performed to analyze the ratio of thermal behavior and scaffold configuration. The sample was heated from room temperature to 500 DEG C at a heating rate of 10 DEG C / min under a nitrogen atmosphere. Was measured by weight change - (W 0) / W 0 (W S) after immersion in a solvent in accordance with an expression of the scaffold before × 100 The ability to absorb water or ethanol is ΔW S (%) =. W 0 and W S are the scaffold weights before and after each soaking. The porosity and density of the scaffold were measured using a mercury porosimeter (PM33, Quantachrome, USA). The specific surface area was analyzed by the Brunauer-Emmett-Teller (BET) method under nitrogen gas. The hydrophilicity of the scaffold was confirmed by measuring the contact angle with a
포화 자화(magnetization) 및 이력곡선(hysteresis loops)의 측면에서 상기 시료의 자기적 특성은 실온에서 ± 20 kOe의 자기장을 적용하여 VSM으로 측정하였다. VSM은 상기 기계에서 제공된 표준(reference, 고순도 니켈 구체)를 기준으로 측정하였다.
In terms of saturation magnetization and hysteresis loops, the magnetic properties of the samples were measured by VSM applying a magnetic field of ± 20 kOe at room temperature. The VSM was measured on the basis of the reference provided on the machine (high purity nickel spheres).
일반적인 TEM 현미경사진으로부터(도 1a), 구형의 잘 분산된 MNP는 좁은 크기의 분포(대략 11 nm의 평균크기)로 관찰되었다. 합성된 MNP의 자기 이력 곡선을 상온에서 VSM에 의해 측정하여 도 1b에 도시하였다. MNP는 72.1 emu/g의 포화 자화를 갖는다. VSM 곡선은 원점을 통과하여 잔류 자화 및 항자기성은 VSM 곡선에서 관찰되지 않았다. 이는 상온에서 MNPS의 초상자성이 보존됨을 나타낸다. From typical TEM micrographs (FIG. 1A), spherical, well dispersed MNPs were observed with a narrow size distribution (average size of approximately 11 nm). The magnetic hysteresis curve of the synthesized MNP was measured by VSM at room temperature and shown in FIG. 1B. MNP has a saturation magnetization of 72.1 emu / g. The VSM curve passes through the origin and residual magnetization and antimagnetic properties are not observed in the VSM curve. This indicates that the superparamagnetism of MNPS is preserved at room temperature.
MNP는 이식에 따른 조직 주변에 매트릭스 스캐폴드에 천연 세포 및 조직의 마이크로 환경에 대해 유익한 물리적 환경을 제공하는 자기장을 만든다. 예를 들어, 조직 공학에서 자성 스캐폴드의 이용은 생체 내에서 혈관 형성 과정을 조절하는 대안으로 제안되어 왔다. 본 발명에서 제조된 PCL-MNP 자성 스캐폴드의 자화를 확인하였다. PCL-MNP 스캐폴드의 자기력은 매트릭스에 분산된 MNP에 의해 증가한다. 상온에서 건조한 PCL-MNP 스캐폴드의 자기적 특성은 VSM에 의해 측정된 그들의 전형적인 이력 곡선으로부터 알 수 있다. 도 6a는 PCL-MNP 스캐폴드의 자기장 대비 자화를 보여준다. PCL-MNP 스캐폴드의 이력 곡선은 MNP의 곡선과 유사한 경향을 보이고, PCL-MNP 스캐폴드의 자화 값은 MNP 함량에 대해 선형적으로 비례하였다(5% 및 10% MNP 함량에서 각 1.6 및 3.1 emu /g). 순수 MNP의 이력 곡선과 유사하게, 항자기성 및 잔류 전류는 PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드의 곡선에서 관찰되지 않았고, 이것은 스캐폴드의 초상자성을 나타낸다. 자기장에 의존한 자성 모멘트는 최대 0.5kOe까지 선형에 가까웠고, 포화 자화 값의 약 80%에 달하였다. 이는 충분한 자기장 하에 물질이 최대치로 자화에 도달 할 수 있을 때 얻어진다. 그러므로, 최대 자화는 자성 스캐폴드의 외부 자기장에서 작은 변화만으로 용이하게 달성 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 도 6b는 영구 자석 및 자화된 스캐폴드 사이에 거리를 측정함으로써 스캐폴드의 자기적 관계를 보여준다. 순수 PCL 스캐폴드의 거리는 0인 반면, 자화된 PCL-MNP5 및 PCL-MNP10의 스캐폴드는 각 4.43 및 7.23 mm였다. 이는 자화된 스캐폴드의 외부 자기장에 의해 유도된 거리를 의미한다. 추가적인 이미지는 자석이 붙은 스캐폴드를 보여준다. 자기적 특성을 기초로 PCL-MNP 스캐폴드는 비록 자성 스캐폴드의 포화 자화가 매우 작은 MNP 농도 때문에 상대적으로 작더라도 MNP가 혼입된 초상자성 거동을 보존하는 것으로 생각된다. 발생된 자기적 효과를 통해 조직 회복 또는 질병 치료를 자극하는 자성 스캐폴드의 생체내 효과를 해명하기 위해 추가적인 연구가 필요하다.
MNPs create magnetic fields around the tissue following transplantation that provide a physical environment beneficial to the microenvironment of natural cells and tissues in the matrix scaffold. For example, the use of magnetic scaffolds in tissue engineering has been proposed as an alternative to controlling the angiogenic process in vivo. The magnetization of the PCL-MNP magnetic scaffold prepared in the present invention was confirmed. The magnetic force of the PCL-MNP scaffold is increased by the MNP dispersed in the matrix. The magnetic properties of PCL-MNP scaffolds dried at room temperature can be seen from their typical hysteresis curves measured by VSM. Figure 6a shows the magnetic field versus magnetization of the PCL-MNP scaffold. The hysteresis curves of the PCL-MNP scaffold showed similar trends to that of the MNP curve, and the magnetization values of the PCL-MNP scaffold were linearly proportional to the MNP content (1.6 and 3.1 emu at 5% and 10% MNP contents, respectively) / g). Similar to the hysteresis curve of pure MNP, the antimagnetic and residual currents were not observed in the curves of the PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds, indicating the super magnetism of the scaffold. The magnetic moment depending on the magnetic field was close to linear up to 0.5 kOe and reached about 80% of the saturation magnetization value. This is obtained when the material can reach the maximum magnetization under a sufficient magnetic field. Therefore, it can be seen that the maximum magnetization can be easily achieved with only a small change in the external magnetic field of the magnetic scaffold. Figure 6b shows the magnetic relationship of the scaffold by measuring the distance between the permanent magnet and the magnetized scaffold. The distance of the pure PCL scaffold was 0 while the scaffolds of magnetized PCL-MNP5 and PCL-MNP10 were 4.43 and 7.23 mm, respectively. This is the distance induced by the external magnetic field of the magnetized scaffold. Additional images show the scaffold with magnets. On the basis of the magnetic properties, the PCL-MNP scaffold seems to preserve the superparamagnetic behavior with MNP even though the saturation magnetization of the magnetic scaffold is relatively small due to the very low MNP concentration. Further research is needed to elucidate the in vivo effects of magnetic scaffolds that stimulate tissue repair or disease treatment through the generated magnetic effects.
