KR101624511B1 - 유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법 - Google Patents

유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법 Download PDF

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전남대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제를 포함하여 기존 유착방지제의 문제점인 빠른 분해, 낮은 점도 및 낮은 강도를 개선하고, 생체 조직 간의 유착을 방지하는 유착방지제 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법에 관한 것이다.

Description

유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법{ANTIADHESION COPOSITION AND COMPRISING ANTIADHESION AGENT PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제를 혼합한 유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법에 관한 것이다.
유착은 외과적 시술 후 염증, 이물, 출혈, 감염, 창상, 마찰 등으로 조직손상이 발생하면 상처의 치유 과정에서 혈액이 응고하고, 이에 의해 주변 조직과 비정상 접합이 일어나는 것이며, 이는 장폐색증, 만성통증, 성기능 장애, 불임 등의 원인이 된다.
이러한 유착을 방지하는 방법으로 수술 시 상처를 최소화, 항염제 사용, 조직 플라즈미노겐 활성인자 활성 증가 방법 및 물리적 장벽 사용 등이 개발되고 있다. 이 중에서 물리적 장벽 사용의 경우 조직 상처가 치유되는 동안 인접한 조직 사이에 유착 형성을 방지함과 동시에 일정 기간 후 자연분해 혹은 흡수되어 제거되어야 하며, 사용되는 재료 자체 혹은 그 분해 및 대사를 통한 배출 물질은 인체에 무해하여야 한다.
현재 상업화된 유착방지제 중 셀룰로오스류나 덱스트란류 등은 천연고분자지만 생체를 구성하는 성분은 아니므로 생체 내에 삽입 시 이물반응을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이로 인해 생체 내에 분해효소가 없어 분해가 일어나지 않기 때문에 산화시키거나, 가수분해 될 수 있도록 조작을 해줘야 하는 추가적인 부분이 있다.
또한, 생체흡수성 고분자는 생체 내에서 수화되어 상처를 주변조직과 격리시켜 줌으로써 유착 발생을 방지하며, 치료가 완료되고 나면 자연적으로 흡수, 제거되어 정상적인 조직에 영향을 미치지 않는 장점을 이용하려는 시도가 진행 중이다. 최근 사용되는 생체흡수성 고분자 중 하나인 히알루론산을 주성분으로 하는 유착방지 용액이 사용되고 있으나, 히알루론산은 생체 내에서 3 일 이내에 분해, 흡수되고, 수용성이 높기 때문에 단시간에 상처의 표면으로부터 확산하며 흐르는 문제점이 있다. 또한 메틸셀룰로오스 및 그 유도체도 유착을 방지한다고 알려져 있지만, 이러한 고분자의 용액들도 지나치게 빨리 흡수되고, 원하는 조직의 위치에 자리 잡지 못하고 흘러내려 원하는 유착방지 효과를 얻을 수 없는 단점이 있다.
또한, 형태에 따라 필름 형태의 유착방지제는 내부 장기에 적용 시 장기 표면에 잘 부착되지 않고, 부착되더라도 장기의 운동으로 인해 상처부위에 지속적으로 위치하지 못한다는 문제점 및, 조직 자체에서 이물질로 인식되어 서로 뭉쳐져서 장기 유착 방지 효과가 미흡한 것으로 보고되고 있다.
본 발명은 기존 유착방지제의 문제점을 개선하고, 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제를 혼합한 적정 조성으로서, 물리적으로 점성을 높이며 생체 조직 간의 유착을 방지하는 유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제를 포함하여 기존 유착방지제의 문제점을 개선하고, 생체 조직 간의 유착을 방지하는 유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제로 이루어질 수 있다.
상기 젤란검 : 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함할 수 있다.
상기 겔화제는 인산완충식염수, 염화칼슘 및 이들의 혼합물에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 유착방지 조성물은 겔 제형일 수 있다.
