KR101613870B1

KR101613870B1 - A pretreatment apparatus for specimen in scanning elctron microscope

Info

Publication number: KR101613870B1
Application number: KR1020140108221A
Authority: KR
Inventors: 정승원; 신현호; 허진비; 정진; 윤석민; 임동일; 백승호
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2016-05-02
Also published as: KR20160022974A

Abstract

본 발명은 생물시료의 주사전자현미경 촬영을 위한 전처리 자동화 장치에 대한 것으로, 특히 대상시료에 처리되는 전처리용액을 공급하는 전처리용액공급모듈과 상기 전처리용액공급모듈에서 공급되는 전처리 용액을 이송하는 배관모듈, 상기 배관모듈에서 공급되는 전처리 용액을 대상시료에 분주하여 처리하는 시료전처리모듈 및 전처리용액의 공급 시기와 공급 량, 처리 순서를 포함하는 공정을 제어하는 제어모듈을 포함하여 구성된다.The present invention relates to a pre-treatment automation apparatus for a scanning electron microscope of a biological sample, and more particularly to a pre-treatment automation apparatus for a pre-treatment solution supply module for supplying a pretreatment solution to be processed to a target sample, A sample preprocessing module for dividing the pretreatment solution supplied from the piping module into a target sample, and a control module for controlling a process including a supply timing, a supply amount, and a process order of the pretreatment solution.

Description

Description of the Related Art [0002] A pretreatment apparatus for specimen in a scanning electron microscope

본 발명은 생물시료의 주사전자현미경 촬영을 위한 전처리 자동화 장치에 대한 것이다.The present invention relates to a pre-processing automation apparatus for scanning electron microscope photographing of a biological sample.

일반적으로 주사전자현미경(SEM:Scanning Elctron Microscope)은 전자가 시편를 통과하도록 하는 것이 아닌, 초점이 잘 맞추어진 전자선(electron beam)을 시편의 표면 위로 주사하였을 때에 시편 표면에서 발생하는 낮은 에너지의 전자(2차 전자)를 검출하여 시편 표면의 미세 구조를 직접 관찰하는 장치이다.In general, a scanning electron microscope (SEM) does not allow electrons to pass through a specimen. Instead, when a focused electron beam is scanned over the surface of a specimen, low energy electrons Secondary electrons are detected to directly observe the microstructure of the specimen surface.

여기서, 상기 주사전자현미경에 의해 주사된 전자선이 시편의 한 점에 집중되면서 1차 전자는 굴절되는 반면,표면에서 발생된 2차 전자는 검출기(detector)에 의해 수집되는바, 그 결과로 생긴 신호들이 여러 점으로부터 모여들어 음극선관(CRT:Cathod Ray Tube)에 상을 형성하게 된다. 이러한 주사전자현미경은 초점이 높은 심도를 이용하여 비교적 큰 시편을 입체적으로 관찰ㆍ분석할 수 있는 특징을 가진다.Here, the primary electron is refracted while the electron beam scanned by the scanning electron microscope is concentrated at one point of the specimen, while the secondary electrons generated at the surface are collected by the detector, and the resultant signal Are gathered from various points and form an image on a cathode ray tube (CRT). Such a scanning electron microscope has a feature that a relatively large specimen can be observed and analyzed in three dimensions using a high depth of focus.

특히, 상술한 주사전자현미경을 이용하여 생물시료를 관찰하는 경우, 세포벽이 약한 생물시료는 세포벽이 수축 등으로 손상되어, 신뢰성 있는 영상을 얻기 어려운바, 세포벽의 손상되지 않는 상태로 원형 그대로의 모습을 유지하여 촬영하기 위해 소정의 전처리 공정이 필수적으로 필요하게 된다.Particularly, when a biological sample is observed using the above-described scanning electron microscope, a biological sample having a weak cell wall is damaged due to shrinkage or the like of a cell wall, and it is difficult to obtain a reliable image. A predetermined preprocessing process is indispensably required for photographing while keeping the image.

그러나 기존의 전처리 공정의 경우, 세포의 고정액이나 탈수액 등의 전처리 용액을 대상 시료에 수동적으로 파이펫으로 넣어서 전처리를 수행하게 되는바, 전처리를 수행하는 자의 숙련도나 경험도에 따른 전처리 효율이 크게 차이가 나게 되며, 각각의 세부 전처리 과정에 소요되는 시간이 표준화되지 않아 정량화된 시료를 확보하기가 매우 어려운 실정이다.However, in the case of the conventional pretreatment process, pretreatment solutions such as cell fixation solution and dewatering solution are manually passively pipetted into the target sample, so that the pretreatment efficiency according to the proficiency or experience of the person performing the pretreatment is large And the time required for each detailed pretreatment process is not standardized, so it is very difficult to obtain a quantified sample.

한국 공개실용신안공보 제20-1997-0039069호Korean Utility Model Publication No. 20-1997-0039069

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 주사전자현미경을 이용하여 생물시료를 촬영하는 경우에 필수적인 전처리 공정을 자동화하여 시료의 전처리 공정에 소요되는 처리 시간을 최소화함은 물론, 전처리 공정을 표준화 자동화하여 사용자의 숙달도의 편차에 따른 전처리 효율의 부정확도를 일소하여, 전처리의 처리 품질을 제고할 수 있는 생물시료의 전처리 자동화 장치를 제공하는 데 있다.The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to minimize the processing time required for a pretreatment process of a sample by automating a pretreatment process which is necessary when a biological sample is photographed using a scanning electron microscope The present invention also provides an automated pretreatment apparatus for a biological sample which can automate standardization of the pretreatment process, thereby eliminating the inaccuracy of the pretreatment efficiency due to variation of the user's proficiency and improving the quality of the pretreatment.