기공의 크기, 기공의 분산, 공극율과 같은 기공 구조의 특성들은 다공성 스캐폴드 및 세포 거동의 물리화학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 도 2는 스캐폴드의 SEM 현미경 및 EDS 매핑 이미지의 단면도이다. 모든 스캐폴드는 기공의 몰폴로지에 큰 차이 없이 잘 다듬어진 기공 구조를 보여준다. 250 μm보다 큰 마크로 기공은 세포의 투과 및 증식에 적합하다고 알려진 반면, 100 μm 작은 기공은 기공 안으로 세포의 침투를 제한한다. 골아세포 활성에서 기공 크기의 효과에 대한 보고에 따르면, 300 μm 보다 큰 구멍은 조골세포의 유도에 바람직하다. 따라서, 본 발명에서 구현된 250 내지 500 μm 범위의 기공 크기가 골 조직공학 분야에 적합하다. EDS 맵핑은 MNP가 혼입된 스캐폴드에서 높은 Fe 신호를 나타내었고, 상기 신호 분포가 균일하게 관찰되었다. Properties of pore structure such as pore size, pore dispersion, and porosity can affect the physico-chemical properties of porous scaffolds and cell behavior. 2 is a cross-sectional view of an SEM microscope and an EDS mapping image of the scaffold. All scaffolds show a well-pored pore structure with little difference in the morphology of the pores. Macro pores larger than 250 μm are known to be suitable for permeation and proliferation of cells, whereas small pores of 100 μm limit cell penetration into pores. According to reports of the effect of pore size on osteoblastic activity, pores larger than 300 μm are preferred for the induction of osteoblasts. Thus, the pore size in the range of 250 to 500 [mu] m, as embodied in the present invention, is suitable for bone tissue engineering. The EDS mapping showed a high Fe signal in the scaffold incorporating the MNP, and the signal distribution was uniformly observed.
공극율은 초기 에탄올 교체 테스트를 사용하여 측정한 기공도 측정기에 의해 측정된 기공과 유사한 범위, 65-70%를 보여준다. 표 1에 요약한 바와 같이, 벌크 밀도 및 구조 밀도와 같은 다른 특성도 이러한 방법에 의하여 측정되었다. 스캐폴드 중에서 공극률이 비슷한 반면, PCL보다 무기물인 MNP의 밀도가 더 높기 때문에, MNP의 함량이 증가할수록 밀도도 증가하였다. The porosity shows a range of 65-70%, similar to the porosity measured by the porosimeter measured using the initial ethanol replacement test. As summarized in Table 1, other properties such as bulk density and structure density were also measured by this method. The porosity of the scaffold is similar, but the density of MNP is higher than that of PCL.
스캐폴드의 표면적은 BET 분석을 통해 측정하였고, MNP가 증가할수록 증가함을 보였다. 참고로, 스캐폴드의 표면적은 공극율에 의존적이지 않았다. 오히려, 표면적 값은 MNP의 함량이 증가함에 따라 증가하였다. 이들의 나노 크기 특성으로, PCL 고분자 매트릭스 안에 고르게 분포된 MNP가 스캐폴드의 표면적을 향상시킬 것으로 해석 될 수 있다.The surface area of the scaffold was measured by BET analysis and increased with increasing MNP. For reference, the surface area of the scaffold was not dependent on porosity. Rather, surface area values increased with increasing MNP content. With their nano-size properties, MNPs evenly distributed in the PCL polymer matrix can be interpreted as improving the surface area of the scaffold.
또한, PCL-MNP 스캐폴드의 물리화학적 특성을 추가적으로 확인하였다. 이를 위해 스캐폴드의 상은 XRD 분석으로 확인하였다(도 3a). MNP는 2 θ가 약 31°, 36°, 43°, 54°, 57°, 및 63°인 곳에서 회절 피크를 보였고, 이것은 벌크 마그테타이트 (Fe3O4 ) 의 전형적인 피크이다. 가장 강한 회절 피크에 대해 Scherrer식으로 계산된 평균 입자 사이즈는 10.7 ± 0.019 nm였고, TEM 이미지에 의해 확인된 크기와 유사하였다. PCL-MNP 스캐폴드의 마그네타이트 피크는 MNP를 증가시키면 더 명확하게 관찰되었다.In addition, the physicochemical properties of the PCL-MNP scaffold were further confirmed. The image of the scaffold was confirmed by XRD analysis (Fig. 3A). The MNP showed diffraction peaks at 2θ of about 31 °, 36 °, 43 °, 54 °, 57 °, and 63 °, which is a typical peak of bulk magnetite (Fe 3 O 4 ) . The mean particle size calculated by the Scherrer equation for the strongest diffraction peak was 10.7 ± 0.019 nm, similar to the size identified by the TEM image. The magnetite peak of the PCL-MNP scaffold was more clearly observed when MNP was increased.
FT-TR 스펙트럼에 나타난 것 처럼(도 3b), 스캐폴드의 화학 결합 구조는 MNP의 Fe-O 본드 진동모드에 나타나는 578 cm-1에서 독특한 밴드를 포함하는 PCL 및 MNP와 관련된 전형적인 밴드를 보였다. 상기 밴드는 MNP의 함량을 높임으로써 PCL-MNP 스캐폴드에서 더 급격하게 나타났다. C=O 및 C-O 스트레칭의 전형적인 PCL 진동 밴드는 1720 및 1293 cm-1에서 관찰된다. 게다가, PCL의 약하고 넓은 O-H 스트레칭 밴드는 3153-3640 cm-1에서 알코올 그룹을 나타낸다. As shown in the FT-TR spectrum (FIG. 3b), the chemical bond structure of the scaffold showed a typical band associated with PCL and MNP, including a unique band at 578 cm -1 , which appears in the Fe-O bond oscillation mode of MNP. The band was more abruptly seen in the PCL-MNP scaffold by increasing the content of MNP. Typical PCL oscillation bands for C = O and CO stretching are observed at 1720 and 1293 cm -1 . In addition, the weak and broad OH stretching band of PCL represents an alcohol group at 3153-3640 cm -1 .