본 발명은 a) 물에 젤란검과 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함하는 혼합조성물로 유착방지겔을 제조하는 단계 및 b) 상기 유착방지겔에 겔화제를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 유착방지겔은 물 100 ㎖당 상기 혼합조성물 1 내지 10 g을 포함할 수 있다.
상기 a) 단계에서 상기 혼합조성물을 50 내지 80 ℃에서 교반 후 상온에서 성형 건조하여 유착방지겔을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 젤란검과 황산콘드로이친을 혼합하고 겔화제로 처리한 후 인체 내에 삽입이 가능한 안정된 구조의 겔 제형으로 유착방지제를 제조하였다. 본 발명의 유착방지제는 7 일 만에 분해되고 최적의 압축강도와 뛰어난 유착방지 효과를 가지는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 있어서, 젤란검과 황산콘드로이친 유착방지제의 팽윤도를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 있어서, 젤란검과 황산콘드로이친 유착방지제의 겔화율을 도시한 것이다.
도3은 본 발명에서 있어서, 상기 유착방지겔에 처리한 용액인 겔화제에 따른 젤란검과 황산콘드로이친 유착방지제의 겔 압축강도를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 있어서, (a)는 비교예 2, (b)는 실시예 1, (c)는 실시예 3을 나타내며, 손 압력을 가하여 육안으로 확인한 겔 압축강도를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명에 있어서, (A)는 실시예 1, (B)는 실시예 2의 표면과 단면을 주사전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 본 발명에 있어서, (a)는 비교예 6, (b)는 비교예 7, (c)는 실시예 1을 나타내며, 유착방지제를 배치한 후 봉합 7 일째 조직의 유착 유무를 육안으로 관찰한 사진이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제를 포함하여 기존 유착방지제의 문제점을 개선하고, 생체 조직 간의 유착을 방지하는 유착방지 조성물 및 이를 포함하는 유착방지제 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 젤란검와 황산콘드로이친의 최적의 조성비를 찾아 기존 유착방지제의 문제점을 개선하고, 겔화제로 처리하여 생체 조직 간의 유착을 효과적으로 방지할 수 있는 유착방지제를 제공한다.
본 발명은 젤란검, 황산콘드로이친 및 겔화제로 이루어질 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
이하는 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에 의하면 생체재료 중 미생물 유래 다당류인 젤란검(Gellan gum, GLG)을 유착방지제 조성에 포함하고자 한다. 상기 젤란검은 글루콘산, 람노오스, 포도당이 1 : 1 : 2로 구성된 복합 다당류로서, 인체 내 수분과 결합하는 형태의 약물 전달 원료 물질 및 기본 약물제제로 활용하는 연구에 응용되고 있다. 상기 젤란검은 무색투명하며, 산과 열에 잘 견디고, pH 조절 또는 이온 첨가를 통하여 겔화율 및 겔 압축강도가 조절될 수 있다. 상기 젤란검은 열을 가해야 용해되고, 여러 번 열을 가해도 겔 압축강도는 저하되지 않는다. 상기 젤란검의 유동학적 구조적 특성이 밝혀지면서 여러 가지 분야에서 각광받는 소재로 인정받고 있다. 상기 젤란검은 생체 적합성이나 물리화학적 특성이 뛰어나서 조직공학에 사용될 뿐만 아니라 제조 과정이 쉬워서 필름, 하이드로겔, 미립구, 마이크로캡슐 및 스폰지 등 다양한 형태로 사용된다.
또한, 상기 젤란검과 더불어 본 발명에 포함된 상기 황산콘드로이친(Chondroitin sulfate, CH)은 D-글루쿠론산, N-아세틸-D-갈락토사민과 황산기가 결합되어 있는 점질성 다당류(Mucopolysaccharide)이다. 상기 황산콘드로이친은 고농도의 SO4 2- 혹은 COO-를 함유하므로 음전하로 하전되면 수분을 끌어당기는 힘이 생겨 보습효과 및 점성을 나타내며, 항 염증활성을 가지고 있다. 상기 황산콘드로이친은 조직재생을 위한 다양한 고체 지지체, 수화겔, 접착제 등으로 개발되고 있으며, 연골, 점막, 피부재생 등의 생물학적 장점을 활용할 수 있는 약리 기능 소재 및 약물전달체로 활용된다.
