KR101614137B1 - 발효인삼종자 오일을 이용한 피토스테롤 대량 생산 방법 - Google Patents

발효인삼종자 오일을 이용한 피토스테롤 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼종자를 발효시키는 단계, 발효인삼종자를 건조 및 분쇄시키는 단계, 오일을 추출하는 단계 및 추출된 발효인삼종자 오일에서 피토스테롤을 추출하는 단계를 포함하는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따를 경우 다양한 생리 활성을 갖는 기능성 소재인 피토스테롤을 대량 생산할 수 있다.

Description

발효인삼종자 오일을 이용한 피토스테롤 대량 생산 방법{MASS PRODUCTION METHOD OF PHYTOSTEROLS USING FERMENTED GINSENG SEED OIL}
본 발명은 인삼종자를 발효시키는 단계, 발효인삼종자를 건조 및 분쇄시키는 단계, 오일을 추출하는 단계 및 추출된 발효인삼종자 오일에서 피토스테롤을 추출하는 단계를 포함하는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
두릅나무과(Araliaceae)의 인삼(Panax ginseng)은 동양의 전통 약초로 잘 알려져 있고, 동아시아에서는 여러 질병을 치료하는 용도로 오랫동안 사용되어 왔다. 인삼은 이의 중추 신경계, 심혈관계, 면역조절 기능, 당뇨, 염증, 노화, 항산화, 저혈압, 항종양, 인지, 진정, 진통 및 암 등을 아우르는 다양한 약리 및 치료 효과로 인해 많은 관심을 받고 있으며, 항암, 항부정맥 효과를 갖는 많은 담마란 유형(dammarane-type)의 트리테르펜 올리고글리코시드가 발견되고 보고된바 있다.
인삼종자는 약 15~26 %의 오일을 함유하고 있으며(Beveridge 등 2002; Matsumoto 등 1986), 주요 지방산 성분으로 단일 불포화지방산인 올레산(C18:1)의 함량이 높아 올리브 오일과 비슷한 지방산 조성을 갖는 것으로 나타났다. 또한 인삼종자 오일에 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 효능이 있는 스쿠알렌, 옥시도스쿠알렌, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 시토스테롤 등과 같은 다양한 피토스테롤이 존재하는 것으로 밝혀져 기능성 원료로서의 인삼종자 오일의 이용가능성이 대두되고 있다. 그밖에 현재까지 이루어진 인삼종자에 관한 연구로는 인삼종자와 인삼근의 진세노사이드 조성에 관한 연구(Hu 등 2008), 인삼종자와 과육의 사포닌 조성에 관한 연구, 산지별 인삼종자 오일의 조성과 산화안정성 비교 연구, 고압살균처리에 따른 인삼종자의 항산화 효과 등 주로 인삼종자의 진세노사이드 조성과 인삼종자 오일의 조성에 관한 연구가 보고되고 있다. 또한, 한국 공개특허공보 제2008-0073000호에는 인삼을 슬라이스하고 발효하여 오일을 분리하고, 분쇄하고 반죽하여 발효 인삼을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 발효인삼종자 오일을 이용하여 피토스테롤 대량 생산하는 방법에 대해서는 기재되어 있지 않다.
한편, 최근 생활 수준이 향상되고 건강에 대한 관심이 증대됨에 따라 식품소비 문화에도 변화가 일어나 건강지향적인 식생활을 추구하는 추세이다. 이에 부응하여 생리활성이 있는 기능성 소재를 첨가한 제품을 개발하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
피토스테롤(phytosterol)은 식물성 오일에 대략 1 %정도 함유되어 있는 성분으로, 식물성 오일에서 토코페롤과 함께 건강기능성을 나타내는 중요한 성분이다. 자연계에 존재하는 피토스테롤은 250 여종으로 다양하지만 식물성 유지에 함유된 피토스테롤은 대부분 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤이 대부분을 차지하는 것으로 알려져 있다(Piironen, Lindsay et al. 2000). 피토스테롤은 항산화 활성을 지니고 있을 뿐만 아니라 오일의 산화안정성을 향상시켜주는 역할을 한다(Gertz, Klostermann et al. 2000). 따라서 오일에 함유되어 있는 피토스테롤은 그 자체의 다양한 건강기능성과 더불어 오일의 산화를 방지해준다는 관점에서도 중요한 성분이라고 할 수 있다.