스캐폴드의 열적 거동은 TGA에 의해 모니터링되었다(도 3c). 순수 MNP의 TGA 곡선은 확실한 수준의 중량 손실(약 10%)를 보이며, 이는 잔여 유기 상 때문으로 추측된다. 반면에 순수 PCL의 전형적인 열적 분해는 거의 400 ℃ (99% 손실)에서 나타났고, PCL-MNP 스캐폴드는 스캐폴드 내 존재하는 MNP 함량 때문에 뚜렷한 수준의 중량이 남았다. 순수 MNP 및 PCL의 중량손실 또한 고려할 때, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드안에 MNP 함량은 각각 대략 4.71 및 10.01 wt%이고, 이는 스캐폴드의 제조에서 혼입된 MNP의 양과 유사하였다.
The thermal behavior of the scaffold was monitored by TGA (Figure 3c). The TGA curve of pure MNP shows a certain level of weight loss (about 10%), presumably due to residual organic phase. On the other hand, typical thermal degradation of pure PCL occurred at approximately 400 ° C (99% loss), and the PCL-MNP scaffold remained at a significant level of weight due to the MNP content present in the scaffold. MNP content in the PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds was approximately 4.71 and 10.01 wt%, respectively, which was similar to the amount of MNP incorporated in the manufacture of the scaffold, considering also the weight loss of pure MNP and PCL.
스캐폴드의 친수성의 결과는 도 4에서 보여준다. 순수 PCL 스캐폴드는 높은 정도의 소수성을 보인 반면(접촉각 85°), PCL-MNP 스캐폴드는 도 4a에 보인 것처럼 더 친수성이 되었다(5% MNP: 61° 및 10% MNP: 47°). 이는 MNP의 존재 때문이며, 더 구체적으로, MNP의 표면에 존재하는 카르복실 그룹 때문이다. 사실 염 침전과정 동안, MNP의 표면은 카르복실화 될 것이다. Jadhav et al.은 MNP를 잡는 계면활성제로서 올레산이 염 이온과 정전기적으로 결합하여 올레산의 COOH 그룹을 COO- 및 H+로 분해시킴으로써, 결과적으로 MNP의 친수성을 향상시킨다. 본 발명자는 또한 계면활성제에 잡힌 MNP의 물 분산성이 소듐 클로라이드 용액을 처리한 후 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(데이터 미도시).The results of the hydrophilicity of the scaffold are shown in Fig. The PCL-MNP scaffold became more hydrophilic (5% MNP: 61 ° and 10% MNP: 47 °), while the pure PCL scaffold showed a high degree of hydrophobicity (contact angle 85 °). This is because of the presence of MNP, and more specifically, the carboxyl group present on the surface of MNP. In fact during the salt precipitation process, the surface of MNP will be carboxylated. Jadhav et al. Is a surfactant that captures MNP, and oleic acid electrostatically binds with salt ions to decompose the COOH group of oleic acid into COO- and H +, resulting in improved hydrophilicity of MNP. The present inventors have also found that the water dispersibility of the MNP caught in the surfactant is remarkably increased after the treatment with the sodium chloride solution (data not shown).
상기 증가된 친수성의 결과로서, PCL-MNP 스캐폴드는 우수한 물 흡수 능력을 보여준다. 물 흡수는 최대 24시간의 기간 동안 측정되었고, 시료들 사이에 큰 차이를 보였다(도 4b). PCL-MNP 스캐폴드의 물 흡수는 몇 시간 안에 빠르게 거의 포화 수준에 도달하였다. 물 흡수량은 MNP 함량이 증가함에 따라 증가하였다. 그 결과, 24시간 후에, 물 흡수량는 PCL 스캐폴드에 대해 약 1440%, PCL-MNP5 스캐폴드에 대해 1870%, 및 PCL-MNP10 스캐폴드에 대해 2850%를 기록했다. PCL-MNP10 스캐폴드의 물 흡수 능력은 순수 PCL 스캐폴드에 비해 거의 2배 높았다. 그러므로, 스캐폴드는 물 흡수 후에 확실하게 팽윤되는 것을 관찰하였다. 광학적으로 측정된 것처럼(도 4c), 증가된 스캐폴드의 부피는 다음과 같았다: PCL에서 5%, PCL-MNP5에서 < 8%, PCL-MNP10에서 < 11%, PCL에 10% 의 MNP를 추가함으로 2배 증가함을 보였다. 사실, 물 흡수 레벨은 물의 공극-매움 및 스캐폴드의 팽윤 때문이다. 모든 스캐폴드에 대해 유사한 공극율을 생각할 때, 물 흡수 능력에서의 차이는 우선 팽윤되어 표면적이 변화된 특성의 결과였고, 즉, 물 분자가 MNP가 분산된 친수성 고분자 네트워크로 흡수된 물분자에 의하여, 스캐폴드의 팽윤은 상당히 증가된 자성 스캐폴드의 물 흡수 능력을 나타낸다.
As a result of the increased hydrophilicity, the PCL-MNP scaffold exhibits excellent water absorption capacity. Water uptake was measured over a period of up to 24 hours and showed a large difference between the samples (Fig. 4B). The water uptake of the PCL-MNP scaffold quickly reached almost saturation levels within a few hours. Water uptake increased with increasing MNP content. As a result, after 24 hours, the water uptake was about 1440% for the PCL scaffold, 1870% for the PCL-MNP5 scaffold, and 2850% for the PCL-MNP10 scaffold. The water absorption capacity of the PCL-MNP10 scaffold was almost two times higher than that of the pure PCL scaffold. Therefore, the scaffold was observed to swell reliably after water absorption. As measured optically (Fig. 4c), the volume of the increased scaffold was: 5% in PCL, <8% in PCL-MNP5, <11% in PCL-MNP10 and 10% MNP in PCL Which is a twofold increase. In fact, the water absorption level is due to the pore-hammering of the water and the swelling of the scaffold. Considering a similar porosity for all scaffolds, the difference in water absorption capacity was first a result of a swollen, surface-modified property, that is, a water molecule is absorbed by a water molecule absorbed into a dispersed hydrophilic polymer network, The swelling of the folds represents the water absorption capacity of the significantly increased magnetic scaffold.