본 발명에 있어서, 상기 젤란검 : 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 범위 내의 혼합물은 7 일만에 분해가 일어나며, 높은 점성과 겔 압축강도를 가진다. 황산콘드로이친 함량 1 중량비에 대하여 젤란검 함량이 1 중량비 미만일 경우, 유착방지제로서 적정한 점성 및 부착성, 도포성을 충족하기 어렵다. 또한, 2 중량비를 초과할 경우 겔화율과 겔 압축강도가 급격히 증가하여 유연성이 좋지 않으며, 유착방지 효과가 떨어진다.
본 발명의 상기 겔화제는 일정량의 염을 포함하는 체액 성분이므로 순수한 물을 사용하여 제조된 조성물보다 겔화제가 포함된 조성물의 생체 적합성이 높아진다. 더욱이 염용액을 사용할 경우 순수한 물을 사용하여 제조한 조성물보다 겔화되는 온도를 낮출 수 있다.
본 발명에 포함된 젤란검은 음전하를 띄는 -COOH 그룹이 2가 양이온인 Ca2 +, Mg2+과 반응하면 정전기적 결합에 의해 코일-헬릭스 전이현상을 거쳐 겔화된다. 따라서 농도가 증가하면 가교된 3차원 망상구조도 증가하고 겔 내부에 물을 함유할 수 있는 체적도 증가한다.
본 발명의 유착방지제는 pH조절 또는 이온첨가로 인하여 겔화율 및 겔화 속도가 조절되며, 겔 압축강도를 높여 겔의 분해속도 조절이 가능하여, 최적의 겔 압축강도를 가지며, 7 일 내외의 분해속도를 갖는다. 이로 인해 체내에서 형태를 유지하고 분해속도가 조절되는 체내 분해성 유착방지 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 유착방지 조성물은 겔 제형인 것이 좋으며, 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 유착방지 조성물은 유화제품, 분산제품, 겔 제품 등의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 겔 제형은 하이드로겔 일 수 있으나 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 하이드로겔은 판형, 미립자, 나노입자, 코팅제, 필름 등과 같은 형태로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 적합성이 우수하여 다량의 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 유사한 거동이 나타나기 때문에 응용범위가 광범위하여 실험실과 임상에서 널리 적용될 수 있다.
또한, 겔 제형 유착방지제는 조직의 상처부위에 부착함으로써 부착형태가 유지되고 유착방지에 효과적이다.
본 발명의 상기 유착방지 조성물은 다음의 단계를 포함하는 유착방지제 제조방법을 제공한다.
본 발명은 a) 물에 젤란검 : 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함하는 혼합물을 혼합하여 유착방지겔을 제조하는 단계 및 b) 상기 유착방지겔에 겔화제를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 유착방지겔은 물 100 ㎖당 상기 혼합물 1 내지 10 g을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 물 100 ㎖당 상기 혼합물 5 내지 7 g을 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서 겔 제조 시 겔 형태유지에 효과적이다.
본 발명은 상기 a) 단계에서 상기 혼합물을 50 내지 80 ℃에서 교반한 후 상온에서 성형 건조하여 유착방지겔을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 55 내지 65 ℃에서 교반할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 a) 단계에서는 열을 가하여 겔화를 진행하였다. 일반적으로 다당류의 화학반응에 의한 가교는 다당류 용액에 2 이상의 관능기를 가지는 가교시약을 작용하게 함으로써 행할 수 있다. 그러나 다당류의 대부분이 실질적으로 물외에는 용해되지 않기 때문에, 수중에서 효율적으로 가교를 진행시킬 수 없다. 이에 반해 상기 혼합조성물에 포함되는 젤란검은 열을 가함으로써 쉽게 겔화가 진행되어 점도가 상승한다. 또한 열을 반복적으로 가하여도 겔 압축강도에 큰 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 상기 젤란검과 황산콘드로이친을 혼합하는 경우 가교시약을 이용하지 않고 물리적으로 점성을 높여 조직에 장기간 머무를 수 있다.