상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시예에 따른 전처리 자동화 장치는, 대상시료에 처리되는 전처리용액을 공급하는 전처리용액공급모듈과 상기 전처리용액공급모듈에서 공급되는 전처리 용액을 이송하는 배관모듈, 상기 배관모듈에서 공급되는 전처리 용액을 대상시료에 분주하여 처리하는 시료전처리모듈 및 전처리용액의 공급 시기와 공급 량, 처리 순서를 포함하는 공정을 제어하는 제어모듈을 포함하여 구성될 수 있다.As a means for solving the above-mentioned problems, the pretreatment automation apparatus according to the embodiment of the present invention includes a pretreatment solution supply module for supplying a pretreatment solution to be processed to a target sample, and a pretreatment solution supply module for transferring the pretreatment solution supplied from the pretreatment solution supply module A pipeline module, a sample preprocessing module for dividing the pretreatment solution supplied from the piping module into a target sample, and a control module for controlling a process including a supply timing, a supply amount, and a process order of the pretreatment solution .

이 경우, 상술한 상기 전처리용액공급모듈은, 상기 대상시료에 분주되어 대상시료를 전고정하는 용액을 제공하는 전고정용액공급부; 전고정된 상기 대상시료에 후고정용액을 배합하여 후고정 용액을 공급하는 후고정용액공급부와, 서로 다른 농도의 탈수액을 일정 간격으로 제공하여 대상시료를 탈수시키는 탈수액을 공급하는 탈수용액공급부, 탈수된 상기 대상시료에 잔존하는 탈수액을 제거하여 대상시료에 치환되는 치환용액을 공급하는 치환용액공급부와 상기 대상시료를 건조하는 건조액을 공급하는 건조용액공급부 및 상기 제어모듈의 제어에 따라 각 공정에 필요한 세척액을 공급하는 세척용액공급부;를 포함하여 구성될 수 있다.In this case, the pre-treatment solution supply module may include: a pre-fix solution supply unit that is dispensed in the target sample to provide a solution for pre-fixing the sample to be tested; A dehydrating solution supply unit for supplying a dehydrating solution for dehydrating a target sample by supplying dehydrating solutions of different concentrations at predetermined intervals to form a dehydrating solution supplying unit for dehydrating an object sample; , A dehydrated solution remaining in the dehydrated sample to remove the dehydrated solution and supplying a replacement solution to be replaced to the sample to be treated, a drying solution supply unit for supplying a drying solution for drying the sample to be tested, And a cleaning solution supply unit for supplying a cleaning solution required for each process.

상술한 상기 전고정용액은 Glutaraldehyde 용액을 적용하고, 상기 후고정용액은 Osmium tetroxide와 HgCl₂의 혼합액을 적용할 수 있으며, 상기 탈수액은, 에탄올의 농도를 적어도 2 이상의 단계로 차별화하여, 차별화된 에탄올을 순차적으로 상기 대상시료에 공급하도록 할 수 있으며, 나아가 상기 치환용액은, 상기 대상시료에 포함되는 에탄올을 t-butanol로 치환하는 용액을 적용할 수 있다.A glutaraldehyde solution may be applied to the pre-fixation solution, and a mixed solution of Osmium tetroxide and HgCl ₂ may be used as the post fixation solution. The dehydration solution may be prepared by differentiating the concentration of ethanol into at least two stages, Ethanol may be sequentially supplied to the target sample. Further, as the replacement solution, a solution in which ethanol contained in the target sample is replaced with t-butanol may be applied.

상술한 본 발명의 실시예에 따른 전처리장치의 상기 배관모듈은, 상기 전처리용액공급모듈을 구성하는 각각의 모듈에 대응하는 배관라인 및 상기 배관라인과 연결되며, 상기 시료전처리모듈로 전처리 용액을 제공하는 연동펌프를 포함하여 구성될 수 있다.The piping module of the pretreatment apparatus according to an embodiment of the present invention is connected to piping lines corresponding to the respective modules constituting the pretreatment solution supply module and to the piping line, and the pretreatment solution is supplied to the sample preparation module And a peristaltic pump.

나아가, 상기 배관라인 중 치환용액공급부와 연결되는 배관라인은, 상기 치환용액을 일정한 온도로 유지시키는 온도처리부를 더 포함하여 구성될 수 있다.Furthermore, the piping line connected to the replacement solution supply unit among the piping lines may further include a temperature processing unit for maintaining the replacement solution at a constant temperature.

또한, 상기 온도처리부는, 상기 치환용액공급부와 연결되는 배관라인 또는 상기 치환용액공급부에 온도를 제어하는 열선 코일을 더 포함하여 구성될 수 있다.The temperature treatment unit may further include a pipe line connected to the replacement solution supply unit or a heating wire coil for controlling the temperature of the replacement solution supply unit.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 주사전자현미경용 시료전처리장치의 상기 시료전처리모듈은, 상기 전처리용액공급모듈에서 공급되는 전처리용액을 상기 대상시료에 분주하는 액상분사부와 상기 대상시료가 배치되는 시료분주부를 포함하여 구성될 수 있다.The sample pretreatment module of the sample preparation apparatus for a scanning electron microscope according to an embodiment of the present invention may further include a liquid injection part for dispensing the pretreatment solution supplied from the pretreatment solution supply module to the target sample, And a sample dispensing portion.