실험예Experimental Example 2 : 2 : 스캐폴드의Scaffold 기계적 특성 조사 Investigation of mechanical properties
PCL-MNP 스캐폴드의 기계적 특성은 젖은 상태에서 정적 및 동적 압축 하에 동적 기계적 분석 (dynamic mechanical analysis, DMA, DMA25N, MetraVib, USA)으로 측정하였다. 원통형 시료 (8 mm의 직경 및 16 mm의 높이)는 우선 PBS에 1일 동안 완전히 담궈 두었다. 통계적 테스트를 위해, 시료는 일정한 압축 부하에서 시간에 따라 변형율을 기록하여 측정하였다. 3개의 다른 시료를 각각의 조건에서 테스트하여 얻은 값을 평균하여 산출하였다.The mechanical properties of the PCL-MNP scaffold were measured by dynamic mechanical analysis (DMA, DMA25N, MetraVib, USA) under static and dynamic compression under wet conditions. Cylindrical samples (8 mm in diameter and 16 mm in height) were first fully immersed in PBS for 1 day. For statistical testing, the samples were measured by recording strain rates over time at constant compressive loads. The results obtained by averaging the values obtained by testing three different samples under the respective conditions were calculated.
그 다음, 동적 테스트는 평평한 플레이트 환경에서 수행되었다. 기계적 분광분석법(spectrometry)은 상온에서 10분 동안 0.5에서 10 Hz의 범위로 동적 주파수 스윕(sweep)을 사용하여 모니터링하였다. 저장 탄성율(E') 및 손실 탄성율(E")를 기록하였다. 탄젠트 델타(tangent delta)는 E"/E' 비율로부터 평가하였다.
The dynamic test was then performed in a flat plate environment. Mechanical spectrometry was monitored using dynamic frequency sweeps ranging from 0.5 to 10 Hz for 10 minutes at room temperature. The storage modulus (E ') and the loss modulus (E ") were recorded. The tangent delta was evaluated from the E" / E' ratio.
PCL-MNP 스캐폴드의 기계적 거동은 각 도 7 및 8에 도시한 것처럼, 젖은 시료를 사용하여 정적 및 동적 조건하에 수행했다. 기계적 특성은 골 복구 및 재생에 대한 타겟으로 스캐폴드를 중요하게 생각하는 또 다른 이유이다. 도 7a는 정적 압축 부하 하에 스캐폴드의 전형적인 응력-변형도 곡선을 보여준다. 모든 3가지 스캐폴드는 유사한 거동을 보였다. 응력 값은 변형도가 증가함에 따라 계속 증가했고, 압축하는 동안 변형도의 증가율은 증가했다. 이것은 일반적으로 압축 부하 하에 조밀화 또는 구멍 붕괴의 과정에서의 다공성 물질에서 나타난다. 스캐폴드의 MNP 혼입은 전체 변형도 범위 동안 증가된 응력 레벨을 기록하였고, 이는 압축 부하 하에 변형에 높은 저항을 갖음을 나타낸다. 도7a는 응력-변형도 곡선의 초기 선형 지역을 보여주고, 탄성율은 초기 선형 기울기부터 얻어진다(도 7b). PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10의 탄성율은 각 1.2, 1.4 및 2.4 MPa 였고, 매트릭스에 분산된 MNP는 스캐폴드를 단단하게 하는데 중요한 역할을 하였다. 정적 기계적 테스트와 마찬가지로, 동적 기계적 분석은 추가로 0.5 내지 10 Hz 주파수 범위에서 지속적인 압력 증폭 하에 수행했다. 저장 탄성율(E'; 응력에 반응하는 물질의 탄성을 나타냄), 손실 탄성율(E"; 응력에 반응하는 물질의 점도를 나타냄), 및 탄젠트 델타 (E"/E')를 도 8에 나타내었다. 스캐폴드는 모든 특성에 대하여 거의 주파수 의존적이지 않은 모습을 보였다. E'값은 E" 값보다 수 만배(by four orders of magnitude)정도 더 높았다. 중요하게, MNP 함량의 증가는 스캐폴드의 저장 탄성율을 크게 증가시키는 정적 테스트의 일관성 있는 결과를 나타낸다. 저장 및 손실 탄성율이 MNP의 혼입과 유사하게 증가할 때, 스캐폴드 중에 탄젠트 델타는 거의 변화가 없었다. 이는 향상된 친수성 및 MNP 혼입에 의한 스캐폴드의 높은 팽창에 따라 탄성 값의 이러한 변화를 초래하는 것으로 생각된다. 비록 MNP 스스로 PCL 고분자 네트워크를 더 단단하게 하는 경향이 있지만, 물에서 증가된 부피(고분자 사슬 사이의 거리에 따라서) 및 내부 물 분자들이 강도를 보완할 것이다.
The mechanical behavior of the PCL-MNP scaffold was performed under static and dynamic conditions using a wet sample, as shown in Figures 7 and 8, respectively. Mechanical properties are another reason to consider scaffolding as a target for bone repair and regeneration. Figure 7a shows a typical stress-strain curves of a scaffold under a static compressive load. All three scaffolds showed similar behavior. The stress value continued to increase as the deformation increased and the rate of increase in deformation increased during compression. This generally manifests itself in porous materials in the process of densification or pore collapse under compressive load. The MNP incorporation of the scaffolds recorded an increased stress level during the entire strain range, indicating a high resistance to strain under compressive load. Figure 7a shows the initial linear region of the stress-strain curve, and the modulus of elasticity is obtained from the initial linear slope (Figure 7b). The elastic moduli of PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10 were 1.2, 1.4 and 2.4 MPa, respectively, and the MNP dispersed in the matrix played an important role in hardening the scaffold. As with static mechanical testing, dynamic mechanical analysis was performed under continuous pressure amplification in the 0.5 to 10 Hz frequency range. The storage elastic modulus (E '), loss elastic modulus (E "), and tangent delta (E" / E') of the material reacting with the stress are shown in FIG. 8 . The scaffold showed almost no frequency dependency for all characteristics. E 'value was higher by several orders of magnitude than E'. Significantly, the increase in MNP content shows a consistent result of static testing, which greatly increases the storage elasticity of the scaffold. When the modulus of elasticity increased similarly to the incorporation of MNP, the tangent delta remained almost unchanged in the scaffold, which is believed to result in this change in elasticity values due to improved hydrophilicity and high expansion of the scaffold due to MNP incorporation. Although the MNP itself tends to make the PCL polymer network tighter, the increased volume in water (along the distance between the polymer chains) and internal water molecules will complement the strength.