본 발명에서는 다양한 효과를 가진 기능성 소재로 활용될 수 있는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 인삼종자를 특정 미생물로 발효하고 특정의 방법으로 추출할 경우 발효인삼종자 오일 중 피토스테롤 함량이 크게 증가함을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 방법에 따를 경우 다양한 생리 활성을 갖는 기능성 소재인 피토스테롤을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 압착 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 나타낸다.
도 2는 용매 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 나타낸다.
도 3은 초임계 유체 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 a) 인삼종자를 발효시키는 단계; b) 발효인삼종자를 건조 및 분쇄시키는 단계; c) 오일을 추출하는 단계; 및 d) 추출된 발효인삼종자 오일에서 피토스테롤을 추출하는 단계를 포함하는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, a) 단계의 발효는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물을 인삼종자에 접종하여 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, a) 단계의 발효는 락토바실러스 가세리 KCTC 3162(Lactobacillus gasseri KCTC 3162), 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011(Pediococcus pentosaceus LY 011), 바실러스 서브틸리스 KFRI 1124(Bacillus subtilis KFRI 1124) 또는 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127(Bacillus subtilis KFRI 1127)를 인삼종자에 접종하여 수행된다.
락토바실러스 균주는 요거트, 치즈, 피클, 맥주, 김치 등 발효식품에 주로 이용되는 균주로서, 락토오스와 설탕 등의 당을 이용하여 발효시켜 젖산으로 전환시키는 이유로 젖산균이라 불리고 있다. 본 발명의 실시예에서 사용한 락토바실러스 가세리 KCTC 3162는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 계대하여 사용하였다.
페디오코쿠스 균주는 독일 김치의 일종인 사우어크라우트(sauerkraut)를 만들 때 주로 사용되는 균주로서, 양배추 등의 야채를 젖산 발효시켜 시큼한 향이 나게 하고 저장성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서 사용한 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011은 한국식품연구원에서 김치에서 분리한 균주를 분양받아 실험에 사용하였다.
고초균으로 알려진 바실러스 서브틸리스는 자연계에 널리 분포하는 비병원성 세균으로 공기, 마른풀, 하수, 토양 속에 존재한다. 균주가 형성하는 호기성 내생포자는 건조나 고온에 대한 저항력이 강하며, 사람과 동물에 병원성이 없으며 배지 중에 다량의 단백질을 분비한다. 균체는 글리코겐을 함유하는 그람 양성균으로 다수의 탄수화물을 분해하여 산을 생성하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서 사용한 바실러스 서브틸리스 KFRI 1124, KFRI 1127은 한국식품연구원에서 분양받아 계대하여 사용하였다.
바람직한 구현예에서, c) 단계의 추출은 추출 수율을 고려할 때 120 bar 내지 180 bar 및 20℃ 내지 80℃ 조건 범위에서의 초임계 유체 추출이며, 150 bar에서 추출된 발효인삼종자 오일이 미백 효과 등의 생리 활성 측면에서 가장 바람직하다.
본 발명의 실시예에서는 발효인삼종자 오일을 추출한 후 피토스테롤 성분 함량을 분석하였다. 같은 시료임에도 추출 방법에 따른 피토스테롤의 추출 정도가 다른 것을 확인하였다. 이러한 결과는 초임계 추출 방법이 비극성 물질을 잘 용해하는 특성을 가지고 있기 때문에 다른 추출 방법으로 추출한 오일보다 피토스테롤 함량이 높게 나온 것으로 예상된다.
한 연구에 따르면 식물 유지의 피토스테롤 조성은 β-시토스테롤이 40~60 %로 함량이 가장 높고, 캄페스테롤 10~30 %, 스티그마스테롤 10~20 %, 그리고 Δ5-아베나스테롤이 약 5 %에 달한다고 보고된바 있다. 본 실시예의 결과도 마찬가지로 함량의 차이는 보이지만 시료나 추출 방법 상관없이 β-시토스테롤(시토스탄올 포함)이 60 % 이상을 차지하였고, 캄페스테롤 10~20 %, 스티그마스테롤 12~18 %로 유사한 결과를 나타냈다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
인삼종자의 발효
충청남도 금산에서 2012년에 수확한 4 년근 인삼종자를 구입하여 50℃ 열풍건조기에서 48 시간 건조시킨 후 실험에 사용하였다.