이 경우, 상기 시료분주부는, 상기 대상시료가 고르게 분주되는 필터부재를 포함하여 구성될 수 있다. 나아가 상기 제어모듈은, 상기 시료분주부에 배치되는 상기 대상시료의 양에 따라, 상기 필터부재의 사이즈 또는 공극의 최적치를 설정하여 산출하여 디스플레이할 수 있도록 구현될 수 있다.
In this case, the sample dispenser may include a filter member in which the target sample is evenly dispensed. Further, the control module may be configured to set, calculate, and display an optimum value of the size or the gap of the filter member according to the amount of the target sample disposed in the sample distributor.

본 발명에 따르면, 전자주사현미경을 이용하여 생물시료를 촬영하는 경우에 필수적인 전처리 공정을 자동화하여 시료의 전처리 공정에 소요되는 처리 시간을 최소화함은 물론, 전처리 공정을 표준화 자동화하여 사용자의 숙달도의 편차에 따른 전처리 효율의 부정확도를 일소하여, 전처리의 처리 품질을 제고할 수 있는 장점이 있다.According to the present invention, it is possible to automate the pre-processing steps necessary for photographing a biological sample using an electronic scanning microscope, thereby minimizing the processing time required for the pre-processing of the sample, and automating the standardization of the pre- It is possible to improve the quality of the preprocessing by eliminating the inaccuracy of the preprocessing efficiency.

특히, 본 발명의 실시예에 따른 표준화된 전처리 장치를 통해 세포벽의 수축 등의 손상되지 않는 생물시료의 완벽한 원형의 모습으로 건조하여 신뢰성 있는 촬영영상을 제공할 수 있는 효과가 있다.Particularly, the standardized pretreatment apparatus according to the embodiment of the present invention is capable of providing a reliable photographed image by drying in a perfect circular shape of an unimpaired biological sample such as contraction of a cell wall.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치의 주요 구성을 도시한 구성 블록도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치를 구현한 예시 개념도이다.
도 3은 도 1에 따른 주사전자현미경용 시료전처리장치를 이용하여 시료의 전처리 공정을 수행하는 공정 순서도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 주사전자현미경용 시료전처리장치를 이용하여 전처리한 와편모조류 칼로디니움 미크롬(Karlodinium micrum)의 이미지 사진이다. 1 is a block diagram showing a main configuration of a sample pretreatment apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention.
2 is a conceptual diagram illustrating an embodiment of a sample pretreatment apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a process flow chart for performing a pretreatment process of a sample using the sample pretreatment apparatus for a scanning electron microscope according to FIG.
Figure 4 is a block diagram of an embodiment of the present invention Wapyeon pretreated using the sample preparation for scanning electron microscopy according to the photo image of the parent bird knife di nium US chromium (Karlodinium micrum).

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 따른 구성 및 작용을 구체적으로 설명한다. 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성요소는 동일한 참조부여를 부여하고, 이에 대한 중복설명은 생략하기로 한다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
Hereinafter, the configuration and operation according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS In the following description with reference to the accompanying drawings, the same reference numerals denote the same elements regardless of the reference numerals, and redundant description thereof will be omitted. The terms first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 주사전자현미경용 시료전처리장치의 주요 구성을 도시한 구성 블록도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치를 구현한 예시 개념도이다.FIG. 1 is a block diagram showing a main configuration of a sample pretreatment apparatus for a scanning electron microscope according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is an exemplary conceptual diagram illustrating a sample pretreatment apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention. to be.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치는, 대상시료에 처리되는 전처리용액을 공급하는 전처리용액공급모듈(100), 상기 전처리용액공급모듈(100)에서 공급되는 전처리 용액을 이송하는 배관모듈(200), 상기 배관모듈에서 공급되는 전처리 용액을 대상시료에 분주하여 처리하는 시료전처리모듈(300) 및 전처리용액의 공급 시기와 공급 량, 처리 순서를 포함하는 공정을 제어하는 제어모듈(400)을 포함하여 구성될 수 있다.1 and 2, a sample preparation apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention includes a pretreatment solution supply module 100 for supplying a pretreatment solution to be treated to a target sample, a pretreatment solution supply module 100 A sample preprocessing module 300 for dividing the pretreatment solution supplied from the piping module into a target sample and a pretreatment solution supply unit 300 for supplying the pretreatment solution to the sample, And a control module 400 for controlling the process including the process.

본 발명의 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치는 상술한 구성을 통해 자동화된 전처리 공정을 구현할 수 있으며, 전처리 용액의 처리 시간 및 처리 용량을 전량화된 지표를 통해 효율적으로 구현하여 표준화된 전처리 시료를 구현할 수 있도록 한다.The sample preparation apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention can realize an automated pretreatment process through the above-described configuration, and can efficiently implement the treatment time and the treatment capacity of the pretreatment solution through the full- So that a standardized pretreatment sample can be realized.