이하 실시예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명은 더욱 상세히 설명된다. 다만 하기 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
또한, 달리 정의되지 않은 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
또한, 명세서에서 특별히 기재하지 않은 첨가물의 단위는 중량%일 수 있다.
[실시예 1]
젤란검 및 황산콘드로이드친 (GLG/CH)을 포함하는 유착방지제 제조
젤란검 :　황산콘드로이드친 = 1 : 1 중량비로 각각 30 g에 물 1,000 ㎖를 혼합하여 6%(w/v)의 GLG/CH 수용액을 제조하였다. 상기 수용액을 60 ℃에서 12 시간 동안 교반시킨 후 6-웰플레이트에 3.5 ㎖씩 옮겨 담아 48 시간 방치하여 유착방지겔을 제조하였다. 유착방지겔에 겔화제 인산완충식염수 1x(Phosphate Buffered Saline, PBS) 5 ㎖로 6 시간동안 처리 한 후 물리적 성질을 평가하였다.
[실시예 2]
상기 실시예 1에서 젤란검 :　황산콘드로이드친 중량비를 2 : 1로 제조하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 1]
상기 실시예 1에서 젤란검 :　황산콘드로이드친 중량비를 1 : 2로 제조하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[실시예 3]
상기 실시예 1에서 인산완충식염수 대신에 고형분 함량 0.03 중량%인 염화칼슘(Calcium chloride, CaCl2)수용액으로 처리하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 2]
상기 실시예 1에서 겔화제를 처리하지 않는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[실시예 4]
상기 실시예 2에서 인산완충식염수 대신에 고형분 함량 0.03 중량%인 염화칼슘(Calcium chloride, CaCl2)수용액으로 처리하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 3]
상기 실시예 2에서 겔화제를 처리하지 않는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 4]
상기 비교예 1에서 겔화제를 처리하지 않는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 5]
상기 비교예 1에서 인산완충식염수 대신에 고형분 함량 0.03 중량%인 염화칼슘(Calcium chloride, CaCl2)수용액으로 처리하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하고, 물리적 성질을 평가하였다.
[비교예 6]
상기 인산완충식염수 1x (Phosphate Buffered Saline, PBS)만 유착방지 부위에 처리하여 유착방지효과실험에서 비교하였다.
[비교예 7]
상기 비교예 3에서 카르복시메틸셀룰로오스 : 히알루론산 = 2 : 1 중량비로 제조된 액체타입의 주사제형 유착방지제(가딕스, 제네월, 대한민국)를 추가 한 후 유착방지효과실험에 사용하여 비교하였다.
[실험예 1]
팽윤도 측정
상기 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 3 및 5에서 제조된 유착방지제를 건조시킨 후, 건조된 유착방지제를 상온에서 증류수에 침지시킨 후 시간 경과에 따른 무게변화가 평형에 이를 때까지 측정하였다. 팽윤도는 팽윤된 유착방지제의 무게(Ws)와 건조된 유착방지제의 무게(Wd)차를 건조된 유착방지제의 무게로 나누어 백분율로 나타냈다.