압착추출용 시료의 경우 인삼종자를 충분히 건조시킨 후 껍질을 제거하여 얻은 배유(endosperm) 부분을 발효에 사용하였다. 용매추출 및 초임계 유체 추출용 시료의 경우 껍질을 포함한 인삼종자 전체를 분쇄기(독일 FRITSCH사 제조)를 사용하여 껍질과 배유 부분을 모두 분쇄하였고, 입자 크기는 1 mm trapezoidal을 통과시켜 균일하게 하여 분쇄하여 사용하였다.
인삼종자 발효에 사용된 균주는 미호기성 젖산간균인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) KCTC 3162, 호기성 젖산 발효형 구균인 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) LY 011, 호기성 포자형성 간균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFRI 1124 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFRI 1127을 한국생명공학연구원 생물자원센터와 한국식품연구원에서 분양받아 3 회 계대배양하여 사용하였다. 시험 균주와 사용 배지 및 배양 온도를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112014003602112-pat00001
인삼종자의 발효는 각 균주별 특성과 멸균처리시 증류수의 양을 다르게 하여 멸균하고 균주를 접종하였다. 바실러스 균주(KFRI 1124, KFRI 1127)의 경우 수분 함량이 적은 조건에서도 잘 자라기 때문에 수분함량을 최소화하였고, 유산균 균주(KCTC 3162, LY 011)는 수분 함량을 시료 대비 2 ~ 3 배로 증량하여 멸균처리 하였다. 유산균(A)에 속하는 락토바실러스 가세리 KCTC 3162와 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011 그리고 고초균(B)에 속하는 바실러스 서브틸리스 KFRI 1124와 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127 두 그룹으로 나누어 실험한 조건은 다음 표 2와 같다.
Figure 112014003602112-pat00002
상기 조건에 따라 멸균한 인삼종자에 각 균주를 1 % 씩 접종하고 균주가 시료에 잘 퍼지도록 멸균한 스패튤라(spatula)로 잘 섞어준 다음 30℃ 인큐베이터에서 24 시간 배양하여 발효인삼종자를 제조하였다. 이를 냉동시켜 동결건조하고 분쇄하여 발효인삼종자 오일 추출용 시료로 사용하였다.
인삼종자 분말의 멸균 후 pH는 5.98로 측정되었다. 락토바실러스 가세리 KCTC 3162를 접종하여 발효시킨 후의 pH는 5.01로 낮아지는 것을 확인하였다. 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011를 접종하여 발효시킨 후의 pH는 5.53으로 측정되었다. 또한, 바실러스 서브틸리스 1124 균주 접종 후에는 pH가 6.13로 상대적으로 높았고, 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127 균주의 경우는 발효 후 pH가 5.11로 상대적으로 낮게 측정되었다.
발효인삼종자 오일 추출
1. 압착 추출
발효인삼종자 오일의 압착추출은 발효 후 동결건조시킨 발효인삼종자 배유를 사용하였다. 발효인삼종자의 압착은 스크루(screw) 압착 방식의 채유기(한국 내쇼날이엔지(주) 제조)를 사용하여, 60℃ 내지 70℃의 온도에서 전처리 단계를 거친 후, 150℃ 내지 180℃의 온도 및 1 kg/cm2 내지 5 kg/cm2의 압력 조건에서 가열 압착하여 얻은 오일을 8,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 불순물을 제거하였고 상층 오일의 무게를 측정하여 수율을 계산하였다. 이때 추출 전 제거한 껍질 무게를 감안하여 수율을 계산하였다.
2. 용매 추출
발효인삼종자 오일의 용매 추출은 발효 후 동결건조시킨 인삼종자 분말을 사용하였고, 식물유지 추출에 주로 사용하는 n-헥산을 사용하여 추출하였다. 추출용 2 L 보틀(bottle)에 발효인삼종자 분말 200 g과 n-헥산 800 mL을 넣고 70℃에서 3 시간 추출하였다. 추출물은 감압여과장치로 여과한 후 50℃에서 감압농축하여 발효인삼종자 오일을 얻었고 오일의 무게를 측정하여 수율을 계산하였다.
3. 초임계 유체 추출
발효인삼종자 오일의 초임계 유체 추출은 발효 후 동결건조시킨 인삼종자 분말을 사용하였다. 발효인삼종자 중의 오일성분 추출을 위해 초임계 이산화탄소 추출장치(한국 Greentek21사 제조)를 이용하여 추출을 진행하였다. 추출조는 내용량 500 mL으로 분쇄한 발효인삼종자 분말 230 g을 투입하여 에너자이드 씰(energized seal)로 밀봉하였으며, 추출조의 헤드(head) 부분과 본체는 클램프(clamp) 채결 방식을 사용하였다. CO2 실린더에서 나온 CO2 가스는 콘덴서(condenser)를 거쳐 액화되어 CO2 펌프에서 압축된 뒤 추출조로 들어가게 된다. 추출조에서 나온 이산화탄소와 추출물은 압력이 상압으로 낮아지면서 이산화탄소는 날아가고 리시버(receiver)에 모인 추출물을 발효인삼종자 초임계 추출물 시료로 하였다. 초임계 유체 추출은 150 bar, 65℃ 조건으로 설정하고 모든 시료에 동일하게 적용하여 추출하였다.