상기 전처리용액공급모듈(100)은 전처리를 위해 필요한 용액을 수용하고, 이를 혼합하여 전처리를 위한 용액을 공급하는 단위 유닛을 포함하여 구성될 수 있다. 일예로, 도 1 및 도 2에 도시된 것과 같이, 상기 전처리용액공급모듈(100)은, 상기 대상시료에 분주되어 대상시료를 전고정하는 용액을 제공하는 전고정용액공급부(110)와 전고정된 상기 대상시료에 후고정용액을 배합하여 후고정 용액을 공급하는 후고정용액공급부(120), 서로 다른 농도의 탈수액을 일정 간격으로 제공하여 대상시료를 탈수시키는 탈수액을 공급하는 탈수용액공급부(130), 탈수된 상기 대상시료에 잔존하는 탈수액을 제거하여 대상시료에 치환되는 치환용액을 공급하는 치환용액공급부(140), 상기 대상시료를 건조하는 건조액을 공급하는 건조용액공급부(150) 및 상기 제어모듈의 제어에 따라 각 공정에 필요한 세척액을 공급하는 세척용액공급부(160)을 포함하여 구성될 수 있다.The pretreatment solution supply module 100 may include a unit for receiving the solution required for the pretreatment, mixing the solution, and supplying a solution for the pretreatment. For example, as shown in FIGS. 1 and 2, the pretreatment solution supply module 100 includes a pre-fixation solution supply part 110 for supplying a solution to be pre-fixed to a sample to be tested, A dehydrating solution supply unit 120 for supplying a dehydrating solution for dehydrating a target sample by providing dehydrating solutions of different concentrations at predetermined intervals, 130), a replacement solution supply unit (140) for removing the dehydrated solution remaining in the dehydrated sample and supplying a replacement solution to be replaced to the sample, a drying solution supply unit (150) for supplying a drying solution for drying the sample, And a cleaning solution supply unit 160 for supplying the cleaning solution required for each process under the control of the control module.

상기 전처리용액공급모듈(100)을 구성하는 상술한 각각의 용액공급모듈은 전처리를 위한 용액의 공급을 위하여 단일의 용액을 수용하거나 2 이상의 용액을 수용하고 이를 혼합한 혼합액을 배합 공급할 수 있도록 하는 구성을 포함하여 구성될 수 있다.Each of the above-mentioned solution supply modules constituting the pretreatment solution supply module 100 is configured to accommodate a single solution for the supply of the solution for the pretreatment, or to mix and supply a mixed solution containing two or more solutions, As shown in FIG.

일예로, 상기 전고정용액공급부(110)는 생물시료인 대상시료를 초기에 공정하는 전고정 공정을 수행하는 용액을 수용하며, 제어모듈의 제어에 따라 초기 전고정을 위해 대상시료에 전고정용액을 공급할 수 있도록 한다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 전고정용액은 Glutaraldehyde 용액을 사용할 수 있으며, 전고정을 위한 농도는 필요에 따라 변경될 수 있으나, 최종 농도를 2%로 형성하여 적용하는 것을 본 실시예에서는 예를 들어 설명한다.For example, the pre-fixation solution supply unit 110 receives a solution for performing a pre-fixation process for initially processing a target sample as a biological sample, and controls the pre-fixation solution . In the embodiment of the present invention, a glutaraldehyde solution can be used as a pre-fixation solution, and the concentration for pre-fixation can be changed as needed, but the final concentration is set to 2% I will explain it.

상기 후고정용액공급부(120)는 대상시료를 전고정하고, 이후 세척액을 통해 전고정액을 인산염들의 세정액으로 세척한 후, 재차 대상시료를 후고정하는 후고정용액을 공급하는 기능을 수행한다. 상기 후고정용액의 예로는, Osmium tetroxide와 HgCl2 용액을 혼합한 용액을 적용할 수 있으며, 바람직한 예로는 Osmium tetroxide: HgCl2 = 5:1 중량비로 만든 후고정액 1 mL 분주하여 후고정을 수행하는 것을 본 실시예에서 적용하여 설명하기로 한다.The post-fix solution supply unit 120 functions to pre-fix the sample to be tested, then wash the pre-fix solution with the cleaning solution of the phosphates through the wash solution, and then supply the post fix solution to fix the sample again. For example, a mixture of Osmium tetroxide and HgCl 2 solution may be used. For example, Osmium tetroxide: HgCl 2 = 5: 1, The following description will be applied to the embodiment.

상기 탈수용액공급부(130)는 상술한 상기 후고정용액공급부(120)는 대상시료를 후고정하고, 이후 세척액을 통해 후고정액을 인산염들의 세정액으로 세척한 후, 대상시료에 대하여 탈수공정을 수행할 수 있도록 하는 탈수용액을 공급할 수 있도록 한다. 상기 탈수용액은 본 실시예에서는 에탄올을 적용하여 수행될 수 있으며, 특히 바람직하게는 상기 탈수액은, 에탄올의 농도를 적어도 2 이상의 단계로 차별화하여, 차별화된 에탄올을 순차적으로 상기 대상시료에 공급할 수 있도록 한다. 일 예로, 이러한 에탄올의 공급 순서를 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%의 농도의 에탄올을 순차적으로 분주하여 시료를 탈수하며, 이 중 100% 에탄올은 2회 반복 하는 것과 같이 탈수의 공정을 진행할 수 있도록 한다.In the dehydrating solution supplying part 130, the post-fixing solution supplying part 120 described above fixes a target sample, and then the post-fixing solution is washed with a washing solution of phosphates through a washing solution, and then a dehydration process is performed on the target sample The dehydrated solution can be supplied. The dehydrating solution may be carried out by applying ethanol in this embodiment. Particularly preferably, in the dehydrating solution, the concentration of ethanol may be differentiated by at least two steps, and differentiated ethanol may be sequentially supplied to the target sample . For example, the order of supplying ethanol is sequentially divided by 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, and 100% ethanol, and the sample is dehydrated, and 100% Thereby allowing the dehydration process to proceed.