실험예Experimental Example 3: 3: 생체외In vitro 세포 접착력, 성장 및 Cell adhesion, growth and 미네랄화Mineralization 테스트 Test
MC3T3-E1 세포(ATCC; American type culture collection)는 7일 동안 5% 의 CO2를 포함하는 습한 공기 및 37 ℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone, Thermo Scientific, USA), 100 U/ml의 페니실린 및 100 μl의 스트렙토마이신을 포함하는 α-최소필수배지(α-Minimal Essential Medium, α-MEM, Gibco, USA)에 배양되었다. 105 세포를 스캐폴드(5 mm의 직경 X 3 mm의 높이) 위에 접종하고, 1일 후에, 스캐폴드를 다른 플레이트의 각 웰로 옮기고, 스캐폴드의 세포 부착율을 세포 카운팅 키트(CCK)로 측정했다. 추가로 세포 증식을 3, 7, 14 및 21일의 배양기간 동안 CCK 방법으로 측정하였다. 세포의 SEM 관찰에서, 시료를 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 고정하여 농도 구배된 에탄올 용액에서 탈수시켜 실온에서 건조하였고, 백금 박막으로 코팅하였다.MC3T3-E1 cells (ATCC; American Type Culture Collection) were cultured for 7 days in humidified air containing 5% CO 2 and 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, (Α-Minimal Essential Medium, α-MEM, Gibco, USA) containing penicillin and 100 μl of streptomycin. 10 5 cells were inoculated onto a scaffold (5
세포의 미네랄화(mineralization)는 Alizarin red 분석(ARS; Sigma Aldrich, USA)으로 평가하였다. 14, 21 및 28일의 배양기간 후에, 세포는 4 ℃에서 1시간 동안 70% 에탄올로 고정된 후, 실온에서 2% w/v 수용성 ARS 용액(pH 4.1-4.3)에 30분 동안 담그고, 증류수로 여러 번 세척 후에, 염색된 시료를 제거하여 10% w/v의 세틸 피리디늄 클로라이드(cetyl pyridinium chloride, CPC)를 포함하는 10 mM의 소듐 포스페이트(pH 7) 용액으로 1시간 동안 용리하였다. 그 후 각 시료 용액의 지속적인 정량 평가를 위해 세포 내 미토콘드리아 탈수소 효소의 총량으로 정규화 한 후, 595 nm의 흡수파장에서 마이크로 플레이트 리더기를 이용해 용리액의 흡광도를 측정하였다.
Mineralization of cells was assessed by Alizarin red assay (ARS; Sigma Aldrich, USA). After 14, 21 and 28 days of incubation, cells were fixed with 70% ethanol for 1 hour at 4 ° C, then immersed in 2% w / v aqueous ARS solution (pH 4.1-4.3) at room temperature for 30 minutes, , The stained sample was removed and eluted with a 10 mM sodium phosphate (pH 7) solution containing 10% w / v of cetyl pyridinium chloride (CPC) for 1 hour. Then, for the continuous quantitative evaluation of each sample solution, the total amount of intracellular mitochondrial dehydrogenase was normalized, and the absorbance of the eluent was measured using a microplate reader at an absorption wavelength of 595 nm.
자성 스캐폴드에 반응하는 생체외 세포를 세포 부착력으로 평가했다. 도 9a는 세포 접종 후, 1, 3 및 24시간에서 세포가 부착된 PCL 및 PCL-MNP 스캐폴드의 SEM 현미경 사진을 보여준다. 과립 같은 MC3T3-E1 세포는 PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드에서 세포 접종 후 3시간째에 잘 나타나고, 상기 세포는 순수 PCL 스캐폴드보다 나노 복합체 스캐폴드에서 더 풍부하게 발견되었다. 세포 부착 레벨을 평가하기 위하여 도 9b에 보여준 것처럼 CCK 측정을 수행했다. 순수 PCL 스캐폴드에서 시간에 따라 세포 부착율에는 큰 차이가 없었지만, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10스캐폴드에서 세포 부착은 세포 접종 후 3시간째에 빠르게 증가하여 최대 24시간까지 급격하게 증가하였다. 3시간째에, PCL-MNP10 에서의 세포 부착 레벨은 순수 PCl 스캐폴드에 비해 대략 1.4배 더 높았다.The in vitro cells responding to the magnetic scaffold were evaluated for cell adhesion. Figure 9a shows SEM micrographs of cell-attached PCL and PCL-MNP scaffolds at 1, 3 and 24 hours after cell inoculation. Granule-like MC3T3-E1 cells appeared well at 3 hours after inoculation in the PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds, and these cells were found to be more abundant in the nanocomposite scaffold than in the pure PCL scaffold. CCK measurements were performed as shown in Figure 9B to assess cell adhesion levels. In the PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds, cell adhesion rapidly increased at 3 hours after cell inoculation and increased sharply up to 24 hours, although there was no significant difference in cell attachment rate over time in pure PCL scaffolds. At 3 hours, the level of cell adhesion at PCL-MNP10 was approximately 1.4 times higher than that of the pure PCl scaffold.
생체외에서 세포 몰폴로지, 증식 및 분화는 추가적으로 연구하였다. 도 10a는 14일 동안 스캐폴드에서 성장한 세포의 SEM 현미경 사진을 보여준다. 모든 스캐폴드는 스캐폴드 전체에 많은 세포 생성물 및 세포의 수를 보여주었다. 스캐폴드 중 세포 성장 몰폴로지에는 약간에 차이가 있었다. 스캐폴드에서 배양된 세포의 증식은 최대 21일까지 도 10b에서 보여준 것처럼 모니터링 되었다. 세포는 모든 스캐폴드에서 최대 14일까지 빠르게 성장하였다. 세포의 14일 내지 21일의 장기 배양에서는 세포의 수가 증가하지 않았다. 이는 스캐폴드 표면에 세포의 밀집 그리고/또는 세포의 증식에서 분화로 전환될 가능성과 관련된다고 여겨진다. 흥미롭게도, 특히 7일 후에 세포의 증식율은 PCL-MNP 스캐폴드에서 보다 순수 PCL에서 더 높았으며, 14일 및 21일에서 큰 차이를 나타냈다(1.3 내지 1.5배 차이). 따라서 이는 7 내지 14일 동안 세포 증식이 순수 PCL에서 더 높음을 나타낸다. PCL-MNP 스캐폴드에서 더 활발한 골아세포 분화 과정을 경험하여 세포가 증식에서 분화로 더 빠른 전환을 경험할 수 있다는 것은 나타낸다. Cell morphogenesis, proliferation and differentiation in vitro were further studied. Figure 10a shows SEM micrographs of cells grown in the scaffold for 14 days. All scaffolds showed a large number of cell products and cells throughout the scaffold. There was a slight difference in cell growth morphology among the scaffolds. The proliferation of cultured cells in the scaffold was monitored as shown in Figure 10b for up to 21 days. Cells grew rapidly in all scaffolds up to 14 days. The number of cells did not increase in the long-term culture of the cells from 14 days to 21 days. It is believed that this is related to the possibility of cell aggregation on the scaffold surface and / or conversion from cell proliferation to differentiation. Interestingly, especially after 7 days, the cell proliferation rate was higher in the pure PCL than in the PCL-MNP scaffold, with large differences between 14 and 21 days (1.3 to 1.5-fold difference). Thus indicating that cell proliferation is higher in pure PCL for 7-14 days. It is shown that the cells experience a more active process of osteoblast differentiation in the PCL-MNP scaffold and can experience faster conversion from proliferation to differentiation.