발효인삼종자 오일 수율
발효인삼종자 오일의 추출방법에 따른 수율을 표 3에 나타내었다.
Figure 112014003602112-pat00003
압착 추출한 오일의 수율은 발효하지 않은 인삼종자 오일(5.2 %) 보다 발효 처리한 인삼종자 오일이 높게 나타났는데, 특히 바실러스 균주로 발효한 인삼종자의 수율이 7 % 이상으로 나타났다. 용매 추출은 반대로 발효처리 하지 않은 대조구의 수율이 16.68 %로 높게 나타났고, 바실러스 균주로 발효한 인삼종자의 수율이 13 % 대로 낮은 결과를 보였다. 락토바실러스 균주로 발효한 인삼종자의 용매 추출 수율은 16.35 %로 대조구 인삼종자 오일과 유사한 수치를 나타냈다. 초임계 추출의 경우 압착 추출과 용매 추출 방법으로 추출한 오일과 반대로 발효하지 않은 대조구 인삼종자의 추출 수율이 4.87 %로 발효한 인삼종자보다 높게 나타났고, 발효인삼종자 오일은 발효 균주에 따라 수율 차이를 보였다. 발효인삼종자로 초임계 추출한 오일 중 가장 높은 수율을 보인 발효 균주는 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127로 4.11 %의 수율을 나타냈다.
발효인삼종자 오일의 분석
색도
색도는 색차계(CR-200, 일본 Minolta사 제조)를 이용하여 L 값(밝기), a 값(+: 적색, -: 청색), b 값(+: 황색, -: 녹색) 및 총 색차 ΔE(Total color difference, ΔE=
Figure 112014003602112-pat00004
)값을 측정하였다. 색도 측정은 6 웰 플레이트(Nunclon™)에 시료 일정량을 담아 측정하였고, 각각 5 회 반복 측정한 수치를 평균한 값으로 나타내었으며, 표준 백색판(L: 97.83, a: -0.36, b: 1.94)으로 보정하여 색도를 측정하였다.
압착 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 표 4 및 도 1에 나타내고, 용매 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 표 5 및 도 2에 나타내고, 초임계 유체 추출 방법을 이용하여 추출한 발효인삼종자 오일의 색도를 표 6 및 도 3에 나타내었다.
Figure 112014003602112-pat00005
Figure 112014003602112-pat00006
Figure 112014003602112-pat00007
지방산 분석
유리지방산 분석은 AOAC 공정분석법에 준하여 가스 크로마토그래피(GC; Agilent 6890)를 사용하여 분석하였다. GC 분석의 컬럼은 HP-FFAP(폴리에틸렌 글리콜-테레프탈산; 25 m × 0.32 mm × 0.5 ㎛)를 사용하였고, 컬럼의 온도는 150℃에서 1 분간 유지 후 230℃까지 1 분당 4℃씩 승온하여 10 분간 유지하였다. 주입 온도는 230℃, 검출기 온도는 250℃로 하였으며, 운반 가스는 He(1.5 mL/min), H2(30 mL/min), 공기(300 mL/min)를 사용하였다. 시료는 메탄올성 수산화나트륨 용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후 트리플루오로보란메탄올(메탄올 중 BF3)을 가하고 가열하여 에스테르화하여 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄에 녹여 시료로 사용하였다. 시료는 1 ㎕씩 주입하였으며, 불꽃이온화 검출기(flame ionization detector, FID)를 사용하여 분석하였다. 지방산 확인을 위한 표준물질은 Supelco 37 component FAME(지방산 메틸 에스테르) mix C4~C24(Supelco)를 사용하여 체류 시간(retention time)을 비교하여 확인하였다.