팽윤도(%)= (Ws- Wd)/ Wd x 100
도 1에 도시된 바와 같이 젤란검과 황산콘드로이친의 농도비에 따라 가교 후 유착방지제의 팽윤도 변화를 관찰하였다. 겔화제로 인산완충식염수, 염화칼슘을 처리한 군과 아무것도 처리하지 않은 군에서 비교하였을 때, 인산완충식염수로 처리한 유착방지제의 형태가 오래 유지되고, 견고한 것을 확인하였다. 또한, 일정 시간이 지나자 팽윤된 상태로 평형을 유지하던 유착방지제는 5 일째가 되면서 서서히 분해되는 것을 관찰할 수 있었고, 7 일이 경과되면서 팽윤된 유착방지제가 완전 분해되었다. 특히, 인산완충식염수는 중성 pH를 가지며 Ca2+ 및 Mg2+을 포함하는 조성으로 구성되어 있고, 염화칼슘은 Ca2+ 로만 구성되어 있어, 인산완충식염수가 염화칼슘보다 강한 양이온을 형성하고 유착방지제 겔 가교에 더 큰 영향을 주는 것을 확인하였다.
[실험예 2]
겔화율 측정
가교반응에 참여하지 않은 잔류고분자를 제거하기 위하여 상기 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 3 및 5에서 제조된 유착방지제를 30 ℃에서 48 시간 동안 교반하면서 수세하였다. 수세과정을 거친 유착방지제를 꺼내어 표면의 물기를 닦고 60 ℃ 오븐에 넣어 48 시간 동안 건조시켰다. 겔화율은 건조된 유착방지제의 무게(Wd)를 초기 사용한 고분자 무게(Wi)로 나누어 백분율로 표시하였다.
겔화율(%) =(Wd/Wi) x 100
도 2에 제조된 겔의 겔화율을 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이 수용성 고분자로만 구성된 유착방지제는 수분함유량이 높아 전반적으로 겔화율이 낮은 값을 가진다. 하지만 인산완충식염수로 처리한 유착방지겔 조성은 효과적인 가교에 의해 분자량이 변화하여 다른 그룹에 비해 상대적으로 높은 겔화율을 나타냄을 확인하였다.
[실험예 3]
겔 압축강도 측정
상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 2 내지 3에서 제조된 유착방지제의 압축강도는 Instron 5569(Instron Co., USA)를 이용하여 상온에서 압축강도를 측정하였다. 압축강도 측정을 위한 겔의 시편 두께는 4.5 ± 0.5 ㎜이고 지름은 10 ㎜이었으며 각 조성마다 6 개의 시편을 제조하여 측정하였다. 압축강도 측정 시 크로스 헤드(cross head) 속도는 10 ㎜/min이였으며, 시편이 50 % 변형이 이루어질 때의 값을 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이 젤란검 : 황산콘드로이친이 중량비 1 : 1 내지 2 : 1의 중량비 조성의 유착방지겔을 인산완충식염수, 염화칼슘을 처리한 군과 아무것도 처리하지 않은 군에서 비교하였을 때, 인산완충식염수를 처리한 군이 가교가 진행됨에 따라 고분자 사슬들이 유착방지제 내부에서 강한 망상 구조를 형성하기 때문에 높은 겔 압축강도를 나타내었다. 또한 겔 압축강도를 육안으로 관찰하기 위하여 손으로 압력을 가하여 유착방지제의 형태 변화를 도 4 (a)비교예 2, (b)실시예 1, (c)실시예 3으로 나타내었다. 비교예 2는 압력을 가했을 때, 쉽게 부서졌으나, 겔화제로 처리 시 겔 압축강도가 높아져 유착방지제 자체의 탄성을 가지며 일정 압력을 가하여도 형태를 유지함을 볼 수 있다. 또한 유착방지겔에 처리한 용액에 따라 겔 압축강도가 다른 것을 확인하였고, 겔화제 용액에 따라 겔 압축강도를 조절할 수 있음을 알 수 있다. 이로 인해, 실시예 1의 물리적 특성이 적합하여 유착방지제로서는 높은 가능성을 보였다.