골아세포 분화의 마지막 단계로서, 세포의 미네랄화는 중요하게 생각된다. 본 발명자는 칼슘 침전을 정량화하는 방법으로 스캐폴드에서 세포의 미네랄화 거동을 분석했다. 이를 위해, 선택적으로 칼슘과 결합하는 ARS로 염색을 수행하였다. 도 11a는 ARS 정량화를 통해 각 스캐폴드에서 배양된 세포에서 칼슘 침전 레벨을 보여준다. 7일 및 14일에서 스캐폴드들 중에 차이를 거의 보이지 않는 반면, 상대적으로 긴 배양기간인 21일에서 큰 차이를 나타냈다. PCL-MNP10 스캐폴드에서 칼슘 레벨은 순수 PCL 스캐폴드에 비해 약 2.8배 높았다. 21일째에 PCL-MNP10 스캐폴드에서 칼슘 침전은 EDS(도 11b)로 분석했다. EDS 맵핑은 Ca(녹색) 및 P(파랑)의 높은 신호를 나타냈으며, Ca/P의 비율은 1.7로 화학양론적 HA의 비율과 유사했다. 이러한 결과로, 세포 미네랄화가 자성 스캐폴드에서 크게 강화되었다는 것을 입증하고, 또한 스캐폴드에서 표면-기능화된 MNP가 세포의 골 형성 및 미네랄화의 마지막 단계를 영향을 미치는 것을 나타낸다. 비록 본 발명에서 골 형성의 마지막 단계를 평가하고 있지만, 향상된 세포 미네랄화를 설명하기 위해 골 형성 유전자의 발현 및 단백질 합성을 포함하는 골 형성 거동에 대한 깊은 연구가 더 필요하다. 골 분화 세포는 세포의 미네랄화에 있어 중요한 골 매트릭스 단백질의 충분한 레벨을 생성할 수 있다. 이런 점에서, 자성 스캐폴드에 의한 세포의 증식 및 골 형성 분화의 향상의 근거에 대하여는 논의가 필요가 있다. PCL-MNP 자성 스캐폴드에서 세포 부착의 유의성 있는 증가는 아마 단백질 및 세포의 친화성을 높인 스캐폴드의 친수성에 기인할 것을 생각된다. PCL 표면의 친수성의 개질은 초기 세포 부착을 증가시킨다고 보고되어 왔다. 이런 향상된 초기 세포 부착은 이어서 세포 증식, 분화, 및 세포 미네랄화에 대한 매트릭스 생산에 영향을 줄 것이다. 또한, 향상된 친수성을 따라, 세포 거동에 자성과 관련된 자극이 향상될 수 있다. MNP가 생체물질 및 스캐폴드 안에 혼입된 MNP의 역할이 생체외에서 세포 증식 및 골 형성 분화에 대하여 영향을 미치는 것으로 보고되어왔다. MNP는 세포 증식 및 분화의 거동에 영향을 미치게 할 수도 있는 세포막의 이온 채널의 중요한 변화를 이끄는 나노 스케일에서 단일 자기적 도메인의 일종으로 제안되었다. 나노 스케일로 생성된 자기 효과는 MNP의 함량을 증가시킴으로 강화 될수 있고, 이것은 생체 외에서의 결과에 더 강한 영향을 미칠 것이다.
As a final stage of osteoblast differentiation, cell mineralization is considered important. The present inventors analyzed the mineralization behavior of cells in the scaffold by a method of quantifying calcium precipitation. For this purpose, staining was performed with ARS which selectively binds to calcium. Figure 11A shows the level of calcium precipitation in cells cultured in each scaffold via ARS quantification. On
SBF에 담가둔 후, PCL-MNP 스캐폴드의 생체외에서 무세포 미네랄화 거동을 평가하였다. 도 5는 SBF에 담가둔 후, 스캐폴드의 SEM 몰폴로지 및 XRD 패턴을 나타낸다. PCL-MNP5 및 PCL-MNP10 스캐폴드는 1일차에 표면에 미네랄 나노결정체를 형성하기 시작하였다. 3일차에는 전체 표면을 미네랄 상이 덮었다. 7일 후에, 미네랄 결정체는 상당히 성장하였다(도 5a). 그에 반하여 순수 PCL 스캐폴드는 3일째에 미네랄의 형성이 시작되었고, 7일째에 PCL-MNP에서 관찰된 것보다 적은 표면을 덮었다. HA 결정의 특징적인 피크(2 θ ≒ 26° 및 32°)에 기초한 SEM 결과는 XRD 패턴에 의해 확인되었다. 이는 MNP의 혼입이 SBF에서 스캐폴드의 미네랄화 거동을 증가시킨다는 것을 명확히 나타났다. 이는 스캐폴드 내부에 분산된 표면이 카르복실화된 MNP 때문이다. 배지 내부에 칼슘이온은 음 전하의 스캐폴드 표면에 더 잘 붙을 것이고, 그 결과로 미네랄 결정핵을 형성하기 위해 인산 이온을 끌어당길 것이다. 반면에 SBF에서 참여하는 세포가 없고, 동적이 아닌 조건 때문에 다소 제한되었고, 그 결과 무세포 미네랄화는 골 재생을 목적으로 유용한 자성 스캐폴드의 표면 반응 가능성 및 골 생체 활성을 예측을 가능하게 하였다.