발효인삼종자 오일의 추출 방법에 따른 지방산 조성 및 함량을 분석한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
Figure 112014003602112-pat00008
전반적으로 인삼종자의 발효 및 추출 방법에 의한 지방산 조성의 차이는 크지 않았다. 발효인삼종자 오일의 지방산 조성은 불포화지방산인 올레산(C18:1)를 78 %, 리놀레산(C18:2)이 18 % 정도로 전체 지방산 함량의 90 % 이상 차지한 것을 알 수 있었고, 특히 올레산의 비중이 높게 나타났다. 이외에 팔미트산(C16:0)을 약 2 %, 그리고 일부 팔미톨레산(C16:1), 스테아르산(C18:0), α-리놀렌산(C18:3, ω3), γ-리놀렌산(C18:3, ω6), 가돌레산(C20:1)을 함유하고 있었다. 표 7에 나타난 것과 같이 압착 추출 방법과 용매 추출 방법으로 추출한 오일의 지방산 조성은 처리구간 거의 차이가 나타나지 않았다. 반면 초임계 추출 방법으로 추출한 오일의 경우 다른 추출 방법과 비교하여 포화지방산인 팔미트산과 스테아르산이 높게 나타났다. 특히 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011 균주로 발효하여 추출한 오일의 수치가 가장 높게 증가하였고, 포화 지방산의 증가에 따라 올레산이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.
피토스테롤 분석
발효인삼종자 오일 0.5 g에 내부 표준물질인 5α-콜레스탄(헥산 중) 0.5 mL (2 mg/mL)와 6 % 피로갈롤(에탄올 중) 용액 10 mL를 넣은 후 1 분간 vortexing 후 질소로 1 분간 플러싱(flushing) 하였다. 그 후 상온에서 10 분간 초음파 처리(sonication)을 진행하였다. 여기에 8 mL의 60 % KOH(D.W. 중) 용액을 가한 후 vortexing 후 1 분간 다시 질소로 플러싱하여 내부 산소를 질소로 치환하였다. 이를 1 시간 동안 75℃, 100 rpm으로 진탕 수조(shaking water bath)에서 검화를 수행한 후 찬물을 이용하여 냉각시켰다. 그 후 2 % NaCl(D.W. 중) 용액 20 mL와 추출 용매(헥산 : 에틸 아세테이트 = 85 : 15, BHT 0.01 % 첨가)를 15 mL 첨가하여 1 분간 vortexing을 진행한 후 상등액을 분리하여 50 mL 메스 플라스크에 옮겼다. 이 때 소듐 술페이트에 여액이 통과하도록 하여 탈수시켰으며 이를 3 번 반복하였다. 50 mL까지 정용한 후 잘 혼합하여 추출액 중 20 mL을 취한 후 질소로 용매를 완전히 제거한 후 헥산 1 mL을 가하여 용해시켜서 0.50 ㎛ 필터로 여과한 후 GC 바이알에 옮겨 피토스테롤 중에서 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤을 분리 및 검출하였다. 기기 분석은 가스 크로마토그래피(M600D, 한국 Younglin사 제조)를 사용하여 분석하였고, 이때 컬럼은 HP ultra-2 Crosslinked 5 % PH ME siloxane(25 m × 0.25 mm × 0.33 ㎛)를 사용하였으며, 컬럼 온도는 285℃, 주입온도와 검출기 온도는 300℃로 하였다. 운반 가스는 N2를 사용하였고 시료는 2 ㎕를 주입하였으며, 각 시료당 총 분석시간은 40 분이었다. 표준 시료는 70 % β-시토스테롤과 5α-콜레스탄 용액을 이용하여 RF 값을 계산하여 정량하였다.
추출 방법에 따른 발효인삼종자 오일의 피토스테롤 성분으로 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 시토스탄올의 함량 및 그 비율을 하기 표 8에 나타내었다.
Figure 112014003602112-pat00009
추출 방법에 따라서 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 시토스탄올의 함량이 큰 차이를 보였고, 총 피토스테롤 함량이 가장 높은 추출 방법은 초임계 추출 방법이었고, 다음으로 용매 추출, 압착 추출순으로 나타났다.
피토스테롤 성분별로 추출 방법에 따른 함량 차이를 살펴보면 다음과 같다. 캄페스테롤의 경우 압착 추출과 용매 추출한 발효인삼종자 오일의 함량은 유사하게 측정되었고, 초임계추출 한 오일에서는 함량이 압착 추출과 용매 추출 오일 시료 보다 두 배 정도 증가한 것으로 나타났다. 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 시토스탄올은 압착 추출 < 용매 추출 < 초임계 추출순으로 뚜렷하게 증가하였는데, β-시토스테롤이 가장 크게 증가하는 것으로 나타났다.