[실험예 4]
모폴로지 관찰
제조된 유착방지제를 자동도공기(Sputter Coater 108auto, Cressington Scientific Instruments Inc.)을 이용하여 Au-Pd로 60초 동안 진공 코팅한 후에 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope,SEM, JEOL, JSM-5400A)을 이용하여 15 kV에서 형태를 관찰하였다.
제조된 유착방지제를 관찰한 결과 표면은 매끄럽고, 젤란검의 농도가 증가될수록 유착방지제의 표면은 고르지 못한 것을 관찰하였다. 이 중 높은 겔 압축강도를 가지는 인산완충식염수를 처리한 유착방지겔의 표면과 단면을 도 5에 나타내었다. 도 5 (A)실시예 1, (B)실시예 2에 도시된 바와 같이 젤란검의 농도가 증가된 유착방지제의 표면과 내부는 거친 표면과 적층 형태를 가졌다. 이러한 결과는 본 연구에서 활용하고자 하는 유착방지제 뿐만 아니라 다양한 분야에서 기공을 필요로 하는 소재로 사용가능하며, 젤란검의 농도를 조절함으로써 약물전달제제나 스캐폴드로의 활용 가능성을 확인하였다.
[실험예 5]
세포독성 실험
상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 겔 형태의 유착방지제의 세포독성의 여부를 조사하기 위하여 MTT(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드)를 이용하여 MTT검색법을 실시하였다. Raw 264.7 세포를 1×105 세포/㎖로 96-웰플레이트에 웰(well) 당 100 ㎕씩 넣고, 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 제조된 유착방지제를 1 ㎎/㎖ 농도로 식염수에 현탁시키고 1/10씩 희석하여 0.1 ㎍/㎖ 농도가 되는 때까지 계속 희석하고 최종부피가 200 ㎕가 되도록 맞추어 상기 Raw 264.7 세포가 배양되고 있는 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 다음 MTT시약이 5 ㎎/㎖ 농도로 들어있는 식염수를 20 ㎕씩 첨가하여 4 시간동안 배양하고, 상층액을 제거하고 디메틸설폭사이드(DMSO)용액을 첨가한 후, ELISA Reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하므로써 세포생존율을 측정하였다.
상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 유착방지제의 농도별 용출액은 125, 250, 500, 1,000 ppm 농도에서 80 % 이상으로 독성이 없는 것을 관찰하였다.
본 발명의 유착방지제는 세포에 독성이 없는 생체재료로 체내 삽입이 가능하여, 생체재료로서 다양한 응용이 가능할 것이다.
[실험예 6]
복강막 유착방지 효과
본 발명의 유착방지제의 유착방지 효과 실험은 평균체중 230 g의 SD(Sprague-Dawley) rat 암컷으로 실험하였다. SD rat을 디에틸 에테르로 마취시킨 후 깨끗한 수술기구를 사용하여 복부 중앙을 개복하여 맹장표면에 찰과성을 내어 출혈이 생기도록 하였으며, 맹장과 접촉되는 복벽을 거친 사포로 마찰시켜 상처를 낸 다음 유착방지제를 상처부위에 점착한 후 장기의 찰과상 부위와 복벽의 상처부위가 인접하도록 복강 내에 재배치하고 복벽과 피부층을 일반외과 수술방법에 의하여 봉합하였다. 실험은 각 군당 SD rat를 5마리씩 배치하고 실시예 1 및 비교예 6 내지 비교예 7을 비교하여 진행하였다. 봉합 후 7일째에 실험동물을 과량의 에테르로 희생시켜 생리식염수를 혈관에 관류시킨 후 10 % 중성포르말린 용액을 혈관에 관류시켜 육안소견과 현미경적 소견에 따라 유착정도와 유착점수를 평가하였다. 각 군마다 각 등급에 해당하는 실험동물의 수를 측정한 후 각 군의 평균등급을 계산하였다.