상기 치환용액공급부(140)는 대상시료에 탈수용액을 처리하여 탈수 공정을 진행한 후, 대상시료에 남아 있는 에탄올 등의 탈수용액과 치환할 수 있도록 하는 치환용액을 공급하는 작용을 수행한다. 이를 테면, 탈수용액으로 상술한 것과 같이 에탄올을 적용한 경우, 치환용액으로 t-butanol을 처리하게 되면, 대상시료에 남아 있는 에탄올을 밀어내고 세포내부에 t-butanol이 유입됩니다. 상기 치환용액은 가장 세포를 원형 그대로 관찰할 수 있도록 하는 기능을 수행한다.The displacement solution supply unit 140 performs a dehydration process on the sample to be dehydrated and then supplies a replacement solution to replace the dehydrated solution such as ethanol remaining in the sample. For example, if ethanol is applied to the dehydrated solution as described above, if t-butanol is treated with the replacement solution, ethanol remaining in the sample is pushed out and t-butanol is introduced into the cell. The replacement solution performs the function of allowing the most cells to be observed in their original form.

상기 건조용액공급부(150)은 상술한 치환용액을 처리한 이후, 대상시료에 건조용액을 공급하여 건조 공정을 수행하는 것으로, 본 발명의 실시예에서는 HMDS를 적용하여 건조 공정을 수행할 수 있도록 한다. 일반적으로, 전자현미경은 크게 HV (high vaccum) 과 LV (low vaccum) 모델로 구분될 수 있으며, HV 모델은 시료가 완전히 건조되어야 사용할 수 있는 모델이고 LV 모델은 비건조 상태의 샘플(wet sample)에서도 전자현미경을 관찰할 수 있있다. 그러나 LV 모델은 비건조 상태의 샘플을 촬영할 수 있는 장점을 가지고 있는 대신, 시료 내에서 계속적으로 수분이 배출되어 고배율로 관찰하지 못하게 되는 단점이 존재하게 된다. 따라서, 시료의 건조는 전자현미경 관찰에 가장 중요한 전처리 중의 하나이다. 일반적으로 현재까지는 생물시료를 전처리 함에 있어서, CPD (critical point dryer, 임계점 건조기)라는 제품으로 건조를 하고 있으나, 이는 장시간 (2-3 시간) 및 숙련도를 많이 요구하는 단점이 존재하나, 본 발명의 실시예에서 적용하는 HMDS는 화학적으로 시료를 증발하는 시약으로 빠르게 증발할 수 있는 특징을 가지는 바 공정시간을 단축할 수 있게 된다.The drying solution supplying unit 150 supplies the drying solution to the sample to be dried after the replacement solution is treated. In the embodiment of the present invention, the drying solution can be applied by applying HMDS . In general, the electron microscope can be classified into HV (high vaccum) and LV (low vacuum) models. HV model is a model that can be used when the sample is completely dried. LV model is a wet sample, The electron microscope can be observed. However, the LV model has the advantage of being able to capture non-dried samples, but has the disadvantage that the water is continuously discharged in the sample and can not be observed at a high magnification. Therefore, the drying of the sample is one of the most important pretreatment for electron microscopic observation. Generally, up to now, in the pretreatment of biological samples, drying is performed with a product called CPD (Critical Point Dryer), but this has disadvantages of requiring a long time (2-3 hours) and a high degree of skill, The HMDS used in the embodiment is chemically a reagent for evaporating a sample and can be rapidly evaporated, thereby shortening the processing time.

상기 세척용액공급부(160)는 상술한 각 전처리 용액의 처리 공정의 중간에 세척이 필요한 경우, 세척용액을 인가하는 기능을 수행하며, 본 실시예에서는 인산염 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 세정액의 pH를 시료의 특성에 맞게 조절한 후, 전고정액이나 후고정액 등을 세척하게 된다.
The cleaning solution supply unit 160 functions to apply the cleaning solution when the cleaning solution is required in the middle of the process of each of the pretreatment solutions described above. In this embodiment, the cleaning solution supply unit 160 uses a phosphate buffer After the pH is adjusted to the characteristics of the sample, the fixing solution or postfixing solution is washed.

도 1 및 도 2를 참조하여 상술한 전처리용액공급모듈(100)에서 공급되는 전처리 용액의 공급을 수행하는 배관모듈(200)의 구성을 설명하면 다음과 같다.The piping module 200 for supplying the pretreatment solution supplied from the pretreatment solution supply module 100 described above with reference to FIGS. 1 and 2 will now be described.

상기 배관모듈(200)은 상술한 전처리용액공급모듈(100)을 구성하는 다수의 용액공급부의 각각에 배관라인(221~226)이 각각 연결되게 되며, 배관라인의 타단부에는 연동펌프(210)을 마련하여, 공급되는 전처리 용액을 시료전처리모듈(300)으로 공급할 수 있도록 한다. The piping module 200 is connected to piping lines 221 to 226 respectively to a plurality of solution supply units constituting the pretreatment solution supply module 100. A peristaltic pump 210 is connected to the other end of the pipeline, So that the supplied pretreatment solution can be supplied to the sample pretreatment module 300.