발효 균주에 따른 오일의 피토스테롤 함량도 차이를 보였다. 압착 추출과 용매 추출 방법으로 추출한 오일은 락토바실러스 가세리 KCTC 3162로 발효한 피토스테롤의 함량이 각각 296.6 mg/100g, 445.75 mg/100g으로 다른 균주로 발효한 오일의 피토스테롤 함량 보다 높은 수치를 보였다. 특히, 초임계 추출 방법으로 추출한 경우 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127 균주로 발효한 오일의 피토스테롤 함량이 983.58 mg/100g으로 추출 방법 중 가장 높은 수치를 보였다.
페놀성분 분석
페놀성 성분에 대한 분석은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)(일본 Jasco사 제조, PU-980)를 이용하였다. 페놀성 성분의 HPLC 분석은 C-18 컬럼(5.0 μm, 4.6×250 mm, 아일랜드 Waters사 제조)을 사용하여 2 % 아세트산을 함유하는 물(용매 A)과 0.5 % 아세트산을 함유하는 50 % 아세토니트릴(용매 B)을 이동상으로 사용하였다. 초기 A 용매 100 %에서 70 분 후 A 용매 45 %로 구배(gradient)를 주어 0.8 mL/min의 속도로 총 80 분간 전개하였으며, 시료는 20 ㎕ 주입하였다. 시료의 검출은 UV detector(MD-2010, 일본 Jasco사 제조)를 사용하여 280 nm에서 측정하였다. 분석에 사용한 표준 물질은 총 10 종으로 말톨(maltol), ρ-쿠마르산(ρ-coumaric acid), 신남산(cinnamic acid), 살리실산(salicylic acid), 바닐산(vanillic acid), 시링산(syringic acid), 페룰산(ferulic acid), 겐티신산(gentisic acid), 카페인산(caffeic acid)은 미국 Sigma사 제품을, ρ-히드록시 벤조산(ρ-hydroxy benzoic acid)은 일본 Junsei사 제품을 사용하였다.
전처리는 각 시료 2 g 씩을 취하여 n-헥산 10 mL에 녹인 후 80 % 메탄올 20 mL를 가하여 80℃ 환류추출장치에서 2 시간 동안 페놀성 물질을 추출하였다. 이 추출물에 n-헥산 10 mL를 가하여 잔존하는 유지 성분을 제거하고, 층분리된 80 % 메탄올 층을 감압 농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거하였다. 농축된 추출물은 10 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹인 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 분석용 시료로 사용하였다.
추출 방법을 달리하여 추출한 발효인삼종자 오일 중의 페놀 성분을 분석한 결과를 표 9 내지 표 11에 나타내었다. 표 9는 압착 추출 발효인삼종자 오일에 대한 것이고, 표 10은 용매 추출 발효인삼종자 오일에 대한 것이고, 표 11은 초임계 유체 추출 발효인삼종자 오일에 대한 것이다.
Figure 112014003602112-pat00010
Figure 112014003602112-pat00011
Figure 112014003602112-pat00012
압착 추출한 오일의 경우 말톨, ρ-쿠마르산, 트랜스-신남산이 검출되었고, 용매 추출한 오일은 ρ-쿠마르산과 트랜스-신남산, 초임계 추출한 오일은 말톨, 바닐산+카페인산, ρ-쿠마르산, 트랜스-신남산이 검출되어 추출 방법에 따른 차이를 보였다. 특히 트랜스-신남산은 추출 방법이나 발효 조건에 관계없이 모든 시료에서 공통적으로 검출된 것을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법:
    a) 인삼종자를 락토바실러스 가세리 KCTC 3162(Lactobacillus gasseri KCTC 3162), 페디오코쿠스 펜토사세우스 LY 011(Pediococcus pentosaceus LY 011), 바실러스 서브틸리스 KFRI 1124(Bacillus subtilis KFRI 1124) 또는 바실러스 서브틸리스 KFRI 1127(Bacillus subtilis KFRI 1127)로 발효시키는 단계;
    b) 발효인삼종자를 건조 및 분쇄시키는 단계;
    c) 발효인삼종자를 120 bar 내지 180 bar 및 20℃ 내지 80℃에서 초임계 유체 추출하여 오일을 추출하는 단계; 및
    d) 추출된 발효인삼종자 오일에서 피토스테롤을 추출하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    피토스테롤이 β-시토스테롤인 것을 특징으로 하는 피토스테롤을 대량 생산하는 방법.
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