After immersing in SBF, the in vitro cell-free mineralization behavior of the PCL-MNP scaffold was evaluated. Figure 5 shows the SEM morphology and XRD pattern of the scaffold after being immersed in SBF. The PCL-MNP5 and PCL-MNP10 scaffolds began to form mineral nanocrystals on their surface at
실험예Experimental Example 4 : 4 : 생체내In vivo 조직 적합성 테스트 Organizational suitability test
체내 실험은 한국의 단국대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받았다. 250 내 350 g의 무게의 3마리의 10주령 수컷 Spraque-Dawley 렛을 사용했다. 실험한 스캐폴드 그룹은 PCL, PCL-MNP5 및 PCL-MNP10, 그리고 각 그룹당 4개의 시료(5 mm의 직경 × 3 mm의 높이)로 이식하였다. 이식에 앞서 스캐폴드는 에틸렌 옥사이드 가스로 살균하였다. 동물은 체질량 대비 80 mg/kg 케타민(ketamine) 및 10 mg/kg 자일라진을 근육 내 주입하여 마취시켰다. 쥐의 투여 부위의 피부를 면도하고, 수술 부위의 살균은 포비돈(povidone) 및 70% 에탄올로 하였다. bard-parker scalpel에 장착된 #10 블래이드를 사용하여 피부에서 2 cm 길이로 선형 절개하였다. 4개의 작은 피하 이식 부위는 각각의 쥐의 척추로부터 측면 방향에서 후 측면으로 Halsted-mosquito hemostatic forceps을 이용하여 비절개 박리하여 준비하였다. 스캐폴드를 절개 부분에서 떨어져 있는 준비된 부위에 삽입하였다. 상기 절개는 나중에 4-0 비 흡수성 모노 필라멘트 봉합재료(Dafilon®, B. Braun, Germany)로 봉합하였다. 수술 중 및 후에, 쥐를 마취에서 회복될 때까지 따듯하게 유지하고 관찰하였다. 쥐를 한 케이지당 하나씩 넣었다. 상기 동물들은 케이지 안에서 12시간 낮 / 12시간 밤 스케줄로 유지되었고 자유식으로 표준 펠릿 식품 및 물을 제공하였다.The body experiment was approved by Dankook University animal experiment ethics committee in Korea. Three 10-week-old male Spraque-Dawley rats weighing 350 grams were used. The scaffold groups tested were transplanted with PCL, PCL-MNP5 and PCL-MNP10, and four samples per group (5 mm diameter × 3 mm height). Prior to implantation, the scaffold was sterilized with ethylene oxide gas. The animals were anesthetized by intramuscular injection of 80 mg / kg ketamine and 10 mg / kg xylazine to body mass. The skin of the mouse was shaved and sterilization of the surgical site was made with povidone and 70% ethanol. Using a # 10 bladder mounted on a bard-parker scalpel, a 2 cm long linear incision was made in the skin. Four small subcutaneous implants were prepared by dissecting and dissecting from each rat's vertebrae using the Halsted-mosquito hemostatic forceps. The scaffold was inserted into the prepared area away from the incision. The incision was later sealed with 4-0 nonabsorbable monofilament suture material (Dafilon (R), B. Braun, Germany). During and after the surgery, the mice were kept warm and observed until recovered from the anesthesia. Rats were placed in one cage. The animals were maintained in a cage for 12 hours day / 12 hours night schedule and provided free-standard pelleted food and water.
이식하고 2주 후에, 상기 동물들은 경추 파열법으로 희생시켰다. 조직학적 분석을 위한 조직 시료는 상온에서 즉시 4% 포름알데히드 용액에 담궜고, 단계별 에탄올에 탈수시켰다. 표본을 양분하여 파라핀에 심었다. 파라핀 블록은 로터리 마이크로톰(microtome)을 사용하여 세로 축에 따라 5 μm 두께로 세분화하였다. 상기 슬라이드를 관행적으로 헤마톡실린 및 에오신(HE) 또는 Masson's trichrome (MT) 염색으로 염색하였고, 그 후 생체적합성 및 혈관생성을 현미경으로 관찰했다. 모든 염색된 슬라이드부터 얻어진 부재(1), 경증(2), 중간(3), 중증(4)로 포인트 인덱싱된 조직학적 점수는 염증 반응, 섬유 캡슐의 두께, 혈관의 존재 및 섬유세포의 증식의 정도를 포함한다.
Two weeks after transplantation, the animals were sacrificed by cervical rupture. Tissue samples for histological analysis were immediately immersed in 4% formaldehyde solution at room temperature and dehydrated in step ethanol. The specimens were planted on paraffin in the form of a split. The paraffin block was subdivided into 5 [mu] m thickness along the longitudinal axis using a rotary microtome. The slides were routinely stained with hematoxylin and eosin (HE) or Masson's trichrome (MT) staining, and then biocompatibility and angiogenesis were microscopically observed. Point-indexed histologic scores from all dyed slides (1), mild (2), intermediate (3), and severe (4) indicate that inflammatory response, fibrous capsule thickness, vascularity and fibroblast proliferation .