특히, 이 경우 다수의 배관라인 중 치환용액공급부(140)과 연결되는 배관라인(224)의 경우, 치환용액의 특성에 따라 상변화(고체화)가 일어나는 경우가 있는바, 상기 치환용액공급부(140)와 이에 연결되는 배관라인(224)의 표면에 열원을 공급하여 항상 일정한 온도를 유지할 수 있도록 하는 열선 코일(231, 232)을 포함하는 온도처리부(230)를 더 포함하여 구성됨이 바람직하다. 일예로, 본 발명의 실시예에서 치환용액으로 사용하는 t-butanol의 경우, 20℃ 이하에서는 고체화되기 때문에, 상술한 열선 코일(231, 232)을 통해 상기 치환용액공급부(140)와 이에 연결되는 배관라인(224)의 온도를 20~25℃로 유지할 수 있도록 함이 바람직하다.Particularly, in this case, in the case of the pipeline line 224 connected to the replacement solution supply unit 140 among the plurality of pipeline lines, a phase change (solidification) may occur depending on the characteristics of the replacement solution. And a temperature processing unit 230 including heat coil coils 231 and 232 for supplying a heat source to the surface of the pipe line 224 connected thereto and maintaining a constant temperature at all times. For example, t-butanol used as a substitution solution in the embodiment of the present invention is solidified at a temperature of 20 ° C or lower. Therefore, it is preferable that the substitution solution supply unit 140 It is preferable that the temperature of the piping line 224 can be maintained at 20 to 25 占 폚.

상기 시료전처리모듈(300)은 상기 배관모듈(200)을 통해 공급되는 전처리용액을 공급받아 대상시료에 분주하여 전처리를 수행하는 기능을 한다. 이를 위해, 상기 전처리용액공급모듈에서 공급되는 전처리용액을 상기 대상시료에 분주하는 액상분사부(310)와 상기 대상시료가 배치되는 시료분주부(320)를 포함하여 구성될 수 있다. 상기 액상분사부(310)은 전처리용액을 대상시료에 균일하게 분주하기 위하여 다양한 형태의 노즐이 결합한 구조의 분사유닛으로 구현될 수 있다.The sample preprocessing module 300 receives the pretreatment solution supplied through the piping module 200 and dispenses the pretreatment solution to the sample to be pretreated. For this, a liquid injection part 310 for dispensing the pretreatment solution supplied from the pretreatment solution supply module to the target sample and a sample dispensing part 320 where the target sample is placed may be included. The liquid injector 310 may be implemented as a spray unit having a structure in which various types of nozzles are combined to uniformly pump the pretreatment solution to a target sample.

나아가, 상기 시료분주부(320)의 경우, 상기 액상분사부(310)에서 분사되는 전처리용액이 도달하는 위치에 대상시료를 재치할 수 있는 기구물을 포함한다. 특히 상기 시료분주부(320)에는 대상시료가 고르게 분주되는 필터부재를 더 포함하여 구성될 수 있으며, 일반적으로 상기 필터부재의 표면에 대상시료가 고르게 배치되게 된다. 상기 필터부재(filter paper)는 주로 polycarbonate 재질의 공극을 가지고 있는 부재를 사용할 수 있으며, 이 경우 공극의 크기는 시료의 크기 및 양에 따라 결정될 수 있도록 한다. 이를 테면,시료 양이 많으면 큰 공극이나 필터의 사이자가 큰 부재를 적용하며, 반대로 양이 적으면 작은 사이즈의 부재를 사용하는 것이 바람직하다. 이를 위해서, 상기 제어모듈에서 상기 시료분주부에 배치되는 상기 대상시료의 양에 따라, 상기 필터부재의 사이즈 또는 공극의 최적치를 설정하여 산출하는 구성을 더 포함하여 형성될 수 있도록 함이 바람직하다.In addition, in the case of the sample dispenser 320, the sample dispenser may include a device capable of placing a target sample at a position where the pretreatment solution injected from the liquid injector 310 reaches. Particularly, the sample distributor 320 may further include a filter member uniformly distributing the target sample. In general, the target sample is uniformly disposed on the surface of the filter member. The filter paper may be a member having a pores of polycarbonate. In this case, the size of the pores can be determined according to the size and amount of the sample. For example, if the amount of the sample is large, a large member such as a large gap or a filter is applied. Conversely, if the amount is small, it is preferable to use a member having a small size. Preferably, the control module is further configured to calculate and calculate the optimum size or pore size of the filter member according to the amount of the target sample placed in the sample distributor in the control module.

나아가 시료전처리모듈(300)의 말단에는 처리액을 회수하는 처리액회수부(330)을 더 포함하여 구성될 수 있다.Further, the sample preprocessing module 300 may further include a treatment liquid recovery unit 330 for recovering the treatment liquid.

본 발명에 따른 제어모듈(400)은 상술한 세척용액공급부(100)에서 공급될 용액의 양과 종류, 공급시간을 제어하며, 배관라인의 온도처리를 제어하고, 이후 시료전처리과정에서 용액의 분사 시간을 제어하는 등 전체적인 장치를 컨트롤할 수 있도록 한다. 아울러, 상기 제어모듈(400)에서는 상술한 제과정을 컨트롤할 수 있는 디스플레이부, 또는 터치패널로 구현되는 유닛으로 구현하여 제어의 효율성을 높일 수 있도록 할 수 있다.The control module 400 according to the present invention controls the amount, kind, and supply time of the solution to be supplied from the cleaning solution supply unit 100, controls the temperature process of the pipeline, To control the entire device. In addition, the control module 400 may be implemented as a display unit that can control the above-described processes, or a unit that is implemented as a touch panel, thereby improving the efficiency of control.