유착정도는 하기 표 1의 등급체계를 이용하였으며, 유착발생의 기준은 복벽에 대한 유착을 기준으로 유착등급은 하기 표 2에 나타내었다.
등급 유착정도
0등급 유착 발생 없음.
1등급 복강 내 지방질이 상처부위에 약간 붙어 있음.
2등급 장간막 등과 상처부위가 유착되어 실 같은 형태를 나타냄.
3등급 혈관성조직이 발달하였고 소장과 복벽이 심하게 유착됨.
구분 비교예 6 비교예 7 실시예 1
0등급 0마리 0마리 0마리
1등급 0마리 1마리 1마리
2등급 2마리 2마리 0마리
3등급 3마리 2마리 0마리
총 유착형성 수 5마리(100%) 5마리(100%) 1마리(25%)
평균유착등급 2.6 2.2 0.2
조직학적 평가를 위해 수술 부위를 근육층과 경막을 포함하여 떼어낸 후 10 % 중성 포르말린 용액에 24시간 동안 넣어 고정시킨 다음 탈골화 용액에 48 시간 넣어서 충분히 탈골시킨 후 알코올로 건조시키고 파라핀 블록을 만들었다. 이 블록을 6 내지 8 ㎛ 두께로 절편을 만들어 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)염색을 하였고 현미경을 통해 관찰하였다. 비교예 6은 복벽과 맹장의 유착이 발생된 것을 관찰하였고 유착등급은 2.6이었고, 비교예 7도 유착등급은 2.2였다. 임상적으로 유착등급이 2이상일 때 유착이 되었다고 평가된다. 이에 반해, 실시예 1은 유착등급이 0.2로 유착이 거의 없고, 상처가 수복된 조직을 도 6에서 관찰할 수 있다. 또한, 조직에서 이물반응에 의한 경도의 염증세포 침윤 및 섬유화 현상 소견이 보였다. 이는 맹장과 복벽 사이에 삽입시킨 실시예 1이 이물질로서 존재하게 되면서 조직에 서서히 흡수되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 흡수는 조직 재형성과정에서 자연스러운 현상이며 염증세포와 더불어 거식세포로 구분되는 거대다핵세포가 발견 되는 것으로 알 수 있다.
조직 검사에서 비교예 6의 조직은 매우 치밀한 반면에 실시예 1은 조직 사이사이에 겔이 존재하여 조직이 덜 치밀하게 되었다. 이는 복막과 맹장이 유착되지 않고 쉽게 분리된 이유로 추정된다. 본 발명의 유착방지제는 생체흡수성 고분자의 빠른 분해를 조절할 수 있으며, 낮은 겔화율에도 불구하고 높은 겔 압축강도를 가지며, 형태를 유지하였다. 연구결과 최적의 조성으로 제조된 유착방지제가 유착방지제로의 가능성이 높은 것을 본 발명을 통하여 확인하였다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예를 통해 유착방지제 제조방법이 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 젤란검; 황산콘드로이친; 및 Ca2+ 및 Mg2+을 포함하는 인산완충식염수, 염화칼슘 및 이들의 혼합물에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 겔화제;로 이루어진 유착방지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 젤란검 : 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함하는 유착방지 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유착방지 조성물은 겔 제형인 유착방지 조성물.
  5. a) 물에 젤란검과 황산콘드로이친을 1 : 1 내지 2 : 1 중량비로 포함하는 혼합조성물로 유착방지겔을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 유착방지겔에 Ca2+ 및 Mg2+을 포함하는 인산완충식염수, 염화칼슘 및 이들의 혼합물에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 겔화제를 혼합하는 단계;
    를 포함하는 유착방지제 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 유착방지겔은 물 100 ㎖당 상기 혼합조성물 1 내지 10 g을 포함하는 유착방지제 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 상기 혼합조성물을 50 내지 80 ℃에서 교반 후 상온에서 성형 건조하여 제조하는 단계를 더 포함하는 유착방지제 제조방법.
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