스캐폴드의 체내 조직 적합성은 자성 스캐폴드의 조직 적합성에 대한 예비 연구로서, 2주 동안 쥐의 투여 부위에 피하 이식 후에 평가했다. 마취 후에 회복에 있어서 수술 후 특별한 점이 없었고, 모든 동물은 물질과 관련된 합병증 없이 정상적인 회복 과정을 보였으며 연구 기간 동안 정상 상태를 유지했다. 수술 2주 후에, 조직을 둘러싼 시료를 채취하여 현미경으로 관찰한 결과, 어떠한 발적 또는 염증 신호는 보이지 않았다. 시료의 조직학적 사진은 도 12에 나타냈으며, 현미경을 이용하여 섬유세포에서 섬유화 캡슐 형성, 염증 반응, 미세 혈관 생성, 및 풍부한 육아 조직(granulation tissue)의 경향을 포함하는 조직 반응은 표 2에 표시하였다. 상기 3가지 스캐폴드 그룹에서 큰 차이점은 관찰되지 않았다. 모든 시료에서 경증에서 보통으로의 섬유 세포 및 혈관 아세포 증식이 관찰되었다. 섬유 조직의 캡슐화는 최소한으로 분해된 스캐폴드에서 보여진다. 모든 스캐폴드는 섬유아세포로 채워졌다. 반면, 경증 염증 반응은 시료의 작은 일부에서만 일어났으며, 전체적으로는 동물 이식 후에 거부 반응이 없었다. 새롭게 형성된 조직은 모든 그룹에서 인접 조직으로 좋은 통합을 보여주었다. 조직화된 섬유 육아 조직은 스캐폴드 및 인접하게 결합하고 있는 조직 및 근육 사이에 공간을 형성한다. 섬유아세포는 이들 스캐폴드 시스템 주변에 있는 인접한 섬유 캡슐 안에 존재한다.The histocompatibility of the scaffold was evaluated as a preliminary study of the histocompatibility of magnetic scaffolds after subcutaneous implantation at the site of administration for 2 weeks. After the anesthesia, there was no postoperative recovery, and all animals showed normal recovery without material-related complications and remained steady during the study. Two weeks after the operation, samples surrounding the tissue were taken and observed under a microscope, showing no signs of redness or inflammation. Histological photographs of the samples are shown in Fig. 12, and the tissue responses including the tendency of fibrocyte encapsulation, inflammation reaction, microvascular production, and abundant granulation tissue in the fibroblasts using a microscope are shown in Table 2 Respectively. No significant differences were observed in the three scaffold groups. Mild to normal fibroblast and vascular cell proliferation were observed in all samples. Encapsulation of the fibrous tissue is seen in the minimally degraded scaffold. All scaffolds were filled with fibroblasts. On the other hand, mild inflammatory reactions occurred in only a small portion of the sample, and overall there was no rejection after animal implantation. Newly formed organizations showed good integration into adjacent organizations in all groups. Organized fibrous tissue forms a space between the scaffold and adjacent tissues and muscles. Fibroblasts are present in adjacent fiber capsules around these scaffold systems.
PCL-MNP 자성 스캐폴드는 2주 동안 쥐 피하조직 모델에서 훌륭한 조직 적합성을 보였고, 더 긴 이식 기간 동안 골 재생 모델로 사용함으로써 더 깊이 있는 생체외 연구가 자성 스캐폴드의 효능을 설명하기 위해 필요하다. 이 이슈는 추가적인 연구로 남아있으나, 골 회복 및 재생에 대한 자성 스캐폴드의 유용성은 초기 부착, 증식 및 미네랄화 뿐 아니라 물 친화성 및 팽윤 거동 및 향상된 기계적 특성에서 스캐폴드에 대한 생체 내 세포 반응의 결과로 알 수 있었다.The PCL-MNP magnetic scaffolds showed good histocompatibility in the rat subcutaneous tissue model for 2 weeks and a deeper in vitro study is needed to demonstrate the efficacy of the magnetic scaffold by using it as a bone regeneration model for a longer implantation period . Although this issue remains to be investigated further, the utility of magnetic scaffolds for bone repair and regeneration is evident in the early adherence, proliferation and mineralization as well as in water affinity and swelling behavior and in vivo cellular responses to scaffolds in improved mechanical properties As a result.
Claims (14)
생체적합성 폴리머 용액을 제조하는 제2단계;
상기 자성 나노입자를 생체적합성 폴리머 용액에 균일하게 분산시키는 제3단계; 및
상기 자성 나노입자가 균일하게 분산된 생체적합성 폴리머 용액을 염이 첨가된 몰드(mold)에 투입하여 - 90 ~ - 60 ℃의 온도 및 3 ~ 8 Torr의 압력 조건에서 동결건조하는 제4단계를 포함하고,
직경은 9 내지 13nm인 구형의 상기 자성 나노입자가 분산된 형태로 구비되며,
크기가 250㎛ 내지 500㎛인 기공을 구비하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
A first step of preparing magnetic nanoparticles;
A second step of preparing a biocompatible polymer solution;
A third step of uniformly dispersing the magnetic nanoparticles in a biocompatible polymer solution; And
A fourth step of putting the biocompatible polymer solution in which the magnetic nanoparticles are uniformly dispersed into a mold to which a salt is added and freeze-drying at a temperature of -90 to -60 ° C and a pressure of 3 to 8 Torr and,
The spherical magnetic nanoparticles having a diameter of 9 to 13 nm are dispersed,
And a pore having a size of 250 to 500 占 퐉.
상기 자성 나노입자는 계면활성제로 표면개질 되어 있는 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the magnetic nanoparticles are surface-modified with a surfactant. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
상기 계면활성제는 1,2-헥사데칸다이올(1,2-hexadecanediol), 올레산(oleic acid), 올레일아민(oleylamine) 및 벤질에터(benzyl ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
3. The method of claim 2,
The surfactant is at least one selected from the group consisting of 1,2-hexadecanediol, oleic acid, oleylamine, and benzyl ether. Wherein the bone scaffold is a bone scaffold.
상기 자성 나노입자는 철 (Fe)을 포함하는 초상자성을 띠는 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the magnetic nanoparticles have a superparamagnetic property including iron (Fe).
상기 제3단계에서 자성 나노입자가 분산된 생체적합성 폴리머 용액 중 자성 나노입자의 함량은 전체 혼합용액의 중량 기준으로 5 내지 10wt%인 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the content of the magnetic nanoparticles in the biocompatible polymer solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed in the third step is 5 to 10 wt% based on the weight of the whole mixed solution.
The biocompatible polymer of claim 1, wherein the biocompatible polymer comprises a poly (lactide-co-glycolide), a poly (lactic acid), a poly (glycolic acid), and a poly (caprolactone) Wherein the bone scaffold is at least one selected from the group consisting of bone scaffolds and bone scaffolds.
상기 제2단계에서 생체적합성 폴리머 용액의 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 디옥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the solvent of the biocompatible polymer solution in the second step is at least one selected from the group consisting of acetonitrile, dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran and dioxane.
상기 제4단계의 염은 NaCl인 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the salt of the fourth step is NaCl. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
상기 제4단계의 염은 200 내지 500㎛의 평균입경을 가진 것인 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the salt of the fourth step has an average particle diameter of 200 to 500 mu m.
상기 제4단계의 몰드의 재질은 테프론, 폴리에틸렌 및 초고분자량 폴리에틸렌으로 이루어진 근으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 뼈 재생용 자성 스캐폴드의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the material of the mold in the fourth step is at least one selected from the group consisting of Teflon, polyethylene, and ultrahigh molecular weight polyethylene.
A magnetic scaffold for bone regeneration wherein the magnetic nanoparticles produced by the method of any one of claims 1 to 4, 6 to 10, and 12 are uniformly dispersed in the biocompatible polymer.
A bone regeneration composition comprising the magnetic scaffold of claim 13 as an active ingredient.
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