도 3은 상술한 본 발명의 실시예에 따른 전자주사현미경용 시료전처리장치를 이용하여 전처리 공정을 수행하는 공정 순서도를 도시한 것이다.FIG. 3 is a flowchart showing a process of performing a pre-treatment process using a sample preparation apparatus for an electron microscope according to an embodiment of the present invention.

도 1 및 도 2의 주사전자현미경용 시료전처리장치의 구성을 참조하고, 도 3의 순서로를 토대로 시료전처리 공정의 수행 실시예를 다음에서 소개한다.Referring to the configuration of the sample pretreatment apparatus for the scanning electron microscope of Figs. 1 and 2, an embodiment of the sample pretreatment process based on the procedure of Fig. 3 will be described below.

우선, 시료분주부(320)의 필터부재 상에 대상시료를 분주(1ml)한다.First, the target sample is dispensed (1 ml) onto the filter member of the sample distributor 320.

이후, 전고정용액공급부(110)에서 전고정용액으로 Glutaraldehyde 용액을 사용하여, 대상 시료를 전고정 한다(최종 농도 2%). 이 경우 전고정용액의 처리 시간은 약 2시간으로 설정한다.Thereafter, the target sample is pre-fixed (final concentration: 2%) by using the Glutaraldehyde solution as the total fixation solution in the total fixation solution supply part 110. In this case, the treatment time of the fixing solution is set to about 2 hours.

전고정공정 이후, 세척공정을 수행한다. 세척용액공급부(160)를 통해 공급되는 세척용액은 인산염 Washing buffer (pH는 시료의 특성에 맞게)로 대상 시료에 남아 있는 전고정액 세척하며, 세척시간 30초, 세척액의 양은 약 10mL를 인가하여 분사하여 수행한다.After the pre-fixing process, the cleaning process is performed. The cleaning solution supplied through the cleaning solution supply unit 160 is washed with a phosphate washing buffer (pH is adjusted to the characteristics of the sample), and the remaining fixative solution remaining in the sample is cleaned. The cleaning time is 30 seconds and the amount of the cleaning solution is about 10 mL. .

이후, 후고정공정이 수행되며, 후고정공정에서는 상기 후고정용액으로 Osmium tetroxide: HgCl₂ = 5:1 중량비로 만든 후고정액을 대상시료에 1 mL 분주하여 후고정을 수행한다. 이 경우 고정시간은 30분으로 한다.After that, the post-fixation process is performed. In the post-fixation process, Osmium tetroxide: HgCl ₂ = 5: 1 weight ratio is prepared as the postfix fix solution, and 1 ml of the fixative is dispensed into the sample. In this case, the fixed time is 30 minutes.

후고정공정 이후에 다시 대상시료에 대해 세척공정이 수행되어 후고정 용액을 세척한다. 세척액으로는 인산염 Washing buffer (pH는 시료의 특성에 맞게)로 후고정액 세척하며, 세척시간은 30초, , 세척액 약 10mL를 인가한다.After the post-fixing process, the cleaning process is performed on the target sample again to clean the post-fixing solution. The washing solution is washed with phosphate washing buffer (pH is adjusted to the characteristics of the sample), the washing time is 30 seconds, and the washing solution is about 10 mL.

이후, 상기 탈수용액공급부(130)에서 탈수용액을 공급받아 대상시료에 인가하여 탈수공정을 수행한다. 상기 탈수용액은 에탄올을 적용하되, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%의 농도의 에탄올을 순차적으로 분주하여 시료를 탈수한다. 이 경우 상술한 100% 에탄올은 2회 반복할 수 있도록 하며, 각 에탄올 농도별 탈수시간은 5분, 에탄올 분주 액량은 10mL로 한다.Thereafter, the dehydrated solution is supplied to the dehydrated solution supply unit 130 and applied to the target sample to perform a dehydration process. Ethanol is applied to the dehydrated solution, and ethanol is dewatered successively in concentrations of 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, and 100%. In this case, the above-mentioned 100% ethanol is allowed to be repeated twice, and the dehydration time for each ethanol concentration is 5 minutes and the ethanol dispensing amount is 10 mL.

이후, 치환용액공급부(140)를 통해 치환용액으로 T-butanol로 대상 시료를 에탄올에서 t-butanol로 치환한다. 치환시간은 5분, 치환액량은 10mL를 인가한다. 이는 세포의 원형을 가장 완벽하게 유지하여 신뢰도 높은 관찰이 가능하게 하는 장점이 있다.Subsequently, the target sample is replaced with t-butanol in ethanol with T-butanol as a replacement solution through the replacement solution supplying unit 140. The substitution time is 5 minutes, and the replacement liquid amount is 10 mL. This has the advantage of keeping the original shape of the cell perfectly and enabling highly reliable observation.

이후, 대상시료에 대한 건조공정이 수행되며, 본 발명의 실시예에서는 건조용액으로 HMDS를 적용하며, 건조시간은 1분 내외로 설정하여 수행될 수 있다.Thereafter, the drying process is performed on the target sample, and in the embodiment of the present invention, HMDS is applied to the drying solution and the drying time is set to about 1 minute or less.

이상의 시료의 전처리 공정을 적용하여 생물시료인 ‘무각 와편모조류 칼로디니움 미크롬 (Karlodinium micrum)’을 전처리하고, 전자 주사 현미경을 이용하여 촬영한 이미지를 도 4에 도시하였다. 도시된 이미지와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 전처리 공정을 통해 처리된 생물시료의 세포의 원형이 완벽하게 유지되어 매우 신뢰성 있는 이미지를 확보할 수 있게 됨을 확인할 수 있다.
FIG. 4 shows an image obtained by pretreating a biological sample, "Karlodinium micrum," which is an obtuse angular bird, using a pre-treatment process of the above samples, and using a scanning electron microscope. As shown in the image, it can be confirmed that the original shape of the cells of the biological sample treated through the pretreatment process according to the embodiment of the present invention is perfectly maintained and a highly reliable image can be obtained.

이상의 본 발명에 따른 전처리장치를 적용하면, 전자주사현미경을 이용하여 생물시료를 촬영하는 경우에 필수적인 전처리 공정을 자동화하여 시료의 전처리 공정에 소요되는 처리 시간을 최소화함은 물론, 전처리 공정을 표준화 자동화하여 사용자의 숙달도의 편차에 따른 전처리 효율의 부정확도를 현저하게 개선할 수 있게 된다.By applying the above-described pretreatment apparatus according to the present invention, it is possible to automate the pretreatment process which is necessary in the case of photographing a biological sample using an electron microscope, thereby minimizing the processing time required for the pretreatment process of the sample, Thereby making it possible to remarkably improve the inaccuracy of the preprocessing efficiency according to the deviation of the user's mastery.

전술한 바와 같은 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였다. 그러나 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 변형이 가능하다. 본 발명의 기술적 사상은 본 발명의 기술한 실시 예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.In the foregoing detailed description of the present invention, specific examples have been described. However, various modifications are possible within the scope of the present invention. The technical idea of the present invention should not be limited to the embodiments of the present invention but should be determined by the equivalents of the claims and the claims.

100: 전처리용액공급모듈
110: 전고정용액공급부
120: 후고정용액공급부
130: 탈수용액공급부
140: 치환용액공급부
150: 건조용액공급부
160: 세척용액공급부
200: 배관모듈
210: 연동펌프
220: 배관라인
230: 온도처리부
300: 시료전처리모듈
310: 액상분사부
320: 시료분주부
330: 처리액회수부
400: 제어모듈100: Pretreatment solution supply module
110: Whole fixing solution supply part
120: Postfixation solution supply part
130: dehydrated solution supply part
140: Substitute solution supply section
150: Drying solution supply part
160: Cleaning solution supply part
200: Piping module
210: peristaltic pump
220: piping line
230: Temperature processor
300: sample preprocessing module
310:
320: SAMPLE DISTRIBUTOR
330: Process liquid recovery unit
400: control module

Claims

A pretreatment solution supply module for supplying a pretreatment solution to be treated to an object sample;
A piping module for transferring the pretreatment solution supplied from the pretreatment solution supply module;
A sample preprocessing module for dividing and processing the pretreatment solution supplied from the piping module to a target sample; And
A control module installed to control a supply timing, a supply amount, and a supply order of the pretreatment solution; / RTI >
The pre-treatment solution supply module includes:
A pre-fixation solution supply unit installed to supply the pre-fixation solution to the object sample;
A postfixed solution supply unit installed to supply a postfixed solution in which Osmium tetroxide and HgCl ₂ are mixed at a weight ratio of 5: 1 to the preliminarily fixed sample;
A dehydrating solution supply unit installed to supply a dehydrated solution for dewatering the post-fixed sample;
A replacement solution supply unit installed to remove the dehydrated solution remaining in the dehydrated sample and supply the replacement solution to be replaced to the sample;
A drying solution supply unit supplying the drying solution to dry the object sample to be substituted; And
A cleaning solution supply unit installed to supply a cleaning solution necessary for each process; / RTI >
The piping module includes:
A piping line installed corresponding to each of the pre-fixation solution supply part, postfixed solution supply part, dehydrated solution supply part, replacement solution supply part, drying solution supply part, and cleaning solution supply part; And
A peristaltic pump connected to the pipeline and installed to provide the pretreatment solution to the sample preprocessing module; / RTI >
The sample pre-
A liquid jetting part installed to dispense the pretreatment solution supplied from the piping module to the target sample;
A sample distributor in which the target sample is disposed; And
A filter member installed to evenly distribute the pretreatment solution to the target sample; / RTI >
A temperature treatment unit is installed in the pipeline line corresponding to the replacement solution supply unit and in the replacement solution supply unit,
The control module includes:
And a controller for controlling the temperature processor so that the replacement solution is maintained at a predetermined temperature by displaying the calculated optimum size of the filter member or the gap of the filter member according to the amount of the sample to be disposed in the sample distributor, A sample pretreatment device for an electron microscope.

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The method according to claim 1,
A sample pretreatment apparatus for a scanning electron microscope applying a glutaraldehyde solution as the total immobilizing solution.

The method according to claim 1,
Ethanol is applied to the dehydrated solution,
Wherein the concentration of ethanol is differentiated by at least two steps, and the differentiated ethanol is sequentially supplied to the object sample.

The method of claim 4,
The substitution solution may contain,
Wherein the sample is a solution for replacing ethanol contained in the sample with t-butanol.

delete